Summary
Beskrivs här är användningen av en metylering-specifik sond amplifiering metod för att analysera metylering nivåer av LINE-1 element i mesenkymala stamceller behandlas med osteosarkom-härledda extracellulära blåsor. Ultracentrifugering, ett populärt förfarande för att separera extracellulära blåsor från fetala bovin serum, visas också.
Abstract
Metylering-specifik sond förstärkning (MSPA) är en enkel och robust teknik som kan användas för att upptäcka relativa skillnader i metylering nivåer av DNA-prover. Det är påhittig, kräver små mängder DNA, och tar cirka 4-5 h praktiskt arbete. I den presenterade tekniken, DNA-prover först denatureras sedan hybridiseras till sonder som riktar DNA på antingen metylerade eller referensplatser som en kontroll. Hybridiserat DNA är uppdelad i parallella reaktioner, en genomgår endast ligering och den andra genomgår ligering följt av HhaI-medierad matsmältning vid ometylerade GCGC-sekvenser. De resulterande DNA-fragmentförstärks av PCR och separeras genom kapillärelektrofores. Metylerade GCGC platser inte smältav HhaI och producera toppsignaler, medan ometylerade GCGC platser smälts och inga toppsignaler genereras. Jämföra kontroll-normaliserade toppar av smälta och osmälta versioner av varje prov ger metylering doseringförhållandet av ett DNA-prov. Här används MSPA för att upptäcka effekterna av osteosarkom-härledda extracellulära blåsor (EVs) på metylering status långa interspersed nukleära element-1 (LINE-1) i mesenkymala stamceller. LINE-1s är repetitiva DNA-faktorer som vanligtvis genomgår hypometylering i cancer och, i denna egenskap, kan fungera som en biomarkör. Ultracentrifugation används också som en kostnadseffektiv metod för att separera extracellulära blåsor från biologiska vätskor (dvs. vid beredning av EV-utarmat fetalt nötkreaturserum [FBS] och isolerae nde organ från osteosarkom konditionerade medier [differentiell centrifugering]). För metyleringanalys är anpassade LINE-1-sonder utformade för att rikta in sig på tre metylationsplatser i LINE-1-promotorn och sju kontrollplatser. Detta protokoll visar användningen av MSPA för LINE-1 metylering analys och beskriver beredningen av EV-utarmat FBS genom ultracentrifugering.
Introduction
DNA-metylering är en viktig epigenetisk modifiering som förekommer i mänskliga celler. DNA-metylering avser kopplingen mellan metylgrupper till cytosinrester i CpG-dinukleotids. Sådana dinucleotides finns vanligtvis i kluster (CpG öar) i 5 region av gener1. I normala celler finns de flesta av dessa dinukleotider i ett ometylat tillstånd, vilket möjliggör DNA-transkription. Förresten, många cancerformer är associerade med hypermetylerade CpG öar och transkriptomiska ljuddämpning2, särskilt i tumör suppressor gener, vilket i sin tur bidrar till olika kännetecken för cancer3.
Å andra sidan är långa interspersed nukleära element-1 (LINE-1s eller L1s) repetitiva, transposable DNA-element som normalt har höga halter av metylering på CpG öar. Metylering av LINE-1 förhindrar flyttning och hjälper till att upprätthålla genomintegritet. I flera typer av cancer är LINE-1 hypometylerad, vilket resulterar i aktivering och efterföljande retroinförlivande-medierad kromosomal instabilitet4. LINE-1 står för nästan 17% av det mänskligagenomet 5, och dess metylering status kan fungera som en indikator på globala genomiska metylering nivåer6. Global LINE-1 hypomethylation anses föregå övergången av celler till en tumör fenotyp7; Därför håller det löfte som en potentiell markör för tidig cancer debut.
För närvarande finns det flera metoder för metylering analys, inklusive pyrosequencing, metylering-specifika PCR, mikroarrayer, och kromatin immunoprecipitation1. Användningen av nästa generations sekvensering har också gjort det möjligt att införliva genomomfattande metoder för påvisande av DNA-metylering. Många av dessa metoder är beroende av bisulfit-behandlade DNA, där ometylerade cytosiner omvandlas till uracil och metylerade cytosiner förblir oförändrade. Arbeta med bisulfit-behandlat DNA har dock flera fallgropar, såsom ofullständiga omvandlingar av ometylerade cytosiner till uracil, partisk förstärkning av sekvenser och sekvensering fel8.
I metylering-specifik sondamplifiering (MSPA), sonder som består av två oligonukleotider mål DNA-sekvenser som innehåller en begränsning siten (GCGC) för metylering-känsliga begränsningsenzym HhaI9. Efter sonderna hybridisera till DNA, varje prov är uppdelad i två uppsättningar. Sonder i den första uppsättningen genomgår ligering, medan sonder i den andra uppsättningen genomgår ligering följt av HhaI-medierad matsmältning vid ometylerade CGCG platser. Båda uppsättningarna av prover förstärks sedan av PCR, och produkterna separeras med kapillärelektrofores. Sonder på ometylerade platser smälts av HhaI och förstärks inte under PCR, vilket resulterar i några toppsignaler. Däremot är sonder på metylerade platser skyddade mot matsmältningoch förstärks därför under PCR, därefter genererar toppsignaler10.
MSPA har flera fördelar jämfört med alternativa metoder. För det första kräver det en låg mängd DNA (50–100 ng) och är väl lämpad för analys av DNA från formalinfixat paraffininbäddade prover10. Det kräver inte bisulfit-behandlat DNA; I själva verket är det olämpligt för DNA som ändras på detta sätt. Många prover kan analyseras samtidigt, och MSPA-sonder kan utformas så att de riktar sig till flera gener eller sekvenser samtidigt. Dessutom är sonderna specifika och känsliga för metylerad DNA eftersom HhaI-begränsningsplatsen motsvarar en sekvens som är typisk för CpG-öarna10.
Denna studie undersökte effekterna av osteosarkom (OS)-härledda extracellulära blåsor (EVs) på LINE-1 metylering i fettvävnad-härledda mesenkymala stamceller (AT-MSCs; figur 1). EVs är nanoskala, membran-bundna blåsor utsöndras av de flesta celltyper. De bär proteiner, lipider, mRNA, microRNA och ytterligare molekyler från moderceller11,12. EVs förmedlar intercellulär kommunikation och spelar viktiga roller i flera patofysiologiska förhållanden13,14. En färsk studie visade att cancer-härledda EVs kan överföra aktiv LINE-1 till mottagare celler15. Det har tidigare rapporterats att EVs från HOS-143B cellinjen kan ändra metylering status LINE-1 i MSCs, utöver andra genetiska effekter16.
När celler odlas för EV isolering, är det viktigt att använda EV-utarmat fetalt nötkreatur serum [FBS] i tillväxtmediet, eftersom FBS-härledda EVs kan störa EVs från andra källor och hämma resultaten17,18. Ultracentrifugering är en av de vanligaste metoderna för utarmning av EVs från FBS. Det är ett relativt enkelt och kostnadseffektivt förfarande jämfört med alternativ som ultrafiltrering och kommersiella EV-utarmat FBS19. Här visar protokollet också hur man förbereder EV-utarmat FBS genom ultracentrifugering.
Denna artikel presenterar ett detaljerat protokoll för ovannämnda tekniker, från isolering av EVs från en OS-cellinje till metylering analys av LINE-1 i OS-EV behandlade MSCs(figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien godkändes av Helsingfors och Nylands universitets etikkommitté (etiskt godkännande D. nr 217/13/03/02/2015).
1. Beredning av EV-utarmat FBS genom ultracentrifugering
- Ta FBS i (ultra)centrifugrör och placera dem i ultracentrifughinkar. För att säkerställa att ultracentrifugeringen går smidigt och säkert, balansera skoporna inom 10 mg från varandra.
- Ladda skoporna på en svängande rotor (typ SW28, k-faktor 246). Placera rotorn i ultracentrifugen och kör på 100 000 x g i 19 timmar vid 4 °C.
- Samla försiktigt det ljusa övre lagret av supernatant (cirka nio tiondelar) och överför till ett 50 mL-rör. Stör ej eller pipette den mörkbruna pelleten, eftersom den innehåller EVs från FBS.
- Passera supernatanten genom ett 0,22 μm filter till ett nytt 50 ml-rör.
- Lägg till den filtrerade, EV-utarmat FBS i cellodlingsmedia när du odlar celler för EV-isolering.
2. Isolering av osteosarkomhärledda eVs
- Platta OS-celler (HOS-143B cellinje) i en T-175 kolv med RPMI 1640 medium, kompletterat med 10% normal FBS och 1% antibiotika (100 U/ml penicillin, 0,1 mg/ml streptomycin). Placera kolven i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
- När kolven är 70%–80% konfluent, tvätta cellerna med fosfatbuffrad koks (PBS) sedan odla dem i media som innehåller 10% EV-utarmat FBS (nedan kallat EV-utarmat medium).
OBS: 1 x 106 HOS-143B-celler pläterade i en T175-kolv når 70% sammanflödet efter ca 60 timmar. - Under de närmaste 48 h, samla in konditionerade medier från osteosarkom celler efter varje 24 h och tillsätt färska EV utarmat media.
- Centrifug de konditionerade medierna vid 2500 x g i 20 min vid 4 °C för att avlägsna celler och cellskräp. Överför supernatanten till ett nytt rör och lämnar runt 2 ml media längst ner.
Obs! Om inte direkt fortsätter med EV isolering i detta skede, kan supernatant lagras på -80 oC. - Häll supernatant i ultracentrifugrör och balansera dem som tidigare. Centrifugrören vid 100 000 x g i 2 timmar vid 4 °C.
- Kassera försiktigt supernatanten och lämna runt 1 ml längst ner. Tillsätt försiktigt cirka 20 ml PBS (0,1 μm) till röret och pipetten för att tvätta och omförd EV-pelleten.
- Balansera rören och utför ytterligare en omgång ultracentrifugering med samma inställningar.
- Ta försiktigt bort supernatanten och omfördela EV-pelleten i 200 μl PBS genom skonsam rörledningar. Förvara eVs i lågbindningsrör.
OBS: Elfordon kan användas omedelbart eller annars lagras i -80 °C tills de behövs.
3. Karakterisering av OS-EVs
OBS: Renade EVs kan kännetecknas av västra blotting (WB), nanopartikel spårninganalys (NTA), och överföring elektronmikroskopi (TEM)16.
- Utför WB enligt standardprotokoll16 med EV-markörerna CD63, TSG101 och Hsp70 och med calnexin som en negativ kontroll för att indikera renhet för EV-provet20.
- För NTA spädförst EV-provet i 0,1 μm filtrerat Dulbeccos PBS för att erhålla (helst) 30–100 partiklar per ram.
- Ta cirka 500 μl av provet i en 1 ml spruta och lasta den i nta-instrumentets inloppsport. Kontrollera att det finns tillräckligt med partiklar per ram, för exakta mätningar.
- Öppna NTA-programvaran och spela in fem videor med 60-talets varaktighet, med kameranivå 13 vid omgivningstemperatur. Under analysen, använd detektionströskel = 5 och vinst = 10.
- Analysera EV-prover av TEM enligt beskrivningen tidigare21.
4. AT-MSC kultur
OBS: Mänsklig fettvävnad för mesenkymala stamceller isolering tillhandahölls som fettsugning aspirate (Institutionen för plastikkirurgi, Laser Tilkka Ltd., Finland). Skriftligt informerat samtycke togs från lipoaspirate givare, som genomgick valbara fettsugning förfaranden.
- Isolera AT-MSCs från fettsugning aspirates med standard mekaniska och enzymatiska isoleringsmetoder22.
OBS: MSC från andra källor (inklusive kommersiella cellinjer) kan också användas. - Kulturceller i DMEM/F-12 media kompletteras med 10% FBS och 1% antibiotika.
5. Behandling av MSCs med OS-EVs
- Platta 15.000 AT-MSCs per brunn i en 24 brunnsplatta.
- Efter 24 h, ta bort det gamla mediet, tvätta celler med PBS och byt till EV-utarmat medium.
- Behandla celler med OS-EVs (vid en partikelkoncentration på 1 x 106 EVs per cell) dag 1 (24 h efter cellvidhäftning), dag 3 (48 h efter dag 1) och dag 5 (96 h efter dag 1).
- Stoppa OS-EV-behandlingen för timepoint (TP) 0-prover dag 1, TP 3-prover na dag 3 och TP 7 prover na dag 7 (48 timmar efter dag 5).
OBS: Andra tidspunktsscheman enligt försöksplanerna kan också följas.
- Stoppa OS-EV-behandlingen för timepoint (TP) 0-prover dag 1, TP 3-prover na dag 3 och TP 7 prover na dag 7 (48 timmar efter dag 5).
- Extrahera DNA från MSCs med hjälp av en lämplig metod. Inkludera positiva och negativa kontrollexempel för dataanalysen.
6. LINE-1 metylering analys
- Designa de anpassade LINE-1-sondens primers, som tidigare gjorts av Pavicic et al.23. För metyleringssonder väljer du tre sekvenser som innehåller HhaI-begränsningsplatsen inom promotorn i LINE-1. För kontrollsonder väljer du sju sekvenser som saknar HhaI-begränsningsplatsen från resten av LINE-1-sekvensen.
OBS: LINE-1-sekvensen finns tillgänglig i GenBank-databasen24 (L1.2, anslutningsnr. AH005269.2). Använd MSPA-tillverkarens anvisningar för att utforma sonderna25. - Späd 70 ng DNA-prov i TE-buffert till en 5 μL-volym.
- Utför efterföljande termocykel- och PCR-steg enligt tabell 1. Värm provexemplaren i 10 min vid 98 °C och kyl sedan till 25 °C.
- Tillsätt 3 μL sondhybridiseringsmix till varje prov och kör termocykeln så att sonderna kan hybridisera till DNA: t.
- Vid rumstemperatur (RT), tillsätt 13 μL post-hybridisering mix till varje prov. Överför 10 μL till ett andra rör.
- Placera båda röruppsättningarna i termocykeln och inkubera vid 48 °C i minst 1 min.
- Medan proverna är på 48 °C, tillsätt 10 μL av ligeringsblandningen till den första uppsättningen rör (osmält serie) och 10 μL av ligationsrötblandningen till den andra uppsättningen rör (smält serie). Kör nästa termocykelprogram.
- Snurra ner rören och ställ samtidigt in termocykeltorn till 72 °C.
- Tillsätt 5 μL polymerasblandning till varje rör och placera rören i termocykeltorn. Kör PCR-programmet.
- När PCR-programmet körs, förbered en lösning på 1 ml formamid som innehåller 2,5 μL storleksstandard. Pipett10 μL av denna lösning till varje brunn av en optisk 96 brunnsplatta (med streckkod).
- Efter PCR, späd osmälta och smälta prover till 1:100 och 1:200 respektive i ultrarent vatten. Tillsätt 2 μL utspädd PCR-produkt till 96-brunnsplattan. Centrifugplattan vid 200 x g i 15–20 s för att avlägsna luftbubblor.
- Utför fragmentanalys av prover genom kapillärelektrofores.
OBS: Plattan ska förvaras vid 4 °C i mörker tills analysen.
7. Analys av fragmentdata
- Öppna kapillärelektroforesen resulterar i en elektropherogramanalysprogramvara.
- Välj MLPA på menyn för ett av exemplen under panelens kolumn. Klicka på panelhuvudet och tryck på Ctrl+D för att tillämpa MLPA på alla prover.
- På samma sätt ställer du in analysmetoden till Microsatellite standard för alla prover.
- Markera alla exempel och klicka på knappen Grön uppspelning för att analysera exemplen enligt de valda inställningarna.
- Markera alla exempel och klicka på knappen Diagram för att visualisera avsökningstopparna.
- Zooma in på toppområdet för högre upplösning av de enskilda sondtopparna. Se till att alla 10 toppar som motsvarar sonderna från LINE-1-sonden-mixen är märkta. Kassera ytterligare toppar (<95 bp och >160 bp).
- Exportera resultaten i CSV-formatet (kommaavgränsade värden) på fliken Genotyper.
- Öppna CSV-filen i en dataanalysprogramvara och sortera data i kolumner.
- Märk de tre metylationsstället toppar baserat på deras ungefärliga storlekar (L1-1m vid 153 bp, L1-2m vid 119 bp, L1-3m på 133 bp). De återstående sju topparna motsvarar kontrollsonderna.
OBS: Här används värden för L1-2m sond toppar, som har en storlek på 117 bp, eftersom regionen har använts i de flesta LINE-1 metylering analyser23. - För varje prov (osmält och smält), beräkna summan toppområdet för alla sju kontrolltoppar. Dela toppområdet för varje LINE-1-sond med denna summa.
- För varje DNA-prov, dela värdet av det smälta provet genom att det osmälta provet för att erhålla metyleringdoseringsförhållandet (DM)med hjälp av följande ekvation:
Var: DM är metylering doseringsförhållande, Ax är området under topp x (t.ex. L1-2m topp), och Enctrl är summan toppområde av alla sju kontroll sonder.
- Märk de tre metylationsstället toppar baserat på deras ungefärliga storlekar (L1-1m vid 153 bp, L1-2m vid 119 bp, L1-3m på 133 bp). De återstående sju topparna motsvarar kontrollsonderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Huvudsyftet med denna studie var att utvärdera de epigenetiska effekterna av OS-EVs på MSCs. OS-EVs isolerades från HOS-143B celler med hjälp av standard differentialcentrifugering metod. Uttryck för de typiska EV markörer CD63, Hsp70 och TSG101 av västra blotting bekräftade förekomsten av OS-EVs. (figur2A). Avsaknad av calnexin signal anges renhet OS-EV isolat. Ytterligare renhet observerades med TEM, med intakta blåsor av olika storlekar som förekommer(figur 2B). Den genomsnittliga partikelkoncentrationen av OS-EV var 7,63x1011/ml (figur 2C). Storleksfördelningen av EVs varierade från 50–500 nm, med cirka 80 % av partiklarna som ligger inom intervallet 50–200 nm (figur 2D).
AT-MSCs behandlades med OS-EVs och DNA extraherades från MSCs vid olika tidpunkter. LINE-1 metylering analyserades av MS-MLPA och beräknades i form av metylering doseringsförhållande. Resultaten från TP 0 användes för att bestämma utgångsmetyltionsnivåerna (streckad linje) (figur 3). Vid TP 3 (gröna kolumner) observerades en minskning av genomsnittlig t.o.m. metyleringskvot i GENOMSNITTLIGA MINST POLYITETER vid behandling med OS-EVs, som omfattas av utgångsvärdet för metylering. Detta hypometylerande fenomen var mer subtilt vid TP 7 (blå kolumner), och den genomsnittliga metylering doseringförhållandet var något högre i både obehandlade och EV-behandlade MSCs jämfört med baslinjen.
Figur 1: Experimentellt arbetsflöde. EVs isolerades från HOS-143B celler genom differentiell centrifugering och kännetecknas av västra blotting, TEM och NTA. AT-MSCs behandlades med OS-EVs vid olika tidpunkter (TP 0, 3, en 7). DNA extraherades från MSCs och LINE-1 metylering analyserades av MSPA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Karakterisering av EVs. (A) Förekomsten av EV-markörerna CD63, Hsp70 och TSG101 bekräftade förekomsten av EVs genom västerländsk blotting, medan inga band observerades för calnexin, vilket indikerar renheten hos EV-isolatet. 10 μg protein laddades för både HOS-143B protein lysate och OS-EVs. B) TEM bekräftade förekomsten av intakta eVs av olika storlekar i isolatet. c) Partikelkoncentration och D-storleksfördelning av OS-Elnät fastställdes genom NTA-mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Metylering doseringsförhållanden av LINE-1 från MSCs antingen obehandlade eller behandlas med OS-EVs. Den streckade grå linjen representerar utgångsvärdet för metylering, motsvarande TP 0-värden. Gröna kolumner representerar genomsnittliga metylering doseringsförhållanden utan och med OS-EV behandling för TP 3 prover, medan blå kolumner representerar samma för TP 7 prover. Både TP 3 och TP 7 prover visade en minskning av metylering nivåer efter behandling med OS-EVs. Skillnaden var dock större i TP 3-prover, där metyleringsnivån efter EV-behandling också var lägre än utgångsvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: MSPA-reagensblandningsrecept och thermocycler/PCR-program. De nämnda volymerna representerar ett DNA-prov. Det bör noteras att polymerasblandningen bör förberedas för 2x så många prover som tidigare blandningar, eftersom det finns två uppsättningar rör i detta skede. Uppgifter om det efterföljande termocykel- eller PCR-programmet finns till höger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie visar hur MSPA kan användas för att upptäcka och kvantifiera metyleringstatus en specifik genetisk faktor. LINE-1 var fokus här, men sonderna kan utformas för att rikta en rad gener och sekvenser. Dessutom finns det en växande lista över sondblandningar tillgängliga för olika applikationer. MSPA är en enkel och robust teknik för DNA-metyleringanalys som inte kräver bisulfitkonvertering10. Den fullständiga proceduren från provförberedelse till dataanalys tar cirka 2 dagar men omfattar bara 4–5 h faktiskt praktisk t.o.m. Det är tillämpligt för små mängder DNA (så lågt som 70 ng), vilket framgår här.
Den viktigaste delen av metylering analysprotokollet är beredningen av anpassade sond-blandningar, såsom LINE-1 sond-mix i denna studie. På grund av deras olika längder syntetiserades LINE-1-sonden oligonukleotider i intervallet 4–40 nM, så upplösningssteget och efterföljande utspädningar måste utföras noggrant, enligt tillverkarens instruktioner25. PCR och flera termocykelprogram av protokollet som används här skiljer sig från dem i den ursprungliga tillverkarens version.
Det finns några försiktighetsåtgärder i samband med HhaI-enzymet. För det första beror den enzymvolym som används i ligeringsnedbrytningsblandningen på tillverkaren, och versioner av enzymet som är resistenta mot värmeinaktivering är inte lämpliga för MSPA. Med vissa enzymer kan det finnas fall av ofullständig matsmältning, vilket skulle resultera i bildandet av felaktiga PCR-produkter och avvikande toppsignaler. Slutligen beror i vilken utsträckning de slutliga PCR-produkterna späds ut för kapillärelektrofores beroende av sonderna. Inledande körningar kommer sannolikt att innebära optimeringar, för vilka det rekommenderas att testa en rad utspädningar.
Det finns vissa begränsningar av MSPA, såsom den selektiva karaktären av HhaI-medierad DNA-matsmältning. Hha (född 1966 Jag klyver DNA endast vid ometylerade GCGC sekvenser och bortser från andra fall av CpG dinucleotides som inte är inneslutna av ett G och C, även om de är belägna inom CpG öar. Som ett resultat kan metyleringstatus för sådana dinucleotides (och de som ligger utanför målsekvensen för sonderna) inte bestämmas. LINE-1-sonden-mix kan omfatta fler sonder som innehåller ytterligare GCGC-sekvenser från promotorn region24,vilket representerar ett större antal metylering platser.
Alternativt kan andra metylationsspecifika restriktionsenzymer, såsom SacII och MluI, som har en annan begränsningsplats än HhaI dessutom användas i MSPA, vilket kan ge en bredare representation av globala metyleringsnivåer26. För det andra, som observerats med TP 7 prover, skillnaderna i metylering doseringsförhållande kan vara ganska subtila. Detta kan bero på det höga kopieringsantalet LINE-1s i genomet5, som har höga nivåer av global metylering under normala förhållanden och kommer till stor del att påverkas av transienta hypometylering händelser i endast ett fåtal CPG platser. Dessutom är de msc heterogena när det gäller olika stadium och cellcykeln, vilket kan påverka utgångsvärdet för metylering. Slutligen kan MSPA bara upptäcka relativa skillnader i DNA-metylering och kräver referensprover av denna anledning. I sådana fall kan metoder som direkt upptäcker lokal metylering vara lämpligare, även om de kan kräva bisulfitomvandlingssteg27.
Eftersom denna studie omfattade användning av extracellulära blåsor, visade vi också beredningen av EV-utarmat FBS, som är en viktig del av cellkultur media för EV isolering. Ultracentrifugering är en billig process som effektivt kan skilja EVs från resten av FBS. Emellertid gör 19 h centrifugering det en mer tidskrävande metod än alternativ, såsom ultrafiltration och kommersiella versioner19. Ultracentrifugering kräver också noggrann hantering av provet, till exempel vid balansering av rören före centrifugering och insamling av supernatant efteråt. Trots dessa utmaningar är det en populär metod för att skilja EVs från biologiska vätskor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Helsingfors universitet projektfinansiering (WBS490302, WBS73714112) Helsingfors universitetssjukhus Statlig finansiering för universitetsforskning på universitetsnivå (Y1014SUL05, TYH2016130), Finsk-norska medicinska stiftelsen, och Selma och Maja-Lisa Selander-fonden (Minervastiftelsen). Vi tackar Walter Pavicic för att ha lämnat det ändrade MSPA-protokollet och för relaterad teknisk support. Vi är tacksamma mot Teemu Masalin (Helsingfors universitet) för att hjälpa oss med videoproduktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
- Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Cancer Research. 66, 8462 (2006).
- Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
- Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
- Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
- Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).
- El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
- Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
- Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris". Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
- Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
- Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
- Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).
- Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
- Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
- L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000).
- Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. , Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018).
- Takara Bio Inc. , Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018).
- Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).
