Summary
De gehele 3D-structuur en cellulaire inhoud van organoïden, evenals hun fenotypische gelijkenis met het oorspronkelijke weefsel kan worden vastgelegd met behulp van de single-cell resolutie 3D imaging protocol hier beschreven. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala van organoïden variërend in oorsprong, grootte en vorm.
Abstract
Organoid technologie, in vitro 3D culturing van miniatuurweefsel, heeft een nieuw experimenteel venster geopend voor cellulaire processen die orgaanontwikkeling en functie evenals ziekteregelen. Fluorescentie microscopie heeft een belangrijke rol gespeeld bij het karakteriseren van hun cellulaire samenstelling in detail en het aantonen van hun gelijkenis met het weefsel waar ze vandaan komen. In dit artikel presenteren we een uitgebreid protocol voor hoge resolutie 3D-beeldvorming van hele organoïden op immunofluorescente etikettering. Deze methode is op grote schaal van toepassing voor beeldvorming van organoïden die verschillen in oorsprong, grootte en vorm. Tot nu toe hebben we de methode toegepast op luchtweg, dikke darm, nieren en leverorganoïden afkomstig van gezond menselijk weefsel, evenals menselijke borsttumor organoïden en muis borstklier organoïden. We maken gebruik van een optische clearing agent, FUnGI, die de verwerving van hele 3D-organoïden met de mogelijkheid voor eencellige kwantificering van markers mogelijk maakt. Dit driedaagse protocol van organoïde oogsten tot beeldanalyse is geoptimaliseerd voor 3D-beeldvorming met behulp van confocale microscopie.
Introduction
De vooruitgang van nieuwe cultuurmethoden, zoals organoïde technologie, heeft de cultuur van organen in een gerecht1mogelijk gemaakt. Organoïden groeien uit tot driedimensionale (3D) structuren die hun weefsel van oorsprong ressemble als ze behouden fenotypische en functionele eigenschappen. Organoïden zijn nu instrumenteel voor het aanpakken van fundamentele biologische vraagstukken2, het modelleren van ziekten, waaronder kanker3, en het ontwikkelen van gepersonaliseerde behandelingsstrategieën4,5,6,7. Sinds het eerste protocol voor het genereren van organoïden afkomstig van darmvolle volwassen stamcellen8, is organoïde technologie uitgebreid met een breed scala aan gezonde en kankerweefsels afkomstig van organen, waaronder prostaat9,hersenen10, lever11,12, maag13, borst14,15, endometrium16, speekselklier17, smaakknop18, alvleesklier19, en nier20.
De ontwikkeling van organoïden is eens met de opkomst van nieuwe volumetrische microscopietechnieken die de architectuur van hele mount weefsel in 3D21,22,23,24kunnen visualiseren . 3D-beeldvorming is superieur aan traditionele 2D-weefselsectiebeeldvorming bij het visualiseren van de complexe organisatie van biologische specimens. 3D-informatie blijkt essentieel te zijn voor het begrijpen van cellulaire samenstelling, celvorm, cel-lot beslissingen en cel-cel interacties van intacte biologische monsters. Niet-destructieve optische sectionietechnieken, zoals confocale of multi-foton laser scanning microscopie (CLSM en MLSM) en light sheet fluorescentie microscopie (LSFM), maken nu de gecombineerde visualisatie van zowel fijne details, evenals algemene weefselarchitectuur, binnen een enkel biologisch exemplaar mogelijk. Deze krachtige beeldvormingsbenadering biedt de mogelijkheid om de structurele complexiteit te bestuderen die kan worden gemodelleerd met organoïden25 en de ruimtelijke verdeling, fenotypische identiteit en cellulaire toestand van alle afzonderlijke cellen die deze 3D-structuren samenstellen in kaart te brengen.
Onlangs publiceerden we een gedetailleerd protocol voor hoge resolutie 3D-beeldvorming van vaste en gewiste organoïden26. Dit protocol is speciaal ontworpen en geoptimaliseerd voor de verwerking van delicate organoïde structuren, in tegenstelling tot methodologieën voor grote intacte weefsels zoals DISCO27,28, CUBIC29,30,31en CLARITY32,33. Als zodanig is deze methode over het algemeen van toepassing op een breed scala van organoïden die verschillen in oorsprong, grootte en vorm en cellulaire inhoud. Bovendien, in vergelijking met andere volumetrische beeldvorming protocollen die vaak aanzienlijke tijd en moeite vereisen, ons protocol is niet veeleisend en kan worden voltooid binnen 3 dagen. We hebben ons 3D-beeldvormingsprotocol toegepast om de architectuur en cellulaire samenstelling van nieuw ontwikkelde organoïde systemen afgeleid van verschillende weefsels te visualiseren, waaronder menselijke luchtwegen34,nier20,lever11en orgaanoïden voor borstkanker bij de mens15. In combinatie met veelkleurige fluorescerende lijntracering is deze methode ook gebruikt om de biopotentie van basale cellen in borstorganoïden van muizen te onthullen14.
Hier verfijnen we het protocol door de invoering van de niet-toxische clearing agent FUnGI35. FUnGI clearing wordt bereikt in een enkele incubatiestap, is gemakkelijker te monteren vanwege de viscositeit, en beter behoudt fluorescentie tijdens de opslag. Daarnaast introduceren we natrium dodecylsulfaat (SDS) in de wasbuffer om nucleaire vlekken te verbeteren, evenals een siliconen montagemethode voor eenvoudige diapreparaat voorafgaand aan microscopie. Figuur 1 geeft het grafische overzicht van het protocol(figuur 1A) en voorbeelden van 3D-beeldorganoïden (figuur 1B−D). Kortom, organoïden worden teruggewonnen uit hun 3D-matrix, vast en immunolabeled, optisch gewist, afgebeeld met behulp van confocale microscopie en vervolgens 3D weergegeven met visualisatiesoftware.
Protocol
Het gebruik van door muizen afgeleide organoïden voldeed aan de wettelijke normen en werd goedgekeurd door het Walter and Eliza Hall Institute (WEHI) Animal Ethics Committee. Alle menselijke organoïde monsters werden opgehaald uit biobanken via de Hubrecht Organoid Technology (HUB, www.hub4organoids.nl). De Commissie Medisch-Ethische Zorg van het UMC Utrecht (METC UMCU) heeft op verzoek van het HUB vergunningen verkregen om ervoor te zorgen dat de Wet op het Medisch Onderzoek Human Subjects wordt nageleefd en waar nodig geïnformeerde toestemming werd verkregen van donoren.
1. Bereiding van reagentia
- Om 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) voor te bereiden, verwarmt u 400 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot iets minder dan 60 °C in een waterbad. Voeg 20 g PFA poeder toe en los op met een roerder.
- Voeg vervolgens een paar druppels van 10 M NaOH. Laat afkoelen op ijs en voeg een paar druppels van 10 M HCl toe om de pH aan te passen aan 7,4. Herla boven PBS tot 500 mL en aliquot (winkel op -20 °C voor maximaal 2 maanden).
LET OP: Verwarm niet boven de 60 °C om afbraak van de PFA te voorkomen. Bereidingstijd = 4 uur.
- Voeg vervolgens een paar druppels van 10 M NaOH. Laat afkoelen op ijs en voeg een paar druppels van 10 M HCl toe om de pH aan te passen aan 7,4. Herla boven PBS tot 500 mL en aliquot (winkel op -20 °C voor maximaal 2 maanden).
- Voeg 1 mL Tween-20 tot 1 L PBS (PBT) (0,1% v/v) toe om PBS voor te bereiden (bewaar maximaal 4 weken bij 4 °C).
LET OP: Bereidingstijd = 10 min. - Voeg 18,6 g EDTA en 2,5 g NaOH toe aan 80 m L2O. Pas de pH aan op 8 met 1 M NaOH en vul tot 100 mL met dH2O.
- Los 60,55 g Tris op met 42 mL geconcentreerd (36-38%) HCl in 300 mL dH2O. Pas de pH aan op 8 en vul tot 500 mL.
- Voeg voor het opstellen van organoïde wasbuffer (OWB) 1 mL Triton X-100, 2 mL van 10% (w/v) SDS en 2 g runderserumalbumine (BSA) toe aan 1 L PBS (opslag op 4 °C tot 2 weken).
LET OP: Bereidingstijd = 10 min. - Om 220 mL FUnGI te maken, meng je 110 mL glycerol met 20 mL dH2O, 2,2 mL Tris buffer (1 M, pH 8.0) en 440 μL EDTA (0,5 M). Voeg 50 g fructose toe en meng bij kamertemperatuur (RT) in het donker tot ze zijn opgelost. Voeg bij helder 49 g fructose toe en meng tot ze zijn opgelost. Voeg vervolgens 33,1 g ureum toe en meng tot het is opgelost (bewaar op 4 °C in het donker).
LET OP: Verwarm niet als fructose karameliseert bij hogere temperaturen. FUnGI bestaat uit 50% (v/v) glycerol, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 m tris base, 1,1 mM EDTA, 2,5 M fructose en 2,5 M ureum. Bereidingstijd = 1 dag. - Los 1 g BSA op in 100 mL PBS (opslag bij 4 °C tot 2 weken).
LET OP: Bereidingstijd = 10 min.
2. Herstel van organoïden
OPMERKING: De volgende stappen zijn van toepassing op organoïden gekweekt in keldermembraanextract (BME) die gekweekt zijn in een 24 putplaat met een grootte van 100−500 μm.
- Aspirate de cultuur medium en was 1x met ijskoude PBS. Vermijd het verstoren van de 3D-matrix.
- Leg de plaat op ijs en voeg 1 mL ijskoude celterugwinningsoplossing(Tabel van materialen)toe aan elke put. Incubeer 30−60 min bij 4 °C op een horizontale shaker (40 rpm).
LET OP: De 3D-matrixdruppels moeten volledig worden opgelost. - Coat een 1 mL pipettip met BSA door 1% PBS-BSA in te dompelen en 2x op en neer te pipetten. Deze coating voorkomt dat organoïden aan de punt kleven. Om de binnenzijde van een 15 mL conische buis te coaten, vul je met 5 mL van 1% PBS-BSA, omkeren 2−3x en gooi je de PBS-BSA weg.
LET OP: Deze coating is nodig voor alle plastic verbruiksartikelen tot fixatie (stap 3.3). - Met behulp van een gecoate punt, voorzichtig resuspend de inhoud van de put 5−10x en breng de organoïden naar gecoate 15 mL buizen. Organoïden uit verschillende putten met dezelfde identiteit kunnen in dezelfde buis worden samengevoegd.
- Voeg 1 mL ijskoude 1% PBS-BSA toe aan elke cultuur om alle organoïden te spoelen en te verzamelen.
- Voeg koude PBS toe aan 10 mL en draai 3 min naar beneden bij 70 x g en 4 °C om een strakke pellet te verkrijgen zonder een zichtbare laag 3D-matrix. Verwijder voorzichtig de supernatant.
3. Fixatie en blokkering
- Resuspend de organoïden voorzichtig opnieuw op in 1 mL ijskoude PFA met een gecoate 1 mL-tip.
- Bevestig op 4 °C gedurende 45 minuten. Voorzichtig resuspend de organoïden halverwege de fixatie tijd met behulp van een gecoate 1 mL tip om zelfs fixatie tussen alle organoïden te garanderen.
- Voeg 10 mL ijskoude PBT toe aan de buis, meng voorzichtig door de buis om te keren, 10 minuten uit te broeden en draai naar beneden bij 70 x g,beide bij 4 °C.
LET OP: Vanaf deze stap is het coaten van tips over het algemeen niet nodig omdat de meeste organoïde types niet aan de tip kleven na fixatie. Echter, sommige organoïden kunnen vereisen gecoate kunststoffen, zelfs na fixatie. - Blokkeer de organoïden door de pellet opnieuw in te brengen in ijskoude OWB (ten minste 200 μL OWB per put) en breng de organoïden over op een 24 putophangplaat.
OPMERKING: Organoïden van één grote pellet kunnen over meerdere putten worden gesplitst om verschillende kleuringen uit te voeren. - Incubeer bij 4 °C gedurende ten minste 15 minuten.
4. Immunolabeling
- Pipette 200 μL van OWB in een lege put om goed als referentie te dienen.
OPMERKING: De immunolabeling kan ook worden uitgevoerd in 48- of 96-putten platen om het gebruik van antilichamen te verminderen. De gebruiker moet zich er echter van bewust zijn dat zowel de kleurings- als de wasprestaties kunnen worden verminderd vanwege het kleinere volume. - Laat de organoïden zich op de bodem van de plaat nestelen.
OPMERKING: Dit kan worden gecontroleerd met behulp van een stereomicroscoop en wordt gemakkelijker gemaakt met behulp van een donkere achtergrond. - Kantel de plaat 45° en verwijder OWB waardoor de organoïden in 200 μL van OWB achter blijven (gebruik de referentieput om 200 μL te schatten).
- Voeg 200 μL OWB toe met primaire antilichamen 2x geconcentreerd (bijvoorbeeld E-cadherin [1:400] en Ki67 [1:200] voor resultaten in figuur 1; keratine 5 [1:500], keratine 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], en Ki67 [1:200] voor resultaten in figuur 2) en 's nachts uitbroeden bij 4 °C terwijl hij licht schommelt/schudt (40 rpm op horizontale shaker).
- De volgende dag, voeg 1 mL van OWB.
- Laat de organoïden zich 3 min op de bodem van de plaat nestelen. Verwijder OWB waardoor 200 μL in de plaat. Voeg 1 mL OWB toe en was 2 uur met mild schommelen/schudden.
- Herhaal stap 4.6 nog twee keer.
- Laat de organoïden zich 3 min op de bodem van de plaat nestelen. Verwijder OWB waardoor 200 μL in de put.
- Voeg 200 μL OWB toe met secundaire antilichamen, geconjugeerde antilichamen en kleurstoffen 2x geconcentreerd (bijvoorbeeld DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], muis-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] voor resultaten in figuur 1 ; AF555 [1:500], phalloïde-AF647 [1:100] voor resultaten in figuur 1; DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], konijn-AF555 [1:500], muis-AF555 [1:500], falloidin-AF647 [1:100] voor resultaten in figuur 2; DAPI [1:1000], phalloidin-AF647 [1:100] voor resultaten in figuur 3) en incubeer 's nachts bij 4 °C terwijl hij licht schommelt/schudt.
- De volgende dag herhaalt u stap 4,5−4.7.
- Breng de organoïden over op een buis van 1,5 mL en draai 3 min op 70 x g.
5. Optische clearing van organoïden
- Verwijder de OWB zoveel mogelijk door te pipetten zonder de organoïden te verstoren.
- Voeg FUnGI (ten minste 50 μL, RT) toe met behulp van een 200 μL-tip met het uiteinde afgesneden en voorzichtig opnieuw op te sluiten om bellenvorming te voorkomen. Incubeer bij RT voor 20 min.
OPMERKING: Optische clearing door FUnGI kan leiden tot kleine weefselkrimp. Dit heeft geen invloed op de algemene morfologie van monolaage en gelaagde organoïden; echter, bolvormige monolaag organoïden met grote lumen kunnen instorten. Het protocol kan hier worden onderbroken en monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 °C (gedurende ten minste 1 week) of bij -20 °C (gedurende ten minste 6 maanden).
6. Diavoorbereiding voor confocale beeldvorming
- Bereid een spuit van 10 mL met een siliconen kit(Tabel van materialen). Bevestig een punt van 200 μL en snijd het uiteinde af om een zachte stroom van de viskeuze siliconen mogelijk te maken na het indrukken van de spuit. Gebruik de spuit om een rechthoek van 1 cm x 2 cm te tekenen in het midden van een dia.
- Snijd het uiteinde van een 200 μL-tip af en breng de organoïden in FUnGI naar het midden van de rechthoek.
- Plaats er een coverslip op. Om gevangen luchtbellen te minimaliseren, plaatst u eerst de linkerkant van de coverslip en laat u het deklip van links naar rechts langzaam zakken totdat er geen gevangen lucht is en laat u vervolgens de coverslip los.
OPMERKING: Afstandhouders die simililar in grootte aan de organoïden kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat ze worden beschadigd. - Druk voorzichtig op alle randen van de coverslip om het stevig vast te maken aan de siliconen kit. De glijbaan is nu klaar voor beeldvorming.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken en het monster kan worden opgeslagen bij 4 °C (gedurende ten minste 1 week) of -20 °C (gedurende ten minste 6 maanden).
7. Beeldverwerving en -verwerking
- Met behulp van een confocale laser scanning microscoop(Tabel van materialen), beeld de dia met een multi- onderdompeling 25x of olie onderdompeling 40x doelstelling voor confocale beeldvorming.
- Gebruik de volgende acquisitie-instellingen voor de 25x-doelstelling: scanmodusframe, framegrootte 1024 x 1024, voxelmaat 332 nm x 332 nm x 1,2 μm, pixeltijd <2 μs, bidirectioneel scannen, gemiddeld nummer 1, bitdiepte 8. Om fotobleaching te verminderen, gebruikt u een laag laservermogen (<5% in het algemeen, <10% voor zwakke kleuring).
- Gebruik de Z-stack-modus om de onder- en bovengrenzen te definiëren en de Z-stapgrootte optimaal in te stellen. Wanneer u grote organoïdenstructuren of meerdere organoïden samen beeldvorming geeft, gebruikt u de tegelmodus met 10% overlap en geeft u het interessegebied aan.
OPMERKING: Met deze instellingen is de gegevensgrootte voor een typische organoïde met een diameter van <300 μm <1 GB.
- Voor tegelscan datasets, steek de imaging bestanden in de software vergezeld van de microscoop(Tabel van materialen). Selecteer in de sectie verwerking de optie Stiksels als methode, kies Nieuwe uitvoer onder parameters en selecteer het bestand dat u wilt borduren. Druk op Toepassen om te beginnen met borduren.
- Verkrijg een 3D-gerenderde weergave van de beeldvorming onder het tabblad 3D-weergave in de beeldsoftware(Tabel van materialen)en optimaliseer vervolgens de helderheid, contrasterende en 3D-renderingeigenschappen. Rgb-momentopnamen van de resultaten exporteren als TIFF-bestanden.
Representative Results
Imaging organoïden in 3D maakt visualisatie van architectuur, cellulaire samenstelling en intracellulaire processen tot in detail mogelijk. De gepresenteerde techniek is niet veeleisend en kan vermoedelijk worden toegepast op een breed scala van organoïde systemen die zijn afgeleid van verschillende organen of gastheersoorten.
De sterkte van 3D-beeldvorming in vergelijking met 2D-beeldvorming wordt geïllustreerd door beelden van muizenklierklierorganoïden die werden gegenereerd met behulp van recent gepubliceerde methoden14. De centrale laag van deze organoïden bestaat uit kolomvormige K8/K18-positieve luminale cellen en de buitenste laag bevat langwerpige K5-postive basale cellen (Figuur 2A), die de morfologie van de borstklier in vivo recapituleert. Deze gepolariseerde organisatie is een uitdaging om te waarderen van een 2D optische sectie van diezelfde organoïde(Figuur 2B, middenpaneel). Een ander voorbeeld van een complexe structuur die onmogelijk te interpreteren is zonder 3D-informatie is het netwerk van MRP2-positieve canaliculi dat het verzamelen van galvloeistof van menselijke leverorganoïden11 (figuur 2B) vergemakkelijkt. Dit illustreert hoe onze methode visualisatie van essentiële structurele kenmerken van organoïden mogelijk maakt. Bovendien zorgt de verkregen kwaliteit en resolutie voor semi-geautomatiseerde segmentatie en beeldanalyse. Zo kunnen de totale celaantallen en de aanwezigheid van markers worden gekwantificeerd in specifieke cellulaire subtypen in hele organoïden. We illustreren dit door de kernen van een hele organoïde met 140 cellen te segmenteren, waarvan 3 cellen een hoge positiviteit vertonen voor de Ki67-celcyclusmarkering(figuur 2C). Het DAPI-kanaal wordt geselecteerd als bronkanaal en segmenten worden gegenereerd op basis van een intensiteitsdrempelstap en een boldiameter van 10 μm. Het aanraken van objecten worden gesplitst per regio die groeit van zaadpunten. Ten slotte wordt een groottefilter van 10 voxels toegepast om kleine ruisgeïnduceerde segmenten te verwijderen. Voor elk segment dat een kern vertegenwoordigt, wordt de gemiddelde intensiteit van het Ki67-kanaal vervolgens geëxporteerd voor plotten.
Onlangs hebben we het optische clearing agent FUnGI35ontwikkeld, dat we nu in dit protocol hebben geïntegreerd om de transparantie van de organoïden te verfijnen. FUnGI is gemakkelijk te gebruiken, omdat clearing gemakkelijk wordt bereikt door een enkele incubatiestap na immunofluorescente kleuring. Een bijkomend voordeel van het middel is de viscositeit, waardoor het gemakkelijker is voor monsterbehandeling tijdens het monteren van de dia. Fluorescerende monsters in FUnGI behouden hun fluorescentie, zelfs wanneer ze meerdere maanden bij -20 °C worden bewaard. We tonen aan dat FUnGI beter presteert dan onduidelijke en fructose-glycerol in fluorescerende signaalkwaliteit diep in de organoïde(figuur 3A,B),en dat FunGI-goedgekeurde organoïden over het algemeen een verbeterde fluorescentieintensiteit hebben in vergelijking met onduidelijke organoïden(figuur 3C).
Samengevat beschrijven we een niet-veeleisende, reproduceerbare 3D-beeldvormingstechniek voor het verkrijgen van volumetrische gegevens van immunolabeled organoïden. Dit protocol kan gemakkelijk worden gebruikt om een verscheidenheid aan organoïden beeld, waaronder die van zowel muis-en menselijke oorsprong, van gezonde en ziekte modellen. De eenvoudige monstervoorbereiding kan worden aangepast om confocale, multi-foton en lichtblad fluorescerende microscopen te vergemakkelijken om cellulaire aan subcellulaire resolutie van volledige organoïden te verkrijgen.
Figuur 1: Schematisch overzicht van het 3D-beeldvormingsprotocol met hoge resolutie. Organoïden worden teruggevonden uit hun 3D matrix. Fixatie en blokkering wordt uitgevoerd voordat immunolabeling met antilichamen en kleurstoffen. Optische clearing wordt bereikt in een enkele stap met behulp van de FUnGI clearing agent. 3D-rendering van beelden kan worden uitgevoerd met behulp van imaging software. aA) Schematisch overzicht van de procedure. (B) Gewist geheel gemonteerde 3D confocale beeld van een menselijke colonische organoïde immunolabeled voor F-actine en E-cadherine (E-cad) (25x olie doelstelling). Schaalbalk = 40 μm. (C) Gewist geheel monteren 3D confocale afbeelding. Schaalbalk = 20 μm. (D) Vergroot optisch gedeelte van een menselijke colonne organoïde immunolabeled voor F-actine, E-cadherine (E-cad) en Ki67 (25x oliedoelstelling). Schaalbalk = 5 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Dekkers et al.26. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Volumetric imaging visualiseert complexe 3D-architectuur. Confocale afbeeldingen die 3D-gegevenssets (linkerpaneel), 2D-optische secties (middenpaneel) en 3D-gebieden van een vergroot gebied (rechterpaneel) vertegenwoordigen. (A) Een organoïde die is afgeleid van één basale cel van de muizenklier die de 3D-organisatie illustreert van langwerpige borstbasiscellen die luminale cellen omringen of zijn gelabeld voor K8/18, K5 en F-actine (fructose-glycerolclearing; 25x oliedoelstelling). Schaalbalken vertegenwoordigen 55 μm (linkerpaneel) en 40 μm (middelste en rechterpanelen). (B) Een menselijke foetale leverorganoïde met een complex 3D-netwerk van MRP2-positieve canaliculi, gelabeld voor DAPI, MRP2 en F-actin (fructose-glycerol clearing; 40x olie doelstelling). Schaalbalken vertegenwoordigen 25 μm (linkerpaneel) en 8 μm (middelste en rechterpanelen). (C) Confocale 3D hele-mount beeld van een menselijke foetale lever organoïde gelabeld met DAPI en Ki67 (linker paneel) en een gesegmenteerde afbeelding op de DAPI kanaal met behulp van imaging software (middenpaneel). Schaalbalk = 15 μm. Grafiek uitgezet die de Ki67 gemiddelde intensiteit vertegenwoordigt in alle cellen (DAPI-gesegmenteerd) van de gehele organoïde (140 cellen) (rechterpaneel). Dit cijfer is gewijzigd van Dekkers et al.26. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Optische clearing van organoïden met FUnGI. (A) Representatieve afbeeldingen van menselijke colonneorganoïden met het label F-actin (groen) en DAPI (grijs) en afgebeeld zonder clearing, gerooid met fructose-glycerol of gerooid met FUnGI (25x oliedoelstelling). Linkerpaneel: 3D-weergave van de organoïde. Rechterpaneel: optische sectie van de organoïde op 150 μm diepte. Voor de "no clearing" voorwaarde moest de helderheid van het beeld worden verhoogd in vergelijking met de "fructose-glycerol" en "FUnGI" voorwaarden om de organoïde te visualiseren. Schaalbalk = 50 μm. (B) Niet-lineaire regressie past de afname van de DAPI-intensiteit met toenemende Z-diepte voor verschillende optische clearingmethoden. Waarden vertegenwoordigen intensiteiten van individuele cellen gedetecteerd door DAPI-segmentatie en worden genormaliseerd tot de gemiddelde DAPI-intensiteit van de eerste 50 μm van de organoïde. Om onderschatting van de demping veroorzaakt door helderdere cellen op de diepere randen en ontluikende structuren te voorkomen, werden alleen de centrumgebieden van de organoïden geanalyseerd. (C) Drie organoïden per aandoening van vergelijkbare grootte en diepte naar de coverslip werden afgebeeld met behulp van identieke microscoop instellingen. De volledige 3D-datasets waren eencellige gesegmenteerd op DAPI signaal voor vergelijking. Staafgrafiek met gemiddelde DAPI-intensiteit met verschillende clearingmethoden op volledig gesegmenteerde gegevenssets. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Waarden zijn intensiteiten van >3800 afzonderlijke cellen gedetecteerd door DAPI-segmentatie. = p < 0,0001, Kruskal-Wallis test met tweezijdige Dunn's meervoudige vergelijking post-hoc testen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Hier hebben we een gedetailleerd protocol voorgesteld voor 3D-beeldvorming van intacte organoïden met eencellige resolutie. Om dit protocol succesvol uit te voeren, moeten enkele kritieke stappen worden genomen. In dit gedeelte lichten we deze stappen uit en zorgen we voor probleemoplossing.
De eerste kritieke stap is het verwijderen van de 3D-matrix. De meeste organoïden worden in vitro gepropageerd met het gebruik van matrices die de in vivo extracellulaire omgeving nabootsen om de vorming van goed gepolariseerde 3D-structuren te verbeteren. Fixeren en daaropvolgende kleuring binnen de 3D-matrix is mogelijk, maar kan nadelig zijn voor de penetratie van antilichamen of kan een hoog achtergrondsignaal genereren (gegevens niet getoond). Efficiënte verwijdering van rijpheden kan worden beïnvloed door het type matrix, de hoeveelheid en grootte van de organoïden en langdurige kweek. Daarom kan optimalisatie nodig zijn voor verschillende cultuuromstandigheden. Voor organoïden die in Matrigel of BME worden gekweekt, volstaat een stap van 30−60 minuten in ijskoude celhersteloplossing om de matrix op te lossen zonder de organoïden te beschadigen. Bovendien kan het verwijderen van de ondersteunende 3D-matrix leiden tot verlies van inheemse structuren en verstoring van organoïde contacten met andere celtypen, bijvoorbeeld wanneer organoïden worden gecoculedeerd met fibroblasten of immuuncellen. Bovendien is een optimale organoïde fixatie cruciaal voor het behoud van 3D-weefselarchitectuur, eiwitantigeneiteit en het minimaliseren van autofluorescentie. De bevestiging van 45 min met 4% PFA bij 4 °C is normaal gesproken voldoende voor het etiketteren van een breed scala aan organoïden en antigenen. Echter, een langere fixatie stap, tot 4 uur, is meestal meer geschikt voor organoïden uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten, maar zal optimalisatie vereisen voor verschillende fluoroforen. Fixatietijden korter dan 20 min zijn onvoldoende om F-actin goed te labelen met phalloidin probes. Een ander veel voorkomend probleem is het verlies van organoïden tijdens het protocol. Het is daarom belangrijk om (i) voorzichtig pipettips en -buizen met 1% BSA-PBS te coaten, zoals beschreven bij het hanteren van niet-gemonteerde organoïden om te voorkomen dat ze aan kunststof blijven plakken, (ii) laaghangende of ophangplaten gebruiken om het monster te voorkomen dat het aan de plaat kleeft, en (iii) de organoïden voldoende tijd geven om zich aan de onderkant van de plaat te vestigen voordat buffers voorzichtig worden verwijderd. Pipetterviscous FUnGI kan bellen introduceren. Het hanteren van het gewiste monster bij RT vermindert de viscositeit en verbetert het gebruiksgemak, waardoor het verlies van organoïden wordt geminimaliseerd. Terwijl de meeste organoïden zijn gemakkelijk te hanteren, cystische organoïden met een vergrote lumen hebben een hoge neiging om in te storten bij de vaststelling met 4% PFA of wanneer gewist met FUnGI. Dit effect kan worden verminderd, maar niet volledig voorkomen, door een ander fixatief te gebruiken (bijvoorbeeld formaline of PFA-glutaraldehyde). Dit kan echter mogelijk gevolgen hebben voor autofluorescentie, antilichaampenetratie en beschikbaarheid van epitoop. Wanneer cystische organoïden na het opruimen gevouwen verschijnen, wordt geadviseerd om de clearingstap en het beeld over te slaan door multi-fotonmicroscopie, die minder wordt belemmerd door lichtverstrooiing. Ten slotte kan het verkrijgen van de gehele 3D-structuur van organoïden uitdagend zijn en vereist minimale afstand tussen coverslip en organoïde. Bovendien, wanneer organoïden ruimte hebben om te bewegen in hun montagemiddel, kan dit resulteren in X- en Y-verschuivingen tijdens het opnemen van gegevens in Z-diepte. Het gebruik van minder siliconen kit tijdens de dia voorbereiding kan oplossen suboptimale montage tussen coverslip en microscoop dia. Echter, te weinig siliconen kan leiden tot organoïde compressie en verlies van hun inherente 3D-structuur. FUnGI verbetert de handling voor slide montage en stabiliteit van organoïden tijdens de beeldvorming, vanwege de hogere viscositeit.
Hoewel dit protocol kan worden gebruikt voor een breed scala aan toepassingen om in de diepte cellulaire inhoud en 3D-architectuur van intacte organoïden te bestuderen, moeten bepaalde beperkingen worden overwogen. Deze methodologie is vrij laag-doorvoer en tijdrovend. Gebruikers moeten er namelijk rekening mee houden dat het beeldvorming van grote intacte organoïden in 3D zowel tegelvorming als monsterverwerving in Z vereist, wat leidt tot langdurige acquisitietijden. Snellere beeldvorming kan worden bereikt door gebruik te maken van microscoopelementen, waaronder resonerende of draaiende schijfscanner, of door lichtbladmicroscooptechnologie26. Een andere overweging is dat markers heterogeen kunnen worden uitgedrukt tussen verschillende organoïden uit hetzelfde monster. Daarom moeten meerdere organoïden worden aangeschaft om deze organoïde heterogeniteit beter in cultuur vast te leggen. Ten slotte, terwijl de volledige natte lab procedure is eenvoudig, nabewerking van gegevens vereist vaardigheden in beeldanalyse software voor 3D-visualisatie en kwantificering, evenals statistieken voor de mijnbouw alle informatie aanwezig in de dataset.
In de afgelopen tien jaar is het gebied van volumebeeldvorming sterk gevorderd, zowel door de ontwikkeling van een breed scala aan optische clearingagents als verbeteringen in microscopie en computationele technologieën27,30,31. Terwijl in het verleden de meeste studies gericht op grote volume beeldvorming van organen of geassocieerde tumoren, meer recent methoden voor kleinere en meer kwetsbare weefsels, met inbegrip van organoïde structuren, zijn ontwikkeld36,37,38. We publiceerden onlangs een eenvoudige en snelle methode voor het imaging van hele-mount organoïden van verschillende oorsprong, grootte en vorm op het niveau van één cel voor de volgende 3D-rendering en beeldanalyse26, die we hier gepresenteerd met een aantal verbeteringen (bijvoorbeeld, FUnGI, siliconen montage) en vergezeld van een videoprotocol. Deze methode is superieur aan conventionele 2D-sectiegebaseerde beeldvorming bij het ontcijferen van complexe celmorfologie en weefselarchitectuur(figuur 2)en eenvoudig te implementeren in laboratoria met een confocale microscoop. Met lichte aanpassingen aan het protocol, kunnen de monsters compatibel worden gemaakt met, super-resolutie confocale, multi-foton en lichtplaat imaging, waardoor dit protocol op grote schaal toepasbaar en biedt gebruikers met een krachtig instrument om beter te begrijpen van de multidimensionale complexiteit die kan worden gemodelleerd met organoïden.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn erg dankbaar voor de technische ondersteuning van het Prinses Máxima Centrum voor Kinderoncologie en het Hubrecht Instituut en Zeiss voor beeldvormingsondersteuning en samenwerkingen. Alle beelden werden uitgevoerd in het beeldcentrum van prinses Máxima. Dit werk werd financieel ondersteund door het Prinses Máxima Centrum voor Kinderoncologie. JFD werd ondersteund door een Marie Curie Global Fellowship en een VENI subsidie van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO). ACR werd ondersteund door een europese raad (ERC) startsubsidie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| 2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
| Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
| Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
| Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
| Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
| Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
| Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
| Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
| Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
| Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
| Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
| Imaris software | Bitplane | ||
| Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
| Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
| E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
| Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
| Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
| Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
| MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
| Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
| Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
| Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
| Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
| Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
| Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Workstation | Dell |
References
- Sato, T., Clevers, H. Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Bartfeld, S., Stem Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), 84 (2016).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Nanki, K., et al. Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
- Jamieson, P. R., et al. Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics. Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Maimets, M., et al. Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. SnapShot: Tissue Clearing. Cell. 171 (2), 496 (2017).
- Rios, A. C., et al. Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation. Nature Communications. 7, 11400 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kubota, S. I., et al. Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 20, 236-250 (2017).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Rios, A. C., et al. Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging. Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).
- Chen, Y., et al. Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues. The Scientific World Journal. 2013, 624342 (2013).
- Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, 166884 (2019).
