Summary
Beskrevet her er brugen af en methylering-specifik sonde forstærkning metode til at analysere methylering niveauer af LINE-1 elementer i mesenkymale stamceller behandlet med osteosarkom-afledte ekstracellulære vesikler. Ultracentrifugation, en populær procedure for adskillelse af ekstracellulære vesikler fra føtal kvægserum, er også påvist.
Abstract
Methyleringsspecifik sondeforstærkning (MSPA) er en enkel og robust teknik, der kan bruges til at påvise relative forskelle i methyleringsniveauer af DNA-prøver. Det er ressourcestærke, kræver små mængder DNA, og tager omkring 4-5 h hands-on arbejde. I den præsenterede teknik, dna-prøver er først denatureret derefter hybridiseret til sonder, der er målrettet DNA på enten methylerede eller referencesteder som en kontrol. Hybridiseret DNA er opdelt i parallelle reaktioner, den ene gennemgår kun ligation og den anden gennemgår ligation efterfulgt af HhaI-medieret fordøjelse på umethylerede GCGC sekvenser. De resulterende DNA-fragmenter forstærkes af PCR og adskilles af kapillær elektroforese. Methylerede GCGC-steder fordøjes ikke af HhaI og frembringer spidssignaler, mens umethylerede GCGC-steder fordøjes, og der genereres ingen spidssignaler. Sammenligning af kontrolnormaliserede toppe af fordøjede og ufordøjede versioner af hver prøve giver methylering doseringsforholdet af en DNA-prøve. Her anvendes MSPA til at opdage virkningerne af osteosarkomafledte ekstracellulære vesikler (EL'er) på methyleringsstatus for lange interspersed nukleare element-1 (LINE-1) i mesenkymale stamceller. LINE-1s er gentagne DNA-elementer, der typisk gennemgår hypomethylation i kræft og i denne egenskab kan tjene som en biomarkør. Ultracentrifugation anvendes også som en omkostningseffektiv metode til at adskille ekstracellulære vesikler fra biologiske væsker (dvs. ved tilberedning af ev-forarmet fosterserum [FBS] og isolering af elbiler fra osteosarkombetingede medier [differentialcentrifugation]). Til methyleringsanalyse er brugerdefinerede LINE-1-sonder designet til at målrette tre methyleringsanlæg i LINE-1-promotorsekvensen og syv kontrolsteder. Denne protokol viser brugen af MSPA til LIN-1-methyleringsanalyse og beskriver præparatet ev-forarmet FBS ved ultracentrifugation.
Introduction
DNA methylering er en større epigenetisk modifikation forekommer i humane celler. DNA-methylering henviser til sammenkædning af methylgrupper med cytosinrester i CpG dinucleotider. Sådanne dinucleotider findes normalt i klynger (CpG-øer) på 5 ' region af gener1. I normale celler findes de fleste af disse dinucleotider i en umethyleret tilstand, som tillader DNA transskription. I øvrigt, mange kræftformer er forbundet med hypermethylerede CpG øer og transskriptorisk hæmning2, især i tumor suppressor gener, som igen bidrager til forskellige kendetegnende for kræft3.
På den anden side er lange interspersed nukleare elementer-1 (LINE-1s eller L1s) gentagne, transposable DNA-elementer, der normalt har høje niveauer af methylering på CpG øer. Methylering af LINE-1 forhindrer translokation og hjælper med at opretholde genomintegriteten. I flere typer af kræft, LINE-1 er hypomethylated, resulterer i aktivering og efterfølgende retrogennemførelse-medieret kromosomale ustabilitet4. LINE-1 tegner sig for næsten 17 % af det menneskelige genom5, og dets methyleringsstatus kan tjene som indikator for det globale genomiske methyleringsniveau6. Global LINE-1 hypomethylation anses for at gå forud for overgangen af celler til en tumor fænotype7; derfor, det holder løfte som en potentiel markør for tidlig kræft debut.
I øjeblikket er der flere metoder til methylering analyse, herunder pyrosequencing, methylering-specifikke PCR, mikroarrays, og kromatin immunudfældning1. Brugen af næste generations sekventering har også gjort det muligt at indarbejde genombrede tilgange til påvisning af DNA-methylering. Mange af disse metoder er afhængige af bisulfit-behandlet DNA, hvor umethylerede cytosiner omdannes til uracil og methylerede cytosiner forbliver uændrede. Men, arbejder med bisulfit-behandlet DNA har flere faldgruber, såsom ufuldstændige konverteringer af umethylerede cytosiner til uracil, forudindtaget forstærkning af sekvenser, og sekventering fejl8.
I methyleringsspecifik sondeforstærkning (MSPA) er sonder, der består af to oligonucleotider, rettet mod DNA-sekvenser, der indeholder et restriktionssted (GCGC) for det methyleringsfølsomme restriktionsenzym HhaI9. Når sonderne hybridiserer til DNA, opdeles hver prøve i to sæt. Sonder i første sæt gennemgåligation, mens sonder i andet sæt gennemgå ligation efterfulgt af HhaI-medieret fordøjelse på umethylerede CGCG steder. Begge sæt prøver forstærkes derefter af PCR, og produkterne adskilles af kapillær elektroforese. Sonder på umethylerede steder fordøjes af HhaI og forstærkes ikke under PCR, hvilket resulterer i ingen spidsbelastningssignaler. Derimod er sonder på methylerede steder beskyttet mod fordøjelsen og forstærkes derfor under PCR og genererer efterfølgende spidssignaler10.
MSPA har flere fordele i forhold til alternative metoder. For det første kræver det en lav mængde DNA (50-100 ng) og er velegnet til analyse af DNA fra formalin-faste paraffin indlejrede prøver10. Det kræver ikke bisulfit-behandlet DNA; faktisk er det uegnet til DNA, der er ændret på denne måde. Mange prøver kan analyseres på samme tid, og MSPA sonder kan udformes således, at de er rettet mod flere gener eller sekvenser samtidig. Derudover sonderne er specifikke og følsomme for methyleret DNA som HhaI begrænsning site svarer til en sekvens, der er typisk for CpG øer10.
Denne undersøgelse undersøgte virkningerne af osteosarkom (OS)-afledte ekstracellulære vesikler (EL)på LINE-1 methylering i fedtvævsafledte mesenkymale stamceller (AT-MSCs; Figur 1). Elbiler er nanoskala, membranbundne vesikler udskilles af de fleste celletyper. De bærer proteiner, lipider, mRNA, microRNA, og yderligere molekyler fra forældreceller11,12. El-producenter mægle intercellulære kommunikation og spiller vigtige roller i flere patofysiologiske forhold13,14. En nylig undersøgelse viste, at kræft-afledte elbiler kan overføre aktive LINE-1 til recipientceller15. Det er tidligere blevet rapporteret, at eldrevne køretøjer fra CELLElinjen HOS-143B kan ændre methyleringsstatus for LINE-1 i MSC ud over andre genetiske virkninger16.
Når der dyrkes celler til ev-isolation, er det vigtigt at anvende ev-forarmet føtal kvægserum [FBS] i vækstmediet, da FBS-afledte elbiler kan forstyrre eldrevne køretøjer fra andre kilder og hæmme resultaterne17,18. Ultracentrifugation er en af de mest almindelige metoder til udtømning af elbiler fra FBS. Det er en forholdsvis enkel og omkostningseffektiv procedure sammenlignet med alternativer som ultrafiltrering og kommerciel EV-forarmet FBS19. Her viser protokollen også, hvordan man forbereder EV-forarmet FBS ved ultracentrifugation.
Denne artikel indeholder en detaljeret protokol for ovennævnte teknikker, fra isolering af eldrevne køretøjer fra en OS-cellelinje til methyleringsanalysen af LINE-1 i OS-EV behandlede MSC 'er (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Den Etiske Komité i Helsinki og Uusimaa Hospital District (etisk godkendelse D. 217/13/03/02/2015).
1. Forberedelse af EV-forarmet FBS ved ultracentrifugation
- Tag FBS i (ultra)centrifuge rør og læg dem i ultracentrifuge spande. For at sikre, at ultracentrifugationen kører problemfrit og sikkert, skal du afbalancere spandene inden for 10 mg af hinanden.
- Læg spandene på en svingende rotor (type SW28, k-faktor 246). Rotoren anbringes i ultracentrifugen, og den køres ved 100.000 x g i 19 timer ved 4 °C.
- Saml forsigtigt det lyse øvre lag af supernatanten (ca. ni tiendedele) og overføres til et 50 ml rør. Den mørkebrune pellet må ikke forstyrres eller pipette, da den indeholder el-producenter fra FBS.
- Overnatanten passerer gennem et 0,22 μm filter i et nyt 50 ml rør.
- Føj det filtersteriliserede, EV-udtømte FBS til cellekulturmedier, når der dyrkes celler til EV-isolation.
2. Isolering af osteosarkomafledte elbiler
- Plade OS celler (HOS-143B cellelinje) i en T-175 kolbe med RPMI 1640 medium, suppleret med 10% normal FBS og 1% antibiotika (100 U/ml penicillin, 0,1 mg/ml streptomycin). Kolben anbringes i en kuvøse ved 37 °C og 5% CO2.
- Når kolben er 70%-80% confluent, vaskes cellerne med fosfat-buffered saltvand (PBS) derefter vokse dem i medier, der indeholder 10% EV-forarmet FBS (i det følgende benævnt EV-forarmet medier).
BEMÆRK: 1 x 106 HOS-143B celler belagt i en T175 kolbe når 70% sammenløb efter ca 60 h. - I løbet af de næste 48 timer, indsamle konditionerede medier fra osteosarkomceller efter hver 24 timer og tilføje friske EV forarmet medier.
- Centrifuger det konditionerede medie ved 2500 x g i 20 min ved 4 °C for at fjerne celler og celleaffald. Overfør supernatanten til et nyt rør, så omkring 2 ml medier i bunden.
BEMÆRK: Hvis du ikke direkte fortsætter med EV-isolation på nuværende tidspunkt, kan supernatantet opbevares på -80 oC. - Hæld supernatanten i ultracentrifugerør, og balance dem som tidligere. Centrifugerne centrifugeres ved 100.000 x g i 2 timer ved 4 °C.
- Kassér forsigtigt supernatanten, så omkring 1 ml i bunden. Tilsæt ca. 20 ml PBS (0,1 μm filtreret) til røret og pipetten forsigtigt for at vaske og ophænge EV-pellet' en igen.
- Balance rørene og udføre en anden runde af ultracentrifugation med de samme indstillinger.
- Fjern forsigtigt supernatanten, og ophæng EV-pellet'en igen i 200 μL PBS ved at skænsende pipettering. El-tv'erne opbevares i lavbindende rør.
BEMÆRK: Elbiler kan bruges med det samme eller andet opbevares i -80 °C, indtil de er nødvendige.
3. Karakterisering af OS-elbiler
BEMÆRK: Rensede elbiler kan karakteriseres ved vestlig blotting (WB), nanopartikelsporingsanalyse (NTA) og mikromikroskopi af transmissionselektron (TEM)16.
- Udfør WB som pr standardprotokol16 med EV-markører CD63, TSG101 og Hsp70 og med calnexin som en negativ kontrol for at angive renheden af EV-prøven20.
- For NTA fortyndes EV-prøven først i 0,1 μm filtreret Dulbeccos PBS for at opnå (ideelt) 30-100 partikler pr. ramme.
- Tag ca. 500 μL af prøven i en 1 ml sprøjte, og læg den i NTA-instrumentets indløbsport. Kontroller, at der er nok partikler pr. ramme, til nøjagtige målinger.
- Åbn NTA-softwaren, og optag fem videoer af 60 s varighed ved hjælp af kameraniveau 13 ved omgivelsestemperatur. Under analysen skal du bruge registreringstærskel = 5 og gevinst = 10.
- Analysér EV-prøver af TEM som beskrevet tidligere21.
4. AT-MSC kultur
BEMÆRK: Human fedtvæv for mesenkymale stamceller isolation blev leveret som fedtsugning aspirate (Institut for Plastikkirurgi, Laser Tilkka Ltd, Finland). Skriftliginformeret samtykke blev taget fra lipoaspirate donorer, der gennemgik elektiv fedtsugning procedurer.
- Isoler AT-MSCs fra fedtsugning aspirates ved hjælp af standard mekaniske og enzymatiskisolation metoder22.
BEMÆRK: MSC'er fra andre kilder (herunder kommercielle cellelinjer) kan også anvendes. - Kulturceller i DMEM/F-12 medier suppleret med 10% FBS og 1% antibiotika.
5. Behandling af MFC'er med os-elbiler
- Plade 15.000 AT-MSCs per brønd i en 24 brønd plade.
- Efter 24 timer skal du fjerne de gamle medier, vaske celler med PBS og skifte til EV-forarmet medie.
- Behandle celler med OS-EVs (ved en partikelkoncentration på 1 x 106 elbiler pr. celle) på dag 1 (24 timer efter cellevedhæftning), dag 3 (48 timer efter dag 1) og dag 5 (96 timer efter dag 1).
- Stop OS-EV behandling for timepoint (TP) 0 prøver på dag 1, TP 3 prøver på dag 3 og TP 7 prøver på dag 7 (48 h efter dag 5).
BEMÆRK: Andre tidsplaner pr. forsøgsplaner kan også følges.
- Stop OS-EV behandling for timepoint (TP) 0 prøver på dag 1, TP 3 prøver på dag 3 og TP 7 prøver på dag 7 (48 h efter dag 5).
- Uddrag DNA fra MsC'erne ved hjælp af en passende metode. Medtag positive og negative kontrolprøver til dataanalysen.
6. LINE-1 methyleringassay
- Design de tilpassede LINE-1 sonde primere, som gjort tidligere ved Pavicic et al.23. For methyleringsonder skal du vælge tre sekvenser, der indeholder HhaI-restriktionsstedet, inden for promotorerregionen LINE-1. For kontrol sonder, skal du vælge syv sekvenser mangler HhaJeg begrænsning site fra resten af LINE-1 sekvens.
BEMÆRK: LINE-1-sekvensen er tilgængelig i GenBank-databasen24 (L1.2, tiltrædelsesnr. AH005269.2). Brug MSPA-producentens anvisninger til at designe sonderne25. - Fortyndes 70 n DNA-prøve i TE-buffer til et 5 μL volumen.
- Udfør efterfølgende termocykling og PCR-trin som nævnt i tabel 1. Prøverne opvarmes i 10 minutter ved 98 °C, derefter afkøles til 25 °C.
- Tilføj 3 μL sonde hybridisering mix til hver prøve og køre termocycler at tillade sonderne at hybridisere til DNA.
- Ved stuetemperatur (RT) tilsættes 13 μL post-hybridiseringsblanding til hver prøve. Overfør 10 μL til et andet rør.
- Begge rørsæt anbringes i termohjulet og inkuberes ved 48 °C i mindst 1 min.
- Mens prøverne er på 48 °C, tilsættes 10 μL af ligationen til det første sæt rør (ufordøjet serie) og 10 μL af ligation-fordøjelsessammensætningen til det andet sæt rør (fordøjet serie). Kør det næste termocyclerprogram.
- Drej rørene ned og sæt samtidig termohjulet til 72 °C.
- Der tilsættes 5 μL polymeraseblanding til hvert rør, og rørne placeres i termohjulet. Kør PCR-programmet.
- Mens PCR-programmet kører, forberede stil en opløsning på 1 ml formamid, der indeholder 2,5 μL størrelsestandard. Pipette 10 μL af denne opløsning til hver brønd af en optisk 96 brøndplade (med stregkode).
- Efter PCR fortyndes de ufordøjede og fordøjede prøver til henholdsvis 1:100 og 1:200 i ultrarent vand. Der tilsættes 2 μL fortyndet PCR-produkt til 96 brøndpladen. Centrifuger pladen ved 200 x g for 15-20 s for at fjerne luftbobler.
- Udfør fragmentanalyse af prøver ved kapillær elektroforese.
BEMÆRK: Pladen skal opbevares ved 4 °C i mørke indtil analysen.
7. Analyse af fragmenteredata
- Åbn den kapillære elektroforese resulterer i en elektrofherogram analyse software.
- Vælg MLPA i menuen under søjlen Panel. Klik på paneloverskriften, og tryk på Ctrl+D for at anvende MLPA på alle eksempler.
- På samme måde skal du indstille metoden Analyse til Microsatellite default for alle prøver.
- Vælg alle prøver og klik på knappen Grøn afspilning for at analysere prøverne i henhold til de valgte indstillinger.
- Vælg alle prøver, og klik på knappen Graf for at visualisere sondespidserne.
- Zoom ind på topområdet for højere opløsning af de enkelte sondetoppe. Sørg for, at alle 10 toppe, der svarer til sonderne fra LINE-1-sondeblandingen, er mærket. Kassér yderligere toppe (<95 bp og >160 bp).
- Eksporter resultaterne i CSV-formatet (kommaseparerede værdier).
- Åbn CSV-filen i en dataanalysesoftware, og sorter dataene i kolonner.
- Mærk de tre methyleringsstedtoppe baseret på deres omtrentlige størrelser (L1-1m ved 153 bp, L1-2m ved 119 bp, L1-3m ved 133 bp). De resterende syv toppe svarer til kontrolsonderne.
BEMÆRK: Her anvendes værdier af L1-2m sondentoppe, som har en størrelse på 117 bp, da denne region har været anvendt i de fleste LINE-1 methylering analyser23. - For hver prøve (ufordøjet og fordøjet) beregnes sumpeakområdet for alle syv kontroltoppe. Opdel topområdet for hver LINE-1-sonde med denne sum.
- For hver DNA-prøve opdeles værdien af den fordøjede prøve med værdien af den ufordøjede prøve for at opnå methyleringsdoseringsforholdet (DM)ved hjælp af følgende ligning:
Hvor: DM er methylering doseringsforhold, Ax er det område under peak x (f.eks L1-2m peak), og Actrl er summen peak område af alle syv kontrol sonder.
- Mærk de tre methyleringsstedtoppe baseret på deres omtrentlige størrelser (L1-1m ved 153 bp, L1-2m ved 119 bp, L1-3m ved 133 bp). De resterende syv toppe svarer til kontrolsonderne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hovedformålet med denne undersøgelse var at evaluere os-eVs's epigenetiske virkninger på EF-pc'er. OS-E'er blev isoleret fra HOS-143B-celler ved hjælp af standardmetoden til differentieret centrifugering. Udtryk for de typiske EV markører CD63, Hsp70, og TSG101 ved vestlige blotting bekræftet tilstedeværelsen af OS-ELBILER. (Figur 2A). Fravær af calnexinsignal angivet renhed af OS-EV isolere. Der blev observeret yderligere renhedsangivelse med TEM, og intakte vesikler af forskellig størrelse var til stede (figur 2B). Den gennemsnitlige OS-EV partikelkoncentration var 7,63 x 1011/ml (figur 2C). Størrelsen fordeling af elbiler varierede fra 50-500 nm, med omkring 80% af partikler falder inden for 50-200 nm rækkevidde(figur 2D).
AT-MFP'er blev behandlet med OS-E'er, og DNA'erne blev udvundet fra MFP'erne på forskellige tidspunkter. LINE-1 methylering blev analyseret af MS-MLPA og beregnet i form af methylering doseringsforhold. Resultaterne fra TP 0 blev anvendt til at bestemme baseline methyleringsniveauer (stiplet linje) (figur 3). Ved TP 3 (grønne kolonner) blev der observeret et fald i det gennemsnitlige linje-1-methyleringsdoseringsforhold i MSC'er, når de blev behandlet med OS-elbiler, der faldt under baseline methyleringsniveauer. Dette hypomethylerende fænomen var mere subtilt ved TP 7 (blå kolonner), og det gennemsnitlige methyleringsdoseringsforhold var lidt højere i både ubehandlede og EV-behandlede MSC'er sammenlignet med baseline.
Figur 1: Eksperimentel arbejdsgang. Elvs blev isoleret fra HOS-143B celler ved differentialcentrifugering og karakteriseret ved vestlige blotting, TEM og NTA. AT-MFP'er e.'er blev behandlet med OS-ELBILER på forskellige tidspunkter (TP 0, 3, en 7). DNA blev udvundet fra MSC'er, og LINE-1 methylering blev analyseret af MSPA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Karakterisering af elbiler. (A) Tilstedeværelsen af EV-markører CD63, Hsp70 og TSG101 bekræftede tilstedeværelsen af elbiler ved vestlig blotning, mens der ikke blev observeret bånd for calnexin, hvilket indikerer ev-isolatets renhed. 10 μg protein blev indlæst til både HOS-143B protein lysat og OS-ELBILER. B) TEM bekræftede tilstedeværelsen af intakte eldrevne køretøjer i forskellige størrelser i isolatet. C) Partikelkoncentration og (D) størrelsesfordeling af OS-ELBILER blev bestemt ved NTA-målinger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Methyleringsdoseringsforhold på LINE-1 fra MFP'er enten ubehandlet eller behandlet med OS-elbiler. Den stiplede grå linje repræsenterer basismethyleringsværdien, der svarer til TP 0-værdier. Grønne kolonner repræsenterer gennemsnitlige methylering doseringsforhold uden og med OS-EV behandling for TP 3 prøver, mens blå kolonner repræsenterer det samme for TP 7 prøver. Både TP 3- og TP 7-prøver viste et fald i methyleringsniveauerne efter behandling med OS-elbiler. Forskellen var imidlertid større i TP 3-prøver, hvor methyleringsniveauet efter behandlingen af ev'et også var lavere end basisværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: MSPA reagens mix opskrifter og termocycler / PCR programmer. De nævnte mængder repræsenterer én DNA-prøve. Det skal bemærkes, at polymerase blandingen bør forberedes til 2x så mange prøver som tidligere blandinger, da der er to sæt rør på dette stadium. Nærmere oplysninger om det efterfølgende termocykling eller PCR-program gives til højre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse illustrerer, hvordan MSPA kan anvendes til at detektere og kvantificere methyleringsstatus for et bestemt genetisk element. LINE-1 var i fokus her, men sonderne kan designes til at målrette en række gener og sekvenser. Desuden er der en voksende liste af sonde blandinger til rådighed for forskellige applikationer. MSPA er en enkel og robust teknik til DNA-methyleringsanalyse, der ikke kræver bisulfitomdannelse10. Den komplette procedure fra prøveforberedelse til dataanalyse tager ca. 2 dage, men omfatter kun 4-5 timer faktisk praktisk arbejde. Det gælder for små mængder DNA (så lavt som 70 ng), som det fremgår her.
Den vigtigste del af methyleringsanalyseprotokollen er udarbejdelsen af brugerdefinerede sondeblandinger, såsom LINE-1-sondemixet i denne undersøgelse. På grund af deres forskellige længder, LINE-1 sonde oligonucleotider blev syntetiseret i intervallet 4-40 nM, så opløsningen trin og efterfølgende fortyndinger skulle udføres omhyggeligt, som pr producentens anvisninger25. PCR og flere termocykling programmer af protokollen, som anvendes her adskiller sig fra dem i den oprindelige producentens version.
Der er et par forholdsregler vedrørende HhaI enzym. For det første afhænger mængden af enzym, der anvendes i ligation-digestion mix, af producenten, og versioner af enzymet, der er resistente over for varmeinaktivering, er ikke egnede til MSPA. Med nogle enzymer, der kan være tilfælde af ufuldstændig fordøjelse, hvilket ville resultere i dannelsen af defekte PCR produkter og afvigende peak signaler. Endelig afhænger det omfang, i hvilket omfang de endelige PCR-produkter fortyndes til kapillær elektroforese, af sonderne. Indledende kørsler vil sandsynligvis indebære optimeringer, som det anbefales at teste en række fortyndinger.
Der er visse begrænsninger af MSPA, såsom den selektive karakter af HhaI-medieret DNA fordøjelse. Hha (Hha) Jeg kløver DNA kun på umethylerede GCGC sekvenser og ser bort fra andre tilfælde af CpG dinucleotider, der ikke er omgivet af en G og C, selv om de er placeret i CpG øer. Som følge heraf kan methyleringsstatus for sådanne dinucleotider (og dem, der er placeret uden for sondernes målsekvens), ikke bestemmes. LINE-1-sondemixet kan omfatte flere sonder, der indeholder yderligere GCGC-sekvenser fra propromotorregionen24, hvilket repræsenterer et større antal methyleringsanlæg.
Alternativt, andre methylering-specifikke begrænsning enzymer, såsom SacII og MluI, der har en anden begrænsning site end hhajeg kan desuden anvendes i MSPA, som kan give en bredere repræsentation af globale methylering niveauer26. For det andet, som observeret med TP 7 prøver, forskellene i methylering dosering sforhold kan være ganske subtile. Dette kan skyldes det høje kopiantal line-1-personer i genomet5, som har et højt niveau af global methylering under normale forhold og i vid udstrækning vil være upåvirket af forbigående hypomethylationshændelser på kun nogle få CPG-steder. Desuden er mfp'erne heterogene med hensyn til differentieringsstadiet og cellecyklussen, som kan påvirke basismethyleringsværdien. Endelig kan MSPA kun påvise relative forskelle i DNA-methylering og kræver referenceprøver af denne grund. I sådanne tilfælde kan metoder, der direkte detekterer lokal methylering, være mere hensigtsmæssige, selv om de kan kræve bisulfitomdannelsestrin27.
Da denne undersøgelse omfattede brugen af ekstracellulære vesikler, viste vi også udarbejdelsen af EV-forarmet FBS, som er en væsentlig del af cellekulturmedier for EV-isolation. Ultracentrifugation er en billig proces, der effektivt kan adskille elbiler fra resten af FBS. Men de 19 h centrifugation gør det til en mere tidskrævende metode end alternativer, såsom ultrafiltrering og kommercielle versioner19. Ultracentrifugation kræver også omhyggelig håndtering af prøven, f.eks. På trods af disse udfordringer er det en populær metode til at adskille elbiler fra biologiske væsker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af projektfinansiering fra University of Helsinki (WBS490302, WBS73714112) Helsinki Universitetshospital Statsmidler til sundhedsforskning på universitetsniveau (Y1014SUL05, TYH2016130), finsk-norsk medical foundation og Selma og Maja-Lisa Selander Fonden (Minerva Foundation). Vi takker Walter Pavicic for at levere den modificerede MSPA protokol og for relateret teknisk support. Vi er taknemmelige for Teemu Masalin (Helsinki Universitet) for at hjælpe os med videoproduktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
- Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Cancer Research. 66, 8462 (2006).
- Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
- Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
- Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
- Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).
- El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
- Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
- Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris". Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
- Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
- Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
- Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).
- Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
- Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
- L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000).
- Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. , Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018).
- Takara Bio Inc. , Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018).
- Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).
