Summary
3DマルチカラーDNA FISHは、3D保存核内の複数のゲノム軌跡を視覚化するツールを表し、核空間内での相互相互作用と局在性を単一の細胞レベルで明確に定義します。ここで、ヒト一次細胞の広いスペクトルについて段階的にプロトコルをステップごとに説明する。
Abstract
細胞生物学における大きな問題は、核空間内のゲノム組織と、クロマチンアーキテクチャが遺伝子発現、細胞同一性、分化などのプロセスにどのような影響を与えるかです。ゲノムの3Dアーキテクチャを研究するために開発された多くのアプローチは、染色体立体構造キャプチャベースの技術(C技術)とイメージングの2つの相補的なカテゴリーに分けることができます。前者は固定細胞集団における染色体立体構造と近位DNA相互作用を捉えるが、後者は3D保存核上のその場ハイブリダイゼーション(FISH)におけるDNA蛍光に基づいて、現代的な視覚化を可能にする単一の細胞レベル(多色)で複数の遺伝子座を有し、核内での相互作用と分布を調べる(3D多色DNA FISH)。3D多色DNA FISHの技術は、少数の所定の座位座のみを可視化するという制限があり、核アーキテクチャの包括的な分析を許さない。しかし、その結果の堅牢性を考えると、3D多色DNA FISHと3D顕微鏡と画像再構成を組み合わせて、C技術ベースの結果を検証し、特定の遺伝子座の位置と組織を明確に研究する方法です。1 つのセル レベルで。ここでは、幅広いヒト初等細胞に適した3D多色DNA FISHのステップバイステップ方式を提案し、成功した有益な3Dマルチカラーを得るために必要なすべての実用的な行動、重要なステップ、3Dイメージングの概念、およびデータ分析について議論するDNA FISH 異なる生物学的文脈の中で.
Introduction
高い真核生物は、核1、2、3、4の分の3D空間で、膨大な量の遺伝情報を体系的に凝縮し、コンパクト化する必要があります。今日、我々は、ゲノムが区画およびトポロジー関連ドメイン5において空間的に秩序化され、DNAフォールディングの複数のレベルがクロマチンループ形成6、7を伴う可能性のある異なるゲノム領域間の接触を生成することを知っている。クロマチンの3D動的ループは、転写8、9、分化および現像10、11、DNA修復12、13、その摂動が様々な疾患14、15、16および発達欠陥15、17、18に関与している間、多くの異なる生物学的プロセスに影響を及ぼし得る。
3Dゲノム組織を研究するために多くのアプローチが開発されています。染色体コンフォメーションキャプチャベースの技術(C技術、3C、4C、5C、Hi-Cおよび誘導体)は、固定細胞3、4、19、20のゲノム組織を研究するために開発された。このようなアプローチは、物理的近接でゲノム遺伝子座間の接触周波数を捕捉する能力に基づいている。C-技術は、その複雑さに応じて、細胞集団3、4、19、20のグローバル3Dゲノム組織と核トポロジーをキャッチします。それにもかかわらず、3D相互作用は時間および空間において動的であり、多重相互作用からなる個々の細胞間で高度に可変であり、かつ広範囲に異種21、22である。
3D多色DNA蛍光インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)は、特定のゲノム軌跡を単一細胞レベルで可視化し、C技術に対して3D核アーキテクチャを補完的に直接調査することを可能にする技術です。これは、C-結果を明確に検証するために現在使用されている技術を表します。3DマルチカラーDNA FISHは、興味のゲノム遺伝子座に相補的な蛍光標識プローブを使用しています。異なる蛍光発光器および適切な顕微鏡装置の使用は核空間23、24内の複数のターゲットの現代的な視覚化を可能にする。近年、FISHは、マイクロスコピーの技術進歩と組み合わされ、高解像度25、26、またはCRISPR-Cas法による微細スケール構造の可視化を得て、ライブイメージング27,28で核酸の可視化を行っている。広く採用されているにもかかわらず、3D多色DNA FISHアプローチは、使用される生物学的材料を適応しなければならないため、多くの研究室では依然として困難であると考えられている。
ここでは、幅広いヒト一次細胞に適用できる3D多色DNA FISH(細胞/プローブ調製からデータ解析まで)の包括的なプロトコルを提供し、多重ゲノム軌跡の可視化を可能にし、核の3D構造を維持します。核建築を研究するためには、核の3D構造を維持しなければならない。このため、他の既存のプロトコル29、30、31とは対照的に、クロマチン構造32に影響を与えるアルコールのアルコール勾配およびカバースリップの貯蔵の使用を避ける。この方法は、保存された3D DNA FISHプロトコル24、33から、広範囲のヒト一次細胞に適用されるように適合され、両方とも単離されたエクスビボまたはインビトロで培養される。異なる核形態および細胞学的特性に対する透過性および脱蛋白パラメータ(例えば、異なる核圧縮度、細胞骨格量)34がある。これらのパラメータは、一般に、異なる細胞型内での手順の明確な識別を提供することなく、他のプロトコル24、33で説明される。さらに、核空間内の異なる軌跡とその核トポロジー分布の3D近接性を自動で改善するデータ解析の原理を提供する、NuCLεD(3Dにおける核接触ロケータ)16という特定のツールを開発しました。
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Protocol
ニック翻訳によるDNAプローブ調製とラベリング手順
- 細菌人工染色体(BAC)、プラスミドまたはPCR製品を特定のキット(材料表)で精製し、精製し、アガロースゲル上の電気泳動でチェックし、定量します。
- 表1に従って0.5 mLの低結合DNAチューブに全ての試薬を混合することにより、ステップ1.1から50μLの最終体積で1.5-2μgのDNAにニック翻訳を行う。
注:直接ラベル付けされたプローブは、信号対ノイズ比を改善することができます。ニック翻訳により様々なAlexaフルオロクロムを用いて間接的および直接的に標識されたプローブを製造するキットが市販されています。 - ニック翻訳ミックスを、開始DNA材料の長さによって一定時間、16°Cのサーマルミキサーにインキュベートします:PCR産物(それぞれ2,000 bpのPCR産物のプール)とBAC DNAおよびプラスミドの場合は最大4時間。
- 2.2%のアガロースゲルで電気泳動により、ステップ1.3で生成されたプローブのサイズを確認します。
注 : 最適なプローブ サイズは <200 bp です (図 1A)。- DNAが十分に消化されない場合は、5 UのDNAポリメラーゼIと0.05 UのDNase Iを反応に加え、16°Cで1〜2時間インキュベートし、その後再チェックします。0.5 mM EDTA(最終濃度)で反応を停止します。プローブは-20°Cに保存してください。
- 各DNA FISH実験について、プローブが生成される開始DNA材料に応じて、ニック翻訳されたPCR産物から200ng、ニック翻訳BACsから100ng、ニック翻訳プラスミドから300ngのプローブ量を沈殿させます。ddH2Oを最大150μL、20μgの無ラベルサーモン精子DNA、3.5μgの種特異的Cot-1 DNA、3体積の100%EtOH、および3 M酢酸ナトリウムpH 5.2の1/10容積を加える。1時間の-80°Cで沈殿する。
- 4°Cで1時間の最高速度で遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを70%EtOHで2回洗浄します。
- ペレットを100%フォルムアミドpH 7.0の2μLで再懸濁し、40°Cで30分間(数時間かかることがあります)、4倍の生理食塩水ナトリウム(SSC)/20%デキストラン硫酸塩を加えます。
- 20x SSCを175.3gのNaClと88.2gのクエン酸ナトリウムを1Lの最終体積のH2O.オートクレーブで混合し、フィルターを適用し、アリコートを準備します。
注:多色DNA FISHの場合、互いにアニールできるプローブを除いて、異なるプローブを一緒に沈殿させることができます。これらの特定のケースでは、それらを別々に処理し、プローブの数に関してステップ1.5-1.7で述べた試薬を分割してプローブを沈殿させ、再懸濁します。フォルメミドで再懸濁した後にのみプローブをプールします。ガラスのカバースリップが 10 mm または 10 mm 未満を使用する場合は、スライドサイズに比例してステップ 1.5-1.7 で使用する試薬の体積を拡大/縮小します。ハイブリダイゼーションプローブは、-20°Cで長期間(最大2ヶ月間)保存できます。
- 20x SSCを175.3gのNaClと88.2gのクエン酸ナトリウムを1Lの最終体積のH2O.オートクレーブで混合し、フィルターを適用し、アリコートを準備します。
2. 細胞固定、前処理、透過
注:浸透と脱タンパク質化の通路は重要なステップです。試薬の反応時間と濃度は、細胞型、細胞質の豊富さ、核形態に大きく依存します。
- ヒト原発性Tリンパ球の細胞固定、前処理および透過性
注:このプロトコルは小さな細胞に適しており、小さな核と細胞質の量が少ない。- ガラスのカバースリップ(10mm、厚さ1.5H)を使用してください。
- ddH2Oでガラスを洗い、70%のEtOHで洗い、乾燥させます。24ウェルプレートの各ウェルにグラスを1枚使用します。
- 200 μL の 0.1% ポリ L-リジン (w/v) (材料の表) をガラスに直接加えて、ドロップを形成します。2-5分間井戸に触れずにガラス表面に落ちない状態に注意してください。
- ステップ2.1.3をさらに2回実行します。
- 200 μLの懸濁液細胞(2 x106/mL、エキセビボ原発性Tリンパ球のPBS懸濁液)をガラス上に直接入れ、細胞を室温(RT)で30分間播種させる。
- ドロップを素早く削除します。作りたての4%PFA(PBS/0.1%TWEEN 20、pH 7.0、フィルター処理で調製)を10分間添加し、RTで播種細胞を固定します。
- RTで0.05%トリトンX-100/PBS(TPBS)でそれぞれ5分間3回洗浄します。
- 2.5 μLのRNaseカクテル(材料表)を250μLのPBS/ウェルに加えて、24ウェルプレートで37°Cで1時間処理します。
- PBSでリンスし、グリセロール/PBSを20%添加し、4°Cで一晩(ON)インキュベートします。
注: このステップの範囲は 1 時間から ON です。スライドは、最大7日間4°Cで20%グリセロール/PBSに保つことができます。 - ドライアイス(15-30s)で凍結し、RTで徐々に解凍し、20%のグリセロール/PBSに浸します。手順 2.1.9 をもう 3 回繰り返します。
- RTで0.5%TPBSで0.5%TPBSを0.05%TPBSで洗浄し、RTで5分間5分間、RT.1 N HClで0.1 N HClで2x SSCで12分間洗浄します。
- RTで50%ホルムアミドpH 7.0/2x SSC ONでインキュベート。
注:インキュベーション時間は最適化され、最終的に短縮できます。スライドは、50%のホルムアミド/2x SSCで数日間保持することができます。
- ヒト原発性筋芽細胞の細胞固定、前治療および透過性
注:このプロトコルは、細胞質の量が多い大きな細胞に適しています。- 成長培地(Dulbeccoの修飾イーグル培地(DMEM)、20%ウシ胎児血清(FBS)、25ng/mL線維芽細胞増殖因子(FGF)、10 ng/mL表皮成長因子(EGF)、10 μg/mLヒトインスリンのカバースリップガラス上でヒト原発性筋芽球を直接成長させる 1xグルタミン、1xペニシリン/ストレプトマイシン)少なくとも24時間(合流の50〜70%に達する)。
注:接着を容易にするために、ゼラチンまたはコラーゲンまたはポリL-リジンを使用して、播種前にカバースリップをコーティングすることができます。 - PBSの2-3変化で細胞をすすいでください。作りたての4%のPFAを加え、RTで10分間細胞を固定します。
- RTで0.01%TPBSでそれぞれ3分間3回洗浄します。
- 2.5 μLのRNaseカクテル(材料表)を250μLのPBS/ウェルに加えて、24ウェルプレートで37°Cで1時間処理します。
- PBSでリンスし、グリセロール/PBSを20%添加し、RTでオンにインキュベートします。
注: このステップの範囲は 1 時間から ON です。スライドは、最大7日間4°Cで20%グリセロール/PBSに保つことができます。 - ドライアイス(15-30s)で凍結し、RTで徐々に解凍し、20%のグリセロール/PBSに浸します。この手順を 3 回繰り返します。
- PBSでそれぞれ10分間3回洗います。2x SSCのRT.リンスで5分間0.1 N HClでインキュベートします。
- RTで50%ホルムアミドpH 7.0/2x SSC ONでインキュベート。
注:インキュベーションの時間を最適化し、最終的に短縮することができます。スライドは、50%のホルムアミド/2x SSCで数日間保持することができます。 - 2分間の2x SSCで平衡スライド(50%ホルムアミド/2x SSCに保持)次いで、PBSで3分間平衡化する。
- 細胞タイプに応じて、数秒から5分までの0.01 N HCl/0.0025%ペプシンで治療してください。このステップでは、光学顕微鏡下で細胞を観察し、核が細胞質から解放されるとすぐに反応を停止します(例えば、核オリは依然として目に見え、そのまま残されています)。
- 50 mM MgCl2/PBSでそれぞれ5分間2回洗浄してペプシンを不活性化します。
- 1% PFA/PBS で 1 分間の後の修正. 1 分間 洗浄 5 分 PBS.2x SSCでそれぞれ5分間2回洗浄し、少なくとも30分間50%のホルムアミド/2x SSCを加えます。
- 成長培地(Dulbeccoの修飾イーグル培地(DMEM)、20%ウシ胎児血清(FBS)、25ng/mL線維芽細胞増殖因子(FGF)、10 ng/mL表皮成長因子(EGF)、10 μg/mLヒトインスリンのカバースリップガラス上でヒト原発性筋芽球を直接成長させる 1xグルタミン、1xペニシリン/ストレプトマイシン)少なくとも24時間(合流の50〜70%に達する)。
3. 3DマルチカラーDNA FISHハイブリダイゼーション
- プローブを80°Cで5分間変性させ、すぐに氷の上に置きます。
- ハイブリダイゼーションプローブをクリーンな顕微鏡スライドにロードします。ハイブリダイゼーションプローブのドロップでセルを逆さまにしてカバースリップを回します。
- カバースリップをゴムセメントで密封します。ゴムセメントを完全に乾燥させます。次に、加熱ブロックの上にスライドを置き、4分間75°Cで変性します。
注:変性のタイミングと変性温度は、80°Cまで、拡張することができます。 - 水槽に浮かぶ金属箱の中で37°C ONでハイブリダイズ。
注:信号対雑音比を改善するために、ハイブリダイゼーション温度は42°Cまで上がることができます。 - ゴムセメントを剥がし、スライドを2x SCCに浸し、ガラスのカバースリップを取り除き、6ウェルプレートで2x SSCに移します。
- 2x SSCで3回37°Cで5分間、インキュベーターシェーカーで90rpmで振る。0.1x SSCで60°Cでそれぞれ5分間3回洗浄し、インキュベーターシェーカーで90rpmで振る。4x SSC/0.2%TWEEN 20で簡単にリンスしてください。
4. 3DマルチカラーDNA FISH検出
メモ: 直接ラベル付けされたプローブの場合は、手順 4.1 および 4.2 をスキップします。
- 4x SSC/0.2%TWEEN 20/4%ウシ血清アルブミン(BSA)で24ウェルプレートで37°Cで20分間ブロックし、インキュベーターシェーカーで20rpmで振る。
- 抗ジガニゲオキシゲチン(1:150)および/またはストレプトアビジン(1:1,000)(材料表)を4x SSC/0.2%TWEEN 20/4%BSAで37°Cの暗くて湿ったチャンバーで35分間希釈し、適切な濃度でインキュベートします。
- 4x SSC/0.2% TWEEN 20で37°Cでそれぞれ5分間3回洗浄し、インキュベーターシェーカーで6ウェルプレートで90rpmで振る。
- 24ウェルプレートでRTで2分間、2%ホルムアルデヒド/PBSでPBSを平衡化し、後修正します。
注: 直接ラベル付けされたプローブは、後固定する必要はありません。 - PBSで5倍の洗浄を短時間行います。RTで5分間1 ng /mL DAPI(4,6-ジアミジノ-2-フェニリンドール)/PBSを備えた染色。
- PBSで5倍の洗浄を短時間行います。アンチフェード溶液(材料のテーブル)でマウントします。
5. 3DマルチカラーDNA FISH顕微鏡と分析
- 顕微鏡システムで3D画像を取得。
注: ここでは、連続する断面間の軸方向の距離が 0.2~0.25 μm の広視野顕微鏡 (図 1B)が使用されます。 - さまざまなソフトウェアとツールを使用して3D画像スタックを解析します(ここでは、NuCLεDまたは3Dの核接触ロケータ)。
注:NuCLεDツールは、蛍光細胞画像zスタックで3DマルチカラーDNA FISHを自動的に分析するために開発されました。NuCLεDは、細胞画像スタックから3Dで核を再構成し、蛍光3Dスポットを検出して局クトします。これは、核内のスポットの相対的な位置(例えば、核の重心および/または核の周囲からの距離)および各核およびスポット間距離の最大半径を測定する。ツールと使用されるアルゴリズムは、コルテシら16で完全に説明されています。 - NuCLεDによって取得されたデータ(例えば、指定されたゲノム軌跡と核心重心と接触周波数との間の3D距離)を分析します。
注: 指定されたゲノム軌跡と核心心の間の 3D 距離の場合、各核の最大半径で距離を正規化し、これらのデータを核心重心からの正規化された距離の周波数分布として表します。長距離相互作用の研究では、接触周波数は10〜20%21の範囲にあり、距離間の閾値は変動し、2μm35前後で配置できる。- 統計解析を行うために、生体複製あたり約100個の核を分析します。指定されたゲノム遺伝子座間の3D距離を、選択した閾値間距離以下の距離の累積周波数分布として表し、t-testを使用して分布の差異の有意性を評価します。また、選択した距離間の閾値を下回る相互作用に対する核陽性の割合を計算し、フィッシャーの正確な検定を使用してパーセンテージの差異の有意性を評価します。
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Representative Results
本稿で説明した3D多色DNA FISHの方法により、保存された3D核内の異なるゲノム軌跡を現代的に視覚化することができます(図1B)。このプロトコルは、対立遺伝子と、それらの空間的近接性を評価するために異なるゲノム遺伝子座との間の距離の測定を可能にし、かつ、核空間内の位置(例えば、心積心または核の周囲からの軌跡距離)16を評価する。ただし、使用するセルの種類ごとに正確かつ具体的に設定する必要がある重要な手順は数多くあります。3D多色DNA FISHの成功のために、以下のステップに特に注意を払うことを強くお勧めします。
DNAプローブ調製の場合、プローブサイズが<200 bpであることを確認します(図1A)。このサイズにより、3D マルチカラー DNA FISH (図 1B)の手順が成功します。ニック翻訳によって生成された最適でないDNA FISHプローブは、部分的に消化することができる(図2A)または消化オーバー(図2B)。部分的に消化されたプローブでは、プローブが核に入り、相補的なゲノム遺伝子座に適切にハイブリダイズすることができないため、この手順は細胞内にシグナルを持たなくなります。消化されたプローブは、ハイブリダイゼーションの特異性の喪失と背景の結果的な増加のために、非特異的シグナルをもたらす。消化プローブの代表例は、図 3 B の最適な消化プローブと比較して、図 3Aに示されています。
脱蛋白とペプシン化のために、細胞の種類に応じてこれらの手順に従ってください。特に、核の大きさと細胞質の豊富さを考慮に入れます。ヒト原発性ex vivo単離Tリンパ球および小さく、高度に圧縮された核および低豊富な細胞質を有する細胞にとって、HCl脱タンパク質化は極めて重要である。5分の0.1 N HClでの治療は、DNA FISHの可視化には十分ではありません。0.1 N 12分間のHCl処理は、DNAプローブへの核のアクセスを促進し、核の完全性を維持するために推奨されます(図4A)。細胞質のペプシン消化は、DNA FISHの良好なシグナルを得るために必要ではない(図4B)。
ヒト原発性筋芽細胞および細胞質が大きい細胞にとって、ペプチド化ステップは基本である。細胞骨格の短く、最適でない消化は、核内のプローブの侵入を妨げる(図4C)、DNAFISHシグナルの不在で終わる。しかし、細胞がペプシン化された場合、核はそのまま残りません(図4D)、その3D構造を失います。成功した3DマルチカラーDNA FISHの例を図4Eに示します。
ハイブリダイゼーション中に、カバースリップを正確にシールします。そうでない場合、プローブは分散して乾燥します。変性とハイブリダイゼーションの工程は、プローブとゲノムDNAが再アニールしないように迅速に行われなければならない。変性の持続時間は増加させることができる。
図1:代表的なDNAプローブと3D多色DNA FISH(A)ニックは、2.2%のアガロースゲル(レーン1、2)、50bpマーカー(M)で最適なサイズのDNAプローブを翻訳した。(B) ヒト原発筋芽球の3q11.2領域(緑)、10q26.3領域(赤)および8q24.13領域(マゼンタ)にマッピングするプローブを用いた代表的な3DマルチカラーDNA FISH核。核は、DAPI(青)でカウンタを得る。63倍の倍率。スケールバー = 5 μm.この図の大きいバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図2:DNA FISHプローブを最適に消化しない例(A) 未消化(レーン1、2)または部分的に消化された(レーン3)ニック翻訳されたDNAプローブは、2.2%のアガロースゲル、2logマーカー(M)上で走る。(B) 消化された過剰なニック翻訳DNAプローブは、2.2%のアガロースゲル、2logマーカー(M)上で実行されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:最適でないまたは最適なDNA FISHプローブを用いた3DマルチカラーDNA FISHの比較(A)ヒト原発筋芽細胞における8q24.13領域(マゼンタ)への消化プローブマッピングを用いた代表的な3D多色DNA FISH核。核は、DAPI(青)でカウンタを得る。63倍の倍率。スケールバー = 10 μm. (B) ヒト原発筋芽細胞の 8q24.13 領域 (マゼンタ) に最適に消化されたプローブ マッピングを使用する代表的な 3D 多色 DNA FISH 核。核は、DAPI(青)でカウンタを得る。63倍の倍率。スケールバー = 10 μm.この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:3D多色DNA FISH結果に対する最適でない脱タンパク質化およびペプシン化ステップの可能性のある結果(A)代表的な3D多色DNAFISHのヒト一次Tリンパ球の核を5分間(左)または12分(右)0.1NHClで処理し、8q24.13領域(緑色)にプローブマッピングを使用する。核は、DAPI(青)でカウンタを得る。100倍の倍率。スケールバー = 10 μm. (B) ヒト初代Tリンパ球の代表的な3D多色DNA FISH核は、0.1 N HCl(左)で12分間処理されるか、0.01 N HCl/0.0025%ペプシンと2分間結合した(右)、8q24.13領域(緑色)へのプローブマッピングを使用する。核は、DAPI(青)でカウンタを得る。100倍の倍率。スケールバー = 10 μm.(C)ヒトの主要筋芽細胞の代表的な3D多色DNA FISH核は、8q24.13領域(マゼンタ)に対するプローブマッピングを用いて、短くてかつ最適でない消化で処理した。核は、DAPI(青)でカウンタを得る。63倍の倍率。スケールバー = 10 μm.(D)ヒトの一次筋芽細胞の代表的な3D多色DNA FISH核を、8q24.13領域(マゼンタ)に対するプローブマッピングを用いて、長期のペプシン処理工程で処理した。核は、DAPI(青)でカウンタを得る。63倍の倍率。スケールバー = 5 μm. (E) 代表的な 3D 多色 DNA のヒトプライマリ筋芽細胞の魚核は、プローブマッピングを用いて最適な HCl/ペプシン条件で処理された 8q24.13 領域 (マゼンタ) です。核は、DAPI(青)でカウンタを得る。63倍の倍率。スケールバー = 25 μm.この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ニック翻訳試薬 | 初期濃度 | 最終濃度 |
dMP (C-G-A) | 0.5 mM | 0.05 mM |
dTTP | 0.1 mM | 0.01 mM |
ビオチン/ディグ/Cy3 dUTP | 1 mM | 0.02 mM |
トリス HCl pH 7.8 | 1 M | 50 mM |
MgCl2 | 100 mM | 5 mM |
βメルカプトエタノール | 100 mM | 10 mM |
Bsa | 100 ng/μL | 10 ng/μL |
DNAポルI | 10 U/μL | 0.1 U/μL |
DNase I | 1 U/μL | 0.002 U/μL |
DNA 2 μg | X | X |
ddH2O | 最大50 μL |
表1:ニック翻訳。すべての試薬、それらの濃度およびニック翻訳反応のタイミングを示す表。
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Discussion
現在の方法は、ヒト一次細胞の広い範囲で3D多色DNA FISHを実行するためのステップバイステッププロトコルを記述する。DNA FISHは広く使用されている技術ですが、保存された3Dの相間核上の3D多色DNA FISHは、主に23、24を使用するサンプルの特性のために、多くの研究室で行うことが困難です。
プローブニック翻訳は、成功した3DマルチカラーDNA FISHのための基本的なステップです。多くの異なる基質(BAC、fosmid、プラスミド、PCR産物)をこの反応に使用することができ、反応および酵素濃度のタイミングは、基質の長さに対してそれに応じて調整することができる。適切なプローブの消化は、最適でないプローブ(図2)として、信号や非特異的シグナル(図3A)を生じさせるため、基本的な(図1)です。浸透、脱蛋白、および消化処理の工程は、使用する細胞型に強く依存する重要な通路です。エキビボ単離Tリンパ球のような小さな核および低い細胞骨格量を有する細胞は、0.1 N HCl治療を延長して脱タンパク化を必要とする。また、トリトンX-100の割合が高いPBSでのワッシュは、これらの細胞の核内のプローブエントリを助けることができます。逆に、インビトロ培養ヒト原発性筋芽細胞は、細胞骨格の含有量が高い、より大きな核を有する、ペプシンによる細胞分裂構造の消化を必要とする。これらの一般的な役割は、細胞の広い範囲に適用することができ、最終的には、特定の細胞特性に応じて異なるステップを組み合わせる。
作製した新鮮な生物学的材料、新鮮な溶液(特に洗剤を用いた溶液)、蛍光試薬の使用が強く示唆されている:pH 7.0で濾過されたPFA;pH 7.0でオートクレーブされ、フィルタリングされた20x SSC;pH 7.0で濾過されたフォルミド;ヌクレアーゼフリー水;そして変更されたUTPの使い捨て可能なアリコート。20%グリセロール/PBS、または50%ホルムアミド/2x SSCで長期インキュベーションは、ハイブリダイゼーションを容易にすることができます。HClおよび/またはペプシン治療は、さらに増加させることができる。ハイブリダイゼーションのタイミング、プローブの量、抗ジゴキシゲニンおよびストレプトアビジンのインキュベーションの濃度およびタイミングは、すべて、信号対雑音比を改善するように更に調整することができる。
3DマルチカラーDNA FISHは、Cベースの結果を検証するための標準的な方法であるC技術の補完ツールを表します。3D顕微鏡と解析と組み合わせると、3D多色DNA FISHは、ゲノム軌跡と核空間内のトポロジカル分布との間の近接性を単一細胞レベルでモニタリングできます。3DマルチカラーDNA FISHは、ゲノム遺伝子座、RNA(メッセンジャーRNAまたは調節非コードRNA)と広範囲のダイナミクスと相互作用の包括的な概要を包括的に把握するために、RNA FISHや免疫蛍光などの他の方法とさらに統合することができますタンパク質の、核構造を可視化し、細胞の同一性を抑えるエピジェネティックなメカニズムを調査するユニークな機会を提供します。
超解像度25、26、生細胞イメージング27、28、36、単一分子検出37を有するFISH技術の大幅な改善にもかかわらず、オリゴペイント37、38のようなオリゴヌクレオチドアレイを有する複数の標的の現代的な視覚化39は、3Dハイスループットアプローチ39を有する、技術の限界は、所定のゲノムロキの離散数のままである視覚化されます。これにより、原子力建築の広範な分析が妨げられています。最近、いくつかの研究では、バーコードDNA FISH40、41、42、43などの単一細胞におけるゲノム組織に対処するためのハイブリダイゼーションの逐次的な方法を説明している。3D多色DNA FISHの単一細胞性をゲノムワイドな特徴に組み合わせることで、一度にテストできる遺伝子座の数が増えるにつれて、核アーキテクチャの不均一性をイメージング技術で広く可視化するために、さらなる努力が必要です。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、3D多色DNA FISH画像の間の支援のために、INGMイメージング施設(イシティト・ナツィオナーレ・ディ・ジェネティスタ・モレコラレ「ロミオ・エド・エンリカ・インヴェルニッツィ」(INGM)、ミラノ、ミラノ、特にC.コルディグリエリの技術的支援を認める取得。この作品は、B.B.への助成金、EPIGENイタリアの旗艦プログラム、協会フランセーズ・コントル・レ・ミオパシー(AFM-Telethon、助成金nr 18754)、イタリア保健省のジョヴァニ・リセルカトリ(GR-2011-02349383)に支えられてきました。この作品は、F.M.への以下の助成金によって支えられてきました:フォンダツィオーネ・カリプロ(バンド・ジョヴァーニ、グラントnr 2018-0321)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
bFGF | PeproTech | 100-18B | |
Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
DNase I | Sigma | AMPD1 | |
dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
EGF | Sigma | E9644.2MG | |
Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
Formamide | Sigma | F9037 | |
Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
HCl | Sigma | 30721 | |
Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
MgCl2 | Sigma | 63069 | |
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
NaCl | Sigma | S9888 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
Pepsin | Biorad | P6887 | |
PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
Rubbercement | Bostik | ||
Slides | VWR | 631-0114 | |
Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
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