Summary
3D flerfarget DNA FISH representerer et verktøy for å visualisere flere genomiske loci innen 3D bevarte kjerner, utvetydig definere sine gjensidige interaksjoner og lokalisering i kjernefysisk plass på et enkelt cellenivå. Her er en trinnvis protokoll beskrevet for et bredt spekter av menneskelige primærceller.
Abstract
Et stort spørsmål i cellebiologi er genomisk organisasjon innen atomrommet og hvordan kromatinarkitektur kan påvirke prosesser som genuttrykk, celleidentitet og differensiering. Mange tilnærminger utviklet for å studere 3D-arkitekturen i genomet kan deles inn i to komplementære kategorier: kromosomkonformasjon fangst basert teknologi (C-teknologier) og bildebehandling. Mens den tidligere er basert på å fange kromosomkonformasjonen og proksimale DNA-interaksjoner i en populasjon av faste celler, tillater sistnevnte, basert på DNA-fluorescens i situ hybridisering (FISH) på 3D-bevarte kjerner, moderne visualisering av flere loci på et enkelt cellenivå (flerfarget), undersøke deres interaksjoner og distribusjon i kjernen (3D flerfarget DNA FISH). Teknikken for 3D flerfarget DNA FISH har en begrensning av å visualisere bare noen få forhåndsbestemte loci, ikke tillater en omfattende analyse av kjernefysisk arkitektur. Men gitt robustheten av resultatene, er 3D flerfarget DNA FISH i kombinasjon med 3D-mikroskopi og bilderekonstruksjon en mulig metode for å validere C-teknologibaserte resultater og å entydig studere posisjonen og organiseringen av spesifikke loci på ett enkelt cellenivå. Her foreslår vi en trinnvis metode for 3D flerfarget DNA FISH egnet for et bredt spekter av menneskelige primærceller og diskutere alle praktiske handlinger, avgjørende trinn, forestillinger om 3D-avbildning og dataanalyse som trengs for å oppnå en vellykket og informativ 3D flerfarget DNA FISH innenfor ulike biologiske sammenhenger.
Introduction
Høyere eukaryoter må systematisk kondensere og komprimere en stor mengde genetisk informasjon i minuttet 3D-rommet i kjernen1,2,3,4. I dag vet vi at genomet er romlig bestilt i rom og toologisk tilknyttede domener5, og at de flere nivåene av DNA-folding genererer kontakter mellom forskjellige genomiske regioner som kan innebære kromatinsløyfedannelse6,7. 3D dynamisk looping av kromatin kan påvirke mange forskjellige biologiske prosesser som transkripsjon8,9, differensiering og utvikling10,11, DNA reparasjon12,13, mens perturbations er involvert i ulike sykdommer14,15,16 og utviklingsdefekter15,17,18.
Mange tilnærminger har blitt utviklet for å studere 3D genom organisasjon. Kromosom konformasjonfangstbaserte teknologier (C-teknologier, 3C, 4C, 5C, Hi-C og derivater) er utviklet for å studere genomorganisasjon i faste celler3,4,19,20. Slike tilnærminger er basert på evnen til å fange kontaktfrekvensene mellom genomisk loci i fysisk nærhet. C-teknologier, avhengig av deres kompleksitet, fange den globale 3D genom organisasjon og kjernefysisk topologi av en cellepopulasjon3,4,19,20. Likevel er 3D-interaksjoner dynamiske i tid og rom, svært variabel mellom individuelle celler som består av multipleksinteraksjoner, og er omfattende heterogene21,22.
3D multicolor DNA fluorescens in situ hybridization (FISH) er en teknikk som gjør det mulig å visualisere spesifikke genomiske loci på et enkelt cellenivå, slik at direkte undersøkelse av 3D kjernefysisk arkitektur på en komplementær måte til C-teknologier. Det representerer en teknologi som for tiden brukes til å utvetydig validere C-resultater. 3D flerfarget DNA FISH bruker fluorescerende merkede sonder komplementære til genomiske loci av interesser. Bruk av forskjellige fluoropforer og egnet mikroskopiutstyr tillater moderne visualisering av flere mål innenfor kjernefysisk rom23,24. De siste årene har FISH blitt kombinert med teknologiske fremskritt i mikroskopi for å oppnå visualisering av finskala strukturer med høy oppløsning25,26 eller med CRISPR-Cas tilnærminger for visualisering av nukleinsyrer i live imaging27,28. Til tross for bred adopsjon, 3D flerfarget DNA FISH tilnærming er fortsatt ansett vanskelig i mange laboratorier fordi det biologiske materialet som brukes må tilpasses.
Her gir vi en omfattende protokoll for 3D flerfarget DNA FISH (fra celle / probe forberedelse til dataanalyse) som gjelder for et bredt spekter av menneskelige primære celler, slik at visualisering av flere genomiske loci og bevare 3D-strukturen av kjerner. For å studere kjernefysisk arkitektur må 3D-strukturen av kjerner bevares. Av denne grunn, kontrasterende fra andre eksisterende protokoller29,30,31, unngår vi bruk av en alkoholgradient og lagring av coverslips i alkohol som kan påvirke kromatinstruktur32. Metoden er tilpasset fra bevarte 3D DNA FISH protokoller24,33 som skal brukes på et bredt spekter av menneskelige primære celler, både isolert ex vivo eller kultivert in vitro. Det er permeabilisering sparameme- og deproteiniseringsparametere for ulike nuklekjernemorfologi og cytologiske egenskaper (f.eks. forskjellige grader av kjernefysisk komprimering, cytoskeleton overflod)34. Disse parametrene er ofte generelt beskrevet i andre protokoller24,33, uten å gi en klar diskriminering av prosedyren innenfor ulike celletyper. Videre utviklet vi et spesifikt verktøy kalt NuCLεD (kjernefysisk kontaktlokator i 3D)16, og gir prinsipper for dataanalyse som vil forbedre 3D-nærheten mellom ulike loci og deres kjernefysiske totoologiske distribusjon innen atomrommet på en automatisert måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA sonde forberedelse og merking prosedyrer med nick oversettelse
- Renog rengjør bakterielle kunstige kromosomer (BACer), plasmider eller PCR-produkter med spesifikke sett (Materialtabell),resuspender i ddH2O, sjekk med elektroforese på en agarosegel og kvantifiser.
- Utfør nick oversettelse på 1,5-2 μg DNA fra trinn 1.1 i et endelig volum på 50 μL ved å blande alle reagensene i en 0,5 ml lavbinding DNA-rør i henhold til tabell 1.
MERK: Direkte merkede prober kan forbedre signalet til støyforholdet. Kits å produsere indirekte og direkte merkede sonder med ulike Alexa fluorochromes av nick oversettelse er kommersielt tilgjengelig. - Inkuber nickoversettelsesblandingen i en termisk mikser ved 16 °C for en tid, avhengig av lengden på start-DNA-materialet: 45 min for PCR-produkter (et basseng med PCR-produkter på 2000 bp hver) og opptil 4 timer for BAC DNA og plasmider.
- Kontroller størrelsen på sondene som produseres i trinn 1,3 av elektroforese på en 2,2% agarosegel.
MERK: Den optimale sondestørrelsen er <200 bp (Figur 1A).- Hvis DNA ikke er fordøyd nok, tilsett 5 U av DNA polymerase I og 0,05 U av DNase I til reaksjonen og inkubatoren i 1-2 timer ved 16 °C og deretter re-sjekk. Stopp reaksjonen med 0,5 mM EDTA (endelig konsentrasjon). Lagre prober ved -20 °C.
- For hvert DNA FISH-eksperiment, utløse følgende mengder sonder avhengig av start-DNA-materialet som sondene produseres fra: 200 ng fra nick oversatte PCR-produkter, 100 ng fra nick oversatte BACer, eller 300 ng fra nick oversatt plasmid. Tilsett ddH2O opptil 150 μL, 20 μg umerket laksesperm DNA, 3,5 μg artsspesifikt Cot-1 DNA, 3 volumer på 100% EtOH og 1/10 volum av 3 M natriumacetat pH 5.2. Stup ved -80 °C i 1 timer.
- Sentrifuge med maksimal hastighet i 1 t ved 4 °C og kast supernatanten. Vask pelleten to ganger med 70% EtOH.
- Resuspender pelleten i 2 μL på 100% formamid pH 7,0, rist ved 40 °C i 30 min (kan ta opptil noen timer) og deretter legge til et likt volum på 4x saltvannsnatriumsitrat (SSC) /20% dextran sulfat.
- Forbered 20x SSC ved å blande 175,3 g NaCl og 88,2 g natriumsitrat i et endelig volum på 1 L H2O. Autoklav, filtrer og klargjør aliquots.
MERK: For flerfarget DNA FISH kan de forskjellige sondene utløses sammen, bortsett fra sonder som kan gløde med hverandre. I disse spesifikke tilfellene behandler du dem separat, utfeller og suspenderer sondene som deler reagensene som er nevnt i trinn 1,5−1,7 med hensyn til antall sonder. Pool sondene bare etter resuspensjon i formamid. Hvis glasstrekkslepper som er større enn 10 mm eller mindre enn 10 mm, skaleres opp/ned volumet på reagensene som brukes i trinn 1,5−1,7 proporsjonalt med lysbildestørrelsen. Hybridiseringsprober kan lagres ved -20 °C i lang tid (opptil to måneder).
- Forbered 20x SSC ved å blande 175,3 g NaCl og 88,2 g natriumsitrat i et endelig volum på 1 L H2O. Autoklav, filtrer og klargjør aliquots.
2. Cell fiksering, pre-behandling og permeabilisering
MERK: Permeabiliserings- og deproteiniseringspassasjer er avgjørende skritt. Tidspunktet for reaksjon og konsentrasjon av reagensene er sterkt avhengig av celletypen, cytoplasmaoverfloden og kjernemorfologien.
- Cellefiksering, pre-behandling og permeabilisering for humane primære T-lymfocytter
MERK: Denne protokollen er egnet for små celler, med små kjerner og en lav mengde cytoplasma.- Bruk glassdekk (10 mm, tykkelse nr. 1,5 H).
- Vask glasset med ddH2O, deretter med 70% EtOH og la dem tørke. Bruk ett glass for hver brønn av en 24-brønns tallerken.
- Tilsett 200 μL 0,1 % poly-L-lysin (m/v) (Materialtabell) direkte på glasset for å danne en dråpe. Vær oppmerksom da dråpen må forbli på glassoverflaten uten å berøre brønnen i 2-5 min. La ut fallet forsiktig, og la glasset tørke i 30 min.
- Utfør trinn 2.1.3 to ganger til.
- Sett 200 μL suspensjonceller (2 x 106/ ml, PBS suspensjon av ex vivo primære T-lymfocytter) direkte på glasset, la cellene frø ved romtemperatur (RT) i 30 min.
- Fjern raskt dråpen. Tilsett nylaget 4% PFA (tilberedt i PBS/0,1% TWEEN 20, pH 7.0, filtrert) i 10 min og fest de seedede cellene på RT.
- Vask tre ganger i 5 min hver med 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) ved RT. Permeabilize med 0,5% TPBS for 10 min ved RT.
- Utfør RNase behandling ved å legge til 2,5 μL RNase cocktail (Materialtabell) i 250 μL PBS/brønn i en 24-brønnsplate i 1 time ved 37 °C.
- Skyll i PBS, tilsett 20% glyserol/PBS, og inkuber over natten (ON) ved 4 °C.
MERK: Dette trinnet kan variere fra 1 t til PÅ. Lysbilder kan oppbevares i 20 % glyserol/PBS ved 4 °C opptil 7 dager. - Frys på tørris (15–30 s), tin gradvis ved RT og bløt legg i 20 % glyserol/PBS. Gjenta trinn 2.1.9 ytterligere tre ganger.
- Vask i 0,5% TPBS i 5 min ved RT. Vask i 0,05% TPBS, to ganger i 5 min ved RT. Inkubat i 0,1 N HCl i 12 min ved RT. Skyll i 2x SSC.
- Inkuber i 50 % formamid pH 7,0/2x SSC ON ved RT.
MERK: Inkubasjonstiden kan optimaliseres og til slutt reduseres. Lysbilder kan oppbevares i 50 % formamid/2x SSC i flere dager.
- Cellefiksering, pre-behandling og permeabilisering for humane primære myoblaster
MERK: Denne protokollen er egnet for store celler, med høy mengde cytoplasma.- Vokse menneskelige primære myoblaster direkte på coverslip briller i 24-brønnplater i vekstmedium (Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM), 20% føtal storfe serum (FBS), 25 ng / ml fibroblast vekstfaktor (FGF), 10 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF), 10 μg / ml humant insulin, 1x glutamin, 1x penicillin/streptomycin) i minst 24 timer (når 50-70% av samtidige).
MERK: For å lette vedhekingen, kan gelatin eller kollagen eller poly-L-lysin brukes til å belegge dekksslipen før seedingen. - Skyll celler i 2–3 endringer av PBS. Tilsett nylaget 4% PFA og fikse cellene i 10 min på RT.
- Vask tre ganger i 3 min hver i 0,01% TPBS på RT. Permeabilize i 0,5% TPBS for 10 min på RT.
- Utfør RNase behandling ved å legge til 2,5 μL RNase cocktail (Materialtabell) i 250 μL PBS/brønn i en 24-brønnsplate i 1 time ved 37 °C.
- Skyll i PBS, tilsett 20% glyserol / PBS, og inkuber PÅ ved RT.
MERK: Dette trinnet kan variere fra 1 t til PÅ. Lysbilder kan oppbevares i 20 % glyserol/PBS ved 4 °C opptil 7 dager. - Frys på tørris (15–30 s), tin gradvis ved RT og bløt legg i 20 % glyserol/PBS. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Vask tre ganger i 10 min hver i PBS. Inkuber i 0,1 N HCl i 5 min ved RT. Skyll i 2x SSC.
- Inkuber i 50 % formamid pH 7,0/2x SSC ON ved RT.
MERK: Inkubasjonstiden kan optimaliseres og til slutt reduseres. Lysbilder kan oppbevares i 50 % formamid/2x SSC i flere dager. - Equilibrate lysbilder (holdt i 50% formamid / 2x SSC) i 2x SSC i 2 min. Deretter likevekt i PBS i 3 min.
- Behandle med 0,01 N HCl/0,0025% pepsin fra noen få sekunder opp til 5 min, avhengig av celletypen. I løpet av dette trinnet, observere cellene under et optisk mikroskop og stoppe reaksjonen (trinn 2.2.11) så snart kjernene er fri fra cytoplasma, samtidig opprettholde sin struktur intakt (f.eks nucleoli er fortsatt synlig og intakt).
- Inaktiver pepsin ved å vaske to ganger i 5 min hver i 50 mM MgCl2/PBS.
- Post-fix i 1% PFA / PBS i 1 min. Vask i 5 min i PBS. Vask to ganger i 5 min hver i 2x SSC, og tilsett deretter 50% formamid / 2x SSC i minst 30 min.
- Vokse menneskelige primære myoblaster direkte på coverslip briller i 24-brønnplater i vekstmedium (Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM), 20% føtal storfe serum (FBS), 25 ng / ml fibroblast vekstfaktor (FGF), 10 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF), 10 μg / ml humant insulin, 1x glutamin, 1x penicillin/streptomycin) i minst 24 timer (når 50-70% av samtidige).
3. 3D flerfarget DNA FISK hybridisering
- Denature sondene ved 80 ° C i 5 min, og deretter sette raskt på is.
- Legg hybridiseringsprobene på et rent mikroskoplysbilde. Snu dekksklien med celler opp ned på dråpe hybridiseringsprober.
- Forsegle dekksslip med gummisement. La gummisementen tørke helt. Plasser deretter lysbilder på en varmeblokk og denature ring ved 75 °C i 4 min.
MERK: Tidspunktet for denaturering og temperatur for denaturering kan økes, opptil 80 °C. - Hybridiser ved 37 °C PÅ i en metallisk boks som flyter i et vannbad.
MERK: For å forbedre signal-til-støy-forholdet kan hybridiseringstemperaturen gå opp til 42 °C. - Skrell av gummisement, dypp lysbildene i 2x SCC, fjern glassdekselet og overfør den til 2x SSC i 6-brønnsplate.
- Vask i 2x SSC tre ganger i 5 min hver ved 37 °C, risting ved 90 o/min i en inkubatorshaker. Vask i 0,1 x SSC tre ganger i 5 min hver ved 60 °C, risting på 90 o/min i en inkubatorshaker. Skyll kort i 4x SSC/0,2 % TWEEN 20.
4. 3D flerfarget DNA FISH deteksjon
MERK: For direkte merkede prober hopper du over trinn 4.1 og 4.2.
- Blokker i 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% storfe serum albumin (BSA) for 20 min ved 37 ° C i en 24-brønnplate, risting på 20 rpm i en inkubator shaker.
- Inkuber med riktig konsentrasjon av anti-digoksygenin (1:150) og/eller streptavidin (1:1000) (Materialtabell) fortynnet i 4x SSC/0,2 % TWEEN 20/4% BSA i 35 min i et mørkt og vått kammer ved 37 °C.
- Vask i 4x SSC/0,2% TWEEN 20 tre ganger i 5 min hver ved 37 °C, risting på 90 o/min i en 6-brønnsplate i en inkubatorshaker.
- Likevekt i PBS og post-fix i 2% formaldehyd / PBS for 2 min på RT i en 24-brønnplate.
MERK: Direkte merkede sonder trenger ikke etterfiksering. - Vask 5x kort i PBS. Flekk med 1 ng/ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindzol)/PBS i 5 min ved RT.
- Vask 5x kort i PBS. Monter med antifadeoppløsning (Materialtabell).
5. 3D flerfarget DNA FISH mikroskopi og analyse
- Få 3D-bilder med et mikroskopsystem.
MERK: Her brukes et widefield-mikroskop med en aksial avstand på 0,2−0,25 μm mellom etterfølgende seksjoner (figur 1B). - Analyser 3D-bildestabler ved hjelp av forskjellig programvare og verktøy (her, NuCLεD eller Nuclear Contacts Locator i 3D).
MERK: Verktøyet NuCLεD er utviklet for å automatisk analysere 3D flerfarget DNA FISH i fluorescenscellebilde z-stabler. NuCLεD rekonstruerer kjernene fra cellebildestabler i 3D, samt oppdager og lokaliserer fluorescerende 3D-flekker. Den måler relativ posisjonering av flekker i kjernen (f.eks. avstand fra kjernens centroiog/eller periferi) og maksimumsradiusen for hver kjerne og mellomflekker. Verktøyet og algoritmen som brukes er fullstendig beskrevet i Cortesi et al.16. - Analyser dataene (f.eks. 3D-avstander mellom spesifisert genomisk loci og kjernecentroid- og kontaktfrekvensene) hentet av NuCLεD.
MERK: For 3D-avstander mellom spesifisert genomisk loci og kjernecentroid, normalisere avstander på maksimal radius for hver kjerne og representere disse dataene som frekvensfordelinger av normaliserte avstander fra kjernecentroid. For samhandlingsstudier med lang rekkevidde skal kontaktfrekvenser være i området 10–20 %21 med en terskel mellomdistanse som kan variere og kan settes rundt 2 μm35.- For å utføre statistisk analyse, analyser ca. 100 kjerner per biologisk replika. Representer 3D-avstander mellom spesifisert genomisk loci som kumulative frekvensfordelinger av avstander som er under terskelen inter-avstand valgt og bruke en t-testfor å vurdere betydningen av forskjeller i distribusjonene. Beregn også prosentandelen av kjerner positivt for samhandlingene som er under terskelinterdistansen som er valgt, og bruk Fishers nøyaktige test for å vurdere betydningen av forskjeller i prosentene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden for 3D flerfarget DNA FISH beskrevet i denne artikkelen tillater moderne visualisering av ulike genomiske loci innenfor bevarte 3D-kjerner (Figur 1B). Denne protokollen tillater måling av avstander mellom alleler, og ulike genomiske loci for å evaluere deres romlige nærhet, og å vurdere deres plassering innenfor kjernefysiskplass (f.eks. loci avstand fra centroid eller periferien av kjernene)16. Det er imidlertid mange viktige trinn som må være nøyaktig og spesifikt satt opp for hver celletype som brukes; Det anbefales på det sterkeste å være spesielt oppmerksom på følgende trinn for å lykkes med 3D flerfarget DNA FISH.
For DNA-sondeforberedelse må du kontrollere at sondestørrelsen er <200 bp (figur 1A). Denne størrelsen sikrer en vellykket prosedyre av 3D flerfarget DNA FISH (Figur 1B). Suboptimale DNA FISH-prober produsert av nickoversettelse kan delvis fordøyes (figur 2A) eller over fordøyd (Figur 2B). Med delvis fordøyd prober vil prosedyren ikke ha noe signal i cellene, på grunn av manglende evne til sonden til å komme inn i kjernene og riktig hybridisere til komplementære genomiske loci. Over fordøyd prober vil resultere i et uspesifikt signal, på grunn av tap av spesifisitet i hybridisering og en påfølgende økning av bakgrunnen. Et representativt eksempel på over fordøyd prober er vist i figur 3A i forhold til en optimal fordøyd sonde i figur 3B.
For deproteinisering og pepsinisering, følg disse trinnene i henhold til celletypen. Spesielt ta hensyn til kjernefysisk størrelse og cytoplasma overflod. For humane primære ex vivo isolerte T-lymfocytter og celler med små, svært komprimerte kjerner og lav rikelig cytoplasma, er HCl deproteinisering avgjørende. Behandling med 0,1 N HCl i 5 min er ikke tilstrekkelig for DNA FISH visualisering. 0,1 N HCl-behandling i 12 min anbefales å fremme kjernetilgjengelighet til DNA-sonder og bevare kjernefysisk integritet (figur 4A). Pepsin fordøyelse av cytoplasma er ikke nødvendig for å få et godt signal om DNA FISH (Figur 4B).
For menneskelige primære myoblaster og celler som har store kjerner og rikelig cytoplasma, er pepsiniseringstrinnet grunnleggende. En kort og suboptimal pepsinisering av cytoskjelettet vil hemme oppføringen av sonden i kjernene (Figur 4C),som slutter i fravær av et DNA FISH-signal. Men hvis cellene er over pepsinisert, vil ikke kjerner forbli intakte (Figur 4D), og mister sin 3D-struktur. Et eksempel på vellykket 3D flerfarget DNA FISH er gitt i figur 4E.
Under hybridisering, forsegle dekseletslip nøyaktig; Ellers vil sonden spre seg og tørke. Denatureation og hybridisering skritt må utføres raskt slik at sonden og genomisk DNA ikke vil reanneal. Varigheten av denaturering kan økes.
Figur 1: Representative DNA-sonder og 3D flerfarget DNA FISH. (A) Nick oversatt DNA-sonder av optimal størrelse kjøre på en 2,2% agarose gel (lane 1, 2), 50 bp markør (M). (B) Representativ 3D flerfarget DNA FISH kjerne ved hjelp av probes kartlegging til 3q11.2 region (grønn), 10q26.3 region (rød) og 8q24.13 region (magenta) i menneskelige primære myoblaster. Nuclei er motfarget med DAPI (blå). 63x forstørrelse. Skala bar = 5 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempler på ikke optimalt fordøyd DNA FISH-sonder. (A) Ikke fordøyd (lane 1, 2) eller delvis fordøyd (lane 3) nick oversatt DNA probes kjøre på en 2,2% agarose gel, 2log markør (M). (B) Over fordøyd nick oversatt DNA-sonder kjøre på en 2,2% agarose gel, 2log markør (M). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Sammenligning av 3D flerfarget DNA FISH ved hjelp av suboptimale eller optimale DNA FISH-sonder. (A) Representative 3D flerfarget DNA FISH kjerner ved bruk over fordøyd sonde kartlegging til 8q24.13 region (magenta) i menneskelige primære myoblaster. Nuclei er motfarget med DAPI (blå). 63x forstørrelse. Skala bar = 10 μm. (B) Representativ 3D flerfarget DNA FISH kjerner ved hjelp av optimalt fordøyd sonde kartlegging til 8q24.13 region (magenta) i menneskelige primære myoblaster. Nuclei er motfarget med DAPI (blå). 63x forstørrelse. Skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Mulige utfall av suboptimal deproteinisering og pepsinisering trinn på 3D flerfarget DNA FISH resultater. (A) Representative 3D flerfarget DNA FISH kjerner av humane primære T-lymfocytter behandlet i 5 min (venstre) eller 12 min (høyre) med 0,1 N HCl, ved hjelp av sondekartlegging til 8q24.13 region (grønn). Nuclei er motfarget med DAPI (blå). 100x forstørrelse. Skala bar = 10 μm. (B) Representative 3D flerfarget DNA FISH kjerner av humanprimær t lymfocytter behandlet i 12 min med 0,1 N HCl (venstre) eller kombinert med 0,01 N HCl/0,0025% pepsin for 2 min (høyre), ved hjelp av sonde kartlegging til 8q24.13 region (grønn). Nuclei er motfarget med DAPI (blå). 100x forstørrelse. Skala bar = 10 μm. (C) Representative 3D flerfarget DNA FISH kjerner av menneskelige primære myoblaster behandlet med kort og suboptimal pepsinization, ved hjelp av sonde kartlegging til 8q24.13 region (magenta). Nuclei er motfarget med DAPI (blå). 63x forstørrelse. Skala bar = 10 μm. (D) Representative 3D flerfarget DNA FISH kjerner av menneskelige primære myoblaster behandlet med langvarig pepsinization trinn, ved hjelp av sonde kartlegging til 8q24.13 region (magenta). Nuclei er motfarget med DAPI (blå). 63x forstørrelse. Skala bar = 5 μm. (E) Representative 3D flerfarget DNA FISH kjerner av menneskelige primære myoblaster behandlet med optimale HCl / pepsin forhold ved hjelp av sonde kartlegging til 8q24.13 region (magenta). Nuclei er motfarget med DAPI (blå). 63x forstørrelse. Skala bar = 25 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Nick oversettelse reagenser | Innledende konsentrasjon | Endelig konsentrasjon |
| DNtPs (C-G-A) | 0,5 mM | 0,05 mM |
| dTTP (andre) | 0,1 mM | 0,01 mM |
| Biotin/Dig/Cy3 dUTP | 1 mM (andre) | 0,02 mM |
| Tris HCl pH 7.8 | 1 M (andre) | 50 mM |
| MgCl2 (Andre) | 100 mM | 5 mM (andre) |
| β-merkaptoetanol | 100 mM | 10 mM |
| Bsa | 100 ng/μL | 10 ng/μL |
| DNA Pol I | 10 U/μL | 0,1 U/μL |
| DNase I | 1 U/μL | 0,002 U/μL |
| DNA 2 μg | X | X |
| DdH2O | Opptil 50 μL |
Tabell 1: Nick Oversettelse. Tabell som beskriver alle reagensene, konsentrasjonen og foreslåtte timing for nickoversettelsesreaksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende metoden beskriver en trinnvis protokoll for å utføre 3D flerfarget DNA FISH på et bredt spekter av menneskelige primære celler. Selv om DNA FISH er en teknologi i bred bruk, er 3D flerfarget DNA FISH på bevarte 3D-interfasekjerner fortsatt vanskelig å utføre i mange laboratorier, hovedsakelig på grunn av egenskapene til prøvene som brukes23,24.
Probe nick oversettelse er et grunnleggende skritt for vellykket 3D flerfarget DNA FISH; forskjellige substrater (BAC, fosmid, plasmid, PCR-produkter) kan brukes til denne reaksjonen, og tidspunktet for reaksjonen og enzymkonsentrasjonen kan justeres tilsvarende med hensyn til lengden på substratet. En riktig probe fordøyelse er grunnleggende (Figur 1), som ikke-optimale sonder (Figur 2) vil resultere i ingen signal eller et uspesifikt signal (Figur 3A). Permeabilisering, deproteinisering og pepsiniseringtrinn er avgjørende passasjer som sterkt avhenger av celletypen som brukes. Celler med små kjerner og lav cytoskeleton overflod, som ex vivo isolerte T-lymfocytter, krever deproteinisering med en langvarig 0,1 N HCl behandling. Også vasker i PBS med høyere prosentandeler av Triton X-100 kan hjelpe sondeoppføring i kjernene i disse cellene. Tvert imot, in vitro kultiverte menneskelige primære myoblaster som presenterer større kjerner, med høyt innhold av cytoskeleton, trenger fordøyelsen av cytosolic strukturer med pepsin. Disse generelle rollene kan brukes på et bredt spekter av celler, og til slutt kombinere de forskjellige trinnene avhengig av de spesifikke cellulære egenskapene.
Bruk av nyforberedt biologisk materiale, friske løsninger (spesielt løsninger med vaskemiddel) og fluorescerende reagenser foreslås sterkt: filtrert PFA ved pH 7.0; autoclaved og filtrert 20x SSC ved pH 7.0; filtrert formamid ved pH 7.0; kjernefritt vann; og engangsaliquots av modifisert UTP. Langvarig inkubasjon med 20 % glyserol/PBS, eller 50 % formamid/2x SSC kan lette hybridiseringen. HCl- og/eller pepsinbehandling kan økes ytterligere. Tidspunktet for hybridisering, mengden av sonder, konsentrasjonog tidspunktet for inkubasjon av anti-digoksigenin og streptavidin kan alle justeres ytterligere for å forbedre signalet til støyforholdet.
3D flerfarget DNA FISH representerer et komplementært verktøy til C-teknologier, standardmetoden for å validere C-baserte resultater. Hvis kombinert med 3D mikroskopi og analyse, 3D flerfarget DNA FISH kan overvåke nærhet mellom genomisk loci og deres topologiske distribusjon i kjernefysisk plass på enkeltcellenivå. 3D flerfarget DNA FISH kan integreres ytterligere med andre metoder som RNA FISH og immunofluorescence for en omfattende oversikt over dynamikken og interaksjonene mellom genomisk loci, RNAs (messenger RNA eller regulatorisk ikke-koding RNA) og et bredt spekter proteiner, noe som gir en unik mulighet til å visualisere kjernefysisk struktur og undersøke de epigenetiske mekanismene som subenerer cellulær identitet.
Til tross for den enorme forbedringen av FISH-teknologier med superoppløsning25,26, levende cellebildebehandling27,28,36, enkeltmolekyldeteksjon37, og moderne visualisering av flere mål med oligonucleotid arrayer som Oligopaint37,38 med 3D høy gjennomstrømning tilnærminger39, en begrensning av teknologien forblir diskret antall forhåndsbestemte genomiske loci som kan visualiseres. Dette forhindrer en omfattende analyse av kjernefysisk arkitektur. Flere studier har nylig beskrevet sekvensielle metoder for hybridisering for å adressere genomorganisasjon i enkeltceller som strekkode DNA FISH40,41,42,43. Ytterligere tiltak vil være nødvendig for å pare enkeltcellearten til 3D flerfarget DNA FISH for å genome brede funksjoner for å visuele kjernefysisk arkitektur heterogenitet med bildeteknologi, da antall loci som kan testes om gangen vil øke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner teknisk assistanse fra INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milano, Italia), spesielt C. Cordiglieri, for hjelp under 3D flerfarget DNA FISH-bilder Oppkjøpet. Dette arbeidet har blitt støttet av følgende tilskudd til B.B.: EPIGEN italiensk flaggskipprogram, Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) og Giovani Ricercatori, italiensk helsedepartement (GR-2011-02349383). Dette arbeidet har blitt støttet av følgende tilskudd til F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, Pt 2 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , Chapter 4, Unit 4 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
