Summary
3D-Mehrfarben-DNA-FISH stellt ein Werkzeug dar, um mehrere genomische Loci innerhalb von 3D-konservierten Kernen zu visualisieren und ihre wechselseitigen Wechselwirkungen und Lokalisierungen innerhalb des Kernraums auf einer einzigen Zellebene eindeutig zu definieren. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für ein breites Spektrum menschlicher Primärzellen beschrieben.
Abstract
Eine wichtige Frage in der Zellbiologie ist die genomische Organisation im Kernraum und wie die Chromatinarchitektur Prozesse wie Genexpression, Zellidentität und Differenzierung beeinflussen kann. Viele Ansätze, die zur Untersuchung der 3D-Architektur des Genoms entwickelt wurden, lassen sich in zwei sich ergänzende Kategorien unterteilen: Chromosomen-Konformationserfassungs-basierte Technologien (C-Technologien) und Bildgebung. Während ersteres auf der Erfassung der Chromosomenkonformation und proximalen DNA-Wechselwirkungen in einer Population fester Zellen basiert, ermöglicht letztere, basierend auf DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) auf 3D-konservierten Kernen, eine zeitgemäße Visualisierung mehrere Loci auf einer einzelzelligen Ebene (mehrfarbig), die ihre Wechselwirkungen und Dieverteilung innerhalb des Zellkerns untersuchen (3D-Mehrfarben-DNA-FISCH). Die Technik der 3D-Mehrfarben-DNA FISH hat eine Einschränkung der Visualisierung nur ein paar vorbestimmte loci, nicht erlaubt eine umfassende Analyse der nuklearen Architektur. Angesichts der Robustheit der Ergebnisse ist 3D-Mehrfarben-DNA-FISH in Kombination mit 3D-Mikroskopie und Bildrekonstruktion jedoch eine mögliche Methode, um C-Technologie-basierte Ergebnisse zu validieren und die Position und Organisation spezifischer Loci eindeutig zu untersuchen. auf einer Einzelzellebene. Hier schlagen wir eine Schritt-für-Schritt-Methode der 3D-Mehrfarben-DNA-FISH vor, die für eine Vielzahl menschlicher Primärzellen geeignet ist, und diskutieren alle praktischen Maßnahmen, entscheidenden Schritte, Vorstellungen von 3D-Bildgebung und Datenanalyse, die erforderlich sind, um eine erfolgreiche und informative 3D-Multicolor-Funktion zu erhalten. DNA FISH in verschiedenen biologischen Kontexten.
Introduction
Höhere Eukaryoten müssen systematisch eine riesige Menge an genetischen Informationen im winzigen 3D-Raum des Kerns1,2,3,4kondensieren und verdichten. Heute wissen wir, dass das Genom räumlich in Kompartimenten und topologisch assoziierten Domänen5 angeordnet ist und dass die verschiedenen Ebenen der DNA-Faltung Kontakte zwischen verschiedenen genomischen Regionen erzeugen, die Chromatin-Schleifenbildung6,7beinhalten können. Die 3D-dynamische Schleife von Chromatin kann viele verschiedene biologische Prozesse beeinflussen, wie Transkription8,9, Differenzierung und Entwicklung10,11, DNA-Reparatur12,13, während seine Störungen sind in verschiedenen Krankheiten beteiligt14,15,16 und Entwicklungsfehler15,17,18.
Viele Ansätze wurden entwickelt, um die 3D-Genom-Organisation zu untersuchen. Chromosomen-Konformations-Capture-basierte Technologien (C-Technologien, 3C, 4C, 5C, Hi-C und Derivate) wurden entwickelt, um Genomorganisation in festen Zellen3,4,19,20zu untersuchen. Solche Ansätze basieren auf der Fähigkeit, die Kontaktfrequenzen zwischen genomischen Loci in physischer Nähe zu erfassen. C-Technologien fangen je nach Komplexität die globale 3D-Genomorganisation und Kerntopologie einer Zellpopulation3,4,19,20. Dennoch sind 3D-Interaktionen zeitlich und räumlich dynamisch, sehr variabel zwischen einzelnen Zellen, die aus Multiplex-Wechselwirkungen bestehen, und sind weitgehend heterogen21,22.
Die 3D-Mehrfarben-DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, die die Visualisierung spezifischer genomischer Loci auf einer einzelnen Zellebene ermöglicht und eine direkte Untersuchung der 3D-Kernarchitektur in komplementärer Weise zu C-Technologien ermöglicht. Es stellt eine Technologie dar, die derzeit verwendet wird, um C-Ergebnisse eindeutig zu validieren. 3D-Multicolor-DNA-FISH verwendet fluoreszierend markierte Sonden, die die genomischen Loci der Interessen ergänzen. Der Einsatz verschiedener Fluorophore und geeigneter Mikroskopiegeräte ermöglicht die zeitgemäße Visualisierung mehrerer Ziele im Kernraum23,24. In den letzten Jahren wurde FISH mit technologischen Fortschritten in der Mikroskopie kombiniert, um die Visualisierung von feinskaligen Strukturen mit hoher Auflösungvon 25,26 oder mit CRISPR-Cas-Ansätzen zur Visualisierung der Nukleinsäuren in Live-Bildgebung zu erhalten27,28. Trotz breiter Akzeptanz wird der 3D-Multicolor-DNA-FISH-Ansatz in vielen Laboratorien immer noch als schwierig angesehen, da das verwendete biologische Material angepasst werden muss.
Hier bieten wir ein umfassendes Protokoll für 3D-Mehrfarben-DNA-FISH (von der Zell-/Sondenvorbereitung bis zur Datenanalyse), das für eine Vielzahl menschlicher Primärzellen gilt, um die Visualisierung mehrerer genomischer Loci zu ermöglichen und die 3D-Struktur von Kernen zu erhalten. Um die Kernarchitektur zu untersuchen, muss die 3D-Struktur von Kernen erhalten bleiben. Aus diesem Grund vermeiden wir im Gegensatz zu anderen bestehenden Protokollen29,30,31, die Verwendung eines Alkoholgradienten und die Lagerung der Abdeckungen in Alkohol, die die Chromatinstruktur beeinflussen können32. Die Methode wird aus den konservierten 3D-DNA-FISH-Protokollen24,33 angepasst, um auf eine breite Palette menschlicher Primärzellen angewendet zu werden, sowohl isoliert ex vivo als auch kultiviert in vitro. Es gibt Permeabilisations- und Deproteinisierungsparameter für verschiedene kernotische Morphologie n.Ä. und zytologische Eigenschaften (z.B. unterschiedliche Grade der nuklearen Verdichtung, Zytoskelettreichtum)34. Diese Parameter werden häufig in anderen Protokollen24,33beschrieben, ohne dass das Verfahren innerhalb verschiedener Zelltypen eindeutig diskriminiert wird. Darüber hinaus haben wir ein spezielles Tool namens NuCL-D (Nuclear Contacts locator in 3D)16entwickelt, das Prinzipien für die Datenanalyse bietet, die die 3D-Nähe zwischen verschiedenen Loci und ihrer nuklearen topologischen Verteilung innerhalb des Kernraums auf automatisierte Weise verbessern.
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Protocol
1. DNA-Sondenvorbereitung und Etikettierungsverfahren mit Nick-Übersetzung
- Reinigen und reinigen Sie bakterielle künstliche Chromosomen (BACs), Plasmide oder PCR-Produkte mit spezifischen Kits (Materialtabelle), resuspendieren in ddH2O, überprüfen Sie durch Elektrophorese auf einem Agarorosengel und quantifizieren.
- Führen Sie die Nick-Translation auf 1,5 x 2 g DNA aus Schritt 1,1 in einem Endvolumen von 50 l durch Mischen aller Reagenzien in einem 0,5 ml niedrig bindenden DNA-Rohr gemäß Tabelle 1durch.
HINWEIS: Direkt gekennzeichnete Sonden können das Signal-Rausch-Verhältnis verbessern. Kits zur indirekten und direkt gekennzeichneten Sonden mit verschiedenen Alexa-Fluorchromen durch Nick-Übersetzung sind im Handel erhältlich. - Inkubieren Sie den Nick-Translation-Mix in einem Thermomischer bei 16 °C je nach Länge des Ausgangs-DNA-Materials: 45 min für PCR-Produkte (ein Pool von PCR-Produkten von je 2.000 bp) und bis zu 4 h für BAC-DNA und Plasmide.
- Überprüfen Sie die Größe der in Schritt 1.3 durch Elektrophorese erzeugten Sonden auf einem 2,2%igen Agarosegel.
HINWEIS: Die optimale Sondengröße ist <200 bp (Abbildung 1A).- Wenn die DNA nicht ausreichend verdaut ist, fügen Sie der Reaktion 5 U DNA-Polymerase I und 0,05 U DNase I hinzu und inkubieren Sie 1x2 h bei 16 °C und überprüfen Sie anschließend erneut. Beenden Sie die Reaktion mit 0,5 mM EDTA (Endkonzentration). Sonden bei -20 °C lagern.
- Für jedes DNA-FISH-Experiment fallen je nach Ausgangs-DNA-Material, aus dem die Sonden hergestellt werden, die folgenden Sondenmengen: 200 ng aus nick übersetzten PCR-Produkten, 100 ng aus nick übersetzten BACs oder 300 ng aus nick übersetztem Plasmid. Fügen Sie ddH2O bis zu 150 l, 20 g nicht gekennzeichnete Lachssperma-DNA, 3,5 g artspezifische Cot-1-DNA, 3 Volumen von 100% EtOH und 1/10 Volumen von 3 M Natriumacetat pH 5.2 hinzu. Bei -80 °C für 1 h niederschlagen.
- Zentrifugieren Sie bei maximaler Geschwindigkeit für 1 h bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 70% EtOH.
- Das Pellet in 2 l von 100% Formamid-pH 7,0 wieder aufhängen, bei 40 °C 30 min schütteln (kann bis zu ein paar Stunden dauern) und dann ein gleiches Volumen von 4x Saline-Natriumcitrat (SSC)/20% Dextransulfat hinzufügen.
- 20x SSC durch Mischen von 175,3 g NaCl und 88,2 g Natriumcitrat in einem Endvolumen von 1 LH2O. Autoklav, Filter und Herstellung von Aliquots vorbereiten.
HINWEIS: Bei mehrfarbigem DNA-FISCH können die verschiedenen Sonden zusammen gefällt werden, mit Ausnahme von Sonden, die miteinander glühen können. In diesen spezifischen Fällen die Insonzien, die die in den Schritten 1.5-1.7 genannten Reagenzien in Bezug auf die Anzahl der Sonden teilen, getrennt behandeln, ausstoßen und wieder aussetzen. Die Sonden erst nach Resuspension in Formamid bündeln. Wenn Glasabdeckungen von mehr als 10 mm oder weniger als 10 mm verwendet werden, skalieren Sie das Volumen der in den Schritten 1,5 bis 1,7 verwendeten Reagenzien proportional zur Foliengröße nach oben/unten. Hybridisationssonden können über einen längeren Zeitraum (bis zu zwei Monate) bei -20 °C gelagert werden.
- 20x SSC durch Mischen von 175,3 g NaCl und 88,2 g Natriumcitrat in einem Endvolumen von 1 LH2O. Autoklav, Filter und Herstellung von Aliquots vorbereiten.
2. Zellfixierung, Vorbehandlung und Permeabilisation
HINWEIS: Permeabilisations- und Deproteinisierungspassagen sind entscheidende Schritte. Die Reaktionszeit und Konzentration der Reagenzien hängt stark vom Zelltyp, dem Zytoplasmareichtum und der Kernmorphologie ab.
- Zellfixierung, Vorbehandlung und Permeabilisation für humane primäre T-Lymphozyten
HINWEIS: Dieses Protokoll eignet sich für kleine Zellen mit kleinen Kernen und einer geringen Menge an Zytoplasma.- Verwenden Sie Glasabdeckungen (10 mm, Dicke Nr. 1.5H).
- Waschen Sie das Glas mit ddH2O, dann mit 70% EtOH und lassen Sie es trocknen. Verwenden Sie ein Glas für jeden Brunnen einer 24-Well-Platte.
- Fügen Sie 200 l von 0,1% Poly-L-Lysin (w/v) (Tabelle der Materialien) direkt auf das Glas, um einen Tropfen zu bilden. Achten Sie darauf, da der Tropfen auf der Glasoberfläche bleiben muss, ohne den Brunnen für 2 bis 5 min zu berühren. Lassen Sie den Tropfen vorsichtig aus, und lassen Sie das Glas 30 min trocknen.
- Führen Sie Schritt 2.1.3 zweimal mehr aus.
- Legen Sie 200 l Suspensionszellen (2 x 106/ml, PBS Suspension von ex vivo primären T-Lymphozyten) direkt auf das Glas, lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur (RT) für 30 min säen.
- Entfernen Sie den Tropfen schnell. Fügen Sie frisch gemachte 4% PFA (zubereitet in PBS/0,1% TWEEN 20, pH 7,0, gefiltert) für 10 min hinzu und fixieren Sie die gesäten Zellen bei RT.
- Waschen Sie dreimal für 5 min mit 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) bei RT. Permeabilize mit 0.5% TPBS für 10 min bei RT.
- Führen Sie die RNase-Behandlung durch, indem Sie 2,5 l RNase-Cocktail (Materialtabelle) in 250 l PBS/Well in einer 24-Well-Platte für 1 h bei 37 °C hinzufügen.
- In PBS abspülen, 20% Glycerin/PBS hinzufügen und über Nacht (ON) bei 4 °C brüten.
HINWEIS: Dieser Schritt kann von 1 h bis EIN reichen. Die Dias können bis zu 7 Tage in 20% Glycerin/PBS bei 4 °C gehalten werden. - Auf Trockeneis (15 bis 30 s) einfrieren, bei RT nach und nach auftauen und 20% Glycerin/PBS einweichen. Wiederholen Sie Schritt 2.1.9 dreimal.
- Waschen Sie in 0.5% TPBS für 5 min bei RT. Waschen Sie in 0.05% TPBS, zweimal für 5 min bei RT. Inkubieren in 0.1 N HCl für 12 min bei RT. Spülen in 2x SSC.
- Inkubieren Sie in 50% Formamid pH 7.0/2x SSC ON bei RT.
HINWEIS: Die Inkubationszeit kann optimiert und eventuell reduziert werden. Die Dias können mehrere Tage in 50% Formamid/2x SSC aufbewahrt werden.
- Zellfixierung, Vorbehandlung und Permeabilisation für humane primäre Myoblaste
HINWEIS: Dieses Protokoll eignet sich für große Zellen mit einer hohen Menge an Zytoplasma.- Wachsen Sie menschliche primäre Myoblasten direkt auf der Deckslipbrille in 24-Well-Platten im Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM), 20% fetales Rinderserum (FBS), 25 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), 10 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 10 g/ml Humaninsulin, 1x Glutamin, 1x Penicillin/Streptomycin) für mindestens 24 h (erreicht 50 bis 70% des Zusammenflusses).
HINWEIS: Um die Haftung zu erleichtern, können Gelatine oder Kollagen oder Poly-L-Lysin verwendet werden, um den Deckslip vor der Aussaat zu beschichten. - Spülen Sie Zellen in 2-3 Veränderungen der PBS. Fügen Sie frisch gemacht 4% PFA und fixieren Sie die Zellen für 10 min bei RT.
- Waschen Sie dreimal für 3 min jeweils in 0.01% TPBS bei RT. Permeabilize in 0.5% TPBS für 10 min bei RT.
- Führen Sie die RNase-Behandlung durch, indem Sie 2,5 l RNase-Cocktail (Materialtabelle) in 250 l PBS/Well in einer 24-Well-Platte für 1 h bei 37 °C hinzufügen.
- In PBS abspülen, 20% Glycerin/PBS hinzufügen und bei RT einbrüten.
HINWEIS: Dieser Schritt kann von 1 h bis EIN reichen. Die Dias können bis zu 7 Tage in 20% Glycerin/PBS bei 4 °C gehalten werden. - Auf Trockeneis (15 bis 30 s) einfrieren, bei RT nach und nach auftauen und 20% Glycerin/PBS einweichen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Waschen Sie dreimal für jeweils 10 min in PBS. Inkubieren in 0.1 N HCl für 5 min bei RT. Spülung in 2x SSC.
- Inkubieren Sie in 50% Formamid pH 7.0/2x SSC ON bei RT.
HINWEIS: Die Zeit der Inkubation kann optimiert und schließlich reduziert werden. Die Dias können mehrere Tage in 50% Formamid/2x SSC aufbewahrt werden. - Gleichgewichtsschlitten (in 50% Formamid/2x SSC gehalten) in 2x SSC für 2 min. Dann, Equilibrate in PBS für 3 min.
- Behandeln Sie mit 0,01 N HCl/0,0025% Pepsin von wenigen Sekunden bis zu 5 min, je nach Zelltyp. Beobachten Sie in diesem Schritt die Zellen unter einem optischen Mikroskop und stoppen Sie die Reaktion (Schritt 2.2.11), sobald die Kerne frei vom Zytoplasma sind, während ihre Struktur intakt bleibt (z. B. sind Nukleoli noch sichtbar und intakt).
- Inaktivieren Sie das Pepsin, indem Sie es zweimal für jeweils 5 min in 50 mM MgCl2/PBS waschen.
- Nachfix in 1% PFA/PBS für 1 min. 5 min in PBS waschen. Zweimal für 5 min in 2x SSC waschen und dann 50% Formamid/2x SSC für mindestens 30 min hinzufügen.
- Wachsen Sie menschliche primäre Myoblasten direkt auf der Deckslipbrille in 24-Well-Platten im Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM), 20% fetales Rinderserum (FBS), 25 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), 10 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 10 g/ml Humaninsulin, 1x Glutamin, 1x Penicillin/Streptomycin) für mindestens 24 h (erreicht 50 bis 70% des Zusammenflusses).
3. 3D Mehrfarbige DNA FISH Hybridisierung
- Denaturieren Sie die Sonden bei 80 °C für 5 min, und legen Sie dann schnell auf Eis.
- Laden Sie die Hybridisierungssonden auf einen sauberen Mikroskopschlitten. Drehen Sie den Coverslip mit Zellen auf den Kopf auf den Tropfen der Hybridisierungssonden.
- Versiegeln Sie den Deckelrutsch mit Gummizement. Den Gummizement vollständig trocknen lassen. Dann rutschen auf einen Heizblock und denaturieren bei 75 °C für 4 min.
HINWEIS: Der Zeitpunkt der Denaturierung und temperaturder Denaturierung kann bis zu 80 °C erhöht werden. - Hybridisieren Bei 37 °C EIN in einer Metallbox, die in einem Wasserbad schwimmt.
HINWEIS: Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, kann die Hybridisierungstemperatur bis zu 42 °C betragen. - Gummizement abziehen, die Dias in 2x SCC eintauchen, den Glasdeckel abstreifen und in 6-Well-Platte auf 2x SSC übertragen.
- 2x SSC dreimal für 5 min bei 37 °C waschen, bei 90 Umdrehungen pro Minute in einem Inkubator-Shaker schütteln. 0,1x SSC dreimal für 5 min bei 60 °C einwaschen, bei 90 Umdrehungen pro Minute in einem Inkubator-Shaker schütteln. Kurz abspülen in 4x SSC/0,2% TWEEN 20.
4. 3D mehrfarbige DNA FISH-Erkennung
HINWEIS: Überspringen Sie bei direkt beschrifteten Sonden die Schritte 4.1 und 4.2.
- Block in 4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% Rinderserumalbumin (BSA) für 20 min bei 37 °C in einer 24-Well-Platte, schütteln bei 20 Umdrehungen pro Minute in einem Inkubator-Shaker.
- Inkubieren Sie mit der entsprechenden Konzentration von Anti-Digoxygenin (1:150) und/oder Streptavidin (1:1.000) (Materialtabelle) in 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% BSA für 35 min in einer dunklen und nassen Kammer bei 37 °C verdünnt.
- 4x SSC/0,2% TWEEN 20 dreimal für je 5 min bei 37 °C waschen, bei 90 Umdrehungen pro Minute in einer 6-Well-Platte in einem Inkubator-Shaker schütteln.
- Gleichgewicht in PBS und Nachfix in 2% Formaldehyd/PBS für 2 min bei RT in einer 24-Well-Platte.
HINWEIS: Direkt gekennzeichnete Sonden benötigen keine Nachfixierung. - 5x kurz in PBS waschen. Stain mit 1 ng/mL DAPI (4,6-Diamidino-2-Phenylindole)/PBS für 5 min bei RT.
- 5x kurz in PBS waschen. Mount mit Antifade-Lösung (Materialtabelle).
5. 3D Mehrfarbige DNA FISH Mikroskopie und Analyse
- Erfassen Sie 3D-Bilder mit einem Mikroskopsystem.
HINWEIS: Hier wird ein Weitfeldmikroskop mit einem axialen Abstand von 0,2 bis 0,25 m zwischen aufeinander folgenden Abschnitten (Abbildung 1B) verwendet. - Analysieren Sie 3D-Bildstapel mit verschiedenen Software und Tools (hier NuCL-D oder Nuclear Contacts Locator in 3D).
HINWEIS: Das Tool NuCL-D wurde entwickelt, um 3D-Mehrfarben-DNA-FISH in Fluoreszenzzellen-Bild-Z-Stacks automatisch zu analysieren. NuCL-D rekonstruiert die Kerne aus Zellbildstapeln in 3D und erkennt und lokalisiert fluoreszierende 3D-Spots. Es misst die relative Positionierung von Flecken im Kern (z. B. Abstand vom Schwerpunkt der Kerne und/oder Peripherie der Kerne) und den maximalen Radius für jeden Kern und zwischen den Spots Entfernungen. Das Werkzeug und der verwendete Algorithmus sind vollständig in Cortesi et al.16beschrieben. - Analysieren Sie die von NuCL-D abgerufenen Daten (z. B. 3D-Abstände zwischen spezifizierten genomischen Loci und dem Kernschwerpunkt und den Kontaktfrequenzen).
HINWEIS: Normalisieren Sie bei 3D-Abstände zwischen spezifiziertem genomischen Loci und dem Kernschwerpunkt die Entfernungen auf dem maximalen Radius für jeden Kern und stellen diese Daten als Frequenzverteilungen normalisierter Entfernungen vom Kernschwerpunkt dar. Bei Langzeitinteraktionsstudien sollen die Kontaktfrequenzen im Bereich von 10 bis 20 %21 liegen, wobei ein Schwellenabstand variieren kann und um 2 m35liegen kann.- Um statistische Analysen durchzuführen, analysieren Sie etwa 100 Kerne pro biologischer Replikation. Stellen Sie 3D-Abstände zwischen bestimmten genomischen Loci als kumulative Frequenzverteilungen von Entfernungen dar, die unterhalb des ausgewählten Schwellenwerts zwischen dem gewählten Abstand liegen, und verwenden sie einen t-Test, um die Signifikanz von Unterschieden in den Verteilungen zu bewerten. Berechnen Sie außerdem den Prozentsatz der Kerne, die für die Wechselwirkungen unterhalb der ausgewählten Schwellenentfernung liegen, und verwenden Sie Fishers genauen Test, um die Signifikanz der Unterschiede in den Prozentsätzen zu bewerten.
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Representative Results
Die in diesem Artikel beschriebene Methode der 3D-Mehrfarben-DNA FISH ermöglicht eine zeitgemäße Visualisierung verschiedener genomischer Loci innerhalb konservierter 3D-Kerne (Abbildung 1B). Dieses Protokoll ermöglicht die Messung von Entfernungen zwischen Allelen und verschiedenen genomischen Loci, um ihre räumliche Nähe zu bewerten und ihre Position innerhalb des Kernraums zu bewerten (z. B. Loci-Entfernung vom Schwerpunkt oder der Peripherie der Kerne)16. Es gibt jedoch viele wichtige Schritte, die genau und speziell für jeden verwendeten Zelltyp eingerichtet werden müssen. Es wird dringend empfohlen, besonders auf die folgenden Schritte für den Erfolg von 3D-Mehrfarben-DNA FISH zu achten.
Überprüfen Sie bei der Dna-Sondenvorbereitung, ob die Sondengröße <200 bp ist (Abbildung 1A). Diese Größe gewährleistet ein erfolgreiches Verfahren der 3D-Mehrfarben-DNA FISH (Abbildung 1B). Suboptimale DNA-FISH-Sonden, die durch Nick-Translation erzeugt werden, können teilweise verdaut werden (Abbildung 2A) oder überverdaut (Abbildung 2B). Bei teilweise verdauten Sonden wird das Verfahren kein Signal in den Zellen haben, da die Sonde nicht in die Kerne eindringen und sich richtig mit den komplementären genomischen Loci hybridisieren kann. Überverdaut werden Sonden zu einem unspezifischen Signal führen, aufgrund eines Verlusts an Spezifität in der Hybridisierung und einer daraus resultierenden Zunahme des Hintergrunds. Ein repräsentatives Beispiel für überverdaute Sonden ist in Abbildung 3A im Vergleich zu einer optimal verdauten Sonde in Abbildung 3Bdargestellt.
Für DieProteinisierung und Pepsinisierung, folgen Sie diesen Schritten entsprechend dem Zelltyp. Berücksichtigen Sie insbesondere die nukleare Größe und die Häufigkeit des Zytoplasmas. Für humane ex vivo isolierte T-Lymphozyten und Zellen mit kleinen, stark verdichteten Kernen und geringem reichlichem Zytoplasma ist die HCl-Deproteinisierung von entscheidender Bedeutung. Die Behandlung mit 0,1 N HCl für 5 min reicht für die DNA-FISH-Visualisierung nicht aus. 0.1 Eine 0.1 HCl-Behandlung für 12 min wird empfohlen, um den Zugang von Kernen zu DNA-Sonden zu fördern und die nukleare Integrität zu wahren (Abbildung 4A). Die Pepsin-Verdauung des Zytoplasmas ist nicht erforderlich, um ein gutes Signal der DNA FISH zu erhalten (Abbildung 4B).
Für menschliche primäre Myoblasten und Zellen, die große Kerne und reichlich Zytoplasma haben, ist der Pepsinisierungsschritt von grundlegender Bedeutung. Eine kurze und suboptimale Pepsinisierung des Zytoskeletts wird den Eintritt der Sonde in die Kerne behindern (Abbildung 4C), die in Ermangelung eines DNA-FISH-Signals endet. Wenn die Zellen jedoch über pepsinisiert sind, bleiben die Kerne nicht intakt (Abbildung 4D), und verlieren ihre 3D-Struktur. Ein Beispiel für erfolgreiche 3D-Mehrfarben-DNA FISH finden Sie in Abbildung 4E.
Versiegeln Sie den Deckelrutsch während der Hybridisierung genau; Andernfalls wird die Sonde dispergiert und trocknen. Denaturierungs- und Hybridisierungsschritte müssen schnell durchgeführt werden, damit die Sonde und die genomische DNA nicht reanneal werden. Die Dauer der Denaturierung kann erhöht werden.
Abbildung 1: Repräsentative DNA-Sonden und 3D-Mehrfarben-DNA-FISH. (A) Nick übersetzte DNA-Sonden von optimaler Größe laufen auf einem 2,2% Agarose-Gel (Lane 1, 2), 50 bp Marker (M). (B) Repräsentativer 3D-Mehrfarbig-DNA-FISCHkern mit Sonden, die in humanen primären Myoblasten (grün), 10q26.3 Region (rot) und 8q24.13 (Magenta) in menschlichen primären Myoblasten kartiert werden. Kerne werden mit DAPI (blau) kontert. 63x Vergrößerung. Maßstabsleiste = 5 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beispiele für nicht optimal verdaute DNA-FISH-Sonden. (A) Nicht verdaut (Spur 1, 2) oder teilweise verdaut (Lane 3) nick übersetzte DNA-Sonden laufen auf einem 2,2% Agarose-Gel, 2log Marker (M). (B) Über verdaute Nick übersetzte DNA-Sonden laufen auf einem 2,2% Agarose-Gel, 2log Marker (M). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vergleich von 3D-Mehrfarben-DNA-FISH mit suboptimalen oder optimalen DNA-FISH-Sonden. (A) Repräsentative 3D-Mehrfarben-DNA-FISH-Kerne unter Verwendung von überdauter Sondenkartierung in der 8q24.13-Region (Magenta) in menschlichen primären Myoblasten. Kerne werden mit DAPI (blau) kontert. 63x Vergrößerung. Skala bar = 10 m . (B) Repräsentative 3D-Mehrfarben-DNA-FISH-Kerne unter Verwendung optimal verdauter Sondenkartierung bis 8q24.13 Region (Magenta) in menschlichen primären Myoblasten. Kerne werden mit DAPI (blau) kontert. 63x Vergrößerung. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Mögliche Ergebnisse suboptimaler Deproteinisierungs- und Pepsinisierungsschritte bei 3D-Mehrfarben-DNA-FISH-Ergebnissen. (A) Repräsentative 3D-Mehrfarben-DNA-FISH-Kerne menschlicher Primär-T-Lymphozyten, die für 5 min (links) oder 12 min (rechts) mit 0,1 N HCl behandelt wurden, wobei die Sondenkartierung bis 8q24.13 Region (grün) verwendet wird. Kerne werden mit DAPI (blau) kontert. 100-fache Vergrößerung. Skalenbalken = 10 m (B) Repräsentative 3D-Mehrfarben-DNA-FISH-Kerne menschlicher Primär-T-Lymphozyten, die 12 min mit 0,1 N HCl (links) oder gekoppelt mit 0,01 N HCl/0,0025% Pepsin für 2 min (rechts) behandelt wurden, wobei die Sondenkartierung auf 8q24.13 Region (grün) verwendet wird. Kerne werden mit DAPI (blau) kontert. 100-fache Vergrößerung. Skala bar = 10 m. (C) Repräsentative 3D-Mehrfarben-DNA-FISH-Kerne menschlicher Primärmyoblasten, die mit kurzer und suboptimaler Pepsinisierung behandelt werden, wobei die Sondenkartierung bis 8q24.13 Region (Magenta) verwendet wird. Kerne werden mit DAPI (blau) kontert. 63x Vergrößerung. Skala bar = 10 m . (D) Repräsentative 3D-Mehrfarben-DNA-FISH-Kerne menschlicher Primärmyoblasten, die mit einem verlängerten Pepsinisierungsschritt behandelt werden, wobei die Sondenkartierung auf 8q24.13 Region (Magenta) verwendet wird. Kerne werden mit DAPI (blau) kontert. 63x Vergrößerung. Skalenbalken = 5 m (E) Repräsentative 3D-Mehrfarben-DNA-FISH-Kerne menschlicher Primärmyoblasten, die mit optimalen HCl/Pepsin-Bedingungen behandelt werden, wobei sondenmapping bis 8q24.13 Region (Magenta) behandelt wird. Kerne werden mit DAPI (blau) kontert. 63x Vergrößerung. Maßstabsleiste = 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Nick-Translationsreagenzien | Anfängliche Konzentration | Endgültige Konzentration |
| dNTPs (C-G-A) | 0,5 mM | 0,05 mM |
| dTTP | 0,1 mM | 0,01 mM |
| Biotin/Dig/Cy3 dUTP | 1 mM | 0,02 mM |
| Tris HCl pH 7,8 | 1 M | 50 mM |
| MgCl2 | 100 mM | 5 mM |
| Mercaptoethanol | 100 mM | 10 mM |
| Bsa | 100 ng/l | 10 ng/l |
| DNA Pol I | 10 U/L | 0,1 U/L |
| DNase I | 1 U/L | 0,002 U/L |
| DNA 2 g | X | X |
| ddH2O | Bis zu 50 l |
Tabelle 1: Nick Übersetzung. Tabelle, die alle Reagenzien, ihre Konzentration und den vorgeschlagenen Zeitpunkt für die Nick-Translation-Reaktion beschreibt.
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Discussion
Die aktuelle Methode beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um 3D-Mehrfarben-DNA-FISH auf einer Vielzahl menschlicher Primärzellen durchzuführen. Obwohl DNA FISH eine Technologie im breiten Einsatz ist, ist 3D-Mehrfarben-DNA-FISH auf konservierten 3D-Interphasenkernen in vielen Laboratorien immer noch schwierig durchzuführen, vor allem aufgrund der Eigenschaften der verwendeten Proben23,24.
Probe nick Translation ist ein grundlegender Schritt für erfolgreiche 3D-Mehrfarben-DNA FISH; Für diese Reaktion können viele verschiedene Substrate (BAC, fosmid, plasmid, PCR-Produkte) verwendet werden, und das Timing der Reaktion und enzymkonzentration kann entsprechend an die Länge des Substrats angepasst werden. Eine ordnungsgemäße Sondenverdauung ist grundlegend (Abbildung 1), da nicht optimale Sonden (Abbildung 2) zu keinem Signal oder einem unspezifischen Signal führen (Abbildung 3A). Permeabilisations-, Deproteinisierungs- und Pepsinisierungsschritte sind entscheidende Passagen, die stark vom verwendeten Zelltyp abhängen. Zellen mit kleinen Kernen und geringer Zytoskelettreichtum, wie ex vivo isolierte T-Lymphozyten, erfordern eine Deproteinisierung mit einer längeren 0,1 N HCl-Behandlung. Auch Washes in PBS mit höheren Prozentsätzen von Triton X-100 können den Sondeneintrag in den Kernen dieser Zellen unterstützen. Im Gegenteil, in vitro kultivierte menschliche primäre Myoblasten, die größere Kerne mit einem hohen Zytoskelettgehalt aufweisen, müssen die zytosolischen Strukturen mit Pepsin verdauen. Diese allgemeinen Rollen können auf eine Vielzahl von Zellen angewendet werden, die schließlich die verschiedenen Schritte in Abhängigkeit von den spezifischen zellulären Eigenschaften kombinieren.
Die Verwendung von frisch zubereitetem biologischem Material, frischen Lösungen (insbesondere Lösungen mit Waschmittel) und fluoreszierenden Reagenzien wird dringend empfohlen: gefiltertes PFA bei pH 7,0; autoklaviert und gefiltert 20x SSC bei pH 7,0; gefiltertes Formamid bei pH 7,0; nuklease freies Wasser; und Einweg-Aliquots modifizierter UTP. Eine längere Inkubation mit 20 % Glycerin/PBS oder 50 % Formamid/2x SSC kann die Hybridisierung erleichtern. Die HCl- und/oder Pepsin-Behandlung kann weiter erhöht werden. Der Zeitpunkt der Hybridisierung, die Menge der Sonden, die Konzentration und der Zeitpunkt der Inkubation von Antidigoxigenin und Streptavidin können alle weiter angepasst werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
3D-Mehrfarben-DNA-FISH stellt ein ergänzendes Werkzeug zu C-Technologien dar, der Standardmethode zur Validierung von C-basierten Ergebnissen. In Kombination mit 3D-Mikroskopie und -analyse kann 3D-Mehrfarben-DNA-FISH die Nähe zwischen genomischen Loci und ihrer topologischen Verteilung im Kernraum auf Einzelzellebene überwachen. 3D-Mehrfarben-DNA-FISH können weiter in andere Methoden wie RNA FISH und Immunfluoreszenz integriert werden, um einen umfassenden Überblick über die Dynamik und Wechselwirkungen zwischen genomischen Loci, RNAs (Messenger RNA oder regulatorischer nicht-kodierender RNA) und einer breiten Palette von Proteine, die eine einzigartige Gelegenheit bieten, die kernnukleare Struktur zu visualisieren und die epigenetischen Mechanismen zu untersuchen, die die zelluläre Identität unterwerfen.
Trotz der enormen Verbesserung der FISH-Technologien mit Super-Auflösung25,26, Live-Zell-Bildgebung27,28,36, Einzelmolekül-Detektion37, und zeitgenössische Visualisierung mehrerer Ziele mit Oligonukleotid-Arrays wie Oligopaint37,38 mit 3D-Hochdurchsatz-Ansätze39, eine Begrenzung der Technologie bleibt die diskrete Anzahl der vorbestimmten genomischen Loci, die visualisiert werden. Dies verhindert eine umfassende Analyse der Nukleararchitektur. Mehrere Studien haben vor kurzem sequenzielle Methoden der Hybridisierung beschrieben, um die Genomorganisation in einzelnen Zellen wie Barcode-DNA FISH40,41,42,43zu behandeln. Weitere Anstrengungen werden erforderlich sein, um die einzellige Natur von 3D-Mehrfarben-DNA-FISH mit genomweiten Merkmalen zu koppeln, um die Heterogenität der Nukleararchitektur mit bildgebenden Technologien zu visualisieren, da die Anzahl der Loci, die gleichzeitig getestet werden können, zunehmen wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen die technische Unterstützung der INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Mailand, Italien), insbesondere C. Cordiglieri, für die Unterstützung bei 3D-Mehrfarben-DNA-FISH-Bildern Erwerb. Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien an B.B. unterstützt: EPIGEN Italienisches Flaggschiff-Programm, Association Francoise contre les Myopathies (AFM-Telethon, Grant nr 18754) und Giovani Ricercatori, italienisches Gesundheitsministerium (GR-2011-02349383). Diese Arbeit wurde durch folgenden Zuschuss an F.M. unterstützt: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, Grant nr 2018-0321).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
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