Summary
Описано здесь использование метилирования конкретных зонд амплификации метод для анализа уровней метилирования элементов LINE-1 в мезенхимальных стволовых клеток, обработанных остеосаркомы полученных внеклеточных пузырьков. Ультрацентррифугация, популярная процедура отделения внеклеточных пузырьков от сыворотки крупного рогатого скота плода, также продемонстрирована.
Abstract
Метилирование-специфическое усиление зонда (MSPA) является простой и надежной техникой, которая может быть использована для обнаружения относительных различий в уровнях метилирования образцов ДНК. Это находчивый, требует небольшого количества ДНК, и занимает около 4-5 ч практической работы. В представленной технике образцы ДНК сначала денатурируются, а затем гибридизируются с зондами, нацеленными на ДНК либо на метилированные, либо на эталонные участки в качестве контроля. Гибридизированная ДНК разделена на параллельные реакции, одна из них проходит только перевязку, а другая проходит перевязку, а затем HhaI-опосредованного пищеварения в неметилированных последовательностях GCGC. Полученные фрагменты ДНК усиливаются ПЦР и разделены капиллярным электрофорезом. Метилированные участки GCGC не усваиваются HhaI и производят пиковые сигналы, в то время как неметилированные участки GCGC усваиваются и пиковые сигналы не генерируются. Сравнение контрольно-нормализованных пиков переваренных и непереваренных версий каждого образца обеспечивает соотношение дозировки метилирования образца ДНК. Здесь MSPA используется для обнаружения влияния внеклеточных пузырьков, полученных от остеосаркомы (ЭВ) на метилирование долго перемежаемого ядерного элемента-1 (LINE-1) в мезенхимальных стволовых клетках. LINE-1s являются повторяющимися элементами ДНК, которые обычно подвергаются гипометилиации при раке и, в этом качестве, может служить в качестве биомаркера. Ультрацентррифегоция также используется в качестве экономически эффективного метода для отделения внеклеточных пузырьков от биологических жидкостей (т.е. при подготовке сыворотки крупного рогатого скота, истощенной евреем, и изоляции ЭВ от остеосаркомы кондиционированных средств массовой информации (дифференцированной центрифугации). Для анализа метилирования, пользовательские зонды LINE-1 предназначены для целевых трех метиловых сайтов в последовательности промоторов LINE-1 и семи контрольных участков. Этот протокол демонстрирует использование MSPA для анализа метилирования LINE-1 и описывает подготовку EV-исчерпаны FBS ультрацентррифегации.
Introduction
Метилирование ДНК является одной из основных эпигенетических изменений, происходящих в клетках человека. Метилирование ДНК относится к связи метиловых групп с остатками цитозина в динуклеотидах CpG. Такие динуклеотиды обычно встречаются в кластерах (острова CpG) в 5' области генов1. В нормальных клетках большинство этих динуклеотидов существуют в неметилируемом состоянии, что позволяет транскрипцию ДНК. Кстати, многие виды рака связаны с гиперметилированными островами CpG и транскриптомическим глушителем2, особенно в генах супрессоров опухолей, которые, в свою очередь, способствуют различным признакам рака3.
С другой стороны, длинные перемежаются ядерные элементы-1 (LINE-1s или L1s) являются повторяющимися, транспозируемыми элементами ДНК, которые обычно имеют высокий уровень метилирования на островах CpG. Метилирование LINE-1 предотвращает транслокацию и помогает поддерживать целостность генома. В нескольких типах рака, LINE-1 гипометилируется, что приводит к активации и последующей ретротранспозиции опосредованной хромосомной нестабильности4. На ЛИНИю-1 приходится почти 17% генома человека5,а его метилирование может служить индикатором глобального уровня геномной метилирования6. Глобальная гипметилирование LINE-1 считается предшествуя переходу клеток к фенотипу опухоли7; поэтому, он имеет перспективу в качестве потенциального маркера для раннего начала рака.
В настоящее время существует несколько методов анализа метилирования, в том числе пиросекенекирование, метилирование конкретных ПЦР, microarrays, и хроматин иммунопрециптом1. Использование секвенирования следующего поколения также позволило включить подходы к выявлению метилирования ДНК в масштабах всего генома. Многие из этих методов опираются на бисульфит-обработанную ДНК, в которой неметилированные цитозины преобразуются в урацил, а метилированные цитозины остаются неизменными. Тем не менее, работа с бисульфит-обработанной ДНК имеет несколько подводных камней, таких как неполные преобразования неметилированных цитозинов в uracil, предвзятое усиление последовательностей, и секвенирование ошибок8.
В метилациляции конкретных усилитель зондов (MSPA), зонды, состоящие из двух олигонуклеотидов целевой ДНК последовательностей, содержащих место ограничения (GCGC) для метилирования чувствительных ограничения фермента HhaI9. После того, как зонды гибридизируются с ДНК, каждый образец делится на два набора. Зонды в первом комплекте проходят перевязку, в то время как зонды во втором наборе проходят перевязку, а затем HhaI-опосредованного пищеварения на неметилированных участках CGCG. Оба набора образцов затем усиливаются ПЦР, и продукты разделены капиллярным электрофорасом. Зонды на неметилированных участках перевариваются HhaI и не усиливаются во время ПЦР, в результате чего нет пиковых сигналов. В отличие от этого, зонды на метилированных участках защищены от пищеварения и поэтому усиливаются во время ПЦР, впоследствии генерируя пиковые сигналы10.
MSPA имеет ряд преимуществ перед альтернативными методами. Во-первых, он требует низкого количества ДНК (50-100 нг) и хорошо подходит для анализа ДНК из формированного фиксированного парафина встроенных образцов10. Он не требует бисульфит-обработанной ДНК; на самом деле, это не подходит для ДНК, которая модифицируется таким образом. Многие образцы могут быть проанализированы в то же время, и MSPA зонды могут быть разработаны таким образом, что они нацелены на несколько генов или последовательностей одновременно. Кроме того, зонды являются специфическими и чувствительными для метилированных ДНК, как HhaI ограничение сайт соответствует последовательности, которая характерна для островов CpG10.
Это исследование исследовало влияние остеосаркомы (ОС) полученных внеклеточных пузырьков (EVs) на LINE-1 метилирования в жировой ткани полученных мезенхимальных стволовых клеток (AT-MSCs; Рисунок 1). EVs являются наноразмерными, мембранными пузырьками, выделяемыми большинством типов клеток. Они несут белки, липиды, мРНК, микроРНК, и дополнительные молекулы из родительских клеток11,12. EVs посредничает межклеточной связи и играют важную роль в нескольких патофизиологических условиях13,14. Недавнее исследование показало, что полученные раком EVs могут передавать активную ЛИНИЮ-1 клеткам-реципиентам15. Ранее сообщалось, что ЭВ из клеточной линии HOS-143B могут изменить метилирование статусLINE-1 в МСК, в дополнение к другим генетическим эффектам16.
При выращивании клеток для изоляции EV, важно использовать EV-обеденной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) в среде роста, так как FBS полученных EVs может мешать EVs из других источников и препятствовать результатам17,18. Ультрацентрифугация является одним из наиболее распространенных методов для истощения EVs от FBS. Это относительно простая и экономичная процедура по сравнению с альтернативами, такими как ультрафильтрация и коммерческий EV-обеденный FBS19. Здесь протокол также демонстрирует, как подготовить EV-исчерпаны FBS ультрацентрифугации.
В этой статье представлен подробный протокол для вышеупомянутых методов, от изоляции ЭВ от линии ячейки ОС до анализа метилирования LINE-1 в ОС-EV обработанных MSCs (Рисунок 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Хельсинки и больницы Уусимаа (этическое утверждение Д. No 217/13/03/02/2015).
1. Подготовка EV-исчерпаны FBS путем ультрацентрифугации
- Возьмите FBS в (ультра)центрифуговых труби и поместите их в ультрацентрифуге ведра. Чтобы ультрацентрифугация прошла гладко и безопасно, сбалансировать ведра в пределах 10 мг друг от друга.
- Загрузите ведра на размахивающий ротор (тип SW28, k-фактор 246). Поместите ротор в ультрацентрифуге и запустить на 100000 х г для 19 ч при 4 c.
- Тщательно соберите светлый верхний слой супернатанта (примерно девять десятых) и перенесите на трубку 50 мл. Не беспокоить или pipette темно-коричневый гранулы, так как он содержит EVs от FBS.
- Передайте супернатант через фильтр 0,22 мкм в новую трубку 50 мл.
- Добавьте фильтр-стерилизованный, EV-исчерпанный FBS к средствам культуры клетки когда расти клетки для изоляции EV.
2. Изоляция эвакуисов, полученных от остеосаркомы
- Клетки плиты OS (линия клетки HOS-143B) в колбе T-175 с rpMI 1640 средним, дополненными с 10% нормальными FBS и 1% антибиотиками (100 U/mL пенициллин, 0.1 мг/мЛ стрептомицин). Поместите колбу в инкубатор при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.
- Когда колба 70%-80% confluent, мыть клетки с фосфат-буфером солей (PBS) затем расти их в средствах, содержащих 10% EV-обеденных FBS (далее называют EV-обед).
ПРИМЕЧАНИЕ: 1 х 106 HOS-143B клеток, покрытых в колбе T175 достигает 70% выпуклости примерно после 60 ч. - В течение следующих 48 ч, собирать условные средства массовой информации из клеток остеосаркомы после каждого 24 ч и добавить свежие EV истощенных средств массовой информации.
- Центрифуги кондиционированных носителей на 2500 х г в течение 20 минут при 4 кв КК, чтобы удалить клетки и мусор ауда. Перенесите супернатант на новую трубку, оставив около 2 мл носителей внизу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если непосредственно не приступить к изоляции EV на данном этапе, супернатант может храниться при -80 oC. - Налейте супернатант в ультрацентрифуговых труб и сбалансировать их, как раньше. Центрифуга труб на 100000 х г на 2 ч при 4 градусах Цельсия.
- Тщательно отбросьте супернатант, оставляя около 1 мл на дне. Добавить около 20 мл PBS (0,1 мкм фильтруется) в трубку и пипетку осторожно мыть и resuspend эВ гранулы.
- Баланс труб и выполнить еще один раунд ультрацентрифугации с теми же настройками.
- Тщательно удалите супернатант и resuspend эВ гранулы в 200 Зл Л PBS путем нежного пипетки. Храните EVs в низкой связывающей трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: EVs можно использовать сразу или же хранить в -80 градусов по Цельсию, пока они не необходимы.
3. Характеристика ОС-EVs
ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные ЭВ могут быть охарактеризованы западной blotting (WB), анализ наночастиц отслеживания (NTA), и передачи электронной микроскопии (TEM)16.
- Выполните WB в соответствии со стандартным протоколом16 с EV маркерами CD63, TSG101 и Hsp70, а также с calnexin в качестве отрицательного контроля, чтобы указать на чистоту образца EV20.
- Для NTA сначала разбавить образец EV в 0,1 мкм фильтруется PBS Dulbecco для получения (в идеале) 30-100 частиц на кадр.
- Возьмите около 500 л образца в шприц объемом 1 мл и загрузите его в вхдыхательный порт прибора NTA. Убедитесь, что на кадр достаточно частиц для точных измерений.
- Откройте программное обеспечение NTA и запишите пять видео продолжительностью 60 с, используя камеру уровня 13 при температуре окружающей среды. Во время анализа используйте порог обнаружения No 5 и получите 10.
- Проанализируйте образцы EV tEM, как описано ранее21.
4. Культура AT-MSC
ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческая жировая ткань для мезенхимальной изоляции стволовых клеток была предоставлена в качестве аспирата липосакции (Департамент пластической хирургии, Laser Tilkka Ltd., Финляндия). Письменное информированное согласие было взято у доноров липоаспиратера, которые проходили процедуры выборной липосакции.
- Изолировать AT-MSCs от липосакции аспиров с использованием стандартных методов механической и ферментативной изоляции22.
ПРИМЕЧАНИЕ: MSCs из других источников (в том числе коммерческих линий ячейки) также могут быть использованы. - Культурные клетки в средствах массовой информации DMEM/F-12 дополнены 10% FBS и 1% антибиотиками.
5. Лечение МСК с ПОМОЩЬю ОС-ЭВ
- Плита 15000 AT-MSCs в скважине в 24 хорошо пластины.
- После 24 ч, удалить старые средства массовой информации, мыть клетки с PBS, и перейти на EV-исчерпаны средств массовой информации.
- Лечить клетки с OS-EVs (при концентрации частиц 1 х 106 EVs на ячейку) на день 1 (24 ч после сливк клетки), День 3 (48 ч после дня 1), и день 5 (96 ч после дня 1).
- Остановить OS-EV лечения для timepoint (TP) 0 образцов на день 1, TP 3 образцов на 3 день и TP 7 образцов на 7 день (48 ч после дня 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие графики тайм-пойнтов в рамках экспериментальных планов также могут быть соблюдены.
- Остановить OS-EV лечения для timepoint (TP) 0 образцов на день 1, TP 3 образцов на 3 день и TP 7 образцов на 7 день (48 ч после дня 5).
- Извлеките ДНК из МСК с помощью соответствующего метода. Включите положительные и отрицательные контрольные образцы для анализа данных.
6. Line-1 метилирование
- Дизайн индивидуальных LINE-1 зонд грунтовки, как это было сделано ранее Pavicic и др.23. Для метилационных зондов выберите три последовательности, содержащие место ограничения HhaI в области промотора LINE-1. Для контрольных зондов выберите семь последовательностей, не хватает места ограничения HhaI от остальной части последовательности LINE-1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность LINE-1 доступна в базе данных GenBank24 (L1.2, присоединение нет. AH005269.2). Используйте инструкции производителя MSPA для проектирования зондов25. - Разбавить 70 нг образца ДНК в буфере TE до объема 5 л.
- Провести последующие шаги термоциклии и ПЦР, как уже упоминалось в таблице 1. Нагрейте образцы в течение 10 мин при температуре 98 градусов по Цельсию, затем охладите до 25 градусов по Цельсию.
- Добавьте 3 зЛ смеси гибридизации зонда к каждому образцу и запустите термоциклер, чтобы позволить зондам гибридизироваться с ДНК.
- При комнатной температуре (RT) добавьте в каждый образец 13 юл постгибридизации смеси. Перенесите 10 зл., на вторую трубку.
- Поместите оба комплекта труб в термоцикле и инкубировать при 48 градусах По Цельсию в течение по крайней мере 1 мин.
- В то время как образцы находятся на уровне 48 градусов по Цельсию, добавьте 10 qL перевязочной смеси к первому набору трубок (непереваренный ряд) и 10 зл. переваривания перевязки к второму набору трубок (переваренной серии). Запустите следующую программу термоциклора.
- Спин вниз трубки и одновременно установить термоциклдора до 72 градусов по Цельсию.
- Добавьте 5 кл. из смеси полимеразы к каждой трубке и поместите трубки в термоциклер. Выполнить программу PCR.
- Во время выполнения программы ПЦР подготовьте решение формамида размером 1 мл, содержащее 2,5 л стандарта размера. Пипетка 10 л этого раствора для каждой скважины из оптической пластины 96 скважины (со штрих-кодом).
- После ПЦР разбавить непереваренные и переваренные образцы до 1:100 и 1:200 соответственно в ультрачистой воде. Добавьте 2 злиц разбавленного пЦР-продукта в 96 хорошо пластины. Центрифуге пластины на 200 х г для 15-20 с, чтобы удалить пузырьки воздуха.
- Провести фрагментный анализ образцов с помощью капиллярного электрофорасиса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина должна храниться при 4 градусах Цельсия в темноте до анализа.
7. Анализ фрагментных данных
- Открытие капиллярного электрофореза приводит к разработке программного обеспечения для анализа электроферограммы.
- В колонке Panel для одного из примеров выберите MLPA из меню. Нажмите на заголовок панели и нажмите Ctrl'D, чтобы применить MLPA ко всем образцам.
- Таким же образом, установить метод анализа на Microsatellite по умолчанию для всех образцов.
- Выберите все образцы и нажмите на кнопку воспроизведения Green, чтобы проанализировать образцы в выбранных настройках.
- Выберите все образцы и нажмите на кнопку График, чтобы визуализировать пики зонда.
- Увеличьте пиковую область для более высокого разрешения отдельных пиков зонда. Убедитесь, что все 10 пиков, соответствующих зондам из зонд-микса LINE-1, помечены. Откажитесь от дополнительных пиков (злт;95 б/с и йgt;160 bp).
- Во вкладке Genotypes экспортировать результаты в формате запятой разделенных значений (CSV).
- Откройте файл CSV в программном обеспечении для анализа данных и сортируйте данные в столбцы.
- Этикетка три метилирования сайт пики на основе их приблизительные размеры (L1-1m на 153 bp, L1-2m на 119 bp, L1-3m на 133 bp). Остальные семь пиков соответствуют контрольные зонды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используются значения пиков зонда L1-2m, которые имеют размер 117 bp, так как этот регион был использован в большинстве анализов метилирования LINE-123. - Для каждого образца (непереваренного и переваренного) вычислите пиковую площадь суммы всех семи контрольных пиков. Разделите пиковую область каждого зонда LINE-1 на эту сумму.
- Для каждого образца ДНК, разделить значение переваренных образцов на непереваренный образец, чтобы получить коэффициент дозировки метилирования (DM) с помощью следующего уравнения:
Где: DM является коэффициентом дозировки метилирования, Ax — это область под пиком x (например, пик L1-2m), аctrl — это пиковая область суммы всех семи контрольных зондов.
- Этикетка три метилирования сайт пики на основе их приблизительные размеры (L1-1m на 153 bp, L1-2m на 119 bp, L1-3m на 133 bp). Остальные семь пиков соответствуют контрольные зонды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основной целью данного исследования была оценка эпигенетического воздействия ОС-ЭВ на MSCs. OS-EVs были выделены из клеток HOS-143B с использованием стандартного метода центрифугации дифференциального дифференциала. Выражение типичных маркеров EV CD63, Hsp70 и TSG101 западным и западным блоттингом подтвердило наличие ОС-EVs. (Рисунок 2А). Отсутствие сигнала калнексина указывает на чистоту изолировать OS-EV. Дополнительные признаки чистоты наблюдался с TEM, с нетронутыми пузырьки различных размеров присутствуют(Рисунок 2B). Средняя концентрация частиц OS-EV составила 7,63х1011/мл(рисунок 2C). Распределение размеров EVs варьировался от 50-500 нм, при этом около 80% частиц падали в пределах диапазона 50-200 нм(рисунок 2D).
AT-MSC лечились с помощью ОС-ЭВ, а ДНК извлекалась из МСК в разные временные точки. Метилирование LINE-1 было проанализировано MS-MLPA и рассчитано с точки зрения соотношения дозировки метилирования. Результаты TP 0 были использованы для определения базовых уровней метилирования (пунктирная линия)(рисунок 3). При TP 3 (зеленые столбцы) снижение среднего соотношения метилирования LINE-1 наблюдалось в МСК при лечении ОС-ЭВ, подпадающих под базовые уровни метилирования. Это гипометилатирующее явление было более тонким на TP 7 (синие столбцы), и среднее соотношение дозировки метилирования было немного выше как в необработанных и EV-обработанных MSC по сравнению с базовым уровнем.
Рисунок 1: Экспериментальный рабочий процесс. EVs были выделены из клеток HOS-143B дифференциальной центругирования и характеризуется западной blotting, TEM и NTA. AT-MSC лечились СПомощь в разных точках времени (TP 0, 3, 7). ДНК была извлечена из MSCs и LINE-1 метилирование было проанализировано MSPA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Характеристика EVs. (A) Присутствие ev маркеров CD63, Hsp70 и TSG101 подтвердило наличие EVs западным blotting, в то время как не было отмечено полос для calnexin, что указывает на чистоту ev изолировать. 10 мкг белка было загружено как для протеина HOS-143B, так и для OS-EVs. (B) TEM подтвердил наличие нетронутых ЭВ различных размеров в изоляте. (C) Концентрация частиц и (D) распределение размера ОС-EVs определялись измерениями NTA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Коэффициенты дозировки метилирования LINE-1 от МСК либо необработанные, либо обработанные ОС-EVs. Разбитая серая линия представляет базовое значение метилирования, соответствующее значениям TP 0. Зеленые столбцы представляют средние коэффициенты дозировки метилирования без и с OS-EV обработки для образцов TP 3, в то время как синие столбцы представляют то же самое для образцов TP 7. Оба образца TP 3 и TP 7 показали снижение уровня метилирования после лечения ОС-ЭВ. Однако разница была больше в образцах TP 3, где уровень метилирования после обработки EV также был ниже базового значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1: Рецепты смеси реагентов MSPA и программы термоциклора/ПЦР. Упомянутые объемы представляют собой один образец ДНК. Следует отметить, что смесь полимераза должна быть подготовлена для 2x столько образцов, как предыдущие смеси, так как Есть два набора труб на данном этапе. Вправо приводится подробная информация о последующей программе термоциклоза или ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование иллюстрирует, как MSPA может быть использован для обнаружения и количественного состояния метилирования конкретного генетического элемента. LINE-1 был в центре внимания здесь, но зонды могут быть разработаны для целевой диапазон генов и последовательностей. Кроме того, существует растущий список смесей зонда, доступных для различных приложений. MSPA является простой и надежный метод для анализа метилирования ДНК,который не требует преобразования бисульфит10 . Полная процедура от подготовки образца до анализа данных занимает около 2 дней, но включает в себя только 4-5 ч фактической практической работы. Это применимо для небольших количеств ДНК (как низко как 70 нг), как показано здесь.
Наиболее важной частью протокола анализа метилирования является подготовка пользовательских смесей зонда, таких как зонд-микс LINE-1 в данном исследовании. Из-за их разной длины, LINE-1 зонд олигонуклеотиды были синтезированы в диапазоне 4-40 нм, так что этап растворения и последующие разбавления должны были быть выполнены тщательно, в соответствии с инструкциями производителя25. PcR и несколько термоциклозаевых программ протокола, как здесь используется отличаются от тех, в оригинальной версии производителя.
Есть несколько мер предосторожности, связанных с ферментом HhaI. Во-первых, объем фермента, используемого в смеси перевязочно-пищеварения, зависит от производителя, а версии фермента, устойчивых к теплоинактивации, не подходят для MSPA. С некоторыми ферментами могут быть случаи неполного пищеварения, что приведет к образованию неисправных продуктов ПЦР и аномальных пиковых сигналов. Наконец, степень разбавления конечных продуктов ПЦР при капиллярном электрофорасе зависит от зондов. Первоначальные запуски, вероятно, будут включать оптимизацию, для которой рекомендуется протестировать ряд разбавлений.
Существуют определенные ограничения MSPA, такие как селективный характер HhaI-опосредованного пищеварения ДНК. Хха Я расщепляет ДНК только в неметилированных последовательностях GCGC и игнорирует другие случаи dinucleotides CpG, которые не заключены G и C, даже если они расположены в пределах островов CpG. В результате, состояние метилирования таких динуклеотидов (и тех, которые находятся за пределами целевой последовательности зондов) не может быть определено. Зонд-микс LINE-1 может включать в себя больше зондов, содержащих дополнительные последовательности GCGC из региона промоутера24,тем самым представляя большее количество метиловых участков.
Кроме того, другие метилирование конкретных ограничений ферментов, таких как SacII и MluI, которые имеют различные места ограничения, чем у HHAЯ может быть дополнительно использован в MSPA, которые могут обеспечить более широкое представление глобальных уровней метилирования26. Во-вторых, как это наблюдается в образцах TP 7, различия в соотношении дозировки метилирования могут быть довольно тонкими. Это может быть связано с большим количеством копий LINE-1 в геноме5, которые имеют высокий уровень глобального метилирования в нормальных условиях и в значительной степени не будут затронуты временными гипометилированием событий только в нескольких сайтах CpG. Кроме того, МСК неоднородны с точки зрения стадии дифференциации и клеточного цикла, что может повлиять на базовое значение метилирования. Наконец, MSPA может только обнаружить относительные различия в метилирование ДНК и требует эталонных образцов по этой причине. В таких случаях методы, непосредственно обнаруживающие локальное метилирование, могут быть более подходящими, хотя для этого может потребоваться этап преобразования бисульфита27.
Так как это исследование включало в себя использование внеклеточных пузырьков, мы также продемонстрировали подготовку EV-исчерпаны FBS, который является важным компонентом клеточной культуры средств массовой информации для изоляции EV. Ultracentrifugation является недорогим процессом, который может эффективно отделить EVs от остальной части FBS. Тем не менее, 19 ч центрифугации делает его более трудоемким методом, чем альтернативы, такие как ультрафильтрация и коммерческие версии19. Ультрацентррифирование также требует тщательного обращения с образцом, например, при балансировании труб до центрифугации и сборе супернатанта после этого. Несмотря на эти проблемы, это популярный метод для отделения EVs от биологических жидкостей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована финансированием проекта Хельсинкского университета (WBS490302, WBS73714112) Хельсинкский университет больницы государственного финансирования университетских исследований в области здравоохранения (Y1014SUL05, TYH2016130), Финско-норвежского медицинского фонда, и Сельма и Фонд Майя-Лиза Селандер (Фонд Минерва). Мы благодарим Вальтера Павича за предоставление измененного протокола MSPA и за соответствующую техническую поддержку. Мы благодарны Теему Масалину (Хельсинкский университет) за помощь в видеопроизводстве.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
- Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Cancer Research. 66, 8462 (2006).
- Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
- Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
- Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
- Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).
- El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
- Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
- Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris". Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
- Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
- Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
- Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).
- Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
- Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
- L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000).
- Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. , Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018).
- Takara Bio Inc. , Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018).
- Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).
