Summary
Hela 3D-struktur och cellulära innehållet av organoider, liksom deras fenotypiska likhet med den ursprungliga vävnaden kan fångas med hjälp av encells upplösning 3D-bildframställning protokollet beskrivs här. Detta protokoll kan tillämpas på ett brett spektrum av organoider varierande ursprung, storlek och form.
Abstract
Organoid teknik, in vitro 3D-kulturing av miniatyr vävnad, har öppnat ett nytt experimentellt fönster för cellulära processer som styr organutveckling och funktion samt sjukdom. Fluorescensmikroskopi har spelat en stor roll i att karakterisera deras cellulära sammansättning i detalj och visar deras likhet med den vävnad de härstammar från. I den här artikeln presenterar vi ett omfattande protokoll för högupplösta 3D-bildbehandling av hela organoider på immunofluorescerande märkning. Denna metod är allmänt tillämplig för bildbehandling av organoider som skiljer sig i ursprung, storlek och form. Hittills har vi tillämpat metoden på luftvägar, kolon, njure och leverorganoider som härrör från frisk mänsklig vävnad, samt mänskliga brösttumörorganoider och musbröstkörtelorganoider. Vi använder ett optiskt clearingmedel, FUnGI, som möjliggör förvärv av hela 3D-organoider med möjlighet till encellig kvantifiering av markörer. Detta tre dagars protokoll från organoid skörd till bildanalys är optimerad för 3D-avbildning med hjälp av konfokalmikroskopi.
Introduction
Utvecklingen av nya kulturmetoder, såsom organoid teknik, har möjliggjort kultur av organ i en maträtt1. Organoider växer till tredimensionella (3D) strukturer som ressemble deras vävnad av ursprung som de bevara fenotypiska och funktionella egenskaper. Organoider är nu avgörande för att ta itu med grundläggandebiologiska frågor 2, modellering sjukdomar inklusive cancer3, och utveckla personliga behandlingsstrategier4,5,6,7. Sedan det första protokollet för att generera organoider som härrör från intestinala vuxna stamceller8, organoid teknik har utvidgats till att omfatta ett brett spektrum av friska och cancervävnader som härrör från organ inklusiveprostata 9, hjärnan10, lever11,12, mage13, bröst14,15, endometrium16, spottkörtel17, smaklök18, bukspottkörteln19, ochnjure 20.
Utvecklingen av organoider har instämt med ökningen av nya volumetriska mikroskopi tekniker som kan visualisera arkitekturen av hela montera vävnad i 3D21,22,23,24. 3D-avbildning är överlägsen traditionella 2D vävnad avsnitt imaging i visualisera den komplexa organisationen av biologiska exemplar. 3D-information visar sig vara avgörande för att förstå cellulär sammansättning, cellform, cell-öde beslut och cell-cell interaktioner av intakta biologiska prover. Icke-förstörande optisk snittning tekniker, såsom confocal eller multi-foton laser scanning mikroskopi (CLSM och MLSM) och ljus blad fluorescens mikroskopi (LSFM), nu möjliggöra en kombinerad visualisering av både fina detaljer, liksom allmän vävnad arkitektur, inom en enda biologisk exemplar. Denna kraftfulla bildframställning tillvägagångssätt ger möjlighet att studera den strukturella komplexiteten som kan modelleras med organoider25 och kartlägga den rumsliga fördelningen, fenotypiska identitet och cellulära tillstånd för alla enskilda celler komponera dessa 3D-strukturer.
Nyligen publicerade vi ett detaljerat protokoll för högupplöst 3D-avbildning av fasta och rensade organoider26. Detta protokoll är särskilt utformad och optimerad för bearbetning av känsliga organoid strukturer, i motsats till metoder för stora intakta vävnader såsom DISCO27,28, CUBIC29,30,31, och CLARITY32,33. Som sådan är denna metod i allmänhet tillämplig på en mängd olika organoider som skiljer sig i ursprung, storlek och form och cellulärt innehåll. Vidare, jämfört med andra volymetriska bildprotokoll som ofta kräver avsevärd tid och ansträngning, är vårt protokoll kravlös och kan slutföras inom 3 dagar. Vi har tillämpat vår 3D-bildbehandling protokoll för att visualisera arkitektur och cellulär sammansättning av nyutvecklade organoid system som härrör från olika vävnader, inklusive human airways34,njure 20, lever11, och mänskliga bröstcancer organoider15. I kombination med flerfärgad fluorescerande härstamning spårning, denna metod har också använts för att avslöja biopotensen av basala celler i mus bröstorganoider14.
Här förfinar vi protokollet genom att införa det giftfria clearingagenten FUnGI35. FUnGI-röjning uppnås i ett enda inkubationssteg, är lättare att montera på grund av sin viskositet, och bevarar bättre fluorescens under lagring. Dessutom introducerar vi natrium dodecyl sulfat (SDS) till tvättbufferten för att förbättra nukleära färgningar samt en silikonbaserad monteringsmetod för enkel glidberedning före mikroskopi. Figur 1 ger den grafiska översikten av protokollet (Bild 1A) och exempel på 3D-avbildade organoider (Bild 1B−D). Kort sagt, organoider återvinns från sin 3D-matris, fasta och immunolabeled, optiskt rensas, avbildas med hjälp av konfokalmikroskopi och sedan 3D återges med visualisering programvara.
Protocol
Användning av mus-härledda organoider överensstämmer med lagstadgade normer och godkändes av Walter och Eliza Hall Institute (WEHI) Animal Ethics Committee. Alla humana organoidprover hämtades från biobanker genom Hubrecht Organoid Technology (HUB, www.hub4organoids.nl). Tillstånd erhölls av den medicinska etiska kommittén för UMC Utrecht (METC UMCU) på begäran av HUB för att säkerställa efterlevnaden av den nederländska lagen om medicinsk forskning som involverar människor och informerat samtycke erhölls från givare när det var lämpligt.
1. Beredning av reagenser
- För att förbereda 4% (w/v) paraformaldehyd (PFA), värm 400 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till knappt 60 °C i ett vattenbad. Tillsätt 20 g PFA-pulver och lös upp med hjälp av en omrörare.
- Därefter tillsätt några droppar av 10 M NaOH. Låt svalna på is och tillsätt några droppar på 10 M HCl för att justera pH-värdet till 7,4. Fylla på med PBS till 500 mL och alikvot (förvara vid -20 °C i upp till 2 månader).
OBS: Värm inte över 60 °C för att undvika nedbrytning av PFA. Tillredningstid = 4 h.
- Därefter tillsätt några droppar av 10 M NaOH. Låt svalna på is och tillsätt några droppar på 10 M HCl för att justera pH-värdet till 7,4. Fylla på med PBS till 500 mL och alikvot (förvara vid -20 °C i upp till 2 månader).
- För att förbereda PBS med Tween-20 (PBT) (0,1% v/v), tillsätt 1 mL Tween-20 till 1 L av PBS (förvara vid 4 °C i upp till 4 veckor).
OBS: Tillredningstid = 10 min. - För att förbereda 100 mL 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA), tillsätt 18,6 g EDTA och 2,5 g NaOH till 80 mL av dH2O. Justera pH till 8 med 1 M NaOH och fyll till 100 mL med dH2O.
- För att förbereda 500 mL av 1 M Tris, lös 60,55 g Tris med 42 mL koncentrerat (36−38%) HCl i 300 mL av dH2O. Justera pH-värdet till 8 och fyll till 500 mL.
- För att förbereda organoid tvättbuffert (OWB), tillsätt 1 mL triton X-100, 2 mL på 10% (w/ v) SDS och 2 g bovint serumalbumin (BSA) till 1 L av PBS (förvara vid 4 °C upp till 2 veckor).
OBS: Tillredningstid = 10 min. - För att göra 220 mL FUnGI, blanda 110 mL glycerol med 20 mL av dH2O, 2,2 mL Tris buffert (1 M, pH 8.0) och 440 μL av EDTA (0,5 M). Tillsätt 50 g fruktos och blanda i rumstemperatur (RT) i mörkret tills den är upplöst. När klar, tillsätt 49 g fruktos och blanda tills upplöst. Tillsätt sedan 33,1 g urea och blanda tills den är upplöst (förvaras i 4 °C i mörker).
OBS: Värm inte som fruktoskaramelliserar vid högre temperaturer. FUnGI består av 50% (v/v) glycerol, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 mM tris bas, 1,1 mM EDTA, 2,5 M fruktos och 2,5 M urea. Tillredningstid = 1 dag. - För att förbereda PBS-BSA (1% w/v), lös 1 g BSA i 100 mL PBS (förvara vid 4 °C upp till 2 veckor).
OBS: Tillredningstid = 10 min.
2. Organoid återhämtning
OBS: Följande steg gäller för organoider som odlas i extrakt från källarmembran (BME) som odlades i en 24 brunnsplatta med en storlek på 100−500 μm .
- Aspirera odlingsmediet och tvätta 1x med iskall PBS. Undvik att störa 3D-matrisen.
- Lägg plattan på is och tillsätt 1 mL iskall cellåtervinningslösning (Table of Materials) till varje brunn. Inkubera 30−60 min vid 4 °C på en horisontell skakmaskin (40 varv/min).
OBS: 3D-matrisdropparna ska vara helt upplösta. - Täck en 1 mL pipettspets med BSA genom att doppa i 1% PBS-BSA och pipettering upp och ner 2x. Denna beläggning kommer att förhindra organoider från att hålla sig till spetsen. För att belägga den inre sidan av ett 15 mL koniskt rör, fyll med 5 mL på 1% PBS-BSA, invertera 2−3x och kassera PBS-BSA.
OBS: Denna beläggning är nödvändig för alla förbrukningsvaror av plast fram till fixering (steg 3.3). - Med hjälp av en överdragen spets, försiktigt återbetal innehållet i brunnen 5−10x och överföra organoiderna till belagda 15 mL rör. Organoider från olika brunnar med samma identitet kan poolas i samma rör.
- Tillsätt 1 mL iskall 1% PBS-BSA till varje kultur väl att skölja och samla alla organoider.
- Tillsätt kall PBS till 10 mL och snurra ner i 3 min vid 70 x g och 4 °C för att få en tät pellet utan ett synligt lager av 3D-matris. Ta försiktigt bort supernatanten.
3. Fixering och blockering
- Försiktigt resuspend organoiderna i 1 mL av iskall PFA med hjälp av en belagd 1 mL spets.
- Fixera vid 4 °C i 45 min. Försiktigt resuspend organoiderna halvvägs genom fixeringstiden med hjälp av en belagd 1 mL spets för att säkerställa jämn fixering bland alla organoider.
- Tillsätt 10 mL iskall PBT till röret, blanda försiktigt genom att vända på tuben, inkubera i 10 min och snurra ner i 70 x g, båda vid 4 °C.
OBS: Från detta steg och framåt beläggning av tips i allmänhet inte behövs eftersom de flesta organoidtyper inte fastnar på spetsen efter fixering. Vissa organoider kan dock kräva belagda plaster även efter fixering. - Blockera organoiderna genom att återutgöra pelleten i iskall OWB (minst 200 μL OWB per brunn) och överför organoiderna till en 24 brunnsfjädringsplatta.
OBS: Organoider från en stor pellet kan delas över flera brunnar för att utföra olika färgningar. - Inkubera vid 4 °C i minst 15 min.
4. Immunmärkning
- Pipett 200 μL OWB i en tom brunn för att fungera som referens brunn.
OBS: Den immunmärkning kan också utföras i 48- eller 96-brunnar plattor för att minska antikroppsanvändning. Användaren bör dock vara medveten om att både färgning och tvättprestanda skulle kunna minskas på grund av den mindre volymen. - Låt organoiderna bosätta sig i botten av plattan.
OBS: Detta kan kontrolleras med hjälp av ett stereomikroskop och underlättas genom att använda en mörk bakgrund. - Luta plattan 45° och ta bort OWB som lämnar organoiderna i 200 μL av OWB (använd referensvälvan för att uppskatta 200 μL).
- Tillsätt 200 μL OWB med primära antikroppar 2x koncentrerade (t.ex., E-cadherin [1:400] och Ki67 [1:200] för resultat i figur 1; keratin 5 [1:500], keratin 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], och Ki67 [1:200] för resultat i figur 2) och inkubera över natten vid 4 °C medan milt gunga/skaka (40 varv/min på horisontell skakmaskin).
- Nästa dag, tillsätt 1 mL OWB.
- Låt organoiderna lägga sig i botten av plattan i 3 min. Ta bort OWB lämnar 200 μL i plattan. Tillsätt 1 mL OWB och tvätta 2 h med mild gungning/skakning.
- Upprepa steg 4,6 två gånger till.
- Låt organoiderna lägga sig i botten av plattan i 3 min. Ta bort OWB lämnar 200 μL i brunnen.
- Tillsätt 200 μL OWB med sekundära antikroppar, konjugerade antikroppar och färgämnen 2x koncentrerade (t.ex., DAPI [1:1000], råtta-AF488 [1:500], mus-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] för resultat i figur 1; DAPI [1:1000], råtta-AF488 [1:500], kanin-AF555 [1:500], mus-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] för resultat i figur 2; DAPI [1:1000], phalloidin-AF647 [1:100] för resultat i figur 3) och inkubera över natten vid 4 °C medan milt gunga/skaka.
- Nästa dag upprepar du steg 4.5−4.7.
- Överför organoiderna till ett 1,5 mL-rör och snurra ner i 70 x g i 3 min.
5. Optisk röjning av organoider
- Ta bort så mycket som möjligt OWB genom pipettering utan att störa organoiderna.
- Tillsätt FUnGI (minst 50 μL, RT) med hjälp av en 200 μL-spets med änden avskuren och återanvänd försiktigt för att förhindra att bubbla bildas. Inkubera vid RT i 20 min.
OBS: Optisk gläntning av FUnGI kan orsaka mindre vävnadskrympning. Detta kommer inte att påverka den allmänna morfologin av monolayered och flerskiktade organoider; dock sfäriska formade monolayered organoider med stora lumens kan kollapsa. Protokollet kan pausas här och prover kan förvaras vid 4 °C (i minst 1 vecka) eller vid -20 °C (i minst 6 månader).
6. Bildförberedelse för konfokal avbildning
- Förbered en 10 mL spruta med ett silikontätningsmedel (Table of Materials). Fäst en 200 μL spets och skär av änden för att möjliggöra ett skonsamt flöde av det viskösa silikonet efter att sprutan tryckts. Använd sprutan för att rita en rektangel på 1 cm x 2 cm mitt i en rutschkana.
- Skär av änden på en 200 μL-spets och överför organoiderna i FUnGI till mitten av rektangeln.
- Placera ett täckskydd ovanpå. För att minimera fångade luftbubblor, placera den vänstra sidan av coverslip först, sedan långsamt sänka täckskydd från vänster till höger tills det inte finns någon instängd luft och sedan släppa coverslip.
OBS: Distanser som är simililar i storlek till organoiderna kan användas för att förhindra att de skadas. - Tryck försiktigt på alla täckkanter för att ordentligt fästa den på silikontätningsmedlet. Bilden är nu klar för avbildning.
OBS: Protokollet kan pausas här och provet kan förvaras vid 4 °C (i minst 1 vecka) eller -20 °C (i minst 6 månader).
7. Bildanskaffning och -bearbetning
- Med hjälp av en confocal laserscanning mikroskop (Tabell of Materials), bild bilden bilden av bilden med en multi- nedsänkning 25x eller olja nedsänkning 40x mål för confocal imaging.
- Använd följande förvärvsinställningar för 25x-målsättningen: bildningslägesramen, bildrutestorlek 1024 x 1024, voxel-storlek 332 nm x 332 nm x 1,2 μm, pixelvältstid <2 μs, dubbelriktad skanning, genomsnittsnummer 1, bitdjup 8. För att minska fotoblekning, använd låg lasereffekt (<5% i allmänhet, <10% för svag färgning).
- Använd läget Z-stack för att definiera de nedre och övre gränserna och ange att Z-stegs storlek ska vara optimal. När imaging stora organoid strukturer eller flera organoider tillsammans, använda plattsättning läge med 10% överlappning och ange området av intresse.
OBS: Med dessa inställningar är datastorleken för en typisk organoid med en diameter på <300 μm <1 GB.
- För kakel skanna dataset, sy bildframställning filer i programvaran tillsammans med mikroskopet (Tabell of Materials). I avsnittet bearbetning väljer du Stitching som metod, välj Ny utmatning under parametrar och välj filen som ska sy ihop. Tryck på Verkställ för att börja sy.
- Få en 3D-återgiven representation av bildåtergivningen under fliken 3D-vy i bildhanteringsprogrammet (Table of Materials) och därefter optimera egenskaperna för ljusstyrka, kontrast och 3D-rendering. Exportera RGB-ögonblicksbilder av resultaten som TIFF-filer.
Representative Results
Bilddiagnostikorganoider i 3D möjliggör visualisering av arkitektur, cellulär sammansättning samt intracellulära processer i stor detalj. Den presenterade tekniken är kravlös och kan förmodligen tillämpas på ett brett spektrum av organoidsystem som härrör från olika organ eller värdarter.
Styrkan i 3D-avbildning jämfört med 2D-avbildning illustreras av bilder av mus bröstkörtelorganoider som genererades med hjälp av nyligen publicerade metoder14. Det centrala skiktet av dessa organoider består av columnarformade K8/K18-positiva luminalceller och det yttre lagret innehåller avlånga K5-postiva basala celler (Figur 2A), som rekapitulerar morfologin hos bröstkörteln in vivo. Denna polariserade organisation är utmanande att uppskatta från en 2D optisk sektion av samma organoid (Figur 2B, mitten panel). Ett annat exempel på en komplex struktur som är omöjlig att tolka utan 3D-information är nätverket av MRP2-positiva canaliculi som underlättar insamlingen av gallvätskan hos humana leverorganoider11 (Figur 2B). Detta exemplifierar hur vår metod tillåter visualisering av väsentliga strukturella funktioner av organoider. Den erhållna kvaliteten och upplösningen möjliggör dessutom halvautomatisk segmentering och bildanalys. Således kan totala cellnummer och förekomst av markörer kvantifieras i specifika cellulära subtyper i hela organoider. Vi illustrerar detta genom att segmentera kärnorna i en hel organoid som innehåller 140 celler, varav 3 celler visar hög positivitet för Ki67 cellcykelmarkör (Figur 2C). DAPI-kanalen väljs som källkanal, och segment genereras baserat på ett intensitetströsksteg och en sfärdiameter på 10 μm. Rörande objekt delas efter region växer från fröpunkter. Slutligen, en storlek filter på 10 voxels tillämpas för att ta bort små brus inducerad segment. För varje segment som representerar en kärna exporteras sedan medelintensiteten i Ki67-kanalen för plottning.
Vi utvecklade nyligen den optiska clearing agenten FUnGI35, som vi nu integrerat i detta protokoll för att förfina insynen i organoider. FUnGI är lätt att använda, eftersom clearing lätt uppnås genom ett enda inkubationssteg efter immunofluorescerande färgning. En extra fördel med medlet är dess viskositet, vilket underlättar för provhantering vid glidmontering. Fluorescerande prover i FUnGI bevarar sin fluorescens även när de förvaras i flera månader vid -20 °C. Vi visar att FUnGI överträffar otydliga och fruktos-glycerol i fluorescerande signalkvalitet djupt i organoiden (Figur 3A,B), och att FunGI-rensade organoider har övergripande förbättrad fluorescensintensitet jämfört med oklara organoider (Figur 3C).
Sammanfattningsvis beskriver vi en undemanding, reproducerbara 3D-bildteknik för att förvärva volymetrisk data av immunolabeled organoider. Detta protokoll kan lätt användas för att avbilda en mängd olika organoider inklusive de av både mus och mänskligt ursprung, från friska och sjukdomsmodeller. Den okomplicerade provberedningen kan anpassas för att underlätta konfokala, multi-foton och ljus ark fluorescerande mikroskop för att erhålla cellulära till subcellulära upplösning av hela organoider.
Bild 1: Schematisk översikt över det högupplösta 3D-bildprotokollet. Organoider återvinns från sin 3D-matris. Fixering och blockering utförs före immunolabeling med antikroppar och färgämnen. Optisk clearing uppnås i ett enda steg med hjälp av FUnGI-clearingagenten. 3D-rendering av bilder kan utföras med hjälp av bildhanteringsprogram. (A) Schematisk översikt över förfarandet. (B) Rensas hela-montera 3D confocal bild av en mänsklig colonic organoid immunolabeled för F-aktin och E-cadherin (E-cad) (25x olja mål). Skala bar = 40 μm. (C) Rensas hela-montera 3D konfokal bild. Skalstång = 20 μm. (D) Förstorad optisk sektion av en human colonic organoid immunolabeled för F-aktin, E-cadherin (E-cad) och Ki67 (25x olja mål). Skala bar = 5 μm. Denna siffra har modifierats från Dekkers et al.26. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Volymetrisk bildtagning visualiserar komplex 3D-arkitektur. Konfokala bilder som representerar 3D-datauppsättningar med hela fattning (vänster panel), optiska 2D-sektioner (mellanpanelen) och 3D-områden i en förstorad region (höger panel). (A) En organoid som härrör från en enda basalcell i musen bröstkörtel som illustrerar 3D-organisation av långsträckta bröst basala celler som omger luminalceller eller märkt för K8/18, K5 och F-aktin (fruktos-glycerol clearing; 25x olja mål). Skalstreck representerar 55 μm (vänster panel) och 40 μm (mellan- och högerpaneler). (B) En human fetal lever organoid med ett komplext 3D-nätverk av MRP2-positiva canaliculi, märkt för DAPI, MRP2 och F-aktin (fruktos-glycerol clearing; 40x olja mål). Skalstreck representerar 25 μm (vänster panel) och 8 μm (mellan- och högerpaneler). (C) Confocal 3D helhet-montera bild av en människa fetala lever organoid märkt med DAPI och Ki67 (vänster panel) och en segmenterad bild på DAPI kanal med hjälp av bildframställning programvara (mellanpanelen). Skala bar = 15 μm. Graf plottad som representerar Ki67-medelintensiteten i alla celler (DAPI-segmenterade) av hela organoiden (140 celler) (höger panel). Denna siffra har modifierats från Dekkers et al.26. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Optisk röjning av organoider med FUnGI. (A) Representativa bilder av humana koloniska organoider märkta med F-aktin (grön) och DAPI (grå) och avbildade utan röjning, rensas med fruktos-glycerol eller rensas med FUnGI (25x oljemål). Vänster panel: 3D-rendering av organoiden. Höger panel: optisk-avsnitt av organoid på 150 μm djup. För "ingen clearing" skick ljusstyrkan på bilden måste ökas i jämförelse med "fruktos-glycerol" och "FUnGI" villkor för att visualisera organoid. Skalstång = 50 μm. (B) Ickelinjär regressionspassning som visar minskningen av DAPI-intensitet med ökande Z-djup för olika optiska clearingmetoder. Värden representerar intensiteter av enskilda celler som detekterats av DAPI segmentering och normaliseras till den genomsnittliga DAPI-intensiteten hos de första 50 μm av organoiden. För att undvika underskattning av dämpningen som orsakas av ljusare celler på de djupare kanterna och spirande strukturer, var endast centrum regionerna av organoiderna analyseras. (C) Tre organoider per villkor av liknande storlek och djup mot coverslip avbildades med hjälp av identiska mikroskop inställningar. De fullständiga 3D-datauppsättningarna var encelliga segmenterade på DAPI-signal för jämförelse. Stapeldiagram som visar genomsnittlig DAPI-intensitet med olika clearingmetoder på fullständiga segmenterade datauppsättningar. Data avbildas som medelvärde ± SD. Värden är intensiteter i >3800 enskilda celler som detekterats av DAPI segmentering. = p < 0.0001, Kruskal-Wallis test med dubbelsidig Dunns flerfaldiga jämförelse efter hoc-testning. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Här lägger vi fram ett detaljerat protokoll för 3D-avbildning av intakta organoider med encellig upplösning. För att framgångsrikt kunna utföra detta protokoll måste vissa kritiska steg tas. I det här avsnittet vi belysa dessa steg och tillhandahålla felsökning.
Det första kritiska steget är borttagandet av 3D-matrisen. De flesta organoider förökas in vitro med användning av matriser som efterliknar in vivo extracellulära miljön för att förstärka bildandet av väl polariserade 3D-strukturer. Fixerande och efterföljande färgning inom 3D-matrisen är möjlig, men kan vara ofördelaktigt för penetration av antikroppar eller kan generera hög bakgrundssignal (data visas inte). Effektiv borttagning av matriser kan påverkas av typ av matris, mängden och storleken på organoiderna och långvarig odling. Därför kan optimering krävas för olika odlingsförhållanden. För organoider som odlas i Matrigel eller BME räcker ett 30−60 min steg i iskall cellåtervinningslösning för att lösa upp matrisen utan att skada organoiderna. Dessutom kan avlägsnande av den stödjande 3D-matrisen resultera i förlust av inhemska strukturer och störningar av organoida kontakter med andra celltyper, till exempel när organoider är co-odlade med fibroblaster eller immunceller. Dessutom är optimal organoid fixering avgörande för att bevara 3D vävnad arkitektur, protein antigenicitet och minimera autofluorescens. Infästning i 45 min med 4% PFA vid 4 °C är normalt tillräcklig för märkning av ett brett spektrum av organoider och antigener. Men en längre fixering steg, upp till 4 h, är vanligtvis mer lämpligt för organoider uttrycker fluorescerande reporter proteiner, men kommer att kräva optimering för olika fluoroforer. Fixeringstider kortare än 20 min är otillräckliga för att korrekt märka F-aktin med hjälp av phalloidin-sonder. En annan vanlig fråga är förlusten av organoider under protokollet. Det är därför viktigt att (i) försiktigt belägga pipet tips och rör med 1% BSA-PBS enligt beskrivningen vid hantering av ofixerade organoider för att förhindra dem från att hålla sig till plast, ii) använda låg följsamhet eller suspension plattor för att avvärja provet från att fastna på plattan, och (iii) ge tillräckligt med tid för organoiderna att bosätta sig i botten av plattan innan försiktigt bort buffertar. Pipetting viskös FUnGI kan införa bubblor. Hantering av det rensade provet vid RT minskar viskositeten och förbättrar användarvänligheten och minimerar därmed förlusten av organoider. Medan de flesta organoider är lätta att hantera, cystic organoider med en förstorad lumen har en hög tendens att kollapsa när fastställande med 4% PFA eller när rensas med FUnGI. Denna effekt kan minskas, men inte helt förhindras, genom att använda en annan fixativ (t.ex. formalin eller PFA-glutaraldehyd). Detta kan dock potentiellt påverka autofluorescens, antikropp penetration och epitope tillgänglighet. När cystiska organoider verkar vikta efter clearing, rekommenderas det att hoppa över clearing steg och bild av multi-foton mikroskopi, som är mindre hämmas av ljusspridning. Slutligen, erhålla hela 3D-strukturen av organoider kan vara utmanande och kräver minimalt avstånd mellan coverslip och organoid. Dessutom, när organoider har utrymme att röra sig i sin montering agent, detta kan resultera i X- och Y-skift samtidigt som du registrerar data i Z-djup. Använda mindre silikon tätningsmedel under glidberedning kan lösa suboptimal montering mellan coverslip och mikroskop slide. För lite silikon kan dock leda till organoid komprimering och förlust av deras inneboende 3D-struktur. FUnGI förbättrar hanteringen för glidmontering och stabilitet hos organoider medan bildtagning, på grund av dess högre viskositet.
Medan detta protokoll kan användas för ett brett spektrum av applikationer för att studera i djup cellulära innehåll och 3D-arkitektur av intakt organoider, bör vissa begränsningar övervägas. Denna metod är ganska låg genomströmning och tidskrävande. Faktum är att användarna bör komma ihåg att bildframställning stora intakta organoider i 3D kräver både plattsättning och prov förvärv i Z, vilket leder till långvarig förvärv gånger. Snabbare avbildning skulle kunna uppnås genom användning av mikroskoptillgångar, inklusive resonant eller spinning disk scanner, eller genom ljusplåtmikroskop teknik26. En annan faktor är att markörer kan heterogent uttryckas mellan olika organoider från samma prov. Därför bör flera organoider förvärvas för att bättre fånga denna organoid heterogenitet i kultur. Slutligen, medan den kompletta våta lab förfarandet är okomplicerad, kräver postprocessing av data färdigheter i bildanalys programvara för 3D-visualisering och kvantifiering, samt statistik för gruvdrift all information som finns i datauppsättningen.
Under det senaste årtiondet har området för volymavbildning kraftigt avancerat, på grund av både utvecklingen av ett brett spektrum av optiska clearingmedel och förbättringar inom mikroskopi och beräkningsteknik27,30,31. Medan tidigare de flesta studier fokuserade på stor volym avbildning av organ eller tillhörande tumörer, mer nyligen metoder för mindre och mer ömtåliga vävnader, inklusive organoid strukturer, har utvecklats36,37,38. Vi publicerade nyligen en enkel och snabb metod för bildframställning hela-mount organoider av olika ursprung, storlek och form på encellsnivå för efterföljande 3D-rendering och bildanalys26, som vi presenterade här med några förbättringar (t.ex. FUnGI, silikon montering) och åtföljs av en video protokoll. Denna metod är överlägsen konventionella 2D avsnittsbaserad avbildning i dechiffrera komplexa cell morfologi och vävnad arkitektur (Figur 2) och lätt att genomföra i laboratorier med en confocal mikroskop. Med små anpassningar till protokollet kan proverna göras kompatibla med, super-upplösning confocal, multi-foton samt ljusblad imaging, vilket gör detta protokoll allmänt tillämpliga och ger användarna ett kraftfullt verktyg för att bättre förstå den flerdimensionella komplexitet som kan modelleras med organoider.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är mycket tacksamma för den tekniska supporten från Princess Máxima Center for Pediatric Oncology och till Hubrecht Institute och Zeiss för bildframställningsstöd och samarbeten. All bildbehandling utfördes på Princess Máxima imaging center. Detta arbete stöddes ekonomiskt av Prinsessan Máxima Center for Pediatric Oncology. JFD stöddes av ett Marie Curie Global Fellowship och ett VENI-anslag från Nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO). ACR stöddes av ett av Europeiska rådets (ERC) startbidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| 2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
| Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
| Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
| Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
| Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
| Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
| Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
| Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
| Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
| Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
| Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
| Imaris software | Bitplane | ||
| Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
| Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
| E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
| Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
| Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
| Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
| MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
| Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
| Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
| Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
| Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
| Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
| Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Workstation | Dell |
References
- Sato, T., Clevers, H. Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Bartfeld, S., Stem Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), 84 (2016).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Nanki, K., et al. Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
- Jamieson, P. R., et al. Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics. Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Maimets, M., et al. Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. SnapShot: Tissue Clearing. Cell. 171 (2), 496 (2017).
- Rios, A. C., et al. Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation. Nature Communications. 7, 11400 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kubota, S. I., et al. Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 20, 236-250 (2017).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Rios, A. C., et al. Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging. Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).
- Chen, Y., et al. Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues. The Scientific World Journal. 2013, 624342 (2013).
- Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, 166884 (2019).
