Summary
Мы описываем метод ретроградного отслеживания дрозофилэмбриональных моторных нейронов с использованием липофильных флуоресцентных красителей.
Abstract
Мы описываем технику ретроградной маркировки моторных нейронов в Дрозофиле. Мы используем растворенный маслом липофильный краситель и доставляем небольшую капельку в эмбриональную подготовку филе микроинжетором. Каждый моторный нейрон, мембрана которого контактирует с каплей, может быть быстро помечен. Индивидуальные моторные нейроны постоянно маркируются, что позволяет четко визуализировать детали конструкций. Учитывая, что липофильные красители бывают различных цветов, техника также обеспечивает средства, чтобы получить соседние нейроны помечены в многоцветных. Этот метод отслеживания поэтому полезен для изучения нейрональных морфогенеза и синаптической связи в двигательной нейронной системы Drosophila.
Introduction
Эмбриональная двигательная нейронная система Дрозофилы предлагает мощную экспериментальную модель для анализа механизмов, лежащих в основе развития центральной нервной системы (ЦНС)1,2,3. Система моторных нейронов поддается биохимическим, генетическим, визуальным и электрофизиологическим методам. Используя методы, генетические манипуляции и функциональные анализы могут быть проведены на уровне одиночных моторных нейронов2,4,5,6.
Во время раннего развития нервной системы нейробласты делятся и генерируют большое количество глии и нейронов. Пространственно-временной связи между delamination и профиль экспрессии генов нейробластов ранее были исследованы в деталях7,8,9. В случае двигательной нейронной системы, формирование эмбрионального нервно-мышечного соединения (NMJ) было широко изучено с помощью aCC (передняя угловая клетка), RP2 (сырые креветки 2), и RP5 моторных нейронов2,10. Например, когда двигательный нейрон RP5 образует зарождающийся синаптический узел, досинаптический и постсинаптический филоподия переплета11,12,13. Такая прямая сотовая связь имеет жизненно важное значение для инициирования формирования NMJ. Вопреки тому, что мы знаем о периферических нервных ветвей, наши знания о том, как моторные дендриты инициировать синаптические связи в ЦНС по-прежнему примитивным.
В этом отчете мы представляем метод, который позволяет ретроградную маркировку моторных нейронов в эмбрионах с помощью микропипети-опосредованного доставки липофильных красителей. Этот метод позволяет нам проследить 38 моторных нейронов, иннервирующих каждый из 30 мышц стенки тела в геми-сегменте на 15 ч после откладки яиц (AEL)14. Используя эту технику, наша группа тщательно исследовала многочисленные выгоды-оф-функции / потери функции аллелей15,16,17. Недавно мы разгадали молекулярные механизмы, которые управляют инициации соединения двигательного дендрита и показали, что взаимодействие Dscam1-Dock-Pak определяет место развития дендрита в моторном нейроне ACC17. В целом, этот метод адаптируется для фенотипического анализа любых эмбриональных моторных нейронов в диком типе или мутантных штаммов, повышая нашу способность предоставлять новые идеи в функциональном дизайне нервной системы Дрозофилы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Оборудование и материалы
- Материалы для сбора эмбрионов и обучения взрослых откладывать яйца
- Подготовка фильтрации аппарата, разрывая 50 мл трубки и резки открыть отверстие в крышке установить сетчатый фильтр с порами 100 мкм (Таблица материалов) между трубкой и крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, клеточные ситечко с порами 100 мкм(Таблица материалов) могут быть использованы для фильтрации шаг сбора эмбриона. - Сделать агар пластины с виноградным агаром премикс(Таблица материалов) в соответствии с перечисленными инструкциями. Кратко, аккуратно перемешать 1 пакет порошка смесь в 500 мл комнатной температуры (RT, 23 КС) dH2O и микроволновой растворенные смеси до энергичного кипения. После охлаждения до 70-75 градусов по Цельсию, залить смесь в чашку Петри (60 мм). После того, как агар затвердеет, храните тарелки при 4 градусах Цельсия.
- Подготовка дрожжевой пасты путем смешивания активных сухих дрожжей(Таблица материалов) и воды в пасту консистенции, и держать на 4 градусов по Цельсию.
- Используйте яичные клетки (для 60 мм Петри блюдо, таблица материалов), которые обеспечивают достаточный поток воздуха.
- Подготовка фильтрации аппарата, разрывая 50 мл трубки и резки открыть отверстие в крышке установить сетчатый фильтр с порами 100 мкм (Таблица материалов) между трубкой и крышкой.
- Приготовление рассечения игл и микропипететов для впрыски красителя
- Приготовьте краситель инъекций микропайпета и иглу вскрытия из той же капиллярной трубки с внутренним диаметром 0,6 мм и внешним диаметром 1,2 мм(Таблица материалов). Потяните капиллярные трубки на выдвижной микропайпет на 7% от 170 V максимальный выход (Таблица материалов) для создания острой иглы с конусом 0,4 см в длину.
- Для впрыска красителя, отрегулируйте micropipette с beveler micropipette (Таблица материалов) методом beveling пузыря описанным в руководстве прибора.
- Короче говоря, замочите мясорубку с смачивания агента (Таблица материалов), чтобы предотвратить воду от "перетаскивания" кончик иглы. Поместите иглу на зажим микропипетки на уровне 25–30 градусов и опустите кончик на две трети радиуса из центра поверхности, соскабившей. Измельчить иглу в то время как шприц с трубками толкает воздух в иглу, чтобы микропипетка будет очищена от стеклянной бритья.
- Отметьте микропайпет с тонкой кончик перманентный маркер, чтобы указать положение открытия на кончике после beveling, как это сложно найти узкое отверстие микропайпет, который формируется под углом.
2. Подготовка к сбору эмбрионов
- Убедитесь, что взрослые мухи (20-40 диких типа Canton-S или белые мухи), самцы и самки, поддерживаются в молодых (злит;7 дней) и здоровых условиях для идеальной коллекции яиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы стимулировать яйцекладка, мухи обучаются в их клетке сбора яиц за пару дней до сбора яиц на агар пластины полосатые дрожжевой пасты по крайней мере один раз в день.
3. Постановка эмбрионов
- Разрешить мухам откладывать яйца на ночь (или не менее 15 ч) на RT, чтобы собрать эмбрионы на 15 h AEL, т.е. этап 1618, для просмотра дендритогенеза aCC и RP3 моторных нейронов. Утром соберите тарелку с яйцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы на 15 ч AEL будет иметь различные 4-камерный кишечник18. Для визуализации различные этапы следуют их специфическим морфологическим критериям и условиям старения. - Чтобы собрать эмбрионы, дехорионат яйца, отложенные на тарелке с 50% отбеливателем в течение 5 мин.
- После того, как хорионы очистили, залить содержимое пластины через фильтрационный аппарат или ситечко клетки, чтобы изолировать эмбрионы. Используя бутылку сжатия воды, разбавить отбеливатель слева на тарелке и собрать как можно больше эмбрионов, как это возможно путем декантирования смеси в фильтр.
- Вымойте эмбрионы на фильтре 3'4x с большим количеством воды или до тех пор, пока запах отбеливателя рассеивается. Снимите фильтр с аппарата и вымойте эмбрионы на другую чистую тарелку с водой. Декантная вода из новой пластины, что эмбрионы на.
- Подготовьте стеклянную горку, покрыв ее двумя слоями виниловой ленты в центре, образуя прямоугольник. Вырежьте прямоугольный бассейн из ленты с помощью лезвия бритвы. Поместите тонкую полоску двусторонней ленты к верхнему концу бассейна, это где эмбрионы будут размещены, как показано на рисунке 1.
- Используя тонкие щипцы, индивидуально отбирайте 5–10 эмбрионов при 15 л.с. AEL и размещайте их на двусторонней ленте с андреевской стороной вверх. Добавить солин насекомого Ringer19 в бассейн вскрытия для защиты эмбрионов от высыхания(рисунок 1).
4. Рассечение и окрашивание
- Используя стеклянную иглу под рассекающим микроскопом(Таблица Материалов),прорежьте середину одного эмбриона на его поверхности от задней части до переднего конца. Затем перетащите эмбрион из вительлина мембраны из ленты на стекло (коробка на рисунке 1). Позаботьтесь о том, чтобы не повредить внутренние ткани эмбриона.
- Переверните эпителиальные ткани из центра и прикрепите эпидермальный край на поверхность стеклянной горки(рисунок 1,вставить).
- Использование трубки подключенной иглы с наконечником открытия 300 мкм (подготовлены путем нарушения тонкого кончика иглы вскрытия), аспирили или дуть воздух, чтобы отделить и удалить дорсальный продольной трахеи стволы, а также любые оставшиеся кишки.
- Используйте 4% параформальдегида (PFA) в фосфат-буферизированных солей (PBS), чтобы исправить эмбрионы в течение 5 минут на RT. Вымойте эмбрионы 3x с PBS.
- Пятно эмбрионов с 1 Л анти-хонредас перекиснида антитела конъюгированные с цианин 3 красителя (анти-HRP Cy3) (Таблица материалов) в 200 ЗЛ PBS на 1 ч. Вымойте эмбрионы с PBS 3x после окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель анти-HRP может быть изменен на основе липофильных красителей выбора для инъекций.
5. Заполнение инъекционной микропипетки
- Тепло липофильных красителей (5 мг/мл DiO или DiD, Таблица материалов) до 60 градусов по Цельсию в 1:10 смесь этанола: растительное масло перед использованием.
- Подготовьте растворенный маслом слайд для инъекционного микропипети. Поместите микропипетт в держатель капилляра(рисунок 2,#1). Используя микроманипулятор(Таблица материалов),отрегулируйте микропипет, чтобы быть над слайдом красителя. Затем отрегулируйте сцену, чтобы поместить микропайпет на краситель(рисунок 2,#2).
- Чтобы заполнить микропипет, используйте микроинжектор(Таблица материалов)(рисунок 2,#3). Соберите краситель в микропайпет, установив Pi (давление инъекций) между 200-500 hPa (гектопаскаль), Ti (время инъекции) между 0,1 и 0,5 с и Pc (компенсационное давление) до 0 hPa в течение 5 мин(рисунок 2, #4).
- После того, как краситель был собран, удалить слайд красителя и поместить образец на стадии микроскопа. Затем увеличьте Pc до диапазона 20-60 hPa, прежде чем опустить микропипетик в образец, чтобы предотвратить загрязнение PBS капиллярным действием.
6. Инъекция красителя в нейроны
- Найдите эмбрион в центре с помощью микроскопа с 10-x объективным объективом(Таблица Материалов)и выровнять микропипетик с эмбрионом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер капли красителя можно регулировать путем изменения Pi или размера отверстия кончика micropipette. Капля должна быть 10–20 мкм, что примерно ширина 1 мышцы. - Измените объектив объективного на объектив погружения в воду 40x(Таблица материалов)и погрузите линзу в PBS, чтобы увидеть эмбрион.
- Используйте флуоресцентную микроскопию, чтобы проверить морфологию нейронов, отмеченную анти-HRP Cy3, и определить место инъекции.
- Во время инъекций, используйте ярко-поле микроскопии, чтобы увидеть капли красителя. Когда эмбрион находится в фокусе, измените положение микропайпета, чтобы сделать нежный контакт с кончиком аксона интереса (например, aCC, RP3).
- Бросьте краситель в правом брюшной полости (A2'A6) геми-сегмент на нервно-мышечной стыке aCC или RP3 (Рисунок 3) с DiD или DiO, с помощью нейронов, отмеченных анти-HRP Cy3. Использование ручного управления (мышь; Рисунок 2, 5) отпустите краситель и удалить микропипетипосле после падения красителя с микроманипулятором и перейти на следующий сайт инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от других красителей (например, Люцифер желтый, кальцийн), которые распространяются в соседние клетки через разрыв узлов, липофильные красители ассоциируются с клеточными мембранами и не передаются соседям. Из-за относительно большого размера капли красителя, однако, этот метод также приводит к маркировке партнерских мышц(Рисунок 3A).
- Инкубировать образец на RT в течение 1 ч после красителя капли до изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь перед монтажом, и образец может храниться при 4 градусах Цельсия на ночь. Липофильные красители также могут быть доставлены с помощью ионтофореза, если внутриклеточного прямого соединения (DC) усилитель легко доступны20.
7. Изображение с помощью конфокального микроскопа
- Снимите двусторонню ленту и виниловую ленту со стеклянной горки с помощью щипочек.
- Подготовьте крышку скольжения (22 х 22 мм2 No 1 крышка стекла) с небольшим количеством вакуумной смазки (Таблица материалов) на четырех углах и тщательно поместите на образец, избегая пузырьков воздуха. Удалите излишки PBS с помощью стеклоочистителей задач.
- Нажмите вниз крышка скольжения, чтобы настроить рабочее расстояние между объективом цели и образца. Полностью запечатать края крышки скольжения с лаком для ногтей.
- Изображение при увеличении в 10 раз и 100 раз с помощью конфокального микроскопа.
- Используйте программное обеспечение ImageJ для обработки необработанных изображений с микроскопа(Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдение должно начаться в течение 10 минут после монтажа для лучших изображений. В противном случае, на RT, краситель будет распространяться на сайты, прилегающие к месту инъекции создания нежелательных фон для изображения. Чтобы замедлить диффузию красителя, образец может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение нескольких часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативное изображение моторных нейронов ACC и RP3 показано на рисунке 3C, чтобы продемонстрировать разноцветную маркировку моторных нейронов на уровне 15 л. Их дендритные морфологии в значительной степени инвариантны между эмбрионами. Шаблон окрашивания, полученный с анти-HRP антитела показаны в серый цвет. Небольшая капля DiO или DiD была депонирована на NMJ мышцы 1 или 6/7, соответственно. Рисунок 4 демонстрирует способность количественно измерять фенотип интереса. Мы подсчитали общее количество советов дендрита в диком типе, по сравнению с мутантом (например, dscam1-/-).
Рисунок 1: Настройка пула вскрытия. Голубая камера, видимая на стеклянной горке, создается с помощью виниловой ленты, удерживая буферы внутри. Двусторонняя лента держится за эмбрионы, которые должным образом выровнены. Также показано в левом нижнем углу пример расчлененного эмбриона в солевом растворе. Передний конец находится на вершине в этом и всех последующих фигур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Оборудование для инъекций красителя. Маркировка стеклянных пипеток на рисунке демонстрирует место установки стеклянной пипетки (1). Эпифлуоресцентный микроскоп оснащен светодиодным источником света и серией фильтров. Вправо от микроскопа помечены микроманипулятор (2) и микроинъекция (3). Вставка представляет собой крупным планом отображение устройства микроинъекций (4) с соответствующими значениями Pi,Tiи Pc). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Липофильные красителя препараты ретроградно помечены моторных нейронов. (A) Ретроградные обозначения моторных нейронов и их целевых мышц. ACC моторных нейронов иннерватирующая мышца 1 (DiO: возбуждение /выброс, 484 нм/501 нм); двигательный нейрон RP3 иннервируя мышцы 6/7 (DiD: возбуждение/выброс, 644 нм/665 нм). Обратите внимание, что мышцы 6/7 также получают иннервацию от другого моторного нейрона (MNISNb/d-Is) в личинок; однако, MNISNb/d-Is не имеет эмбрионального аналога3. Круги указывают места применения красителя. (B) Схематическая диаграмма мышц стенки тела и периферических нервных ветвей в 15 h AEL. Брюшной нервный шнур (VNC) состоит из сегментически повторяющихся и двустороннически симметричных нейромер по отношению к брюшной средней линии (пунктирная линия). Мышцы стенки тела каждого геми-сегмента иннерватированы 38 моторными нейронами. Моторные нейроны проецируют свои аксоны через шесть основных нервных ветвей (ISN (интерсегментальный нерв), SNa (сегментальный нерв а), SNb, SNc, SNd и TN (поперечный нерв). (C) Дендритические ветви от ACC и RP3 моторных нейронов показывают обширное перекрытие. Оба нейрона являются биполярными нейронами, что означает, что нейроны устанавливают две разные популяции дендритов. Каждый нейрон проектов одной беседки в ipsilateral нейропил, а другой в контралатеральный нейропил. Стрелки указывают на дендритные советы. Флуоресценция изображения были приобретены с целью 10x или 100x цель погружения масла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: aCC dendritogenesis, как показано с ретроградной маркировки в час-15 эмбрионов. (A) В диком типе, aCC расширяет свои дендриты в обоих ipsilateral и контралатеральных нейропилс. Для простоты, мы отображаем только ipsilateral дендриты от aCC в этой цифре. aCC помечен ано дио, показанный зеленым цветом. (B) В dscam1 мутантов(dscam121/21 от д-р Цумин Ли, Janelia Научно-исследовательский кампус), ACC имеет несколько ipsilateral дендритов в большинстве случаев наблюдается17. Стрелы показывают дендритные советы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование маркировки красителей для изучения морфологии нейронов имеет ряд преимуществ по сравнению с методами генетической маркировки клеток. Техника маркировки красителя может свести к минимуму время, необходимое для маркировки и визуализации морфологий моторных нейронов. Процесс маркировки красителя довольно быстро, так как он занимает менее 2 ч и позволяет нам определить контур нейронных проекций. В качестве альтернативы, можно визуализировать aCC моторный нейрон, выбрав линию GAL4, которая выражает дрожжевой GAL4 транскрипционный фактор в aCC, и пересечение его с зеленым флуоресцентным белком (GFP) репортер контролируется вверх по течению последовательности активации (UAS)21. Метод маркировки GFP как таковой требует генетического креста и, таким образом, занимает дополнительные несколько дней.
Еще одним преимуществом маркировки красителя является разрешение маркировки плазменной мембраны при чрезвычайно высокой плотности. Достаточная плотность липофильных красителей может присутствовать на каждой части мембраны, что позволяет нам решать мелкие детали маркированной структуры. В отличие от этого, плотность молекул GFP часто зависит от периода ожидания после начала действия системы UAS-GAL4. Например, aCC начинает выражать GFP от 10 л. К 15 ч AEL, когда мы наблюдаем, плотность молекул GFP недостаточно, чтобы скрыть всю мембрану. Это приводит к недостаточной маркировке тонких нейронных проекций (D.K., неопубликованные данные).
Хотя этот метод дает ряд преимуществ, он менее выгоден, когда очевидна ошибочная проекция моторных аксонов. При отсутствии бокового шага,например, моторные нейроны проявляют серьезные аксональные дефекты, такие как преждевременный срыв, сегментный пограничный переход и чрезмерное ветвление22. Как следствие, выход к определенному аксоновому терминалу становится громоздким. Эффективность маркировки также зависит от возраста, будучи эффективным в эмбрионах моложе 20 л. По мере увеличения внеклеточных матричных белков с развитием, маркировка моторных нейронов кажется очень сложной.
Описанный здесь метод позволяет измерить многие морфологические параметры, такие как общая длина и количество неврита, а также невритовую ветвь и форму15,16,17,23,24. Поскольку липофильные карбоциановые красители бывают разных цветов (таких как DiO, DiA, DiI, DiD и DiR), многоцветная маркировка смежных моторных нейронов также достижима. Как показано на рисунке 4, дендриты из ACC и RP3 моторных нейронов широко перекрываются. Для дальнейшего нашего понимания в развитии моторной цепи, механизмы взаимодействия дендрита-дендрита будут исследованы.
Здесь мы подробно универсальный метод, который обеспечивает возможность для изучения нейронов подключения в моторной цепи. Хотя демонстрация ограничивается aCC и RP3 моторных нейронов в 15 h AEL, этот метод может быть применен к другим моторным нейронам на различных стадиях эмбрионального развития. Если аксон терминал доступен с инъекционным микропайпетом, этот метод также может быть применен к маркировке любого нейрона в личинок и взрослых стадиях мух или даже в других организмах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим членов лаборатории Камиямы за комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана NIH R01 NS107558 (м.и., К.Б. и Д.К.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22x22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. Umemori, H., Hortsch, M. , Springer. New York. 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).
- Drosophila Ringer's solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
