Summary
3D multicolor DNA FISH vertegenwoordigt een hulpmiddel om meerdere genomische loci binnen 3D bewaarde kernen te visualiseren, ondubbelzinnig definiëren d.m.v. hun wederzijdse interacties en lokalisatie binnen de nucleaire ruimte op één celniveau. Hier wordt een stap voor stap protocol beschreven voor een breed spectrum van menselijke primaire cellen.
Abstract
Een belangrijke vraag in de celbiologie is genomische organisatie binnen de nucleaire ruimte en hoe chromatinearchitectuur processen zoals genexpressie, celidentiteit en differentiatie kan beïnvloeden. Veel benaderingen ontwikkeld om de 3D-architectuur van het genoom te bestuderen, kunnen worden onderverdeeld in twee complementaire categorieën: chromosoom-conformatie capture gebaseerde technologieën (C-technologieën) en beeldvorming. Terwijl de eerste is gebaseerd op het vastleggen van de chromosoom-conformatie en proximale DNA-interacties in een populatie van vaste cellen, de laatste, gebaseerd op DNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) op 3D-bewaarde kernen, maakt hedendaagse visualisatie van meerdere loci op een enkelcelniveau (veelkleurig), het onderzoeken van hun interacties en distributie binnen de kern (3D multicolor DNA FISH). De techniek van 3D multicolor DNA FISH heeft een beperking van het visualiseren van slechts een paar vooraf bepaalde loci, niet toestaan dat een uitgebreide analyse van de nucleaire architectuur. Echter, gezien de robuustheid van de resultaten, 3D multicolor DNA FISH in combinatie met 3D-microscopie en beeldreconstructie is een mogelijke methode om C-technologie gebaseerde resultaten te valideren en ondubbelzinnig de positie en organisatie van specifieke loci te bestuderen op één celniveau. Hier stellen we een stapsgewijze methode voor van 3D multicolor DNA FISH die geschikt is voor een breed scala aan menselijke primaire cellen en bespreken we alle praktische acties, cruciale stappen, noties van 3D-beeldvorming en data-analyse die nodig zijn om een succesvolle en informatieve 3D-multicolor te verkrijgen DNA VIS binnen verschillende biologische contexten.
Introduction
Hogere eukaryoten moeten systematisch condenseren en compacteen enorme hoeveelheid genetische informatie in de minuut 3D-ruimte van de kern1,2,3,4. Vandaag de dag weten we dat het genoom ruimtelijk wordt geordend in compartimenten en topologische geassocieerde domeinen5 en dat de vele niveaus van DNA vouwen contacten genereren tussen verschillende genomische regio's die chromatine lusvorming kunnen betrekken6,7. De 3D dynamische lus van chromatine kan invloed hebben op veel verschillende biologische processen, zoals transcriptie8,9, differentiatie en ontwikkeling10,11, DNA-reparatie12,13, terwijl de verstoringen zijn betrokken bij verschillende ziekten14,15,16 en ontwikkelingsfouten15,17,18.
Er zijn veel benaderingen ontwikkeld om de 3D-genoomorganisatie te bestuderen. Chromosoom conformatie capture-gebaseerde technologieën (C-technologieën, 3C, 4C, 5C, Hi-C en derivaten) zijn ontwikkeld om genoom organisatie te bestuderen in vaste cellen3,4,19,20. Dergelijke benaderingen zijn gebaseerd op de mogelijkheid om de contactfrequenties tussen genomische loci in fysieke nabijheid vast te leggen. C-technologieën, afhankelijk van hun complexiteit, vangen de wereldwijde 3D-genoomorganisatie en nucleaire topologie van een celpopulatie3,4,19,20. Niettemin zijn 3D-interacties dynamisch in tijd en ruimte, zeer variabel tussen individuele cellen bestaande uit multiplex interacties, en zijn op grote schaal heterogeen21,22.
3D multicolor DNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een techniek die het mogelijk maakt de visualisatie van specifieke genomic loci op een cell niveau, waardoor direct onderzoek van de 3D nucleaire architectuur op een complementaire manier aan C-technologieën. Het vertegenwoordigt een technologie die momenteel wordt gebruikt om c-resultaten ondubbelzinnig te valideren. 3D multicolor DNA FISH maakt gebruik van fluorescerende gelabelde sondes die complementair zijn aan de genomische loci van belangen. Het gebruik van verschillende fluorophores en geschikte microscopieapparatuur maken het mogelijk om meerdere doelen binnen de nucleaire ruimte23,24, op een eigentijdse manier te visualiseren. In de afgelopen jaren is FISH gecombineerd met technologische vooruitgang in microscopie om de visualisatie van fijnschaalstructuren te verkrijgen bij hoge resolutie25,26 of met CRISPR-Cas benaderingen voor de visualisatie van de nucleïnezuren in live imaging27,28. Ondanks de brede adoptie wordt de 3D-multicolor DNA FISH-benadering in veel laboratoria nog steeds als moeilijk beschouwd omdat het gebruikte biologische materiaal moet worden aangepast.
Hier bieden we een uitgebreid protocol voor 3D-multicolor DNA FISH (van cel/sondevoorbereiding tot data-analyse) die van toepassing is op een breed scala aan menselijke primaire cellen, waardoor de visualisatie van meerdere genomische loci mogelijk is en de 3D-structuur van kernen behouden blijft. Om de nucleaire architectuur te bestuderen, moet de 3D-structuur van kernen behouden blijven. Om deze reden vermijden we, in tegenstelling tot andere bestaande protocollen29,30,31, het gebruik van een alcoholgradiënt en de opslag van de afdekkingen in alcohol die chromatinestructuur32kunnen beïnvloeden . De methode is aangepast van bewaarde 3D DNA FISH protocollen24,33 die moeten worden toegepast op een breed scala van menselijke primaire cellen, zowel geïsoleerd ex vivo of gekweekt in vitro. Er zijn permeabilisatie- en deproteinisatieparameters voor verschillende nucleaire morfologie en cytologische kenmerken (bijvoorbeeld verschillende graden van nucleaire verdichting, cytoskeletovervloed)34. Deze parameters worden vaak over het algemeen beschreven in andere protocollen24,33, zonder een duidelijke discriminatie van de procedure binnen verschillende celtypen. Verder hebben we een specifiek instrument ontwikkeld genaamd NuCLεD (nuclear contacts locator in 3D)16, die principes biedt voor data-analyse die de 3D-nabijheid tussen verschillende loci en hun nucleaire topologische distributie binnen de nucleaire ruimte op een geautomatiseerde manier zullen verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA-sondevoorbereidings- en etiketteringsprocedures met nick-vertaling
- Zuiveren en reinigen van bacteriële kunstmatige chromosomen (BACs), plasmiden of PCR producten met specifieke kits (Tabel van materialen), resuspend in ddH2O, controleren door elektroforese op een agarose gel en kwantificeren.
- Voer nick vertaling op 1,5−2 μg DNA uit stap 1.1 in een laatste volume van 50 μL door het mengen van alle reagentia in een 0,5 mL lage binding S-buis volgens tabel 1.
OPMERKING: Direct gelabelde sondes kunnen de signaal-ruisverhouding verbeteren. Kits om indirect en direct gelabelde sondes te produceren met verschillende Alexa fluorochromes door nick vertaling zijn commercieel beschikbaar. - Incubeer de nick vertaling mix in een thermische mixer op 16 °C voor een tijd, afhankelijk van de lengte van het startende DNA-materiaal: 45 min voor PCR producten (een pool van PCR producten van 2.000 bp per stuk) en tot 4 uur voor BAC DNA en plasmiden.
- Controleer de grootte van de sondes geproduceerd in stap 1.3 door elektroforese op een 2,2% agarose gel.
OPMERKING: De optimale sondegrootte is <200 bp (figuur 1A).- Als het DNA niet voldoende is verteerd, voeg dan 5 U DNA polymerase I en 0,05 U van DNase I toe aan de reactie en uitbroed en uitbroed voor 1−2 uur bij 16 °C en vervolgens opnieuw te controleren. Stop de reactie met 0,5 mM EDTA (eindconcentratie). Bewaar sondes bij -20 °C.
- Voor elk DNA FISH-experiment, neerslaan de volgende hoeveelheden sondes, afhankelijk van het startende DNA-materiaal waaruit de sondes worden geproduceerd: 200 ng van nick vertaald PCR producten, 100 ng van nick vertaald BACs, of 300 ng van nick vertaald plasmid. Voeg ddH2O tot 150 μL, 20 μg niet-gelabeld emanaatsperma DNA, 3,5 μg soortspecifiek Cot-1 DNA, 3 volumes van 100% EtOH en 1/10 volume van 3 M natriumacetaat pH 5.2. Neerslag bij -80 °C gedurende 1 uur.
- Centrifugeer bij maximale snelheid van 1 uur bij 4 °C en gooi de supernatant weg. Was de pellet twee keer met 70% EtOH.
- Zet de pellet opnieuw op in 2 μL van 100% formamide pH 7.0, schud bij 40 °C gedurende 30 min (kan enkele uren duren) en voeg vervolgens een gelijk volume van 4x zout-natriumcitrate (SSC)/20% dextran sulfaat toe.
- Bereid 20x SSC voor door 175,3 g NaCl en 88,2 g natriumcitrate te mengen in een laatste volume van 1 L van H2O. Autoclave, filter en bereid aliquots.
OPMERKING: Voor veelkleurige DNA FISH kunnen de verschillende sondes samen worden neergeslagen, behalve voor sondes die met elkaar kunnen annealen. In deze specifieke gevallen, behandel ze afzonderlijk, neerslaan en opnieuw opschorten van de sondes verdelen van de reagentia vermeld in stappen 1.5−1.7 met betrekking tot het aantal sondes. Bundel de sondes pas na resuspension in formamide. Als glasafdekkingen van meer dan 10 mm of minder dan 10 mm worden gebruikt, moet het volume van de reagentia die in de stappen 1.5−1.7 worden gebruikt, proportioneel naar de schuifgrootte worden opgeschaald/omlaag. Hybridisatiesondes kunnen gedurende een lange periode (tot twee maanden) bij -20 °C worden opgeslagen.
- Bereid 20x SSC voor door 175,3 g NaCl en 88,2 g natriumcitrate te mengen in een laatste volume van 1 L van H2O. Autoclave, filter en bereid aliquots.
2. Celfixatie, voorbehandeling en permeabilisatie
LET OP: Permeabilisatie en deproteinization passages zijn cruciale stappen. De tijd van reactie en concentratie van de reagentia hangt sterk af van het celtype, de cytoplasmaovervloed en de nucleaire morfologie.
- Celfixatie, voorbehandeling en permeabilisatie voor primaire T-lymfocyten bij de mens
OPMERKING: Dit protocol is geschikt voor kleine cellen, met kleine kernen en een lage hoeveelheid cytoplasma.- Gebruik glazen afdekkingen (10 mm, dikte nr. 1,5H).
- Was het glas met ddH2O, dan met 70% EtOH en laat ze drogen. Gebruik één glas voor elke put van een 24-put plaat.
- Voeg 200 μL van 0,1% poly-L-lysine (w/v)(Materiaaltabel)direct op het glas toe om een druppel te vormen. Let op als de druppel moet blijven op het glazen oppervlak zonder het aanraken van de put voor 2−5 min. Laat de druppel voorzichtig, en laat het glas drogen voor 30 min.
- Voer stap 2.1.3 nog twee keer uit.
- Zet 200 μL suspensiecellen(2 x 10 6/mL, PBS-suspensie van ex vivo primaire T-lymfocyten) direct op het glas, laat de cellen 30 min bij kamertemperatuur (RT) zaaien.
- Verwijder snel de druppel. Voeg vers gemaakte 4% PFA (bereid in PBS/0,1% TWEEN 20, pH 7.0, gefilterd) voor 10 min en bevestig de gezaaide cellen op RT.
- Was drie keer voor 5 min elk met 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) bij RT. Permeabilize met 0,5% TPBS voor 10 min bij RT.
- Voer de RNase-behandeling uit door 2,5 μL RNase cocktail(Tabel met materialen)toe te voegen in 250 μL PBS/well in een 24-well plate gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Spoel in PBS, voeg 20% glycerol/PBS toe en incubatie 's nachts (ON) bij 4 °C.
OPMERKING: Deze stap kan variëren van 1 uur tot AAN. Dia's kunnen worden bewaard in 20% glycerol/PBS bij 4 °C tot 7 dagen. - Vries op droogijs (15−30 s), ontdooi geleidelijk bij RT en geniet van 20% glycerol/PBS. Herhaal stap 2.1.9 nog eens drie keer.
- Was in 0,5% TPBS voor 5 min bij RT. Was in 0,05% TPBS, twee maal voor 5 min bij RT. Incubete in 0,1 N HCl voor 12 min bij RT. Rinse in 2x SSC.
- Incubeer in 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON bij RT.
LET OP: De incubatietijd kan worden geoptimaliseerd en uiteindelijk worden verminderd. Dia's kunnen worden bewaard in 50% formamide/2x SSC voor meerdere dagen.
- Celfixatie, voorbehandeling en permeabilisatie voor menselijke primaire myoblasten
OPMERKING: Dit protocol is geschikt voor grote cellen, met een hoge hoeveelheid cytoplasma.- Kweek menselijke primaire myoblasten direct op de coverslipbril in 24-well platen in groeimedium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM), 20% foetaal runderserum (FBS), 25 ng/mL fibroblast groeifactor (FGF), 10 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 10 μg/mL menselijke insuline, 1x glutamine, 1x penicilline/streptomycine) voor ten minste 24 uur (tot 50−70% van de samenvloeiing).
OPMERKING: Om de hechting te vergemakkelijken, kan gelatine of collageen of poly-L-lysine worden gebruikt om de coverslip voorafgaand aan het zaaien te coaten. - Spoel cellen af in 2−3-veranderingen van PBS. Voeg vers gemaakte 4% PFA toe en bevestig de cellen 10 min bij RT.
- Was drie keer voor 3 min elk in 0,01% TPBS bij RT. Permeabilize in 0,5% TPBS voor 10 min bij RT.
- Voer de RNase-behandeling uit door 2,5 μL RNase cocktail(Tabel met materialen)toe te voegen in 250 μL PBS/well in een 24-well plate gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Spoel in PBS, voeg 20% glycerol / PBS, en uitbroeden op op RT.
OPMERKING: Deze stap kan variëren van 1 uur tot AAN. Dia's kunnen worden bewaard in 20% glycerol/PBS bij 4 °C tot 7 dagen. - Vries op droogijs (15−30 s), ontdooi geleidelijk bij RT en geniet van 20% glycerol/PBS. Herhaal deze stap drie keer.
- Was drie keer gedurende 10 min elk in PBS. Incubeer in 0,1 N HCl voor 5 min bij RT. Rinse in 2x SSC.
- Incubeer in 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON bij RT.
LET OP: De tijd van incubatie kan worden geoptimaliseerd en uiteindelijk verminderd. Dia's kunnen worden bewaard in 50% formamide/2x SSC voor meerdere dagen. - Equilibrate slides (bewaard in 50% formamide/2x SSC) in 2x SSC gedurende 2 min. Vervolgens, equilibrate in PBS voor 3 min.
- Behandel met 0,01 N HCl/0,0025% pepsine van enkele seconden tot 5 minuten, afhankelijk van het celtype. Observeer tijdens deze stap de cellen onder een optische microscoop en stop de reactie (stap 2.2.11) zodra de kernen vrij zijn van het cytoplasma, met behoud van hun structuur intact (bijvoorbeeld nucleoli zijn nog steeds zichtbaar en intact).
- Activeer de pepsine door twee maal te wassen voor 5 min elk in 50 mM MgCl2/PBS.
- Post-fix in 1% PFA/PBS voor 1 min. Was gedurende 5 min in PBS. Was twee maal voor 5 min elk in 2x SSC, en voeg vervolgens 50% formamide/2x SSC voor ten minste 30 min.
- Kweek menselijke primaire myoblasten direct op de coverslipbril in 24-well platen in groeimedium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM), 20% foetaal runderserum (FBS), 25 ng/mL fibroblast groeifactor (FGF), 10 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 10 μg/mL menselijke insuline, 1x glutamine, 1x penicilline/streptomycine) voor ten minste 24 uur (tot 50−70% van de samenvloeiing).
3. 3D multicolor DNA FISH hybridisatie
- Denatureer de sondes bij 80 °C gedurende 5 min, en zet dan snel op ijs.
- Laad de hybridisatiesondes op een schone microscoopdia. Draai de coverslip met cellen ondersteboven op de val van hybridisatie sondes.
- Sluit de coverslip af met rubbercement. Laat het rubbercement volledig drogen. Plaats vervolgens dia's op een verwarmingsblok en denatureer op 75 °C gedurende 4 min.
OPMERKING: De timing van de naturatie en de temperatuur van de naturatie kan worden verhoogd tot 80 °C. - Hybridiseren bij 37 °C ON in een metalen doos drijvend in een waterbad.
OPMERKING: Om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, kan de hybridisatietemperatuur oplopen tot 42 °C. - Schil rubbercement af, dompel de glijbanen onder in 2x SCC, strip van de glazen coverslip en breng het over naar 2x SSC in 6-well plaat.
- Was in 2x SSC drie keer gedurende 5 min elk bij 37 °C, schudden bij 90 rpm in een incubator shaker. Was in 0,1x SSC drie keer gedurende 5 min elk bij 60 °C, schudden bij 90 rpm in een incubator shaker. Spoel kort in 4x SSC/0,2% TWEEN 20.
4. 3D multicolor DNA FISH detectie
OPMERKING: Sla de stappen 4.1 en 4.2 over voor de direct geëtiketteerde sondes.
- Blok in 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% runderserumalbumine (BSA) gedurende 20 min bij 37 °C in een 24-put plaat, schudden bij 20 rpm in een incubator shaker.
- Incubeer met de juiste concentratie anti-digoxygenine (1:150), en/of streptavidin (1:1.000) (Tabel van Materialen)verdund in 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% BSA gedurende 35 min in een donkere en natte kamer bij 37 °C.
- Was in 4x SSC/0,2% TWEEN 20 drie keer voor 5 min elk bij 37 °C, schudden bij 90 rpm in een 6-put plaat in een incubator shaker.
- Equilibrate in PBS en post-fix in 2% formaldehyde/PBS voor 2 min bij RT in een 24-put plaat.
OPMERKING: Direct geëtiketteerde sondes hebben geen post-fixatie nodig. - Was 5x kort in PBS. Vlek met 1 ng/mL DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)/PBS gedurende 5 min bij RT.
- Was 5x kort in PBS. Monteer met antifade-oplossing (Tabel met materialen).
5. 3D multicolor DNA FISH microscopie en analyse
- Verwerf 3D-beelden met een microscoopsysteem.
OPMERKING: Hier wordt een breedveldmicroscoop met een axiale afstand van 0,2−0,25 μm gebruikt tussen opeenvolgende secties (figuur 1B). - Analyseer 3D-beeldstapels met behulp van verschillende software en tools (hier, NuCLεD of Nucleaire Contacten Locator in 3D).
OPMERKING: De tool NuCLεD is ontwikkeld om automatisch 3D-multicolor DNA FISH te analyseren in fluorescentiecelbeeld z-stacks. NuCLεD reconstrueert de kernen van celbeeldstapels in 3D en detecteert en lokaliseert fluorescerende 3D-spots. Het meet de relatieve positionering van vlekken in de kern (bijvoorbeeld afstand tot de centroid van de kernen en/of periferie van de kernen) en de maximale straal voor elke kern- en intervlekkenafstanden. De tool en het gebruikte algoritme zijn volledig beschreven in Cortesi et al.16. - Analyseer de gegevens (bijvoorbeeld 3D-afstanden tussen gespecificeerde genomische loci en de nucleaire centroid- en contactfrequenties) die door NuCLεD worden opgehaald.
OPMERKING: Voor 3D afstanden tussen gespecificeerde genomische loci en de nucleaire centroid normaliseert u afstanden op de maximale straal voor elke kern en vertegenwoordigt u deze gegevens als frequentieverdelingen van genormaliseerde afstanden van de nucleaire centroid. Voor lange afstandsinteracties studies, contactfrequenties worden verondersteld te zijn in het bereik van 10−20%21 met een drempel inter-afstand die kan variëren en kan worden gezet rond 2 μm35.- Om statistische analyse uit te voeren, analyseert u ongeveer 100 kernen per biologische repliceren. Vertegenwoordigen 3D afstanden tussen gespecificeerde genomische loci als cumulatieve frequentieverdelingen van afstanden die onder de gekozen drempel tussen afstand liggen en gebruik maken van een t-testom de betekenis van verschillen in de verdelingen te beoordelen. Bereken ook het percentage kernen positief voor de interacties die onder de gekozen drempel zijn, en gebruik fisher's exacte test om de betekenis van verschillen in de percentages te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De methode van 3D multicolor DNA FISH beschreven in dit artikel maakt hedendaagse visualisatie van verschillende genomische loci binnen bewaard 3D-kernen(Figuur 1B) mogelijk. Dit protocol maakt het mogelijk afstanden tussen allelen en verschillende genomic loci meten te meten om de ruimtelijke nabijheid ervan te evalueren en de ligging ervan in de nucleaire ruimte te beoordelen (bijvoorbeeld loci-afstand van de centroid of de periferie van de kernen)16. Er zijn echter veel cruciale stappen die nauwkeurig en specifiek moeten worden ingesteld voor elk celtype dat wordt gebruikt; het wordt ten zeerste aanbevolen om bijzondere aandacht te besteden aan de volgende stappen voor succes van 3D multicolor DNA FISH.
Controleer voor de voorbereiding van dna-sonde of de grootte van de sonde <200 bp (figuur 1A) is. Deze grootte zorgt voor een succesvolle procedure van 3D multicolor DNA FISH (Figuur 1B). Suboptimale DNA FISH-sondes die door nick-vertaling worden geproduceerd, kunnen gedeeltelijk worden verteerd (figuur 2A) of over verteerd (figuur 2B). Met gedeeltelijk verteerdsondes, zal de procedure geen signaal in de cellen hebben, wegens het onvermogen van de sonde om de kernen in te gaan en behoorlijk aan de aanvullende genomic loci te hybridiseren. Over verteerds sondes zal resulteren in een niet-specifiek signaal, als gevolg van een verlies van specificiteit in de hybridisatie en een daaruit voortvloeiende toename van de achtergrond. Een representatief voorbeeld van oververteerd sondes wordt weergegeven in figuur 3A in vergelijking met een optimale verteerde sonde in figuur 3B.
Voor deproteinisatie en pepsinisatie, volg deze stappen volgens het celtype. Houd met name rekening met de nucleaire grootte en de overvloed aan cytoplasma. Voor menselijke primaire ex vivo geïsoleerde T lymfocyten en cellen met kleine, sterk verdichte kernen en laag overvloedig cytoplasma, HCl deproteinization is cruciaal. Behandeling met 0,1 N HCl voor 5 min is niet voldoende voor DNA FISH visualisatie. 0,1 N HCl behandeling voor 12 min wordt aanbevolen om de toegankelijkheid van kernen van DNA-sondes te bevorderen en de nucleaire integriteit te behouden(figuur 4A). Pepsine vergisting van het cytoplasma is niet nodig om een goed signaal van DNA-vis(figuur 4B)te verkrijgen.
Voor menselijke primaire myoblasten en cellen die grote kernen en overvloedig cytoplasma hebben, is de pepsinization stap fundamenteel. Een korte en suboptimale pepsinisatie van het cytoskelet zal de binnenkomst van de sonde in de kernen belemmeren (figuur 4C), eindigend bij afwezigheid van een DNA FISH-signaal. Als de cellen echter meer dan gepepsiniseerd zijn, blijven de kernen niet intact(figuur 4D),verliezen hun 3D-structuur. Een voorbeeld van succesvolle 3D-multicolor DNA FISH is opgenomen in figuur 4E.
Sluit tijdens de hybridisatie de coverslip nauwkeurig af; anders zal de sonde zich verspreiden en drogen. Denaturatie en hybridisatie stappen moeten snel worden uitgevoerd zodanig dat de sonde en genomische DNA niet zal reanneal. De duur van de denaturatie kan worden verhoogd.
Figuur 1: Representatieve DNA-sondes en 3D-multicolor DNA-vis. (A) Nick vertaalde DNA-sondes van optimale grootte draaien op een 2,2% agarose gel (baan 1, 2), 50 bp marker (M). (B) Representatieve 3D-multicolor DNA FISH-kern met behulp van sondes die in kaart brengen tot 3q11.2 regio (groen), 10q26.3 regio (rood) en 8q24.13 regio (magenta) in menselijke primaire myoblasten. Kernen zijn tellerstained met DAPI (blauw). 63x vergroting. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Voorbeelden van niet optimaal verteerd DNA FISH sondes. (A) Niet verteerd (rijstrook 1, 2) of gedeeltelijk verteerd (baan 3) nick vertaalde DNA-sondes draaien op een 2,2% agarose gel, 2log marker (M). (B) Over verteerd nick vertaald DNA-sondes draaien op een 2,2% agarose gel, 2log marker (M). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van 3D-meerkleurige DNA-vissen met behulp van suboptimale of optimale DNA FISH-sondes. (A) Representatieve 3D multicolor DNA FISH kernen met behulp van meer dan verteerd sonde mapping tot 8q24.13 regio (magenta) in de menselijke primaire myoblasten. Kernen zijn tellerstained met DAPI (blauw). 63x vergroting. Schaalbalk = 10 μm. (B) Representatieve 3D-veelkleurige DNA FISH-kernen met behulp van optimaal verteerde sondemapping tot 8q24.13 regio (magenta) in menselijke primaire myoblasten. Kernen zijn tellerstained met DAPI (blauw). 63x vergroting. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Mogelijke uitkomsten van suboptimale deproteinisatie- en pepsinisatiestappen op 3D-multicolor DNA FISH-resultaten. (A) Representatieve 3D-veelkleurige DNA VIS-kernen van primaire T-lymfocyten van de mens die gedurende 5 min (links) of 12 min (rechts) met 0,1 N HCl worden behandeld, met behulp van sondetoewijzing tot een gebied van 8q24.13 (groen). Kernen zijn tellerstained met DAPI (blauw). 100x vergroting. Schaalbalk = 10 μm. (B) Representatieve 3D-veelkleurige DNA FISH-kernen van menselijke primaire T-lymfocyten die gedurende 12 minuten worden behandeld met 0,1 N HCl (links) of gekoppeld aan 0,01 N HCl/0,0025% pepsin voor 2 min (rechts), met behulp van sondemapping tot een gebied van 8q24.13 (groen). Kernen zijn tellerstained met DAPI (blauw). 100x vergroting. Schaalbalk = 10 μm. (C) Representatieve 3D-veelkleurige DNA FISH-kernen van menselijke primaire myoblasten die worden behandeld met korte en suboptimale pepsinisatie, met behulp van sondetoewijzing tot 8q24.13-regio (magenta). Kernen zijn tellerstained met DAPI (blauw). 63x vergroting. Schaalbalk = 10 μm. (D) Representatieve 3D-veelkleurige DNA FISH-kernen van menselijke primaire myoblasten die worden behandeld met langdurige pepsinisatiestap, met behulp van sondetoewijzing tot 8q24.13-regio (magenta). Kernen zijn tellerstained met DAPI (blauw). 63x vergroting. Schaalbalk = 5 μm. (E) Representatieve 3D-veelkleurige DNA FISH-kernen van menselijke primaire myoblasten die worden behandeld met optimale HCl/pepsine-omstandigheden met behulp van sondetoewijzing tot 8q24.13-regio (magenta). Kernen zijn tellerstained met DAPI (blauw). 63x vergroting. Schaalbalk = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Nick vertaalreagents | Initiële concentratie | Eindconcentratie |
| dNTP's (C-G-A) | 0,5 mM | 0,05 mM |
| dTTP | 0,1 mM | 0,01 mM |
| Biotine/Dig/Cy3 dUTP | 1 mM | 0,02 mM |
| Tris HCl pH 7.8 | 1 M | 50 mM |
| MgCl2 | 100 mM | 5 mM |
| β-mercaptoethanol | 100 mM | 10 mM |
| Bsa | 100 ng/μL | 10 ng/μL |
| DNA Pol I | 10 U/μL | 0,1 U/μL |
| DNase I | 1 U/μL | 0,002 U/μL |
| DNA 2 μg | X | X |
| ddH2O | Maximaal 50 μL |
Tabel 1: Nick Translation. Tabel waarin alle reagentia, hun concentratie en voorgestelde timing voor nick vertaling reactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige methode beschrijft een stap voor stap protocol om 3D multicolor DNA FISH uit te voeren op een breed scala van menselijke primaire cellen. Hoewel DNA FISH een technologie is in breed gebruik, is 3D-multicolor DNA VIS op bewaarde 3D-interfasekernen nog steeds moeilijk uit te voeren in veel laboratoria, voornamelijk vanwege de kenmerken van de gebruikte monsters23,24.
Probe nick vertaling is een fundamentele stap voor succesvolle 3D multicolor DNA FISH; veel verschillende substraten (BAC, fosmid, plasmid, PCR producten) kunnen worden gebruikt voor deze reactie, en de timing van de reactie en enzymconcentratie kan dienovereenkomstig worden aangepast met betrekking tot de lengte van het substraat. Een goede sondevertering is fundamenteel(figuur 1),aangezien niet-optimale sondes (figuur 2) zullen resulteren in geen signaal of een niet-specifiek signaal (figuur 3A). Permeabilisatie, deproteinisatie en pepsinisatiestappen zijn cruciale passages die sterk afhankelijk zijn van het gebruikte celtype. Cellen met kleine kernen en een lage cytoskelet overvloed, zoals ex vivo geïsoleerd T lymfocyten, vereisen deproteinisatie met een langdurige 0,1 N HCl behandeling. Ook wasbeurten in PBS met hogere percentages Triton X-100 kan helpen de sonde binnenkomst in de kernen van deze cellen. Integendeel, in vitro gekweekte menselijke primaire myoblasten die grotere kernen presenteren, met een hoog gehalte aan cytoskelet, hebben de vertering van de cytosoieke structuren met pepsine nodig. Deze algemene rollen kunnen worden toegepast op een breed scala van cellen, uiteindelijk het combineren van de verschillende stappen, afhankelijk van de specifieke cellulaire kenmerken.
Het gebruik van vers bereid biologisch materiaal, verse oplossingen (met name oplossingen met wasmiddel) en fluorescerende reagentia worden sterk voorgesteld: gefilterde PFA bij pH 7.0; autoclaved en gefilterd 20x SSC bij pH 7.0; gefilterde formamide bij pH 7.0; nuclease gratis water; en wegwerpaliquots van gemodificeerde UTP. Langdurige incubatie met 20% glycerol/PBS, of 50% formamide/2x SSC kan de hybridisatie vergemakkelijken. HCl en/of pepsine behandeling kan verder worden verhoogd. De timing van hybridisatie, de hoeveelheid sondes, de concentratie en de timing van incubatie van anti-digoxigenin en streptavidin kunnen allemaal verder worden aangepast om de signaal-ruisverhouding te verbeteren.
3D multicolor DNA FISH is een aanvullend instrument voor C-technologieën, de standaardmethode om C-gebaseerde resultaten te valideren. In combinatie met 3D-microscopie en analyse kan 3D-veelkleurige DNA FISH de nabijheid tussen genomic loci en hun topologische verdeling binnen de nucleaire ruimte op ééncelniveau monitoren. 3D multicolor DNA FISH kan verder worden geïntegreerd met andere methoden zoals RNA FISH en immunofluorescentie voor een uitgebreid overzicht van de dynamiek en interacties tussen genomic loci, RNAs (messenger RNA of regulatory non coding RNA) en een breed scala van eiwitten, die een unieke kans om de nucleaire structuur te visualiseren en de epigenetische mechanismen die subtend cellulaire identiteit te onderzoeken.
Ondanks de enorme verbetering van FISH-technologieën met superresolutie25,26, live cell imaging27,28,36, single molecule detection37, en hedendaagse visualisatie van meerdere doelen met oligonucleotide arrays zoals Oligopaint37,38 met 3D high-throughput benaderingen39, een beperking van de technologie blijft het discrete aantal vooraf bepaalde genomic loci die kan worden gevisualiseerd. Dit voorkomt een brede analyse van nucleaire architectuur. Verschillende studies hebben onlangs sequentieele methoden van hybridisatie beschreven om genoomorganisatie in enkele cellen aan te pakken, zoals barcode DNA FISH40,41,42,43. Verdere inspanningen zullen nodig zijn om het eencellige karakter van 3D-multicolor DNA FISH te koppelen aan genoombrede kenmerken om nucleaire architectuurheterogeniteit breed te visualiseren met beeldvormingstechnologieën, omdat het aantal loci dat tegelijkertijd getest kan worden, zal toenemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de technische bijstand van de INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milaan, Italië), in het bijzonder C. Cordiglieri, voor hulp bij 3D multicolor DNA FISH-beelden Verwerving. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan B.B.: EPIGEN Italiaans vlaggenschipprogramma, Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) en Giovani Ricercatori, Italiaans ministerie van Volksgezondheid (GR-2011-02349383). Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidie aan F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, Pt 2 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , Chapter 4, Unit 4 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
