Summary
Beschrieben wird hier die Verwendung einer methylierungsspezifischen Sondenverstärkungsmethode zur Analyse der Methylierungvon LINE-1-Elementen in mesenchymalen Stammzellen, die mit osteosarkomabgeleiteten extrazellulären Vesikeln behandelt werden. Ultrazentrifugation, ein beliebtes Verfahren zur Trennung extrazellulärer Vesikel vom fetalen Rinderserum, wird ebenfalls demonstriert.
Abstract
Die Methylierungsspezifische Sondenverstärkung (MSPA) ist eine einfache und robuste Technik, mit der relative Unterschiede in den Methylierungswerten von DNA-Proben erkannt werden können. Es ist einfallsreich, erfordert kleine Mengen an DNA und dauert etwa 4-5 h hands-on Arbeit. In der vorgestellten Technik werden DNA-Proben zunächst denaturiert und dann zu Sonden hybridisiert, die entweder auf methylierte oder Referenzstellen als Kontrolle abzielen. Hybridisierte DNA wird in parallele Reaktionen getrennt, eine unterzieht sich nur ligation und die andere wird ligation, gefolgt von der HhaI-vermittelten Verdauung in nicht methylierten GCGC-Sequenzen. Die resultierenden DNA-Fragmente werden durch PCR verstärkt und durch Kapillarelektrophorese getrennt. Methylierte GCGC-Standorte werden von HhaI nicht verdaut und erzeugen Spitzensignale, während nicht methylierte GCGC-Standorte verdaut werden und keine Spitzensignale erzeugt werden. Der Vergleich der kontrollnormalisierten Spitzen verdauter und unverdauter Versionen jeder Probe ergibt das Methylierungs-Dosierungsverhältnis einer DNA-Probe. Hier wird MSPA verwendet, um die Auswirkungen von Osteosarkom-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) auf den Methylierungsstatus von lang durchsetzten Kernelement-1 (LINE-1) in mesenchymalen Stammzellen zu erkennen. LINE-1 sind repetitive DNA-Elemente, die typischerweise bei Krebs hypomethyliert werden und in dieser Eigenschaft als Biomarker dienen können. Ultrazentrifugation wird auch als kostengünstige Methode verwendet, um extrazelluläre Vesikel von biologischen Flüssigkeiten zu trennen (d. h. bei der Herstellung von EV-erschöpftem fetalem Rinderserum [FBS] und der Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Osteosarkom-konditionierten Medien [Differentialzentrifugation]). Für die Methylierungsanalyse sind benutzerdefinierte LINE-1-Sonden für drei Methylierungsstandorte in der LINE-1-Promotorsequenz und sieben Kontrollstellen ausgelegt. Dieses Protokoll veranschaulicht die Verwendung von MSPA für die LINE-1-Methylierungsanalyse und beschreibt die Herstellung von EV-erschöpftem FBS durch Ultrazentrifugation.
Introduction
DNA-Methylierung ist eine wichtige epigenetische Modifikation, die in menschlichen Zellen auftritt. DNA-Methylierung bezieht sich auf die Verknüpfung von Methylgruppen mit Zytosinrückständen in CpG-Dinukleotiden. Solche Dinukleotide finden sich in der Regel in Clustern (CpG-Inseln) in der 5' Region der Gene1. In normalen Zellen existieren die meisten dieser Dinukleotide in einem unmethylierten Zustand, der eine DNA-Transkription ermöglicht. Übrigens sind viele Krebsarten mit hypermethylierten CpG-Inseln und transkriptomischer Silencing2verbunden, insbesondere in Tumorsuppressor-Genen, die wiederum zu verschiedenen Merkmalen von Krebs beitragen3.
Andererseits sind lange durchsetzte Kernelemente-1 (LINE-1s oder L1s) repetitive, transponierbare DNA-Elemente, die normalerweise einen hohen Methylierungsgrad auf CpG-Inseln aufweisen. Die Methylierung von LINE-1 verhindert die Translokation und trägt zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität bei. Bei mehreren Krebsarten wird LINE-1 hypomethyliert, was zu einer Aktivierung und anschließender retrotranspositionierter chromosomaler Instabilität4führt. LINE-1 macht fast 17% des menschlichen Genoms5aus, und sein Methylierungsstatus kann als Indikator für die globale genomische Methylierung6dienen. Globale LINE-1-Hypomethylierung gilt als vor dem Übergang von Zellen zu einem Tumor-Phänotyp7; daher verspricht sie als potenzieller Marker für den frühen Krebsbeginn.
Derzeit gibt es mehrere Methoden für die Methylierungsanalyse, einschließlich Pyrosequencing, methylierungsspezifischer PCR, Mikroarrays und Chromatin-Immunpräzipitation1. Die Verwendung der Sequenzierung der nächsten Generation hat es auch ermöglicht, genomweite Ansätze zum Nachweis der DNA-Methylierung zu integrieren. Viele dieser Methoden basieren auf bisulfitbehandelter DNA, bei der unmethylierte Zytosine in Uracil umgewandelt werden und methylierte Zytosine unverändert bleiben. Die Arbeit mit bisulfitbehandelter DNA hat jedoch mehrere Fallstricke, wie unvollständige Umwandlungen von nicht methylierten Zytosinen in Uracil, voreingenommene Amplifikation von Sequenzen und Sequenzierungsfehler8.
Bei der methylierungsspezifischen Sondenverstärkung (MSPA) zielen Sonden aus zwei Oligonukleotiden auf DNA-Sequenzen ab, die eine Restriktionsstelle (GCGC) für das methylierungsempfindliche Restriktionsenzym HhaI9enthalten. Nachdem die Sonden mit der DNA hybridisiert wurden, wird jede Probe in zwei Sätze unterteilt. Sonden im ersten Satz werden einer Ligation unterzogen, während Sonden im zweiten Satz einer Ligation unterzogen werden, gefolgt von der HhaI-vermittelten Verdauung an unmethylierten CGCG-Standorten. Beide Probensätze werden dann durch PCR verstärkt, und die Produkte werden durch Kapillarelektrophorese getrennt. Sonden an unmethylierten Standorten werden von HhaI verdaut und während der PCR nicht verstärkt, was zu keinen Spitzensignalen führt. Im Gegensatz dazu sind Sonden an methylierten Standorten vor der Verdauung geschützt und werden daher während der PCR verstärkt, wodurch anschließend Spitzensignale10erzeugt werden.
MSPA hat mehrere Vorteile gegenüber alternativen Methoden. Erstens benötigt es eine geringe Menge an DNA (50–100 ng) und eignet sich gut für die Analyse der DNA aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Proben10. Es erfordert keine Bisulfit-behandelte DNA; in der Tat, es ist ungeeignet für DNA, die auf diese Weise modifiziert wird. Viele Proben können gleichzeitig analysiert werden, und MSPA-Sonden können so konzipiert werden, dass sie mehrere Gene oder Sequenzen gleichzeitig zielen. Darüber hinaus sind die Sonden spezifisch und empfindlich für methylierte DNA, da die HhaI Restriktionsstelle einer Sequenz entspricht, die typisch für CpG-Inseln10ist.
Diese Studie untersuchte die Auswirkungen von Osteosarkom (OS)-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) auf die LINE-1-Methylierung in fettgewebeabgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (AT-MSCs; Abbildung 1). Elektrofahrzeuge sind nanoskalige, membrangebundene Vesikel, die von den meisten Zelltypen abgesondert werden. Sie tragen Proteine, Lipide, mRNA, microRNA und zusätzliche Moleküle aus den Elternzellen11,12. EVs vermitteln interzelluläre Kommunikation und spielen eine wichtige Rolle bei mehreren pathophysiologischen Bedingungen13,14. Eine aktuelle Studie zeigte, dass krebsverlesene Elektrofahrzeuge aktive S.1-V1 auf Empfängerzellen übertragen können15. Es wurde bereits berichtet, dass Elektrofahrzeuge aus der HOS-143B-Zelllinie den Methylierungsstatus von LINE-1 in MSCs verändern können, zusätzlich zu anderen genetischen Effekten16.
Beim Anbau von Zellen zur EV-Isolierung ist es wichtig, EV-dezimiertes fetales Rinderserum [FBS] im Wachstumsmedium zu verwenden, da FBS-abgeleitete Elektrofahrzeuge EVs aus anderen Quellen stören und die Ergebnisse17,18behindern können. Ultrazentrifugation ist eine der häufigsten Methoden zur Erschöpfung von Elektrofahrzeugen von FBS. Es ist ein relativ einfaches und kostengünstiges Verfahren im Vergleich zu Alternativen wieUltrafiltration und kommerzielle EV-erschöpftfb19 . Hier zeigt das Protokoll auch, wie EV-erschöpfte FBS durch Ultrazentrifugation vorbereitet werden.
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die oben genannten Techniken vor, von der Isolierung von Elektrofahrzeugen von einer OS-Zelllinie bis zur Methylierungsanalyse von LINE-1 in OS-EV behandelten MSCs (Abbildung 1).
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Protocol
Diese Studie wurde von der Ethikkommission von Helsinki und Uusimaa Hospital District genehmigt (ethische Zulassung D. Nr. 217/13/03/02/2015).
1. Vorbereitung von EV-erschöpftem FBS durch Ultrazentrifugation
- Nehmen Sie FBS in (Ultra-)Zentrifugenröhren und legen Sie sie in Ultrazentrifugen-Eimer. Um sicherzustellen, dass die Ultrazentrifugation reibungslos und sicher abläuft, balancieren Sie die Eimer innerhalb von 10 mg voneinander.
- Laden Sie die Eimer auf einen schwingenden Rotor (Typ SW28, k-Faktor 246). Den Rotor in die Ultrazentrifuge legen und bei 100.000 x g bei 19 h bei 4 °C laufen.
- Sammeln Sie vorsichtig die helle obere Schicht des Überstandes (ca. neun Zehntel) und übertragen Sie sie auf ein 50 ml Rohr. Stören oder pipetten Sie das dunkelbraune Pellet nicht, da es EVs von FBS enthält.
- Übergeben Sie den Überstand durch einen 0,22 m Filter in ein neues 50 ml Rohr.
- Fügen Sie den filtersterilisierten, EV-erschöpften FBS zu Zellkulturmedien hinzu, wenn Zellen für die EV-Isolierung wachsen.
2. Isolierung von Osteosarkom-eVs
- Platten-OS-Zellen (HOS-143B-Zelllinie) in einem T-175-Kolben mit RPMI 1640 Medium, ergänzt durch 10% normale FBS und 1% Antibiotika (100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin). Legen Sie den Kolben in einen Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.
- Wenn der Kolben 70% –80% konfluent ist, waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Saline (PBS) und wachsen Sie sie dann in Medien, die 10% EV-erschöpftes FBS enthalten (im Folgenden als EV-depleted media bezeichnet).
HINWEIS: 1 x 106 HOS-143B-Zellen, die in einem T175-Kolben plattiert sind, erreichen 70% Konfluenz nach ca. 60 h. - Während der nächsten 48 h, sammeln Konditionierte Medien aus Osteosarkomzellen nach 24 h und fügen Sie frische EV erschöpfte Medien.
- Zentrifugieren Sie das konditionierte Medium bei 2500 x g für 20 min bei 4 °C, um Zellen und Zellablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre, so dass ca. 2 ml Medien am Boden bleiben.
HINWEIS: Wenn sie in diesem Stadium nicht direkt mit der EV-Isolierung fortfahren, kann der Überstand bei -80 oC gelagert werden. - Gießen Sie den Überstand in Ultrazentrifugenrohre und balancieren Sie sie wie früher. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 100.000 x g für 2 h bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und lassen Sie ca. 1 ml am Boden. Rund 20 ml PBS (0,1 m gefiltert) in das Rohr und die Pipette geben, um das EV-Pellet sanft zu waschen und wieder aufzuhängen.
- Balancieren Sie die Rohre und führen Sie eine weitere Runde der Ultrazentrifugation mit den gleichen Einstellungen.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und setzen Sie das EV-Pellet in 200 l PBS durch sanftes Pipettieren wieder auf. Bewahren Sie die Elektrofahrzeuge in niedrigverbindlichen Rohren auf.
HINWEIS: Elektrofahrzeuge können sofort verwendet oder in -80 °C gespeichert werden, bis sie benötigt werden.
3. Charakterisierung von OS-EVs
HINWEIS: Gereinigte Elektrofahrzeuge können durch Western Blotting (WB), Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)16charakterisiert werden.
- Führen Sie WB gemäß dem Standardprotokoll16 mit den EV-Markern CD63, TSG101 und Hsp70 und mit Calnexin als Negativkontrolle aus, um die Reinheit der EV-Probe20anzuzeigen.
- Bei NTA wird zunächst die EV-Probe in 0,1 m gefilterten Dulbecco-PBS verdünnt, um (idealerweise) 30–100 Partikel pro Frame zu erhalten.
- Nehmen Sie ca. 500 l der Probe in eine 1 ml Spritze und laden Sie sie in den Einlassanschluss des NTA-Instruments. Prüfen Sie, ob pro Rahmen genügend Partikel für genaue Messungen vorhanden sind.
- Öffnen Sie die NTA-Software und zeichnen Sie fünf Videos mit einer Dauer von 60 s auf, indem Sie die Kamerastufe 13 bei Umgebungstemperatur verwenden. Verwenden Sie während der Analyse den Erkennungsschwellenwert = 5 und gain = 10.
- Analysieren Sie EV-Proben von TEM, wie zuvor beschrieben21.
4. AT-MSC-Kultur
HINWEIS: Menschliches Fettgewebe für die mesenchymale Stammzellisolierung wurde als Fettabsaugungaspirat bereitgestellt (Department of Plastic Surgery, Laser Tilkka Ltd., Finnland). Schriftliche Informierte Zustimmung wurde von den Lipoaspirat-Spendern, die sich einer elektiven Fettabsaugung unterzogen wurden, eingeholt.
- Isolieren Sie AT-MSCs von Fettabsaugungaspiraten mit Standard-Mechanischen und enzymatischen Isolationsmethoden22.
HINWEIS: MSCs aus anderen Quellen (einschließlich kommerzieller Zelllinien) können ebenfalls verwendet werden. - Kulturzellen in DMEM/F-12-Medien, ergänzt durch 10% FBS und 1% Antibiotika.
5. Behandlung von MSCs mit OS-EVs
- Platte 15.000 AT-MSCs pro Brunnen in einer 24 Well Platte.
- Nach 24 h die alten Medien entfernen, Zellen mit PBS waschen und auf EV-erschöpfte Medien umstellen.
- Behandeln Sie Zellen mit OS-EVs (bei einer Partikelkonzentration von 1 x 106 EVs pro Zelle) an Tag 1 (24 h nach Zelladhäsion), Tag 3 (48 h nach Tag 1) und Tag 5 (96 h nach Tag 1).
- Beenden Sie die OS-EV-Behandlung für Timepoint (TP) 0 Proben an Tag 1, TP 3 Proben an Tag 3 und TP 7 Proben an Tag 7 (48 h nach Tag 5).
HINWEIS: Andere Zeitpläne gemäß den experimentellen Plänen können ebenfalls befolgt werden.
- Beenden Sie die OS-EV-Behandlung für Timepoint (TP) 0 Proben an Tag 1, TP 3 Proben an Tag 3 und TP 7 Proben an Tag 7 (48 h nach Tag 5).
- Extrahieren Sie DNA aus den MSCs mit einer geeigneten Methode. Fügen Sie positive und negative Kontrollbeispiele für die Datenanalyse ein.
6. LINE-1-Methylierungstest
- Entwerfen Sie die kundenspezifischen LINE-1-Sondengrundierungen, wie sie zuvor von Pavicic et al.23durchgeführt wurden. Wählen Sie für Methylierungssonden drei Sequenzen aus, die die Hha-I-Einschränkungsstelle innerhalb des Promotorbereichs von LINE-1 enthalten. Wählen Sie für Kontrollsonden sieben Sequenzen aus, die nicht die HhaI-Einschränkungssite aus dem Rest der LINE-1-Sequenz entnehmen.
HINWEIS: Die LINE-1-Sequenz ist in der GenBank-Datenbank24 (L1.2, Beitritts-Nr. AH005269.2). Verwenden Sie die Anweisungen des MSPA-Herstellers für die Konstruktion der Sonden25. - 70 ng DNA-Probe im TE-Puffer auf ein Volumen von 5 l verdünnen.
- Führen Sie nachfolgende Thermocycling- und PCR-Schritte wie in Tabelle 1erwähnt. Die Proben 10 min bei 98 °C erhitzen, dann auf 25 °C abkühlen lassen.
- Fügen Sie jeder Probe 3 L Sondenhybridisierungsmix hinzu und führen Sie den Thermocycler aus, damit die Sonden mit der DNA hybridisieren können.
- Fügen Sie bei Raumtemperatur (RT) jeder Probe 13 L Nachhybridisierungsmischung hinzu. Übertragen Sie 10 l in ein zweites Rohr.
- Legen Sie beide Röhrensätze in den Thermocycler und brüten Sie mindestens 1 min bei 48 °C.
- Während die Proben bei 48 °C liegen, fügen Sie dem ersten Satz von Röhren (unverdaute Serie) und dem zweiten Satz von Röhren (verdauliche Serie) 10 l der Ligations-Verdauungsmischung hinzu. Führen Sie das nächste Thermocycler-Programm aus.
- Drehen Sie die Rohre herunter und stellen Sie gleichzeitig den Thermocycler auf 72 °C ein.
- Fügen Sie jedem Rohr 5 l Polymerase-Mix hinzu und legen Sie die Rohre in den Thermocycler. Führen Sie das PCR-Programm aus.
- Während das PCR-Programm läuft, bereiten Sie eine Lösung aus 1 ml Formamid vor, die einen Standard von 2,5 l enthält. Pipette 10 l dieser Lösung für jeden Brunnen einer optischen 96-Wellplatte (mit Barcode).
- Nach pcR die unverdauten und verdauten Proben auf 1:100 bzw. 1:200 in Reinstwasser verdünnen. Fügen Sie der 96-Well-Platte 2 L verdünntes PCR-Produkt hinzu. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 x g für 15–20 s, um Luftblasen zu entfernen.
- Durchführung der Fragmentanalyse von Proben durch Kapillarelektrophorese.
HINWEIS: Die Platte sollte bis zur Analyse bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.
7. Fragmentdatenanalyse
- Öffnen Sie die Kapillarelektrophorese ergibt eine Elektropherogramm-Analyse-Software.
- Wählen Sie unter der Spalte Panel für eines der Beispiele MLPA aus dem Menü aus. Klicken Sie auf den Panel-Header und drücken Sie Strg+D, um MLPA auf alle Samples anzuwenden.
- Legen Sie auf die gleiche Weise die Analysis-Methode für alle Samples auf Microsatellite-Standard fest.
- Wählen Sie alle Samples aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Grün spielen, um die Samples gemäß den gewählten Einstellungen zu analysieren.
- Wählen Sie alle Samples aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Graph, um die Sondenspitzen zu visualisieren.
- Zoomen Sie auf den Spitzenbereich für eine höhere Auflösung der einzelnen Sondenspitzen. Stellen Sie sicher, dass alle 10 Spitzen, die den Sonden des LINE-1-Sondenmixes entsprechen, beschriftet sind. Verwerfen Sie zusätzliche Spitzen (<95 bp und >160 bp).
- Exportieren Sie auf der Registerkarte Genotypes die Ergebnisse im CSV-Format (Comma-Separated-Values).
- Öffnen Sie die CSV-Datei in einer Datenanalysesoftware, und sortieren Sie die Daten in Spalten.
- Kennzeichnen Sie die drei Methylierungs-Standortspitzen auf der Grundlage ihrer ungefähren Größe (L1-1m bei 153 bp, L1-2m bei 119 bp, L1-3m bei 133 bp). Die restlichen sieben Spitzen entsprechen den Kontrollsonden.
HINWEIS: Hier werden Werte der L1-2m-Sondenspitzen verwendet, die eine Größe von 117 bp haben, da diese Region in den meisten LINE-1-Methylierungstests23verwendet wurde. - Berechnen Sie für jede Probe (unverdaute und verdauliche) die Summenspitzenfläche aller sieben Kontrollspitzen. Teilen Sie den Spitzenbereich jeder LINE-1-Sonde durch diese Summe.
- Teilen Sie für jede DNA-Probe den Wert der verdauten Probe durch den Wert der unverdauten Probe, um das Methylierungsdosisverhältnis (DM) unter Verwendung der folgenden Gleichung zu erhalten:
Wobei: DM ist Methylierungs-Dosierungsverhältnis, Ax ist die Fläche unter Peak x (z. B. L1-2m Peak), und AStrg ist die Summe Spitzenfläche aller sieben Kontrollsonden.
- Kennzeichnen Sie die drei Methylierungs-Standortspitzen auf der Grundlage ihrer ungefähren Größe (L1-1m bei 153 bp, L1-2m bei 119 bp, L1-3m bei 133 bp). Die restlichen sieben Spitzen entsprechen den Kontrollsonden.
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Representative Results
Das Hauptziel dieser Studie war es, die epigenetischen Wirkungen von OS-EVs auf MSCs zu bewerten. OS-EVs wurden aus HOS-143B-Zellen mit der Standard-Differentialzentrifugationsmethode isoliert. Der Ausdruck der typischen EV-Marker CD63, Hsp70 und TSG101 durch Western Blotting bestätigte das Vorhandensein von OS-EVs. (Abbildung 2A). Das Fehlen eines Calnexin-Signals deutete auf die Reinheit des OS-EV-Isolats hin. Zusätzliche Reinheitsangaben wurden bei TEM beobachtet, wobei intakte Vesikel unterschiedlicher Größe vorhanden waren (Abbildung 2B). Die durchschnittliche OS-EV-Partikelkonzentration betrug 7,63x1011/ml (Abbildung 2C). Die Größenverteilung von Elektrofahrzeugen reichte von 50 bis 500 nm, wobei etwa 80 % der Partikel im Bereich von 50–200 nm lagen(Abbildung 2D).
AT-MSCs wurden mit OS-EVs behandelt und DNA wurde zu verschiedenen Zeitpunkten aus den MSCs extrahiert. Die LINE-1-Methylierung wurde mit MS-MLPA analysiert und in Bezug auf das Methylierungs-Dosierungsverhältnis berechnet. Die Ergebnisse von TP 0 wurden verwendet, um die Basismethylierungsniveaus (gestrichelte Linie) zu bestimmen (Abbildung 3). Bei TP 3 (grüne Säulen) wurde bei MSCs bei Behandlung mit OS-EVs, die unter die Ausgangsmethylierungsniveaus fielen, eine Abnahme des durchschnittlichen LINE-1-Methylierungs-Dosierungsverhältnisses beobachtet. Dieses hypomethylierende Phänomen war bei TP 7 (blaue Säulen) subtiler, und das durchschnittliche Methylierungsdosisverhältnis war sowohl bei unbehandelten als auch bei EV-behandelten MSCs etwas höher als bei der Baseline.
Abbildung 1: Experimenteller Workflow. Elektrofahrzeuge wurden durch Differentialzentrifugation aus HOS-143B-Zellen isoliert und durch Western Blotting, TEM und NTA gekennzeichnet. AT-MSCs wurden zu verschiedenen Zeitpunkten mit OS-EVs behandelt (TP 0, 3, an 7). DNA wurde aus MSCs extrahiert und die LINE-1-Methylierung wurde von MSPA analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Charakterisierung von Elektrofahrzeugen. (A) Das Vorhandensein der EV-Marker CD63, Hsp70 und TSG101 bestätigte das Vorhandensein von Elektrofahrzeugen durch Western-Blotting, während keine Bänder für Calnexin beobachtet wurden, was auf die Reinheit des EV-Isolats hindeutet. Sowohl für HOS-143B-Proteinlysat als auch für OS-EVs wurden 10 g Protein geladen. (B) TEM bestätigte das Vorhandensein intakter Elektrofahrzeuge unterschiedlicher Größe im Isolat. (C) Die Partikelkonzentration und (D) Größenverteilung von OS-EVs wurden durch NTA-Messungen bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Methylierungs-Dosierungsverhältnisse von LINE-1 von MSCs, die entweder unbehandelt oder mit OS-EVs behandelt werden. Die gestrichelte graue Linie stellt den Basiswert für die Methylierung dar, der TP 0-Werten entspricht. Grüne Säulen stellen die durchschnittlichen Methylierungsdosisverhältnisse ohne und mit OS-EV-Behandlung für TP 3-Proben dar, während blaue Säulen für TP 7-Proben dasselbe darstellen. Sowohl die Proben TP 3 als auch TP 7 zeigten eine Abnahme der Methylierungswerte nach der Behandlung mit OS-EVs. Bei TP-3-Proben war der Unterschied jedoch größer, wo der Methylierungsgrad nach der EV-Behandlung ebenfalls niedriger als der Ausgangswert war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: MSPA Reagenz-Mix-Rezepte und Thermocycler/PCR-Programme. Die genannten Bände stellen eine DNA-Probe dar. Es sei darauf hingewiesen, dass der Polymerase-Mix für 2x so viele Proben wie frühere Mischungen vorbereitet werden sollte, da es in diesem Stadium zwei Sätze von Rohren gibt. Details zum nachfolgenden Thermocycling- oder PCR-Programm finden Sie auf der rechten Seite.
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Discussion
Diese Studie zeigt, wie MSPA verwendet werden kann, um den Methylierungsstatus eines bestimmten genetischen Elements zu erkennen und zu quantifizieren. LINE-1 stand hier im Mittelpunkt, aber die Sonden können so konzipiert werden, dass sie auf eine Reihe von Genen und Sequenzen abzielen. Darüber hinaus gibt es eine wachsende Liste von Sondenmischungen, die für verschiedene Anwendungen verfügbar sind. MSPA ist eine einfache und robuste Technik für die DNA-Methylierungsanalyse, die keine Bisulfitumwandlungerfordert 10. Das gesamte Verfahren von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse dauert etwa 2 Tage, erfordert aber nur 4–5 h tatsächlicher Hands-on-Arbeit. Es gilt für kleine Mengen von DNA (so niedrig wie 70 ng), wie hier gezeigt.
Der wichtigste Teil des Methylierungsanalyseprotokolls ist die Herstellung von kundenspezifischen Sondenmischungen, wie z.B. dem LINE-1-Sondenmix in dieser Studie. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Längen wurden LINE-1-Sondenoligonukleotide im Bereich von 4–40 nM synthetisiert, so dass der Auflösungsschritt und die nachfolgenden Verdünnungen sorgfältig durchgeführt werden mussten, wie es der Hersteller vorgibt25. Die PCR und mehrere Thermocycling-Programme des hier verwendeten Protokolls unterscheiden sich von denen in der Originalversion des Herstellers.
Es gibt ein paar Vorsichtsmaßnahmen in Bezug auf das Enzym HhaI. Erstens hängt das Volumen des Enzyms, das in der Ligations-Verdauungsmischung verwendet wird, vom Hersteller ab, und Versionen des Enzyms, die gegen Wärmeinaktivierung resistent sind, sind für MSPA nicht geeignet. Bei einigen Enzymen kann es zu einer unvollständigen Verdauung kommen, die zur Bildung fehlerhafter PCR-Produkte und abwegiger Spitzensignale führen würde. Schließlich hängt das Ausmaß, in dem die endgültigen PCR-Produkte für die Kapillarelektrophorese verdünnt werden, von den Sonden ab. Erste Durchläufe sind wahrscheinlich mit Optimierungen verbunden, für die empfohlen wird, eine Reihe von Verdünnungen zu testen.
Es gibt bestimmte Einschränkungen der MSPA, wie die selektive Natur der HhaI-vermittelten DNA-Verdauung. Hha Ich spalte DNA nur in unmethylierten GCGC-Sequenzen und vernachlässige andere Fälle von CpG-Dinukleotiden, die nicht von einem G und C eingeschlossen sind, selbst wenn sie sich innerhalb von CpG-Inseln befinden. Daher kann der Methylierungsstatus solcher Dinukleotide (und solcher, die sich außerhalb der Zielsequenz der Sonden befinden) nicht bestimmt werden. Der LINE-1-Sondenmix kann weitere Sonden enthalten, die zusätzliche GCGC-Sequenzen aus der Promotorregion24enthalten, wodurch eine größere Anzahl von Methylierungsstellen dargestellt wird.
Alternativ können andere methylierungsspezifische Restriktionsenzyme, wie SacII und MluI, die eine andere Restriktionsstelle als die von HhaI haben, zusätzlich in MSPA verwendet werden, was eine breitere Darstellung der globalen Methylierungsniveaus26ermöglichen kann. Zweitens, wie bei TP 7 Proben beobachtet, können die Unterschiede im Methylierungs-Dosierungsverhältnis ziemlich subtil sein. Dies kann auf die hohe Kopierzahl von LINE-1 im Genom5zurückzuführen sein, die unter normalen Bedingungen einen hohen globalen Methylierungsgrad aufweisen und von vorübergehenden Hypomethylierungsereignissen nur an wenigen CpG-Standorten weitgehend unberührt bleiben. Darüber hinaus sind die MSCs heterogen in Bezug auf das Differenzierungsstadium und den Zellzyklus, was sich auf den Basismethylierungswert auswirken kann. Schließlich kann MSPA nur relative Unterschiede in der DNA-Methylierung erkennen und benötigt aus diesem Grund Referenzproben. In solchen Fällen können Methoden, die lokale Methylierung direkt erkennen, geeigneter sein, obwohl sie den Bisulfitumwandlungsschritt27erfordern können.
Da diese Studie die Verwendung von extrazellulären Vesikeln beinhaltete, haben wir auch die Herstellung von EV-erschöpftem FBS gezeigt, das ein wesentlicher Bestandteil von Zellkulturmedien für die EV-Isolierung ist. Ultrazentrifugation ist ein kostengünstiger Prozess, der Elektrofahrzeuge effektiv vom Rest des FBS trennen kann. Die 19 h Zentrifugation machen es jedoch zu einer zeitaufwändigeren Methode als Alternativen, wie Ultrafiltration und kommerzielle Versionen19. Ultrazentrifugation erfordert auch eine sorgfältige Handhabung der Probe, z. B. beim Auswuchten der Rohre vor der Zentrifugation und anschließender Erfassung des Überstandes. Trotz dieser Herausforderungen ist es eine beliebte Methode, um Elektrofahrzeuge von biologischen Flüssigkeiten zu trennen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Projektförderung der Universität Helsinki (WBS490302, WBS73714112) gefördert. Maja-Lisa Selander Fund (Minerva Foundation). Wir danken Walter Pavicic für die Bereitstellung des modifizierten MSPA-Protokolls und für den damit verbundenen technischen Support. Wir danken Teemu Masalin (Universität Helsinki) für die Unterstützung bei der Videoproduktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
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