Summary
3D многоцветная ДНК FISH представляет собой инструмент для визуализации нескольких геномных локусов в 3D сохранившихся ядрах, однозначно определяя их взаимные взаимодействия и локализацию в ядерном пространстве на уровне одной клетки. Здесь описывается протокол шаг за шагом для широкого спектра первичных клеток человека.
Abstract
Важным вопросом в клеточной биологии является геномная организация в ядерном пространстве и то, как архитектура хроматина может влиять на такие процессы, как экспрессия генов, клеточная идентичность и дифференциация. Многие подходы, разработанные для изучения 3D-архитектуры генома, можно разделить на две взаимодополняющие категории: технологии захвата хромосомы (C-технологии) и визуализации. В то время как первый основан на захвате хромосомы конформации и проксимальных взаимодействий ДНК в популяции фиксированных клеток, последний, основанный на флуоресценции ДНК на месте гибридизации (FISH) на 3D-сохраненных ядер, позволяет современную визуализацию несколько локусов на уровне одной клетки (многоцветный), изучая их взаимодействия и распределение внутри ядра (3D многоцветная ДНК FISH). Техника 3D многоцветной ДНК FISH имеет ограничение визуализации лишь нескольких предопределенных локусов, не позволяя всесторонний анализ ядерной архитектуры. Однако, учитывая надежность его результатов, 3D многоцветная ДНК FISH в сочетании с 3D-микроскопией и реконструкцией изображения является возможным методом проверки результатов на основе C-технологий и однозначного изучения положения и организации конкретных локусов на уровне одной ячейки. Здесь мы предлагаем шаг за шагом метод 3D многоцветной ДНК FISH подходит для широкого спектра основных клеток человека и обсуждаем все практические действия, важные шаги, понятия 3D-изображения и анализа данных, необходимых для получения успешного и информативного 3D многоцветного ДНК FISH в различных биологических контекстах.
Introduction
Высшие эукариоты должны систематически конденсировать и уплотнять огромное количество генетической информации в минуту 3D пространство ядра1,2,3,4. Сегодня мы знаем, что геном пространственно упорядочен в отсеках и топологически связанных областях5 и что несколько уровней сворачивания ДНК генерируют контакты между различными геномными регионами, которые могут включать образование хроматиновых циклов6,7. 3D динамическая петля хроматина может влиять на многие различные биологические процессы, такие как транскрипция8,9,дифференциация и развитие10,11,репарация ДНК12,13, в то время как его возмущения участвуют в различных заболеваниях14,15,16 и дефекты развития15,17,18.
Для изучения организации 3D генома было разработано множество подходов. Хромосомы конформации захвата на основе технологий (C-технологии, 3C, 4C, 5C, Hi-C и производных) были разработаны для изучения организации генома в фиксированных клетках3,4,19,20. Такие подходы основаны на способности захватывать контактные частоты между геномными локусами в физической близости. C-технологии, в зависимости от их сложности, ловят глобальную организацию 3D генома и ядерную топологию популяции клеток3,4,19,20. Тем не менее, 3D взаимодействия являются динамическими во времени и пространстве, весьма изменчивы между отдельными клетками, состоящими из мультиплексных взаимодействий, и широко неоднородны21,22.
3D многоцветная флуоресценция ДНК на месте гибридизации (FISH) является методом, который позволяет визуализации конкретных геномных локусов на уровне одной клетки, что позволяет прямое исследование 3D ядерной архитектуры в дополнение к C-технологий. Он представляет собой технологию, используемую в настоящее время для однозначной проверки C-результатов. 3D многоцветная ДНК FISH использует флуоресцентно маркированные зонды, дополняющие геномные локусовы интересов. Использование различных фторофоров и подходящего микроскопионного оборудования позволяет современную визуализацию нескольких целей в ядерном пространстве23,24. В последние годы FISH был объединен с технологическими достижениями в микроскопии, чтобы получить визуализацию мелкомасштабных структур с высоким разрешением25,26 или с CRISPR-Cas подходы для визуализации нуклеиновых кислот в живой визуализации27,28. Несмотря на широкое внедрение, 3D многоцветный подход DNA FISH по-прежнему считается сложным во многих лабораториях, поскольку используемый биологический материал должен быть адаптирован.
Здесь мы предоставляем всеобъемлющий протокол для 3D многоцветной ДНК FISH (от подготовки клеток/зонда до анализа данных), применимый к широкому кругу первичных клеток человека, что позволяет визуализировать несколько геномных локусов и сохранять 3D-структуру ядер. Для изучения ядерной архитектуры необходимо сохранить трехдернскую структуру ядер. По этой причине, в отличие от других существующих протоколов29,30,31, мы избегаем использования градиента алкоголя и хранения крышки в спирте, которые могут повлиять на структуру хроматина32. Метод адаптирован из сохранившихся 3D-протоколов ДНК FISH24,33, которые будут применяться к широкому кругу первичных клеток человека, как изолированных ex vivo, так и культивируемых in vitro. Существуют параметры пермяки и депротеинации для различных ядерных морфологии и цитологических характеристик (например, разной степени ядерного уплотнения, цитоскелет изобилие)34. Эти параметры часто обычно описаны в других протоколах24,33, без предоставления четкой дискриминации процедуры в различных типах клеток. Кроме того, мы разработали специальный инструмент под названием NuCL'D (ядерный локатор контактов в 3D)16, обеспечивая принципы анализа данных, которые улучшат 3D близость между различными локусами и их ядерное топологическое распределение в ядерном пространстве в автоматизированном режиме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка зонда дна и процедуры маркировки с переводом nick
- Очистите и очистите и очистите бактериальные искусственные хромосомы (BACs), плазмиды или продукты ПЦР с конкретными комплектами(Таблица материалов),resuspend в ddH2O, проверить электрофорусна на гель агарозы и количественно.
- Выполните ник перевод на 1,5 х 2 мкг ДНК от шага 1,1 в окончательном объеме 50 qL путем смешивания всех реагентов в 0,5 мл низкой связывающей ДНК трубки в соответствии с таблицей 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Непосредственно помеченные зонды могут улучшить соотношение сигнала к шуму. Наборы для производства косвенно и непосредственно помечены зонды с различными Alexa фторхромы на ник перевод коммерчески доступны. - Инкубация смеси перевода ник в термальных смесителя на 16 градусов по Цельсию в течение некоторого времени в зависимости от длины исходного материала ДНК: 45 мин для продуктов ПЦР (бассейн ПЦР продуктов по 2000 bp каждый) и до 4 ч для BAC ДНК и плазмидов.
- Проверьте размер зондов, производимых в шаге 1.3 электрофорасисом на 2,2% агарозного геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный размер зонда составляет 200 bp(рисунок 1A).- Если ДНК не усваивается достаточно, добавьте 5 U ПОЛимеразы ДНК I и 0,05 U DNase I к реакции и инкубировать в течение 1 х 2 ч при 16 градусах Цельсия, а затем перепроверить. Остановите реакцию с 0,5 мМ EDTA (окончательная концентрация). Храните зонды при -20 градусах По Цельсию.
- Для каждого эксперимента ДНК FISH, осадок следующие количества зондов в зависимости от исходного материала ДНК, из которого производятся зонды: 200 нг из ник переведены ПЦР продуктов, 100 нг от ник переведены BACs, или 300 нг от ник переведен плазмида. Добавьте ddH2O до 150 КЛ, 20 мкг немаркированной ДНК спермы лосося, 3,5 мкг специфической ДНК Cot-1, 3 тома 100% EtOH и 1/10 объем 3 M ацетата натрия рН 5,2. Осадок при -80 градусах по Цельсию на 1 ч.
- Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 ч при 4 градусах По Цельсию и отбрасывайте супернатант. Вымойте гранулы дважды с 70% EtOH.
- Приостановите гранулы в 2 qL 100% formamide pH 7.0, встряхните при 40 градусах По Цельсия в течение 30 мин (может занять до нескольких часов), а затем добавьте равный объем 4x солен-натриевого цитрата (SSC)/20% dextran сульфата.
- Подготовка 20x SSC путем смешивания 175,3 г NaCl и 88,2 г цитрата натрия в окончательном объеме 1 L H2O. Autoclave, фильтр и подготовить aliquots.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для многоцветной ДНК FISH, различные зонды могут быть осаждены вместе, за исключением зондов, которые могут anneal друг с другом. В этих конкретных случаях относитесь к ним отдельно, осаждаети и resuspend зонды, разделяющие реагенты, упомянутые в шагах 1.5-1.7 по отношению к количеству зондов. Бассейн зондов только после повторного в formamide. Если используются стеклянные крышки размером более 10 мм или менее 10 мм, масштабируйте/вниз объем реагентов, используемых в шагах 1,5–1,7 пропорционально размеру слайда. Зонды гибридизации могут храниться при -20 градусов в течение длительного периода времени (до двух месяцев).
- Подготовка 20x SSC путем смешивания 175,3 г NaCl и 88,2 г цитрата натрия в окончательном объеме 1 L H2O. Autoclave, фильтр и подготовить aliquots.
2. Фиксация клеток, предварительное лечение и пермяки
ПРИМЕЧАНИЕ: Пермябилизация и депротеинаизации проходы являются ключевыми шагами. Время реакции и концентрации реагентов сильно зависит от типа клеток, изобилия цитоплазмы и ядерной морфологии.
- Клеточная фиксация, предварительное лечение и пермяки для первичных Т-лимфоцитов человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подходит для небольших клеток, с небольшими ядрами и низким количеством цитоплазмы.- Используйте стеклянные крышки (10 мм, толщина No 1,5Н).
- Вымойте стекло с ddH2O, затем с 70% EtOH и дайте им высохнуть. Используйте по одному стакану для каждого колодца из 24-колодца пластины.
- Добавить 200 л 0,1% поли-L-лизин (w/v)(Таблица материалов)непосредственно на стекле, чтобы сформировать каплю. Обратите внимание, как капля должна оставаться на стеклянной поверхности, не касаясь колодца в течение 2'5 мин. Оставьте падение тщательно, и дайте стеклу высохнуть в течение 30 мин.
- Выполните шаг 2.1.3 в два раза больше.
- Положите 200 зл подвесных клеток (2 х 106/мл, PBS подвеска ex vivo первичных Т лимфоцитов) непосредственно на стекло, позволяют клеткам семян при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут.
- Быстро удалите падение. Добавить свежеприготовленный 4% PFA (подготовлен в PBS/0,1% TWEEN 20, рН 7,0, отфильтрованный) в течение 10 мин и исправить семенами клеток на RT.
- Вымойте три раза в течение 5 минут каждый с 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) на RT. Permeabilize с 0,5% TPBS в течение 10 минут на RT.
- Выполните rNase лечения, добавив 2,5 злицита RNase коктейль(Таблица материалов) в 250 Л ПБС / хорошо в 24-хорошо пластины для 1 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Промыть в PBS, добавить 20% глицерола / PBS, и инкубировать ночь (ON) при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может варьироваться от 1 ч до ON. Слайды могут храниться в 20% глицерола/PBS при 4 градусах Цельсия до 7 дней. - Заморозить на сухом льду (15-30 с), постепенно оттепель на РТ, и замочить в 20% глицерола / PBS. Повторите шаг 2.1.9 еще три раза.
- Вымойте в 0,5% TPBS в течение 5 мин на RT. Мыть еврейв в 0,05% TPBS, дважды в течение 5 мин на RT. Инкубировать в 0,1 N HCl в течение 12 минут на RT. Промыть в 2x SSC.
- Инкубировать в 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может быть оптимизировано и в конечном итоге сокращено. Слайды могут храниться в 50% formamide/2x SSC в течение нескольких дней.
- Фиксация клеток, предварительное лечение и пермяки для первичных миобластов человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подходит для больших клеток, с большим количеством цитоплазмы.- Выращивайте первичные миобласти человека непосредственно на крышках в 24-колодцах в среде роста (модифицированная среда Eagle DmeM), 20% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 25 нг/мл фибробластный фактор роста (FGF), 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 10 мкг/мл человеческого инсулина, 1x глутамин, 1x пенициллин/ стрептомицин) не менее 24 ч (до 50-70% от слияния).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения слипания, желатин или коллаген или поли-L-лизин может быть использован для покрытия coverslip до посева. - Промыть клетки в 2х3 изменения PBS. Добавить свежеприготовленные 4% PFA и исправить клетки в течение 10 минут на RT.
- Вымойте три раза в течение 3 мин каждый в 0,01% TPBS на RT. Пермяки в 0,5% TPBS в течение 10 минут на RT.
- Выполните rNase лечения, добавив 2,5 злицита RNase коктейль(Таблица материалов) в 250 Л ПБС / хорошо в 24-хорошо пластины для 1 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Промыть в PBS, добавить 20% глицерола / PBS, и инкубировать ON на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может варьироваться от 1 ч до ON. Слайды могут храниться в 20% глицерола/PBS при 4 градусах Цельсия до 7 дней. - Заморозить на сухом льду (15-30 с), постепенно оттепель на РТ, и замочить в 20% глицерола / PBS. Повторите этот шаг три раза.
- Вымойте три раза в течение 10 минут каждый в PBS. Инкубировать в 0,1 N HCl в течение 5 мин на RT. Промыть в 2x SSC.
- Инкубировать в 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может быть оптимизировано и в конечном итоге сокращено. Слайды могут храниться в 50% formamide/2x SSC в течение нескольких дней. - Уравновешивать слайды (сохраняется в 50% formamide/2x SSC) в 2x SSC в течение 2 мин. Затем уравновешивать в PBS в течение 3 мин.
- Лечить с 0,01 N HCl/0.0025% пепсина от нескольких секунд до 5 мин, в зависимости от типа клетки. Во время этого шага наблюдайте за клетками под оптическим микроскопом и останавливайте реакцию (шаг 2.2.11), как только ядра освобождаются от цитоплазмы, сохраняя при этом их структуру нетронутой (например, нуклеоли все еще видны и нетронутыми).
- Инактивируйте пепсина, смыв дважды по 5 мин каждый в 50 мМ MgCl2/PBS.
- Пост-фикс в 1% PFA/PBS в течение 1 мин. Вымойте в течение 5 мин в PBS. Вымойте дважды в течение 5 минут каждый в 2x SSC, а затем добавить 50% formamide/2x SSC, по крайней мере 30 мин.
- Выращивайте первичные миобласти человека непосредственно на крышках в 24-колодцах в среде роста (модифицированная среда Eagle DmeM), 20% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 25 нг/мл фибробластный фактор роста (FGF), 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 10 мкг/мл человеческого инсулина, 1x глутамин, 1x пенициллин/ стрептомицин) не менее 24 ч (до 50-70% от слияния).
3. 3D многоцветная гибридизация ДНК FISH
- Денатурировать зонды при 80 градусах по Цельсию в течение 5 минут, а затем быстро положить на лед.
- Загрузите зонды гибридизации на чистый слайд микроскопа. Включите крышку с клетками вверх дном на падение гибридизации зондов.
- Запечатайте крышку резиновым цементом. Пусть резиновый цемент полностью высохнет. Затем поместите горки на нагревательный блок и денатурируйте при 75 градусах по Цельсию в течение 4 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки денатурации и температура денатурации могут быть увеличены, до 80 градусов по Цельсию. - Гибридизуйся при 37-c ON в металлической коробке, плавающей в водяной бане.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения соотношения сигнала к шуму температура гибридизации может подняться до 42 градусов по Цельсию. - Очистите от резинового цемента, погрузите горки в 2x SCC, снимите стеклянную крышку и перенесите его в 2x SSC в 6-хорошую пластину.
- Вымойте в 2x SSC три раза в течение 5 минут каждый при 37 градусах По Цельсию, встряхивая при 90 об/мин в инкубаторе шейкера. Вымойте в 0,1x SSC три раза в течение 5 минут каждый при 60 градусах Цельсия, встряхивая при 90 об/мин в экскере инкубатора. Кратко промыть в 4x SSC/0.2% TWEEN 20.
4. 3D многоцветное обнаружение ДНК FISH
ПРИМЕЧАНИЕ: Для непосредственно обозначенных зондов пропустите шаги 4.1 и 4.2.
- Блок в 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% бычьей сыворотки альбумина (BSA) в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия в 24-хорошей пластине, тряся при 20 об/мин в шейкере-инкубаторе.
- Инкубировать с соответствующей концентрацией антидигоксигена (1:150) и/или стрептавидина (1:1,000)(Таблица материалов),разбавленного в 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% BSA на 35 мин в темной и влажной камере при 37 градусах Цельсия.
- Вымойте в 4x SSC/0,2% TWEEN 20 три раза в течение 5 мин каждый при 37 градусах Цельсия, встряхивая при 90 об/мин в 6-колодценной тарелке в шейкере-инкубаторе.
- Равновесие в PBS и пост-фикс в 2% формальдегида / PBS в течение 2 мин на RT в 24-хорошо пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Непосредственно помеченные зонды не нуждаются в постфиксации. - Вымойте 5x кратко в PBS. Пятно с 1 нг/мл DAPI (4,6-диамидино-2-фенилинол) /PBS в течение 5 мин на RT.
- Вымойте 5x кратко в PBS. Гора с антифадедным раствором(Таблица материалов).
5. 3D многоцветная микроскопия и анализ ДНК FISH
- Приобретение 3D-изображений с помощью системы микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется широкоугольный микроскоп с осевым расстоянием 0,2–0,25 мкм между последовательными секциями(рисунок 1B). - Проанализируйте 3D-изображения с тексисов с помощью различных программ и инструментов (здесь, NuCL'D или Ядерные контакты Locator в 3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент NuCL'D был разработан для того, чтобы автоматически анализировать 3D многоцветную ДНК FISH в флуоресценционном изображении ячейки z-stacks. NuCL'D реконструирует ядра из стеков клеток в 3D, а также обнаруживает и локализует флуоресцентные 3D пятна. Он измеряет относительное позиционирование пятен в ядре (например, расстояние от центроида ядра и/или периферии ядер) и максимальный радиус для каждого ядра и межпятна расстояний. Используемый инструмент и алгоритм полностью описаны в Cortesi et al.16. - Проанализируйте данные (например, 3D расстояния между указанными геномными локотьями и ядерными центроидами и контактными частотами), полученными NuCL-D.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для 3D расстояний между указанными геномными локотьи и ядерным центроидом, нормализовать расстояния на максимальном радиусе для каждого ядра и представить эти данные как распределение частот нормализованных расстояний от ядерного центроида. Для исследований взаимодействия на большие расстояния контактные частоты должны находиться в диапазоне от 10–20%21 с пороговым межрасстоянием, которое может меняться и может быть помещено около 2 мкм35.- Для проведения статистического анализа проанализируйте около 100 ядер на биологическую репликацию. Представляйте 3D-расстояния между указанными геномными локусами как кумулятивные частотные распределения расстояний, которые находятся ниже выбранного порогового уровня, и используйте t-testдля оценки значимости различий в распределении. Кроме того, вычислить процент ядер положительный для взаимодействий, которые находятся ниже порога между расстояния выбран, и использовать точный тест Фишера для оценки значимости различий в процентах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод 3D многоцветной ДНК FISH, описанный в данной статье, позволяет современную визуализацию различных геномных локусов в сохранившихся 3D ядрах(рисунок 1B). Этот протокол позволяет измерять расстояния между аллелями, и различные геномные loci для того чтобы оценить их spatial близость, и определить их положение внутри ядерное пространство (например, расстояние локусов от centroid или периферии ядер)16. Тем не менее, есть много важных шагов, которые должны быть точно и специально настроены для каждого используемого типа ячейки; настоятельно рекомендуется обратить особое внимание на следующие шаги для успеха 3D многоцветной ДНК FISH.
Для подготовки зонда ДНК, проверьте, что размер зонда составляет 200 bp(Рисунок 1A). Этот размер обеспечивает успешную процедуру 3D многоцветной ДНК FISH(рисунок 1В). Субоптимальные зонды ДНК FISH, производимые с помощью ник-перевода, могут быть частично переварены(рисунок 2А)или более переваренные(рисунок 2B). С частично усваиваемыми зондами, процедура не будет иметь сигнала в клетках, из-за неспособности зонда войти в ядра и правильно гибридизировать к дополняя дополнительным геномным loci. Над усваиваемыми зондами приведет к в неспецифическом сигнале, из-за потери специфическости в гибридизации и последовательне увеличение предпосылки. Репрезентативный пример более переваренных зондов показан на рисунке 3А по сравнению с оптимальным переваренный зонд на рисунке 3B.
Для депротеинации и пепсинизации, следуйте этим шагам в соответствии с типом клеток. В частности, учитывайте ядерные размеры и изобилие цитоплазмы. Для человека первичного ex vivo изолированных Т-лимфоцитов и клеток с небольшими, очень уплотненные ядра и низкий обильный цитоплазма, HCl депротеиализации имеет решающее значение. Лечение 0,1 N HCl в течение 5 мин не является достаточным для визуализации ДНК FISH. 0.1 N HCl лечение в течение 12 мин рекомендуется для содействия доступности ядер для ДНК зондов и сохранения ядерной целостности(рисунок 4A). Пепсин переваривание цитоплазмы не требуется для получения хорошего сигнала ДНК FISH(рисунок 4B).
Для основных миобластов человека и клеток, которые имеют большие ядра и обильные цитоплазмы, пепсиназизационный шаг имеет основополагающее значение. Короткая и субоптимальная пепсинизация цитоскелета будет препятствовать проникновению зонда в ядра(рисунок 4С),заканчивающийся отсутствием сигнала ДНК FISH. Однако, если клетки более пепсина, ядра не останутся нетронутыми(Рисунок 4D), потеряв свою 3D-структуру. Пример успешной 3D многоцветной ДНК FISH приведен на рисунке 4E.
Во время гибридизации, печать coverslip точно; в противном случае зонд рассеется и высохнет. Шаги денатурации и гибридизации должны быть выполнены быстро, так что зонд и геномная ДНК не будут reanneal. Продолжительность денатурации может быть увеличена.
Рисунок 1: Репрезентативные ДНК-зонды и 3D многоцветные ДНК FISH. (A) Ник перевел ДНК зонды оптимального размера работать на 2,2% агарозный гель (полоса 1, 2), 50 bp маркер (M). (B) Представитель 3D многоцветного ядра ДНК FISH с помощью зондов отображение 3q11.2 области (зеленый), 10q26.3 области (красный) и 8q24.13 области (пурпурный) в основных миобластов человека. Ядра противозапятнаны DAPI (синим). 63x увеличение. Шкала бар 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Примеры не оптимально усваиваемых зондов ДНК FISH. (A) Не переваривается (полоса 1, 2) или частично переваривается (полоса 3) ник переведен ДНК зонды работают на 2,2% агарозный гель, 2log маркер (M). (B) Более переваренный ник переведен ДНК зонды работают на 2,2% агарозный гель, 2log маркер (M). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Сравнение 3D многоцветной ДНК FISH с использованием неоптимальных или оптимальных зондов DNA FISH. (A) Представитель 3D многоцветных ядер ДНК FISH, используя более переваренный зонд отображение до 8q24.13 области (пурпурный) в основных миобластах человека. Ядра противозапятнаны DAPI (синим). 63x увеличение. Шкала бар No 10 мкм. (B) Представитель 3D многоцветных ядер ДНК FISH с использованием оптимально усваивается зонд отображение до 8q24.13 области (магента) в основных миобластов человека. Ядра противозапятнаны DAPI (синим). 63x увеличение. Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Возможные результаты неоптимальной депротеинации и пепсинизации на 3D многоцветных результатах ДНК FISH. (A) Представитель 3D многоцветных ядер ДНК FISH человека первичных Т-лимфоцитов, обработанных в течение 5 мин (слева) или 12 мин (справа) с 0,1 N HCl, используя зонд отображение до 8q24.13 области (зеленый). Ядра противозапятнаны DAPI (синим). 100-x увеличение. Шкала бар No 10 мкм. (B) Представитель 3D многоцветных ДНК FISH ядра человека первичных Т-лимфоцитов лечение в течение 12 мин с 0,1 N HCl (слева) или в сочетании с 0,01 N HCl/0.0025% пепсина в течение 2 мин (справа), используя зонд отображение до 8q24.13 области (зеленый). Ядра противозапятнаны DAPI (синим). 100-x увеличение. Шкала бар No 10 мкм. (C) Представитель 3D многоцветных ДНК FISH ядра человеческих первичных миобластов, обработанных с коротким и неоптимальным пепсинацией, с помощью зонда отображение до 8q24.13 области (пурпурный). Ядра противозапятнаны DAPI (синим). 63x увеличение. Шкала бар No 10 мкм. (D) Представитель 3D многоцветных ДНК FISH ядра человеческих первичных миобластов, обработанных с длительным шагом пепсиназа, используя зонд отображение до 8q24.13 области (магента). Ядра противозапятнаны DAPI (синим). 63x увеличение. Шкала бар No 5 мкм. (E) Представитель 3D многоцветных ДНК FISH ядра человеческих первичных миобластов, обработанных с оптимальными HCl / пепсина условиях с помощью зонда отображения до 8q24.13 области (магента). Ядра противозапятнаны DAPI (синим). 63x увеличение. Шкала бар 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Реагенты перевода Ника | Первоначальная концентрация | Окончательная концентрация |
| dNTPs (C-G-A) | 0,5 мм | 0,05 мм |
| dTTP | 0,1 мм | 0,01 мм |
| Биотин/Dig/Cy3 dUTP | 1 мМ | 0,02 мм |
| Tris HCl рН 7,8 | 1 M | 50 мМ |
| MgCl2 | 100 мМ | 5 мМ |
| -меркаптоэтанол | 100 мМ | 10 мМ |
| Bsa | 100 нг/л | 10 нг/Л л |
| ДНК Пол I | 10 U/L | 0,1 U/Зл |
| DNase I | 1 U/l | 0,002 U/L |
| ДНК 2 мкг | X | X |
| ddH2O | До 50 л л |
Таблица 1: Ник Перевод. Таблица, описывающая все реагенты, их концентрацию и предлагаемые сроки реакции на перевод ник.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Текущий метод описывает пошагу протокол для выполнения 3D многоцветной ДНК FISH на широком диапазоне первичных клеток человека. Хотя ДНК FISH является технологией широкого использования, 3D многоцветная ДНК FISH на сохранившихся 3D межфазных ядрах по-прежнему трудно выполнить во многих лабораториях, в основном из-за характеристик образцов, используемых23,24.
Перевод зонда ник является фундаментальным шагом для успешного 3D многоцветной ДНК FISH; для этой реакции можно использовать различные субстраты (BAC, фосмид, плазмид, ПЦР продукты), а также соответственно регулировать время реакции и концентрацию ферментов в зависимости от длины субстрата. Надлежащее пищеварение зонда является фундаментальным(Рисунок 1), как неоптимальные зонды (Рисунок 2) приведет к отсутствию сигнала или неспецифического сигнала(рисунок 3A). Пермябилизация, депротеиализация и пепсинизация являются важнейшими проходами, которые сильно зависят от используемого типа клеток. Клетки с небольшими ядрами и низким изобилием цитоскелетов, такие как ex vivo изолированные Т-лимфоциты, требуют депротеинации с длительным лечением 0,1 N HCl. Кроме того, сматки в PBS с более высоким процентом Triton X-100 может помочь зонд вступления в ядрах этих клеток. Напротив, в пробирке культивировали первичные миобласти человека, которые представляют более крупные ядра, с высоким содержанием цитоскелета, необходимо переваривание цитозолических структур с пепсином. Эти общие роли могут быть применены к широкому кругу клеток, в конечном итоге комбинируя различные шаги в зависимости от конкретных клеточных характеристик.
Настоятельно рекомендуется использование свежеподготовленного биологического материала, свежих растворов (в частности, растворов с моющим средством) и флуоресцентных реагентов: фильтрованный ПФА при рН 7,0; автоматическии и отфильтрованные 20x SSC на рН 7.0; фильтрованный формамид при рН 7,0; nuclease свободной воды; и одноразовые aliquots модифицированного UTP. Длительная инкубация с 20% глицерол / PBS, или 50% формамид /2x SSC может облегчить гибридизацию. HCl и / или пепсина лечение может быть дополнительно увеличена. Сроки гибридизации, количество зондов, концентрация и сроки инкубации анти-дигоксигенина и стрептавидина могут быть дополнительно скорректированы для улучшения соотношения сигнала к шуму.
3D многоцветная ДНК FISH представляет собой дополнительный инструмент для C-технологий, стандартного метода проверки результатов на основе C. В сочетании с 3D микроскопией и анализом 3D многоцветная ДНК FISH может контролировать близость между геномными локоциями и их топологическим распределением в ядерном пространстве на уровне одной клетки. 3D многоцветная ДНК FISH может быть дополнительно интегрирована с другими методологиями, такими как РНК FISH и иммунофлуоресценция для всестороннего обзора динамики и взаимодействия между геномными локами, РНК (мессенджер РНК или нормативной не кодирующей РНК) и широким диапазоном белков, предоставляя уникальную возможность визуализировать ядерную структуру и исследовать эпигенетические механизмы, которые subtend клеточной идентичности.
Несмотря на огромное улучшение FISH технологий с суперразрешением 25,26, живой визуализации клеток27,28,36, одномолекулярное обнаружение37, и современная визуализация нескольких целей с олигонуклеотидных массивов, таких как Oligopaint37,38 с 3D высокой пропускной способности подходов39, ограничение технологии остается дискретным числом предопределенных геномных loci, которые могут быть визуализированы. Это предотвращает широкомасштабный анализ ядерной архитектуры. Несколько исследований недавно описал последовательные методы гибридизации для решения генома организации в одиночных клетках, таких как штрих-код ДНК FISH40,41,42,43. Потребуются дальнейшие усилия для того, чтобы соединить одноклеточный характер 3D многоцветной ДНК FISH с широкими функциями генома, чтобы широко визуализировать неоднородность ядерной архитектуры с помощью технологий визуализации, так как количество локусов, которые могут быть протестированы в то время, будет увеличиваться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают техническую помощь INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Ромео эд Энрика Инверници" (INGM), Милан, Италия), в частности C. Cordiglieri, за помощь в 3D многоцветных изображений ДНК FISH Приобретение. Эта работа была поддержана следующими грантами Для B.B.: EPIGEN Итальянский флагман программы, Ассоциация Франсез contre les Myopathies (AFM-Telethon, грант nr 18754) и Джовани Ricercatori, Министерство здравоохранения Италии (GR-2011-02349383). Эта работа была поддержана следующим грантом Ф.М.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, грант nr 2018-0321).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, Pt 2 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , Chapter 4, Unit 4 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
