Summary
3डी मल्टीकलर डीएनए फिश 3डी संरक्षित नाभिक के भीतर कई जीनोमिक लोकी की कल्पना करने के लिए एक उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है, जो एक ही कोशिका स्तर पर परमाणु अंतरिक्ष के भीतर उनकी पारस्परिक बातचीत और स्थानीयकरण को स्पष्ट रूप से परिभाषित करती है। यहां, मानव प्राथमिक कोशिकाओं के एक विस्तृत स्पेक्ट्रम के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल वर्णित है।
Abstract
सेल जीव विज्ञान में एक बड़ा सवाल परमाणु अंतरिक्ष के भीतर जीनोमिक संगठन है और कैसे क्रोमेटिन वास्तुकला जीन अभिव्यक्ति, सेल पहचान और भेदभाव जैसी प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है। जीनोम के 3डी वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए विकसित कई दृष्टिकोणों को दो पूरक श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: गुणसूत्र संरचना कैप्चर आधारित प्रौद्योगिकियों (सी-टेक्नोलॉजीज) और इमेजिंग। जबकि पूर्व निश्चित कोशिकाओं की आबादी में गुणसूत्र संरचना और समीपस्थ डीएनए बातचीत पर कब्जा करने पर आधारित है, बाद, 3 डी संरक्षित नाभिक पर सीटू संकरण (मछली) में डीएनए फ्लोरेसेंस के आधार पर, समकालीन दृश्य की अनुमति देता है एक ही कोशिका स्तर (बहुरंगी) पर कई लोकी, नाभिक (3 डी बहुरंगी डीएनए मछली) के भीतर उनकी बातचीत और वितरण की जांच करती है। 3 डी मल्टीकलर डीएनए फिश की तकनीक में केवल कुछ पूर्व निर्धारित लोकी की कल्पना करने की सीमा है, जो परमाणु वास्तुकला के व्यापक विश्लेषण की अनुमति नहीं देता है। हालांकि, इसके परिणामों की मजबूती को देखते हुए, 3डी-माइक्रोस्कोपी और छवि पुनर्निर्माण के संयोजन में 3डी बहुरंगी डीएनए मछली सी-प्रौद्योगिकी आधारित परिणामों को मान्य करने और विशिष्ट लोकी की स्थिति और संगठन का स्पष्ट रूप से अध्ययन करने के लिए एक संभावित तरीका है एक ही सेल स्तर पर। यहां, हम मानव प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त 3डी बहुरंगी डीएनए मछली की चरण विधि के कदम से एक कदम का प्रस्ताव करते हैं और एक सफल और सूचनात्मक 3डी मल्टीकलर प्राप्त करने के लिए आवश्यक सभी व्यावहारिक कार्यों, महत्वपूर्ण कदमों, 3डी इमेजिंग की धारणाओं और डेटा विश्लेषण पर चर्चा करते हैं विभिन्न जैविक संदर्भों के भीतर डीएनए मछली।
Introduction
उच्च यूकेरियोट्स को नाभिक1,2, 3,4के 3डी अंतरिक्ष में व्यवस्थित रूप से गाढ़ा और कॉम्पैक्ट करने की आवश्यकता होती है । आज, हम जानते हैं कि जीनोम को डिब्बों और टोपिलॉजिकल रूप से जुड़े डोमेन5 में स्थानिक रूप से आदेश दिया जाता है और डीएनए तह के कई स्तर विभिन्न जीनोमिक क्षेत्रों के बीच संपर्क उत्पन्न करते हैं जिसमें क्रोमेटिन लूप गठन6,7शामिल हो सकता है। क्रोमेटिन की 3डी डायनेमिक लूपिंग कई विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं जैसे ट्रांसक्रिप्शन8,9, विभेदन और विकास10,11,डीएनए मरम्मत12,13को प्रभावित कर सकती है, जबकि इसकी क्षोभ विभिन्न बीमारियों में शामिल हैं14,15,16 और विकासात्मक दोष15,17,18.
3डी जीनोम संगठन का अध्ययन करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। गुणसूत्र संरचना पर कब्जा आधारित प्रौद्योगिकियों (सी-टेक्नोलॉजीज, 3सी, 4C, 5C, हाय-सी और डेरिवेटिव) को फिक्स्ड कोशिकाओं3,4,19,20में जीनोम संगठन का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । इस तरह के दृष्टिकोण भौतिक निकटता में जीनोमिक लोकी के बीच संपर्क आवृत्तियों पर कब्जा करने की क्षमता पर आधारित हैं। सी-टेक्नोलॉजीज, उनकी जटिलता के आधार पर, वैश्विक 3 डी जीनोम संगठन और एक सेल जनसंख्या3,4,19,20के परमाणु टोपोलॉजी को पकड़ते हैं। फिर भी, 3 डी इंटरैक्शन समय और स्थान में गतिशील होते हैं, मल्टीप्लेक्स इंटरैक्शन से मिलकर व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच अत्यधिक परिवर्तनशील होते हैं, और बड़े पैमाने पर विषम21,22होते हैं।
सीटू संकरण (मछली) में 3डी बहुरंगी डीएनए फ्लोरेसेंस एक तकनीक है जो एक ही कोशिका स्तर पर विशिष्ट जीनोमिक लोकी के दृश्य की अनुमति देती है, जिससे सी-प्रौद्योगिकियों के पूरक तरीके से 3डी परमाणु वास्तुकला की सीधी जांच सक्षम होती है। यह वर्तमान में सी-परिणामों को स्पष्ट रूप से मान्य करने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है। 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली फ्लोरोसेंटी लेबल जांच का उपयोग करता है जो हितों के जीनोमिक लोकी के पूरक हैं। विभिन्न फ्लोरोफोरस और उपयुक्त माइक्रोस्कोपी उपकरणों के उपयोग से परमाणु अंतरिक्ष23,24के भीतर कई लक्ष्यों के समकालीन दृश्य की अनुमति मिल जाती है । हाल के वर्षों में, मछली को माइक्रोस्कोपी में तकनीकी प्रगति के साथ जोड़ा गया है ताकि लाइव इमेजिंग27,28में न्यूक्लिक एसिड के दृश्य के लिए उच्च संकल्प25,26 या CRISPR-कैस दृष्टिकोणों पर ठीक पैमाने की संरचनाओं का दृश्य प्राप्त किया जा सके। व्यापक गोद लेने के बावजूद, 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली दृष्टिकोण अभी भी कई प्रयोगशालाओं में मुश्किल माना जाता है क्योंकि जैविक सामग्री का इस्तेमाल किया अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
यहां, हम मानव प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू 3डी बहुरंगी डीएनए मछली (सेल/जांच तैयारी से डेटा विश्लेषण तक) के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिससे कई जीनोमिक लोकी के दृश्य को सक्षम किया जा सकता है और न्यूक्लिकी की 3डी संरचना को संरक्षित किया जा सकता है । परमाणु वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए, नाभिक की 3 डी संरचना को संरक्षित किया जाना चाहिए। इस कारण से, अन्य मौजूदा प्रोटोकॉल29,30,31के विपरीत, हम अल्कोहल ढाल के उपयोग और अल्कोहल में कवरस्लिप के भंडारण से बचते हैं जो क्रोमेटिन संरचना32को प्रभावित कर सकता है। विधि संरक्षित 3 डी डीएनए मछली प्रोटोकॉल24,33 से अनुकूलित किया जाता है मानव प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जाना है, दोनों अलग पूर्व वीवो या विट्रो में सुसंस्कृत । विभिन्न परमाणु आकृति विज्ञान और साइटोलॉजिकल विशेषताओं (जैसे, परमाणु कॉम्पैक्टेशन की विभिन्न डिग्री, साइटोस्केलेटन बहुतायत)34के लिए पार्मेबिलाइजेशन और डिप्रोटीनाइजेशन पैरामीटर हैं। इन मापदंडों को अक्सर अन्य प्रोटोकॉल24,33में वर्णित किया जाता है, विभिन्न सेल प्रकारों के भीतर प्रक्रिया का स्पष्ट भेदभाव प्रदान किए बिना। इसके अलावा, हमने 16 में NuCLεD (3D में परमाणु संपर्क लोकेटर)16नाम का एक विशिष्ट उपकरण विकसित किया है, जो डेटा विश्लेषण के लिए सिद्धांत प्रदान करता है जो स्वचालित तरीके से परमाणु अंतरिक्ष के भीतर विभिन्न लोकी और उनके परमाणु स्थलीय वितरण के बीच 3डी निकटता में सुधार करेगा।
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Protocol
1. डीएनए जांच की तैयारी और निक अनुवाद के साथ लेबलिंग प्रक्रियाओं
- बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्रों (BACs), प्लाज्मिड या पीसीआर उत्पादों को विशिष्ट किट(सामग्री की तालिका)के साथ शुद्ध और साफ करें, डीडीएच2ओ में फिर से निलंबित करें, एक अगारोज जेल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा जांच करें और मात्रा निर्धारित करें।
- टेबल 1के अनुसार 0.5 मिलीग्राम कम बाध्यकारी डीएनए ट्यूब में सभी अभिकर्ताओं को मिलाकर 50 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में चरण 1.1 से 1.5−2 माइक्रोन पर निक अनुवाद करें।
नोट: सीधे लेबल जांच शोर अनुपात के लिए संकेत में सुधार कर सकते हैं । निक अनुवाद द्वारा विभिन्न एलेक्सा फ्लोरोक्रोम के साथ अप्रत्यक्ष और प्रत्यक्ष रूप से लेबल की गई जांच का उत्पादन करने के लिए किट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। - शुरुआती डीएनए सामग्री की लंबाई के आधार पर एक समय के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल मिक्सर में निक अनुवाद मिश्रण को इनक्यूबेट करें: पीसीआर उत्पादों के लिए 45 मिन (2,000 बीपी प्रत्येक के पीसीआर उत्पादों का एक पूल) और बीएसी डीएनए और प्लाज्मिड के लिए 4 घंटे तक।
- 2.2% अगारोज जेल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा चरण 1.3 में उत्पादित जांच के आकार की जांच करें।
नोट: इष्टतम जांच आकार <200 बीपी(चित्रा 1ए)है।- यदि डीएनए पर्याप्त पचा नहीं है, तो डीएनए पॉलीमरेज I और DNase I के 0.05 यू के 5 यू को प्रतिक्रिया और 16 डिग्री सेल्सियस पर 1−2 घंटे के लिए इनक्यूबेट और बाद में फिर से जांच ें। 0.5 m EDTA (अंतिम एकाग्रता) के साथ प्रतिक्रिया बंद करो। स्टोर जांच -20 डिग्री सेल्सियस पर।
- प्रत्येक डीएनए मछली प्रयोग के लिए, शुरू डीएनए सामग्री जिसमें से जांच का उत्पादन कर रहे है के आधार पर जांच की निम्नलिखित मात्रा उपजी: निक अनुवादित पीसीआर उत्पादों से २०० एनजी, निक अनुवादित BACs से १०० एनजी, या निक अनुवाद प्लाज्मिड से ३०० एनजी । DdH2O अप 150 μL, अलेबल सामन शुक्राणु डीएनए के 20 μg, प्रजातियों के 3.5 μg-विशिष्ट खाट-1 डीएनए, 100% EtOH के 3 संस्करणों, और 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच 5.2 की 1/10 मात्रा जोड़ें। 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर उपजी।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र और अतिशयोक्ति त्यागें। 70% EtOH के साथ दो बार गोली धोएं।
- 100% फॉर्मामाइड पीएच 7.0 के 2 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें, 30 मिन के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं (कुछ घंटों तक लग सकते हैं) और फिर 4x खारा-सोडियम साइटेट (एसएससी) /20% dextran सल्फेट की बराबर मात्रा जोड़ें।
- 20x एसएससी को एनएसीएल के 175.3 ग्राम और 88.2 ग्राम सोडियम साइट्रेट को एच2ओ ऑटोक्लेव के 1 एल की अंतिम मात्रा में मिलाकर तैयार करें, फ़िल्टर करें और एलिकोस तैयार करें।
नोट: बहुरंगी डीएनए मछली के लिए, विभिन्न जांच ों को एक दूसरे के साथ एनियल कर सकते हैं कि जांच के अलावा एक साथ उपजी जा सकती है। इन विशिष्ट मामलों में, जांच की संख्या के संबंध में 1.5−1.7 चरणों में उल्लिखित अभिकर्मकों को विभाजित करने वाली जांचको अलग से मानते हैं, उपजी और फिर से निलंबित करें। फॉर्मामाइड में पुनर्सस्पेंशन के बाद ही जांच पूल करें। यदि 10 मिमी से अधिक या 10 मिमी से कम ग्लास कवरस्लिप का उपयोग किया जाता है, तो स्लाइड आकार के आनुपातिक रूप से चरण1.5−1.7 में उपयोग किए जाने वाले रिएजेंट्स की मात्रा को स्केल/डाउन करें। संकरण जांच को लंबी अवधि (दो महीने तक) के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- 20x एसएससी को एनएसीएल के 175.3 ग्राम और 88.2 ग्राम सोडियम साइट्रेट को एच2ओ ऑटोक्लेव के 1 एल की अंतिम मात्रा में मिलाकर तैयार करें, फ़िल्टर करें और एलिकोस तैयार करें।
2. सेल निर्धारण, पूर्व उपचार और परमीबिलाइजेशन
नोट: परमीबिलाइजेशन और डिप्रोटीनाइजेशन मार्ग महत्वपूर्ण कदम हैं। प्रतिक्रिया और अभिकर्मकों की एकाग्रता का समय दृढ़ता से सेल प्रकार, साइटोप्लाज्म बहुतायत, और परमाणु आकृति विज्ञान पर निर्भर करता है।
- मानव प्राथमिक टी लिम्फोसाइट्स के लिए सेल निर्धारण, पूर्व उपचार और परमीबिलाइजेशन
नोट: यह प्रोटोकॉल छोटी कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है, जिसमें छोटी नाभिक और साइटोप्लाज्म की कम मात्रा है।- ग्लास कवरस्लिप (10 मिमी, मोटाई नंबर 1.5 H) का उपयोग करें।
- डीडीएच2ओ के साथ ग्लास धोएं, फिर 70% EtOH के साथ और उन्हें सूखने दें। 24-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए एक गिलास का उपयोग करें।
- एक बूंद बनाने के लिए ग्लास पर सीधे 0.1% पॉली-एल-लिसिन (w/v)(सामग्री की तालिका)के 200 माइक्रोन जोड़ें। ध्यान दें क्योंकि बूंद को 2−5 मिनट के लिए कुएं को छुए बिना कांच की सतह पर रहना चाहिए। बूंद को ध्यान से छोड़ दें, और कांच को 30 मिनट के लिए सूखा दें।
- दो बार और कदम 2.1.3 प्रदर्शन करते हैं।
- निलंबन कोशिकाओं के २०० μLरखो (2 x 10 6/mL, पूर्व वीवो प्राथमिक टी लिंफोसाइट्स के पीबीएस निलंबन) सीधे गिलास पर, कोशिकाओं को कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 किमी के लिए बीज के लिए अनुमति देते हैं ।
- ड्रॉप को जल्दी से हटा दें। 10 मिन के लिए हौसले से बनाया 4% पीएफए (PBS/0.1% TWEEN 20, पीएच 7.0, फ़िल्टर) में तैयार जोड़ें और आरटी में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को ठीक करें।
- आरटी में ०.०५% ट्राइटन एक्स-100/PBS (TPBS) के साथ प्रत्येक 5 मिन के लिए तीन बार धोएं । आरटी में 10 मिन के लिए ०.५% टीपीबीएस के साथ Permeabilize ।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 24-अच्छी प्लेट में पीबीएस/वेल के 250 माइक्रोन में आरनैस कॉकटेल(टेबल ऑफमैटेरियल) के 2.5 माइक्रोन जोड़कर RNase उपचार करें।
- पीबीएस में कुल्ला करें, 20% ग्लाइसेरोल/पीबीएस जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (ऑन) इनक्यूबेट करें।
नोट: यह कदम 1 घंटे से लेकर ऑन तक हो सकता है। स्लाइड्स में रखा जा सकता है 20% ग्लाइसेरोल/पीबीएस में 7 दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस रखा जा सकता है। - सूखी बर्फ (15−30 एस) पर फ्रीज, आरटी पर धीरे-धीरे गल, और 20% ग्लाइसेरोल/पीबीएस में भिगोएं। दोहराएं कदम 2.1.9 एक और तीन बार।
- आरटी में 5 मिन के लिए 0.5% टीपीबीएस में धोएं। 0.05% टीपीबीएस में धोएं 0.05% टीपीबीएस में, आरटी में 5 मिन के लिए दो बार। 0.1 एन एचसीएल में इनक्यूबेट आरटी में 12 मिन के लिए। 2x एसएससी में कुल्ला।
- आरटी में 50% फॉर्ममाइड पीएच 7.0/2x एसएससी ऑन में इनक्यूबेट।
नोट: ऊष्मायन समय अनुकूलित किया जा सकता है और अंततः कम किया जा सकता है। स्लाइड्स में रखा जा सकता है 50% फॉर्ममाइड/2x एसएससी कई दिनों तक रखा जा सकता है।
- मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट के लिए सेल निर्धारण, पूर्व उपचार और परमीबिलाइजेशन
नोट: यह प्रोटोकॉल बड़ी कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है, जिसमें साइटोप्लाज्म की उच्च मात्रा है।- विकास माध्यम (Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM), 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 25 एनजी/एमएल फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (FGF), 10 एनजी/mL एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), 10 μg/mL मानव इंसुलिन, में 24-अच्छी तरह प्लेटों में कवरस्लिप चश्मे पर सीधे मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट हो जाना, 1x ग्लूटामाइन, 1x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन) कम से कम 24 घंटे (संगम के 50−70% तक पहुंचने) के लिए।
नोट: आसंजन, जिलेटिन या कोलेजन या पॉली-एल-लिसिन को सीडिंग से पहले कवरस्लिप कोट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। - पीबीएस के 2−3 परिवर्तनों में कोशिकाओं को कुल्ला। हौसले से बनाया 4% पीएफए जोड़ें और आरटी में 10 मिन के लिए कोशिकाओं को ठीक करें।
- आरटी में 0.01% टीपीबीएस में 3 मिन के लिए तीन बार धोएं। 0.5% टीपीबीएस में आरटी में 10 मिन के लिए Permeabilize।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 24-अच्छी प्लेट में पीबीएस/वेल के 250 माइक्रोन में आरनैस कॉकटेल(टेबल ऑफमैटेरियल) के 2.5 माइक्रोन जोड़कर RNase उपचार करें।
- PBS में कुल्ला, 20% ग्लाइसेरोल/PBS जोड़ें, और आरटी पर इनक्यूबेट ।
नोट: यह कदम 1 घंटे से लेकर ऑन तक हो सकता है। स्लाइड्स में रखा जा सकता है 20% ग्लाइसेरोल/पीबीएस में 7 दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस रखा जा सकता है। - सूखी बर्फ (15−30 एस) पर फ्रीज, आरटी पर धीरे-धीरे गल, और 20% ग्लाइसेरोल/पीबीएस में भिगोएं। इस कदम को तीन बार दोहराएं।
- पीबीएस में प्रत्येक 10 मिन के लिए तीन बार धोएं। आरटी में 5 मिन के लिए 0.1 एन एचसीएल में इनक्यूबेट। 2x एसएससी में कुल्ला।
- आरटी में 50% फॉर्ममाइड पीएच 7.0/2x एसएससी ऑन में इनक्यूबेट।
नोट: ऊष्मायन के समय को अनुकूलित किया जा सकता है और अंततः कम किया जा सकता है। स्लाइड्स में रखा जा सकता है 50% फॉर्ममाइड/2x एसएससी कई दिनों तक रखा जा सकता है। - 2 x एसएससी में 2x एसएससी में 2x sin में इक्विब्रेट स्लाइड (50% फॉर्मामाइड/2x एसएससी में रखा गया) । फिर, 3 मिन के लिए पीबीएस में समान।
- सेल प्रकार के आधार पर, 5 मिनट तक कुछ सेकंड से 0.01 एन एचसीएल/0.0025% पेप्सिन के साथ इलाज करें। इस चरण के दौरान, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें और जैसे ही नाभिक साइटोप्लाज्म से मुक्त होते हैं, प्रतिक्रिया (चरण 2.2.11) को रोकें, जबकि उनकी संरचना बरकरार है (उदाहरण के लिए, नाभिक अभी भी दिखाई देते हैं और बरकरार हैं)।
- 50 एमएम एमजीसीएल 2/पीबीएस में प्रत्येक 5 मिनके लिए दो बार धोकर पेप्सिन को निष्क्रिय करें।
- 1 मिन के लिए 1% पीएफए/पीबीएस में फिक्स के बाद । पीबीएस में 5 मिन के लिए वॉश करें । 2x एसएससी में प्रत्येक 5 मिन के लिए दो बार धोएं, और फिर कम से कम 30 गुना के लिए 50% फॉर्ममाइड/2x एसएससी जोड़ें।
- विकास माध्यम (Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM), 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 25 एनजी/एमएल फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (FGF), 10 एनजी/mL एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), 10 μg/mL मानव इंसुलिन, में 24-अच्छी तरह प्लेटों में कवरस्लिप चश्मे पर सीधे मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट हो जाना, 1x ग्लूटामाइन, 1x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन) कम से कम 24 घंटे (संगम के 50−70% तक पहुंचने) के लिए।
3. 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश हाइब्रिडाइजेशन
- 5 मिन के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर जांच विकृत, और फिर बर्फ पर जल्दी डाल दिया।
- एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर संकरण जांच लोड। संकरण जांच की बूंद पर कोशिकाओं के साथ कवरस्लिप को उल्टा करें।
- रबर सीमेंट से कवरस्लिप को सील करें। रबर सीमेंट को पूरी तरह से सूखने दें। फिर 4 मिन के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक और विकृत पर स्लाइड रखें।
नोट: दरिद्रता के समय और निंदा के तापमान को बढ़ाया जा सकता है, 80 डिग्री सेल्सियस तक। - पानी के स्नान में तैरते धातु बॉक्स में 37 डिग्री सेल्सियस पर संकरण करें।
नोट: शोर अनुपात के लिए संकेत में सुधार करने के लिए, संकरण तापमान 42 डिग्री सेल्सियस तक जा सकता है। - रबर सीमेंट से छील, 2x एससीसी में स्लाइड विसर्जित, कांच कवरस्लिप से पट्टी और 6 अच्छी तरह से थाली में 2x एसएससी के लिए हस्तांतरण ।
- 2x एसएससी में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए तीन बार धोएं, एक इनक्यूबेटर शेकर में 90 आरपीएम पर मिलाते हुए। 0.1x एसएससी में 3 बार 5 मिन के लिए तीन बार 60 डिग्री सेल्सियस पर धोएं, एक इनक्यूबेटर शेकर में 90 आरपीएम पर मिलाते हुए। 4x एसएससी/0.2% TWEEN 20 में संक्षेप में कुल्ला ।
4. 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश डिटेक्शन
नोट: सीधे लेबल जांच के लिए, कदम 4.1 और 4.2 छोड़ ें।
- 4x एसएससी/0.2% ट्वीन 20/4% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) में 24-वेल प्लेट में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए ब्लॉक करें, एक इनक्यूबेटर शेकर में 20 आरपीएम पर मिलाते हुए।
- एंटी-डिगऑक्सीजनिन (1:150), और/या स्ट्रेप्टाविडिन (1:1,000)(सामग्री की तालिका)की उचित एकाग्रता के साथ इनक्यूबेट 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे और गीले कक्ष में 35 मिन के लिए 20/4% बीएसए पतला हो गया है।
- 4x एसएससी/0.2% ट्वीन 20 में धोएं 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए तीन बार, एक इनक्यूबेटर शेकर में 6-वेल प्लेट में 90 आरपीएम पर मिलाते हुए।
- पीबीएस में समतुल्य और 2% फॉर्मलडिहाइड/पीबीएस में 24-अच्छी तरह की प्लेट में आरटी में 2 मिन के लिए फिक्स करें ।
नोट: सीधे लेबल जांच के बाद निर्धारण की जरूरत नहीं है । - पीबीएस में संक्षेप में 5x धोएं। आरटी में 5 मिन के लिए 1 एनजी/एमएल डीएपीआई (४,६-डिमिडिनो-2-फेनिलिंडॉल)/पीबीएस के साथ दाग ।
- पीबीएस में संक्षेप में 5x धोएं। एंटीफीका समाधान(सामग्री की तालिका) केसाथ माउंट करें।
5. 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण
- माइक्रोस्कोप सिस्टम के साथ 3डी इमेज हासिल करें।
नोट: यहां, लगातार वर्गों(चित्रा 1बी)के बीच 0.2−0.25 माइक्रोन की अक्षीय दूरी के साथ एक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है। - विभिन्न सॉफ़्टवेयर और टूल (यहां, 3 डी में NuCLεD या न्यूक्लियर कॉन्टैक्ट्स लोकेटर) का उपयोग करके 3डी इमेज स्टैक का विश्लेषण करें।
नोट: फ्लोरेसेंस सेल इमेज जेड-स्टैक में 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश का स्वचालित रूप से विश्लेषण करने के लिए टूल NuCLεD विकसित किया गया है। NuCLεD 3 डी में सेल इमेज स्टैक से नाभिक को पुनर्निर्मित करता है और साथ ही फ्लोरोसेंट 3 डी स्पॉट का पता लगाता है और स्थानीयकरण करता है। यह नाभिक में स्थानों की सापेक्ष स्थिति (जैसे, नाभिक के सेंट्रोइड से दूरी और/या नाभिक की परिधि) और प्रत्येक नाभिक और अंतर-स्थानों की दूरी के लिए अधिकतम त्रिज्या को मापता है । उपकरण और एल्गोरिथ्म का उपयोग पूरी तरह से कोर्टेसी एट अल16में वर्णित है। - डेटा का विश्लेषण करें (उदाहरण के लिए, निर्दिष्ट जीनोमिक लोकी और परमाणु सेंट्रोइड और संपर्क आवृत्तियों के बीच 3 डी दूरी) NuCLεD द्वारा प्राप्त की।
नोट: निर्दिष्ट जीनोमिक लोकी और परमाणु सेंट्रोइड के बीच 3 डी दूरी के लिए, प्रत्येक नाभिक के लिए अधिकतम त्रिज्या पर दूरी को सामान्य करें और परमाणु सेंट्रोइड से सामान्यीकृत दूरी के आवृत्ति वितरण के रूप में इन आंकड़ों का प्रतिनिधित्व करते हैं । लंबी दूरी के इंटरैक्शन अध्ययनों के लिए, संपर्क आवृत्तियों को 10−20%21 की सीमा में एक सीमा अंतर-दूरी के साथ माना जाता है जो भिन्न हो सकते हैं और 2 माइक्रोन35के आसपास रखा जा सकता है।- सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए, जैविक प्रतिकृति प्रति लगभग 100 नाभिक का विश्लेषण करें। निर्दिष्ट जीनोमिक लोकी के बीच 3 डी दूरी का प्रतिनिधित्व करता है जो दूरी के संचयी आवृत्ति वितरण के रूप में है जो चयनित सीमा अंतर-दूरी से नीचे हैं और वितरण में मतभेदों के महत्व का आकलन करने के लिए टी-टेस्टका उपयोग करते हैं। इसके अलावा, उन इंटर-डिस्टेंस से नीचे की गई बातचीत के लिए न्यूक्लिकी पॉजिटिव के प्रतिशत की गणना करें और प्रतिशत में मतभेदों के महत्व का आकलन करने के लिए फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करें ।
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Representative Results
इस लेख में वर्णित 3डी बहुरंगी डीएनए मछली की विधि संरक्षित 3 डी नाभिक(चित्रा 1बी)के भीतर विभिन्न जीनोमिक लोकी के समकालीन दृश्य की अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल एलील्स और विभिन्न जीनोमिक लोकी के बीच दूरी की माप की अनुमति देता है ताकि उनकी स्थानिक निकटता का मूल्यांकन किया जा सके, और परमाणु अंतरिक्ष के भीतर उनके स्थान का आकलन किया जा सके (उदाहरण के लिए, सेंट्रोइड से लोकी दूरी या नाभिक की परिधि)16। हालांकि, ऐसे कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक सेल प्रकार के लिए सटीक और विशेष रूप से स्थापित किया जाना चाहिए; 3डी मल्टीकलर डीएनए मछली की सफलता के लिए निम्नलिखित चरणों पर विशेष ध्यान देने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।
डीएनए जांच की तैयारी के लिए, जांच करें कि जांच का आकार <200 bp(चित्रा 1A)है । यह आकार 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश(चित्रा 1बी)की एक सफल प्रक्रिया सुनिश्चित करता है। निक अनुवाद द्वारा उत्पादित सबऑप्टिमल डीएनए फिश जांच आंशिक रूप से पचाई जा सकती है(चित्रा 2ए)या पचाने से अधिक(चित्रा 2बी)। आंशिक रूप से पचाने वाली जांच के साथ, प्रक्रिया में कोशिकाओं में कोई संकेत नहीं होगा, जांच की असमर्थता के कारण नाभिक में प्रवेश करने और पूरक जीनोमिक लोकी को ठीक से संकरण करना होगा। अधिक पचाजांच एक गैर विशिष्ट संकेत में परिणाम होगा, संकरण में विशिष्टता की हानि और पृष्ठभूमि के परिणामस्वरूप वृद्धि के कारण । चित्रा 3बीमें इष्टतम पचाने वाली जांच की तुलना में चित्रा 3ए में अधिक पचाने वाली जांच का एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाया गया है।
डिप्रोटीनाइजेशन और पेप्सिनाइजेशन के लिए सेल टाइप के हिसाब से इन स्टेप्स को फॉलो करें । विशेष रूप से, परमाणु आकार और साइटोप्लाज्म बहुतायत को ध्यान में रखें। मानव प्राथमिक पूर्व वीवो अलग टी लिम्फोसाइट्स और छोटे, अत्यधिक संकुचित नाभिक और कम प्रचुर मात्रा में साइटोप्लाज्म के साथ कोशिकाओं के लिए, एचसीएल डिप्रोटीनाइजेशन महत्वपूर्ण है। 5 मिन के लिए 0.1 एन एचसीएल के साथ उपचार डीएनए मछली दृश्य के लिए पर्याप्त नहीं है। 12 मिन के लिए 0.1 एन एचसीएल उपचार डीएनए जांच के लिए नाभिक पहुंच को बढ़ावा देने और परमाणु अखंडता की रक्षा(चित्र4ए)की सिफारिश की है। डीएनए फिश(चित्रा 4बी)का अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए साइटोप्लाज्म के पेप्सिन पाचन की आवश्यकता नहीं है।
मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट और कोशिकाओं के लिए जिनमें बड़े नाभिक और प्रचुर मात्रा में साइटोप्लाज्म होते हैं, पेप्सिनाइजेशन कदम मौलिक है। साइटोस्केलेटन का एक छोटा और उप-इष्टतम पेप्सिनाइजेशन डीएनए फिश सिग्नल के अभाव में समाप्त होने वाले नाभिक(चित्र4सी)में जांच के प्रवेश में बाधा उत्पन्न करेगा। हालांकि, यदि कोशिकाएं पेप्सिनाइज्ड खत्म हो जाती हैं, तो नाभिक बरकरार नहीं रहेंगे(चित्र4डी),उनकी 3 डी संरचना खो देगा। चित्रा 4ईमें सफल 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश का एक उदाहरण प्रदान किया गया है।
संकरण के दौरान, कवरस्लिप को सही ढंग से सील करें; अन्यथा, जांच तितर-बितर और सूख जाएगी। Denaturation और संकरण कदम तेजी से किया जाना चाहिए ताकि जांच और जीनोमिक डीएनए reanneal नहीं होगा । दरिदर्शन की अवधि बढ़ाई जा सकती है।
चित्रा 1: प्रतिनिधि डीएनए जांच और 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली । (ए)निक इष्टतम आकार के डीएनए जांच अनुवाद एक २.२% agarose जेल (लेन 1, 2), ५० बीपी मार्कर (एम) पर चलाते हैं । (ख)प्रतिनिधि 3डी बहुरंगी डीएनए फिश नाभिक मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट में 3q11.2 क्षेत्र (हरा), 10q26.3 क्षेत्र (लाल) और 8q24.13 क्षेत्र (मजेंटा) के लिए जांच मानचित्रण का उपयोग कर । नाभिक को डीपीआई (नीला) के साथ प्रतिदागित किया जाता है। 63x आवर्धन। स्केल बार = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: डीएनए मछली जांच को बेहतर रूप से पचाने के उदाहरण। (ए)पचानहीं (लेन 1, 2) या आंशिक रूप से पचा (लेन 3) निक अनुवाद डीएनए जांच एक २.२% agarose जेल, 2log मार्कर (एम) पर चलाते हैं । (ख)पचानिक अनुवादित डीएनए जांच एक २.२% agarose जेल, 2log मार्कर (एम) पर चलाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: उपइष्टतम या इष्टतम डीएनए मछली जांच का उपयोग कर 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली की तुलना। (A)प्रतिनिधि 3डी बहुरंगी डीएनए मछली नाभिक मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट में 8q24.13 क्षेत्र (मजेंटा) के लिए पचा जांच मानचित्रण पर उपयोग कर । नाभिक को डीपीआई (नीला) के साथ प्रतिदागित किया जाता है। 63x आवर्धन। स्केल बार = 10 माइक्रोन(बी)प्रतिनिधि 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश न्यूक्लिआई मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट में 8q24.13 क्षेत्र (मजेंटा) के लिए इष्टतम पचा जांच मानचित्रण का उपयोग कर। नाभिक को डीपीआई (नीला) के साथ प्रतिदागित किया जाता है। 63x आवर्धन। स्केल बार = 10 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: 3 डी मल्टीकलर डीएनए मछली परिणामों पर सबऑप्टिमल डिप्रोटीनाइजेशन और पेप्सिनाइजेशन चरणों के संभावित परिणाम। (A)मानव प्राथमिक टी लिम्फोसाइट्स के प्रतिनिधि 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली नाभिक 0.1 एन एचसीएल के साथ 5 मिन (बाएं) या 12 मिन (दाएं) के लिए इलाज किया, 8q24.13 क्षेत्र (हरे रंग) के लिए जांच मानचित्रण का उपयोग कर। नाभिक को डीपीआई (नीला) के साथ प्रतिदागित किया जाता है। 100x आवर्धन। स्केल बार = 10 माइक्रोन(बी)प्रतिनिधि 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश न्यूक्ली ऑफ ह्यूमन प्राइमरी टी लिम्फोसाइट्स ने 0.1 एन एचसीएल (बाएं) के साथ 12 मिनट के लिए इलाज किया या 2 मिनट (दाएं) के लिए 0.01 एन एचसीएल/0.0025% पेप्सिन के साथ मिलकर, 8q24.13 क्षेत्र (ग्रीन) के लिए जांच मानचित्रण का उपयोग करके। नाभिक को डीपीआई (नीला) के साथ प्रतिदागित किया जाता है। 100x आवर्धन। स्केल बार = 10 माइक्रोन(सी)प्रतिनिधि 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश न्यूक्ली ऑफ ह्यूमन प्राइमरी मायोब्लास्ट्स का इलाज 8q24.13 क्षेत्र (मजेंटा) को प्रोप मैपिंग का उपयोग करते हुए शॉर्ट और सबऑप्टिमल पेप्सिनाइजेशन के साथ किया जाता है। नाभिक को डीपीआई (नीला) के साथ प्रतिदागित किया जाता है। 63x आवर्धन। स्केल बार = 10 माइक्रोन(डी)प्रतिनिधि 3डी मल्टीकलर डीएनए मछली नाभिक मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट के 8q24.13 क्षेत्र (मजेंटा) के लिए जांच मानचित्रण का उपयोग कर, लंबे समय तक पेप्सिनाइजेशन कदम के साथ इलाज किया । नाभिक को डीपीआई (नीला) के साथ प्रतिदागित किया जाता है। 63x आवर्धन। स्केल बार = 5 μm.(ई)प्रतिनिधि 3डी बहुरंगी डीएनए मछली मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट के नाभिक 8q24.13 क्षेत्र (मजेंटा) के लिए जांच मानचित्रण का उपयोग कर इष्टतम एचसीएल/पेप्सिन शर्तों के साथ इलाज किया । नाभिक को डीपीआई (नीला) के साथ प्रतिदागित किया जाता है। 63x आवर्धन। स्केल बार = 25 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
निक अनुवाद अभिकर्मक | प्रारंभिक एकाग्रता | अंतिम एकाग्रता |
डीएनटीपी (सी-जी-ए) | 0.5 एमएम | 0.05 एमएम |
डीटीटीपी | 0.1 एमएम | 0.01 एमएम |
बायोटिन/डीआईजी/Cy3 dUTP | 1 एमएम | 0.02 एमएम |
Tris HCl पीएच 7.8 | 1 एम | 50mm |
एमजीसीएल2 | 100 एमएम | 5 एमएम |
ए-मर्काटोइथेन | 100 एमएम | 10 एमएम |
Bsa | 100 एनजी/μL | 10 एनजी/μL |
डीएनए पोल I | 10 यू/μL | 0.1 यू/μL |
DNase मैं | 1 यू/माइक्रोन | 0.002 यू/μL |
डीएनए 2 μg | एक्स | एक्स |
डीडीएच2ओ | 50 माइक्रोन तक |
तालिका 1: निक अनुवाद । सभी अभिकर्मकों, उनकी एकाग्रता और निक अनुवाद प्रतिक्रिया के लिए सुझाव दिया समय का वर्णन मेज ।
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Discussion
वर्तमान विधि मानव प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला पर 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली प्रदर्शन करने के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम का वर्णन करती है। हालांकि डीएनए मछली व्यापक उपयोग में एक तकनीक है, संरक्षित 3 डी इंटरफेज नाभिक पर 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली अभी भी कई प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है, मुख्य रूप से23,24इस्तेमाल नमूनों की विशेषताओं के कारण ।
जांच निक अनुवाद सफल 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली के लिए एक बुनियादी कदम है; इस प्रतिक्रिया के लिए कई अलग-अलग सब्सट्रेट्स (बीएसी, फॉस्मिड, प्लाज्मिड, पीसीआर उत्पाद) का उपयोग किया जा सकता है, और प्रतिक्रिया और एंजाइम एकाग्रता के समय को सब्सट्रेट की लंबाई के संबंध में तदनुसार समायोजित किया जा सकता है। एक उचित जांच पाचन मौलिक है(चित्रा 1),क्योंकि नॉनऑप्टिमल जांच(चित्रा 2)के परिणामस्वरूप कोई संकेत या गैर-विशिष्ट संकेत(चित्रा 3ए)नहीं होगा। Permeabilization, deproteinization, और पेप्सिनाइजेशन कदम महत्वपूर्ण मार्ग है कि दृढ़ता से इस्तेमाल किया सेल प्रकार पर निर्भर कर रहे हैं । छोटे नाभिक और कम साइटोस्केलेटन बहुतायत वाली कोशिकाओं, जैसे पूर्व वीवो अलग-थलग टी लिम्फोसाइट्स, लंबे समय तक 0.1 एन एचसीएल उपचार के साथ विप्रोटीनीकरण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, ट्राइटन एक्स-100 के उच्च प्रतिशत के साथ पीबीएस में धोता इन कोशिकाओं के नाभिक में जांच प्रवेश में मदद कर सकता है। इसके विपरीत, इन विट्रो सुसंस्कृत मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट जो साइटोस्केलेटन की उच्च सामग्री के साथ बड़े नाभिक पेश करते हैं, को पेप्सिन के साथ साइटोसोलिक संरचनाओं के पाचन की आवश्यकता होती है। इन सामान्य भूमिकाओं को कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है, अंततः विशिष्ट सेलुलर विशेषताओं के आधार पर विभिन्न चरणों का संयोजन।
ताजा तैयार जैविक सामग्री का उपयोग, ताजा समाधान (डिटर्जेंट के साथ विशेष समाधान में), और फ्लोरोसेंट रिएजेंट्स दृढ़ता से सुझाए जाते हैं: पीएच 7.0 पर फ़िल्टर पीएफए; पीएच 7.0 पर ऑटोक्लेव और फ़िल्टर 20x एसएससी; पीएच 7.0 पर फ़िल्टर फॉर्ममाइड; न्यूकलीज मुक्त पानी; और संशोधित यूटीपी के डिस्पोजेबल एलिकोकोट। 20% ग्लाइसेरोल/पीबीएस, या 50% फॉर्मामाइड/2x एसएससी के साथ लंबे समय तक ऊष्मायन संकरण की सुविधा प्रदान कर सकता है। एचसीएल और/या पेप्सिन ट्रीटमेंट को और बढ़ाया जा सकता है । संकरण के समय, जांच की मात्रा, एकाग्रता और विरोधी digoxigenin और स्ट्रेप्टाविडिन के ऊष्मायन के समय सभी को आगे शोर अनुपात के संकेत में सुधार करने के लिए समायोजित किया जा सकता है ।
3डी मल्टीकलर डीएनए फिश सी-टेक्नोलॉजीज के लिए एक पूरक उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है, सी-आधारित परिणामों को मान्य करने की मानक विधि। यदि 3डी माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण के साथ संयुक्त, 3 डी बहुरंगी डीएनए मछली जीनोमिक लोकी और एकल सेल स्तर पर परमाणु अंतरिक्ष के भीतर उनके स्थलोलॉजिकल वितरण के बीच निकटता की निगरानी कर सकती है। 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश को जीनोमिक लोकी, आरएनए (मैसेंजर आरएनए या नियामक गैर कोडिंग आरएनए) और एक विस्तृत श्रृंखला के बीच गतिशीलता और बातचीत के व्यापक सिंहावलोकन के लिए आरएनए मछली और प्रतिकार जैसे अन्य तरीकों के साथ आगे एकीकृत किया जा सकता है। प्रोटीन की, परमाणु संरचना की कल्पना करने और सेलुलर पहचान को सबटेंड करने वाले एपिजेनेटिक तंत्र की जांच करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है।
सुपर रिज़ॉल्यूशन25,26,लाइव सेल इमेजिंग27,28,36,एकल अणु का पता लगाने37,और ओलिगोपेंट37,3डी हाई-थ्रूपुट दृष्टिकोण39के साथ38 के साथ कई लक्ष्यों के समकालीन दृश्य के साथ मछली प्रौद्योगिकियों में भारी सुधार के बावजूद, प्रौद्योगिकी की एक सीमा पूर्व निर्धारित जीनोमिक लोकी की असतत संख्या बनी हुई है जो कर सकती है कल्पना की जाए। यह परमाणु वास्तुकला के व्यापक विश्लेषण को रोकता है। कई अध्ययनों में हाल ही में बारकोड डीएनएफिश40,41,42,43जैसी एकल कोशिकाओं में जीनोम संगठन को संबोधित करने के लिए संकरण के अनुक्रमिक तरीकों का वर्णन किया गया है . इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के साथ परमाणु वास्तुकला विषमता की व्यापक कल्पना करने के लिए जीनोम वाइड सुविधाओं के लिए 3डी बहुरंगी डीएनए मछली की एकल कोशिका प्रकृति को जोड़े जाने के लिए आगे के प्रयासों की आवश्यकता होगी, क्योंकि एक समय में परीक्षण किए जा सकने वाले लोकी की संख्या में वृद्धि होगी।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक 3डी मल्टीकलर डीएनए फिश छवियों के दौरान सहायता के लिए विशेष रूप से सी कॉर्डिग्नेरी में इंग्म इमेजिंग फैसिलिटी (इस्टूटो नाजिओनेल डी जेनेटिका मोल्कोलारे "रोमियो एड एनरिका इनवर्नेज़ी" (INGM), मिलान, इटली की तकनीकी सहायता स्वीकार करते हैं अधिग्रहण. इस काम को बी बी को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया है: एपिजेन इतालवी फ्लैगशिप प्रोग्राम, एसोसिएशन फ्रैंकोइस कॉन्ट्रे लेस मायोपैथीज (एएफएम-टेलीथॉन, ग्रांट एनआर 18754) और जियोवानी राइसरकाटोरी, इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (जीआर-2011-02349383)। इस काम को F.M.: फोंडाजिओन कैरिप्लो (बंदो जियोवानी, अनुदान एनआर 2018-0321) को निम्नलिखित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
bFGF | PeproTech | 100-18B | |
Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
DNase I | Sigma | AMPD1 | |
dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
EGF | Sigma | E9644.2MG | |
Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
Formamide | Sigma | F9037 | |
Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
HCl | Sigma | 30721 | |
Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
MgCl2 | Sigma | 63069 | |
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
NaCl | Sigma | S9888 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
Pepsin | Biorad | P6887 | |
PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
Rubbercement | Bostik | ||
Slides | VWR | 631-0114 | |
Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
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