Summary
3D multicolor DNA FISH repræsenterer et værktøj til at visualisere flere genomiske loci inden for 3D bevaret kerner, utvetydigt definere deres gensidige interaktioner og lokalisering i det nukleare rum på et enkelt celleniveau. Her beskrives en trinvis protokol for et bredt spektrum af humane primære celler.
Abstract
Et vigtigt spørgsmål i cellebiologi er genomisk organisation inden for det nukleare rum, og hvordan kromatinarkitektur kan påvirke processer som genekspression, celleidentitet og differentiering. Mange tilgange udviklet til at studere 3D-arkitekturen af genomet kan opdeles i to komplementære kategorier: kromosom kropsbygning capture baseret teknologier (C-teknologier) og billeddannelse. Mens førstnævnte er baseret på at fange de kromosom reformation og proksimale DNA interaktioner i en population af faste celler, sidstnævnte, baseret på DNA fluorescens in situ hybridization (FISH) på 3D-bevarede kerner, giver mulighed for moderne visualisering af multipel loci på et enkelt celleniveau (multifarve), undersøge deres interaktioner og fordeling i kernen (3D multicolor DNA FISH). Teknikken med 3D multicolor DNA FISH har en begrænsning af visualisere kun et par forudbestemt loci, ikke tillader en omfattende analyse af den nukleare arkitektur. I betragtning af resultaternes robusthed er 3D-flerfarvet DNA-FISK i kombination med 3D-mikroskopi og billedrekonstruktion imidlertid en mulig metode til validering af C-teknologibaserede resultater og utvetydigt undersøge placeringen og tilrettelæggelsen af specifikke på et enkelt celleniveau. Her foreslår vi en trin for trin metode til 3D multicolor DNA FISK egnet til en bred vifte af menneskelige primære celler og diskutere alle de praktiske handlinger, afgørende skridt, forestillinger om 3D-billedbehandling og dataanalyse er nødvendige for at opnå en vellykket og informativ 3D multicolor DNA FISK i forskellige biologiske sammenhænge.
Introduction
Højere eukaryoter nødt til systematisk at kondensere og komprimere en enorm mængde af genetiske oplysninger i det øjeblik 3D plads i kernen1,2,3,4. I dag ved vi, at genomet er rumligt bestilt i rum og topologisk tilknyttede domæner5, og at de mange niveauer af DNA foldning generere kontakter mellem forskellige genomiske regioner, der kan involvere kromatin loop dannelse6,7. 3D dynamisk looping af kromatin kan påvirke mange forskellige biologiske processer såsom transskription8,9,differentiering og udvikling10,11, DNA reparation12,13, mens dens forstyrrelser er involveret i forskellige sygdomme14,15,16 og udviklingsmæssige defekter15,17,18.
Mange tilgange er blevet udviklet til at studere 3D genom organisation. Kromosom konformation capture-baserede teknologier (C-teknologier, 3C, 4C, 5C, Hi-C og derivater) er blevet udviklet til at studere genom organisation i faste celler3,4,19,20. Sådanne tilgange er baseret på evnen til at fange kontaktfrekvenser mellem genomiske loci i fysisk nærhed. C-teknologier, afhængigt af deres kompleksitet, fange den globale 3D genom organisation og nuklear topologi af en celle befolkning3,4,19,20. Ikke desto mindre, 3D-interaktioner er dynamiske i tid og rum, meget variabel mellem de enkelte celler, der består af multiplex interaktioner, og er meget heterogen21,22.
3D multicolor DNA fluorescens in situ hybridization (FISH) er en teknik, der gør det muligt at visualisering af specifikke genomiske loci på et enkelt celleniveau, der muliggør direkte undersøgelse af 3D-nuklear arkitektur på en supplerende måde til C-teknologier. Det repræsenterer en teknologi, der i øjeblikket anvendes til entydigt at validere C-resultater. 3D flerfarvet DNA FISH bruger fluorescerende mærket sonder supplerer den genomiske loci af interesser. Brugen af forskellige fluorophorer og egnet mikroskopiudstyr gør det muligt at visualisering af flere mål inden for det nukleare rum23,24. I de senere år er FISH blevet kombineret med teknologiske fremskridt inden for mikroskopi for at opnå visualisering af fine strukturer ved høj opløsning25,26 eller med CRISPR-Cas tilgange til visualisering af nukleinsyrer i levende billeddannelse27,28. På trods af bred vedtagelse, 3D multicolor DNA FISH tilgang er stadig betragtes som vanskeligt i mange laboratorier, fordi det biologiske materiale, der anvendes skal tilpasses.
Her leverer vi en omfattende protokol for 3D multicolor DNA FISH (fra celle / sonde forberedelse til dataanalyse), der gælder for en bred vifte af menneskelige primære celler, så visualisering af flere genomiske loci og bevare 3D-strukturen af kerner. For at studere nuklear arkitektur skal 3D-strukturen af kerner bevares. Derfor undgår vi i modsætning til andre eksisterende protokoller29,30,31brugen af en alkoholgradient og opbevaring af dæksedler i alkohol, der kan påvirke kromatinstruktur32. Metoden er tilpasset fra bevarede 3D DNA FISH protokoller24,33, der skal anvendes på en bred vifte af menneskelige primære celler, både isolerede ex vivo eller dyrket in vitro. Der er permeabiliserings- og deproteiniseringsparametre for forskellige nukleare morfologi og cytologiske egenskaber (f.eks. forskellige grader af nuklear komprimering, cytoskeletoverflod)34. Disse parametre er ofte generelt beskrevet i andre protokol24,33, uden at give en klar forskelsbehandling af proceduren inden for forskellige celletyper. Desuden har vi udviklet et specifikt værktøj ved navn NuCLεD (nukleare kontakter locator i 3D)16, der giver principper for dataanalyse, der vil forbedre 3D nærhed mellem forskellige loci og deres nukleare topologiske distribution inden for det nukleare rum på en automatiseret måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA-sonde forberedelse og mærkning procedurer med nick oversættelse
- Purify og ren bakterielle kunstige kromosomer (BaCs), plasmider eller PCR produkter med specifikke kits(Tabel over materialer),resuspend i ddH2O, kontrollere ved elektroforese på en agarose gel og kvantificere.
- Udfør nick oversættelse på 1,5−2 μg DNA fra trin 1.1 i et slutvolumen på 50 μL ved at blande alle reagenser i et 0,5 ml lavt bindende DNA-rør i henhold til tabel 1.
BEMÆRK: Direkte mærkede sonder kan forbedre signal-til-støjforholdet. Kits til at producere indirekte og direkte mærket sonder med forskellige Alexa fluorokonomer ved nick oversættelse er kommercielt tilgængelige. - Inkuber er nick-oversættelsesblandingen i en termisk mixer ved 16 °C i en periode afhængigt af længden af udgangs-DNA-materialet: 45 min for PCR-produkter (en pulje af PCR-produkter på hver 2.000 bp) og op til 4 timer for BAC DNA og plasmider.
- Kontroller størrelsen af de sonder, der produceres i trin 1.3 af elektroforese på en 2,2% agarose gel.
BEMÆRK: Den optimale sondestørrelse er <200 bp (Figur 1A).- Hvis DNA'et ikke fordøjes nok, skal du tilføje 5 U DNA-polymerase I og 0,05 U dnase I til reaktionen og inkuberingen i 1−2 timer ved 16 °C og efterfølgende kontrollere igen. Stop reaktionen med 0,5 mM EDTA (endelig koncentration). Opbevar sonder ved -20 °C.
- For hvert DNA FISH-eksperiment udfældes følgende mængder sonder afhængigt af det udgangspunkt-DNA-materiale, hvorfra sonderne produceres: 200 ng fra nick oversatte PCR-produkter, 100 ng fra nick oversatte BaCs eller 300 ng fra nick oversat plasmid. Tilsæt ddH2O op til 150 μL, 20 μg umærket laksesæd-DNA, 3,5 μg artsspecifikt Cot-1 DNA, 3 mængder 100 % EtOH og 1/10 volumen af 3 M natriumacetat pH 5.2. Udfældes ved -80 °C i 1 time.
- Centrifugeret ved maksimal hastighed i 1 time ved 4 °C, og supernatanten kasseres. Vask pellet to gange med 70% EtOH.
- Pelleten skal ophænges igen i 2 μL på 100% formamid pH 7.0, rystes ved 40 °C i 30 minutter (kan tage op til et par timer) og derefter tilsættes en tilsvarende mængde 4x saltvandsnatriumcitrat (SSC)/20% dextran sulfat.
- Forbered 20x SSC ved at blande 175,3 g NaCl og 88,2 g natriumcitrat i et endeligt volumen på 1 L H2O. Autoklave, filtrere og forberede aliquots.
BEMÆRK: For flerfarvet DNA FISK, kan de forskellige sonder udfældes sammen undtagen for sonder, der kan anneal med hinanden. I disse særlige tilfælde behandles dem separat, udfældeog de sonder, der deler de reagenser, der er nævnt i trin 1.5−1.7, med hensyn til antallet af sonder. Pool sonderne først efter resuspension i formamid. Hvis der anvendes glasdækstrækket på over 10 mm eller mindre end 10 mm, skalere op/ned i mængden af de reagenser, der anvendes i trin 1.5−1.7 proportionalt med glidestørrelsen. Hybridiseringsonder kan opbevares ved -20 °C i længere tid (op til to måneder).
- Forbered 20x SSC ved at blande 175,3 g NaCl og 88,2 g natriumcitrat i et endeligt volumen på 1 L H2O. Autoklave, filtrere og forberede aliquots.
2. Cellefiksering, forbehandling og permeabilisering
BEMÆRK: Permeabilisering og deproteinisering passager er afgørende skridt. Tidspunktet for reaktion og koncentration af reagenserne afhænger i høj grad af celletypen, cytoplasmaforekomsten og den nukleare morfologi.
- Cellefiksering, forbehandling og permeabilisering for primære T-lymfocytter hos mennesker
BEMÆRK: Denne protokol er velegnet til små celler med små kerner og en lav mængde cytoplasma.- Brug glasdækselstegn (10 mm, tykkelse nr. 1,5 H).
- Vask glasset med ddH2O, derefter med 70% EtOH og lad dem tørre. Brug et glas til hver brønd af en 24-brønds plade.
- Der tilsættes 200 μL 0,1 % poly-L-lysin (w/v) (materialetabel)direkte på glasset for at danne en dråbe. Vær opmærksom, da dråben skal forblive på glasoverfladen uden at røre brønden i 2−5 min. Lad dråben være let, og lad glasset tørre i 30 minutter.
- Udfør trin 2.1.3 to gange mere.
- Sæt 200 μL af suspensionceller (2 x 106/ml, PBS suspension af ex vivo primære T lymfocytter) direkte på glasset, gør det muligt for cellerne at frø ved stuetemperatur (RT) i 30 min.
- Fjern hurtigt affaldet. Tilsæt frisklavet 4% PFA (fremstillet i PBS/0,1% TWEEN 20, pH 7,0, filtreret) i 10 min og fastgør de seedede celler på RT.
- Vask tre gange i 5 min hver med 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) på RT. Permeabilize med 0,5% TPBS i 10 min på RT.
- Rnase behandling ved at tilsætte 2,5 μL RNase cocktail (Tabel over materialer) i 250 μL PBS/brønd i en 24-brønds plade i 1 time ved 37 °C.
- Skyl i PBS, tilsæt 20% glycerol/PBS, og inkubernatten (ON) ved 4 °C.
BEMÆRK: Dette trin kan variere fra 1 time til TIL. Slides kan opbevares i 20% glycerol/PBS ved 4 °C op til 7 dage. - Fryses på tøris (15−30 s), optø gradvist på RT, og suge i 20% glycerol/PBS. Gentag trin 2.1.9 yderligere tre gange.
- Vask i 0,5% TPBS i 5 min på RT. Vask i 0,05% TPBS, to gange i 5 min på RT. Inkuber i 0,1 N HCl i 12 min på RT. Skyl i 2x SSC.
- Inkuberi i 50% formamid pH 7.0/2x SSC ON på RT.
BEMÆRK: Inkubationstiden kan optimeres og til sidst reduceres. Slides kan opbevares i 50% formamid/2x SSC i flere dage.
- Cellefiksering, forbehandling og permeabilisering for primære myoblaster hos mennesker
BEMÆRK: Denne protokol er velegnet til store celler med en stor mængde cytoplasma.- Dyrk human primære myoblaster direkte på coverslip briller i 24-brønd plader i vækstmedium (Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM), 20% føtal kvæg serum (FBS), 25 ng /ml fibroblast vækstfaktor (FGF), 10 ng/ml epidermal vækstfaktor (EGF), 10 μg/ml humaninsulin, 1x glutamin, 1x penicillin/streptomycin) i mindst 24 timer (og nåede 50−70% af sammenløbet).
BEMÆRK: For at lette vedhæftningen, gelatine eller kollagen eller poly-L-lysin kan bruges til pels dækslet før såning. - Skyl cellerne i 2−3 ændringer af PBS. Tilsæt frisklavet 4% PFA og fastgør cellerne i 10 min på RT.
- Vask tre gange i 3 min hver i 0,01% TPBS på RT. Permeabilize i 0,5% TPBS i 10 min på RT.
- Rnase behandling ved at tilsætte 2,5 μL RNase cocktail (Tabel over materialer) i 250 μL PBS/brønd i en 24-brønds plade i 1 time ved 37 °C.
- Skyl i PBS, tilsæt 20% glycerol/PBS, og inkuber på på RT.
BEMÆRK: Dette trin kan variere fra 1 time til TIL. Slides kan opbevares i 20% glycerol/PBS ved 4 °C op til 7 dage. - Fryses på tøris (15−30 s), optø gradvist på RT, og suge i 20% glycerol/PBS. Gentag dette trin tre gange.
- Vask tre gange i 10 minutter hver i PBS. Inkuberi i 0,1 N HCl i 5 min på RT. Skyl i 2x SSC.
- Inkuberi i 50% formamid pH 7.0/2x SSC ON på RT.
BEMÆRK: Inkubationstiden kan optimeres og til sidst reduceres. Slides kan opbevares i 50% formamid/2x SSC i flere dage. - Ligevægtsdias (opbevaret i 50 % formamid/2x SSC) i 2x SSC i 2 min. Derefter ligevægt i PBS i 3 min.
- Behandl med 0,01 N HCl/0.0025% pepsin fra et par sekunder op til 5 min, afhængigt af celletypen. I løbet af dette trin skal cellerne observeres under et optisk mikroskop, og stop reaktionen (trin 2.2.11), så snart kernerne er fri for cytoplasmaet, samtidig med at deres struktur bevares (f.eks. nucleoli er stadig synlige og intakte).
- Inaktiver pepsin ved at vaske to gange i 5 min hver i 50 mM MgCl2/PBS.
- Post-fix i 1% PFA / PBS i 1 min. Vask i 5 min i PBS. Vask to gange i 5 min hver i 2x SSC, og derefter tilføje 50% formamid/2x SSC i mindst 30 min.
- Dyrk human primære myoblaster direkte på coverslip briller i 24-brønd plader i vækstmedium (Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM), 20% føtal kvæg serum (FBS), 25 ng /ml fibroblast vækstfaktor (FGF), 10 ng/ml epidermal vækstfaktor (EGF), 10 μg/ml humaninsulin, 1x glutamin, 1x penicillin/streptomycin) i mindst 24 timer (og nåede 50−70% af sammenløbet).
3. 3D flerfarvet DNA FISK hybridisering
- Denature sonderne ved 80 °C i 5 min, og derefter sat hurtigt på is.
- Indlæs hybridiseringsonderne på et rent mikroskopdias. Drej dækstrækket med celler på hovedet på dråbe af hybridisering sonder.
- Forsegle dæksel med gummi cement. Lad gummicementen tørre helt. Placer derefter dias på en varmeblok og denature ved 75 °C i 4 min.
BEMÆRK: Tidspunktet for denaturering og denatureringstemperatur kan forhøjes op til 80 °C. - Hybridiseres ved 37 °C ON i en metallisk kasse, der flyder i et vandbad.
BEMÆRK: For at forbedre signal-støjforholdet kan hybridiseringstemperaturen gå op til 42 °C. - Skræl gummicementen af, sænk rutsjebanerne i 2x SCC, fjern glasdækslet og overfør den til 2x SSC i 6-brøndsplade.
- Vask i 2x SSC tre gange i 5 min hver ved 37 °C, rystes ved 90 rpm i en kuvøse shaker. Vask i 0,1 x SSC tre gange i 5 min hver ved 60 °C, rystes ved 90 rpm i en kuvøse shaker. Skyl kortvarigt i 4x SSC/0,2% TWEEN 20.
4. 3D multicolor DNA FISK afsløring
BEMÆRK: For direkte mærkede sonder springetrin 4.1 og 4.2 over.
- Bloker i 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% kvægserumalbumin (BSA) i 20 min ved 37 °C i en 24-brøndsplade, ryst ved 20 omdrejninger i en inkubatorshaker.
- Inkubermed passende koncentration af anti-digoxygenin (1:150) og/eller streptavidin (1:1.000) (Materialetabel) fortyndet i 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% BSA i 35 min i et mørkt og vådt kammer ved 37 °C.
- Vask i 4x SSC/0,2% TWEEN 20 tre gange i 5 min hver ved 37 °C, rystes ved 90 rpm i en 6-brøndplade i en kuvøse shaker.
- Ligevægt i PBS og post-fix i 2% formaldehyd / PBS i 2 min på RT i en 24-brønd plade.
BEMÆRK: Direkte mærkede sonder behøver ikke efterfiksering. - Vask 5x kort i PBS. Plet med 1 ng/mL DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)/PBS i 5 min på RT.
- Vask 5x kort i PBS. Monter med antifadeopløsning (Materialetabel).
5. 3D multicolor DNA FISK mikroskopi og analyse
- Anskaf 3D-billeder med et mikroskopsystem.
BEMÆRK: Her anvendes et widefield mikroskop med en aksial afstand på 0,2−0,25 μm mellem på hinanden følgende sektioner (figur 1B). - Analysér 3D-billedstakke ved hjælp af forskellige software og værktøjer (her, NuCLεD eller Nuclear Contacts Locator i 3D).
BEMÆRK: Værktøjet NuCLεD er udviklet med henblik på automatisk at analysere 3D multicolor DNA FISK i fluorescens cellebillede z-stakke. NuCLεD rekonstruerer kernerne fra cellebilledstakke i 3D samt registrerer og lokaliserer fluorescerende 3D-pletter. Den måler den relative placering af pletter i kernen (f.eks. afstand fra kernernes centroid og/eller periferi) og den maksimale radius for hver kerne og interspotsdistancer. Værktøjet og den anvendte algoritme er fuldt beskrevet i Cortesi et al.16. - Analysér dataene (f.eks. 3D-afstande mellem specificeret genomloci og de nukleare centroid- og kontaktfrekvenser), der er hentet af NuCLεD.
BEMÆRK: For 3D-afstande mellem specificeret genomloci og den nukleare centroid normaliseres afstandene på den maksimale radius for hver kerne og repræsenterer disse data som frekvensfordelinger af normaliserede afstande fra den nukleare centroid. I forbindelse med undersøgelser af fjerndistanceinteraktioner formodes kontaktfrekvenser at ligge inden for intervallet 10-20 %21 med en grænse mellem distance, der kan variere og kan sættes omkring 2 μm35.- For at udføre statistisk analyse analyseres ca. 100 kerner pr. biologisk replikat. Repræsenterer 3D-afstande mellem specificeret genomloci som kumulative frekvensfordelinger af afstande, der ligger under den valgte tærskelafstand, og brug en t-testtil at vurdere betydningen af forskelle i fordelingerne. Desuden beregnes procentdelen af kerner positiv for de interaktioner, der er under den valgte tærskel, og bruge Fishers nøjagtige test til at vurdere betydningen af forskelle i procenterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden til 3D multicolor DNA FISH beskrevet i denne artikel giver mulighed for moderne visualisering af forskellige genomiske loci inden bevaret 3D kerner (Figur 1B). Denne protokol gør det muligt at måle afstande mellem alleler og forskellige genomiske loci er for at vurdere deres rumlige nærhed og vurdere deres placering i det nukleare rum (f.eks. loci afstand fra centroid eller periferien af kerner)16. Der er dog mange afgørende trin, der skal konfigureres nøjagtigt og specifikt for hver anvendt celletype. det anbefales stærkt at være særlig opmærksom på følgende trin for succes 3D multicolor DNA FISK.
For DNA sonde forberedelse, kontrollere, at sonde størrelse er <200 bp (Figur 1A). Denne størrelse sikrer en vellykket procedure af 3D multicolor DNA FISH(Figur 1B). Suboptimale DNA FISKEsonder fremstillet af nick oversættelse kan delvis fordøjes (figur 2A) eller over fordøjet (Figur 2B). Med delvist fordøjede sonder, vil proceduren ikke have noget signal i cellerne, på grund af den manglende evne til sonden til at komme ind i kerner og korrekt hybridisere til den komplementære genomiske loci. Over fordøjede sonder vil resultere i et uspecifikt signal, på grund af et tab af specificitet i hybridisering og en deraf følgende stigning i baggrunden. Et repræsentativt eksempel på overfordøjede sonder er vist i figur 3A i forhold til en optimal fordøjet sonde i figur 3B.
For deproteinisering og pepsinization, skal du følge disse trin i henhold til celletypen. Især tage hensyn til nukleare størrelse og cytoplasma overflod. For human primær ex vivo isoleret T lymfocytter og celler med små, meget komprimeret kerner og lav rigelige cytoplasma, HCl deproteinisering er afgørende. Behandling med 0,1 N HCl i 5 min er ikke tilstrækkelig til DNA FISH visualisering. 0,1 N HCl behandling i 12 min anbefales at fremme kerner adgang til DNA-sonder og bevare nuklear integritet (Figur 4A). Pepsin fordøjelse af cytoplasmaet er ikke nødvendig for at opnå et godt signal om DNA FISH (Figur 4B).
For menneskelige primære myoblaster og celler, der har store kerner og rigelige cytoplasma, pepsinization trin er grundlæggende. En kort og suboptimal pepsinization af cytoskelettet vil hæmme optagelsen af sonden i kernerne (figur 4C),der slutter i mangel af et DNA FISH-signal. Men hvis cellerne er over pepsinized, kerner vil ikke forblive intakt(Figur 4D), mister deres 3D-struktur. Et eksempel på vellykket 3D-flerfarvet DNA-fisk findes i figur 4E.
Under hybridiseringforsegles dæksedlen nøjagtigt. Ellers vil sonden sprede sig og tørre. Denaturerings- og hybridiseringstrinskal udføres hurtigt, således at sonden og det genomiske DNA ikke vil reanneal. Denatureringens varighed kan øges.
Figur 1: Repræsentative DNA-sonder og 3D flerfarvet DNA FISK. (A) Nick oversat DNA-sonder af optimal størrelse køre på en 2,2% agarose gel (lane 1, 2), 50 bp markør (M). (B) Repræsentativ 3D multicolor DNA FISH kerne ved hjælp af sonder kortlægning til 3q11.2 region (grøn), 10q26.3 region (rød) og 8q24.13 region (magenta) i menneskelige primære myoblaster. Nuclei er kontrastained med DAPI (blå). 63x forstørrelse. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempler på ikke optimalt fordøjede DNA FISH-sonder. (A) Ikke fordøjet (vognbane 1, 2) eller delvist fordøjet (vognbane 3) nick oversat DNA-sonder køre på en 2,2% agarose gel, 2log markør (M). (B) Over fordøjet nick oversat DNA-sonder køre på en 2,2% agarose gel, 2log markør (M). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sammenligning af 3D-flerfarvet DNA-fisk ved hjælp af suboptimale eller optimale DNA FISH-sonder. (A) Repræsentant 3D flerfarvet DNA FISK kerner ved hjælp af over fordøjet sonde kortlægning til 8q24,13 region (magenta) i menneskelige primære myoblaster. Nuclei er kontrastained med DAPI (blå). 63x forstørrelse. Skalabar = 10 μm. (B) Repræsentativ 3D flerfarvet DNA FISK kerner ved hjælp af optimalt fordøjet sonde kortlægning til 8q24.13 region (magenta) i human primære myoblaster. Nuclei er kontrastained med DAPI (blå). 63x forstørrelse. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Mulige resultater af suboptimal deproteinisering og pepsinization trin på 3D flerfarvet DNA FISH resultater. (A) Repræsentativ 3D flerfarvet DNA FISK kerner af human primære T lymfocytter behandlet i 5 min (venstre) eller 12 min (højre) med 0,1 N HCl, ved hjælp af sonde kortlægning til 8q24,13 region (grøn). Nuclei er kontrastained med DAPI (blå). 100x forstørrelse. Skalabar = 10 μm. (B) Repræsentativ 3D flerfarvet DNA FISK kerner af human primære T lymfocytter behandlet i 12 min med 0,1 N HCl (venstre) eller kombineret med 0,01 N HCl/0,0025% pepsin i 2 min (højre), ved hjælp af sonde kortlægning til 8q24.13 region (grøn). Nuclei er kontrastained med DAPI (blå). 100x forstørrelse. Skalabar = 10 μm. (C) Repræsentativ 3D flerfarvet DNA FISK kerner af human primære myoblaster behandlet med kort og suboptimal pepsinization, ved hjælp af sonde kortlægning til 8q24.13 region (magenta). Nuclei er kontrastained med DAPI (blå). 63x forstørrelse. Skalabar = 10 μm. (D) Repræsentant 3D flerfarvet DNA FISK kerner af human primære myoblaster behandlet med langvarig pepsinization trin, ved hjælp af sonde kortlægning til 8q24.13 region (magenta). Nuclei er kontrastained med DAPI (blå). 63x forstørrelse. Skalabar = 5 μm. (E) Repræsentativ 3D flerfarvet DNA FISK kerner af human primære myoblaster behandlet med optimale HCl / pepsin betingelser ved hjælp af sonde kortlægning til 8q24.13 region (magenta). Nuclei er kontrastained med DAPI (blå). 63x forstørrelse. Skalabjælke = 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Nick oversættelse reagenser | Indledende koncentration | Endelig koncentration |
| dNTPs (C-G-A) | 0,5 mM | 0,05 mM |
| dTTP | 0,1 mM | 0,01 mM |
| Biotin/Dig/Cy3 dUTP | 1 mM | 0,02 mM |
| Tris HCl pH 7.8 | 1 M | 50 mM |
| MgCl2 | 100 mM | 5 mM |
| β-mercaptoethanol | 100 mM | 10 mM |
| Bsa | 100 ng/μL | 10 ng/μL |
| DNA Pol I | 10 U/μL | 0,1 U/μL |
| DNase Jeg | 1 U/μL | 0,002 U/μL |
| DNA 2 μg | X | X |
| ddH2O | Op til 50 μL |
Tabel 1: Nick Oversættelse. Tabel, der beskriver alle reagenser, deres koncentration og foreslog timing for nick oversættelse reaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende metode beskriver en trin for trin-protokol til at udføre 3D multicolor DNA FISH på en bred vifte af menneskelige primære celler. Selv om DNA FISH er en teknologi i bred anvendelse, 3D flerfarvet DNA FISK på bevaret 3D interfasede kerner er stadig vanskeligt at udføre i mange laboratorier, hovedsagelig på grund af de særlige kendetegn ved de anvendte prøver23,24.
Sonde nick oversættelse er et grundlæggende skridt for en vellykket 3D multicolor DNA FISK; mange forskellige substrater (BAC, fosmid, plasmid, PCR produkter) kan anvendes til denne reaktion, og timingen af reaktionen og enzymkoncentrationen kan derfor justeres med hensyn til længden af substratet. En korrekt sondefordøjelse er grundlæggende (figur 1), da ikke-optimale sonder (figur 2) ikke vil resultere i noget signal eller et uspecifikt signal (figur 3A). Permeabilisering, deproteinisering, og pepsinization trin er afgørende passager, der stærkt afhænger af den anvendte celletype. Celler med små kerner og lav cytoskelet overflod, såsom ex vivo isolerede T lymfocytter, kræver deproteinisering med en langvarig 0,1 N HCl behandling. Også, vasker i PBS med højere procentdele af Triton X-100 kan hjælpe sonden indrejse i kerner af disse celler. Tværtimod, in vitro kulturrede menneskelige primære myoblaster, der præsenterer større kerner, med et højt indhold af cytoskelet, har brug for fordøjelsen af cytosolstrukturer med pepsin. Disse generelle roller kan anvendes på en bred vifte af celler, i sidste ende kombinere de forskellige trin afhængigt af de specifikke cellulære egenskaber.
Anvendelsen af friskfremstillet biologisk materiale, friske opløsninger (især opløsninger med vaskemiddel) og fluorescerende reagenser foreslås kraftigt: filtreret PFA ved pH 7.0; autoclaved og filtreret 20x SSC ved pH 7.0; filtreret formamid ved pH 7.0 nuklease gratis vand; og engangsaliquots af modificeret UTP. Langvarig inkubation med 20% glycerol/PBS, eller 50% formamid/2x SSC kan lette hybridisering. HCl og/eller pepsinbehandling kan øges yderligere. Tidspunktet for hybridisering, mængden af sonder, koncentrationen og tidspunktet for inkubation af anti-digoxigenin og streptavidin kan alle justeres yderligere for at forbedre signalet til støjforholdet.
3D multicolor DNA FISH repræsenterer et supplerende værktøj til C-teknologier, standardmetoden til validering af C-baserede resultater. Hvis det kombineres med 3D-mikroskopi og analyse, 3D multicolor DNA FISH kan overvåge nærhed mellem genomisk loci og deres topologiske fordeling i det nukleare rum på enkelt celleniveau. 3D multicolor DNA FISH kan yderligere integreres med andre metoder såsom RNA FISH og immunfluorescens for et omfattende overblik over dynamikken og samspillet mellem genomisk loci, RNA'er (messenger RNA eller regulatorisk ikke-kodende RNA) og en bred vifte af proteiner, hvilket giver en unik mulighed for at visualisere den nukleare struktur og undersøge de epigenetiske mekanismer, der subtend cellulære identitet.
På trods af den enorme forbedring af FISH teknologier med super opløsning25,26, levende celle imaging27,28,36, enkelt molekyle detektion37, og moderne visualisering af flere mål med oligonucleotid arrays såsom Oligopaint37,38 med 3D high-throughput tilgange39, en begrænsning af teknologien er fortsat det diskrete antal forudbestemte genomiske loci, der kan visualiseres. Dette forhindrer en vidtrækkende analyse af nuklear arkitektur. Flere undersøgelser har for nylig beskrevet sekventielle metoder til hybridisering for at løse genomorganisation i enkelte celler såsom stregkode DNA FISH40,41,42,43. Der vil være behov for en yderligere indsats for at koble den enkelte celle karakter af 3D multicolor DNA FISK til genom brede funktioner til bredt visualisere nuklear arkitektur heterogenitet med billeddannelse teknologier, som antallet af loci, der kan testes på et tidspunkt vil stige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender den tekniske bistand fra INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milano, Italien), især C. Cordiglieri, for at få hjælp under 3D flerfarvet DNA FISH billeder Erhvervelse. Dette arbejde er blevet støttet af følgende tilskud til B.B.: EPIGEN italiensk flagskibsprogram, Association Française contre les Myopaties (AFM-Telethon, grant nr 18754) og Giovani Ricercatori, det italienske sundhedsministerium (GR-2011-02349383). Dette arbejde er blevet støttet af følgende tilskud til F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, tilskud nr 2018-0321).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, Pt 2 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , Chapter 4, Unit 4 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
