Summary
Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.
Abstract
Biz Drosophilamotor nöronların retrograd etiketleme için bir teknik açıklar. Yağda çözünmüş lipophilic boya kullanıyoruz ve mikroenjektör tarafından embriyonik fileto hazırlığına küçük bir damlacık sıyoruz. Membranı damlacıkla temas eden her motor nöron daha sonra hızla etiketlenebilir. Bireysel motor nöronlar sürekli olarak etiketlenir ve ince yapısal detayların net bir şekilde görüntülenmesini sağlar. Lipophilic boyalar çeşitli renklerde gelir göz önüne alındığında, teknik de çok renkli etiketli komşu nöronlar almak için bir araç sağlar. Bu izleme tekniği bu nedenle Drosophilamotor nöron sisteminde nöronal morfogenez ve sinaptik bağlantı incelenmesi için yararlıdır.
Introduction
Drosophila embriyonik motor nöron sistemi merkezi sinir sisteminin gelişiminin altında yatan mekanizmaları analiz etmek için güçlü bir deneysel model sunuyor (CNS)1,2,3. Motor nöron sistemi biyokimyasal, genetik, görüntüleme ve elektrofizyolojik tekniklere uygundur. Teknikler kullanılarak, genetik manipülasyonlar ve fonksiyonel analizler tek motor nöronlar düzeyinde yapılabilir2,4,5,6.
Sinir sisteminin erken gelişimi sırasında, nöroblastlar bölmek ve glia ve nöronların çok sayıda üretmek. Delaminasyon ve nöroblastların gen ekspresyonu profili arasındaki spatiotemporal ilişki daha önce ayrıntılı olarak araştırılmıştır7,8,9. Motor nöron sistemi durumunda, embriyonik nöromüsküler kavşak oluşumu (NMJ) kapsamlı aCC kullanılarak çalışılmıştır (ön köşe hücresi), RP2 (ham karides 2), ve RP5 motor nöronlar2,10. Örneğin, RP5 motor nöron bir doğmakta olan sinaptik kavşak formları, pre-sinaptik ve post-sinaptik filopodia11,12,13. Bu tür doğrudan hücresel iletişim NMJ oluşumunu başlatmak için hayati önem taşımaktadır. Periferik sinir dalları hakkında bildiklerimizin aksine, motor dendritlerin CNS içinde sinaptik bağlantıyı nasıl başlattığına dair bilgimiz hala ilkeldir.
Bu raporda, lipophilic boyaların mikropipet aracılı teslimatı ile embriyolarda motor nöronların retrograd etiketlemesağlayan bir teknik sokuldu. Bu teknik bize 38 motor nöronlar her 30 vücut duvarı kasları bir hemi segmentinde innerve izlemenizi sağlar 15 saat sonra yumurta yumurtlama (AEL)14. Bu tekniği kullanarak, grubumuz iyice çok sayıda kazanç-of-fonksiyon / fonksiyon kaybı alel15,16,17araştırdı. Biz son zamanlarda motor dendrite bağlantısı nın başlatılması sürücü moleküler mekanizmaları çözdük ve bir Dscam1-Dock-Pak etkileşimi aCC motor nöron dendrite outgrowth site tanımlar gösterdi17. Genel olarak, bu teknik vahşi tip veya mutant suşları herhangi bir embriyonik motor nöronların fenotipik analizi için uyarlanabilir, Drosophila sinir sisteminin fonksiyonel tasarımı içine yeni anlayışlar sağlamak için yeteneğimizi artırarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekipman ve Sarf Malzemeleri
- Embriyo toplamak ve yetişkinleri yumurtlamak için eğitmek için malzemeler
- 50 mL'lik bir tüpü keserek ve kapakta bir delik açarak filtreleme aparatıhazırlayın ve tüp ile kapak arasında 100 μm 'lik(Malzeme Tablosu)gözenekli bir örgü filtre ayarlayın.
NOT: Alternatif olarak, embriyo toplamanın filtrasyon basamaşlarında 100 μm(Malzeme Tablosu)gözenekli hücre süzgeci kullanılabilir. - Listelenen talimatlara göre üzüm agar premix(Malzeme Tablosu)ile agar plakaları olun. Kısaca, 1 paket toz karışımını oda sıcaklığında 500 mL (RT, 23 °C) dH2O ve mikrodalga da çözünmüş karışımı iyice kaynatın. 70−75 °C'ye kadar soğuttuktan sonra karışımı Petri kaplarına (60 mm) dökün. Agar katılaştırıladıktan sonra plakaları 4 °C'de saklayın.
- Aktif kuru mayayı(Malzeme Tablosu)karıştırarak maya hamurunu hazırlayın ve bir macun kıvamında su layın ve 4 °C'de tutun.
- Yeterli hava akışı sağlayan yumurta toplama kafesleri (60 mm Petri kabı, Malzeme Tablosuiçin) kullanın.
- 50 mL'lik bir tüpü keserek ve kapakta bir delik açarak filtreleme aparatıhazırlayın ve tüp ile kapak arasında 100 μm 'lik(Malzeme Tablosu)gözenekli bir örgü filtre ayarlayın.
- Diseksiyon iğnelerinin ve boya enjeksiyon mikropipetlerinin hazırlanması
- 0,6 mm iç çapı ve 1,2 mm dış çapı ile aynı kılcal borudan boya enjeksiyonmikropipet ve diseksiyon iğnesi hazırlayın(Malzeme Tablosu). 170 V maksimum çıkıştan(Malzeme Tablosu)%7 oranında bir mikropipet çekmecesi ile kılcal boruyu çekin ve uzunluğu ~0,4 cm'lik bir konikle keskin bir iğne oluşturun.
- Boya enjeksiyonu için, mikropipeti, aletin el kitabında tanımlanan bir kabarcık beveling tekniği ile bir mikropipet beveler(Malzeme Tablosu)ile ayarlayın.
- Kısacası, iğne ucunu 'sürükleyerek' su önlemek için bir ıslatma maddesi(Malzeme Tablosu)ile öğütücü ıslatın. İğneyi 25−30° de mikropipet kelepçesine yerleştirin ve ucu yarıçapın üçte ikisine indirin. Mikropipetin cam talaşlardan arındığından emin olmak için, borulu bir şırınga havayı iğneye doğru iterken iğneyi öğütün.
- Bir açıda oluşan mikropipetin dar açıklığı bulmak zor olduğu için, beveling sonra ucundaki açılış konumunu belirtmek için ince uçlu kalıcı marker ile mikropipet işaretleyin.
2. Embriyo Toplama Hazırlığı
- Yetişkin sineklerin (20−40 vahşi tip Kton-S veya beyaz sinekler), erkek ve dişilerin, genç (<7 gün) ve ideal yumurta toplama için sağlıklı koşullarda muhafaza edilmesini sağlayın.
NOT: Yumurta yumurtlamayı teşvik etmek için sinekler, her gün en az bir kez maya macunu ile süslenmiş agar tabaklarında yumurta toplamadan birkaç gün önce yumurta toplama kafesinde eğitilirler.
3. Embriyo Evreleme
- Sinekler bir gecede yumurtlamak için izin (ya da en az 15 saat) RT de embriyoları toplamak için 15 h AEL, yani, evre 1618, aCC ve RP3 motor nöronların dendritogenezi görüntülemek için. Sabah, yumurta ile plaka toplamak.
NOT: 15 saat AEL'deki embriyolar 4 odacıklı ayrı bir bağırsak18olacaktır. Farklı aşamaları görüntüleme için kendi özel morfolojik kriterleri ve yaşlanma koşulları izleyin. - Embriyoları toplamak için, 5 dakika boyunca% 50 çamaşır suyu ile plaka üzerine yatırılan yumurta dekorionate.
- Korolar temizlendikten sonra, embriyoları izole etmek için plakanın içeriğini filtrasyon aparatı veya hücre süzgecinden geçirin. Bir sıkma şişesi su kullanarak, plaka üzerinde kalan çamaşır suyunu seyreltin ve karışımı filtreye ayırarak mümkün olduğunca çok embriyo toplayın.
- Embriyoları filtrede 3−4x daha fazla suyla veya çamaşır suyu kokusu dağılına kadar yıkayın. Filtreyi cihazdan çıkarın ve embriyoları suyla başka bir temiz tabağa yıkayın. Embriyoların üzerinde olduğu yeni plakadan suyu çıkar.
- Bir dikdörtgen oluşturan, merkezinde vinil bant iki kat ile kaplayarak bir cam slayt hazırlayın. Jilet kullanarak banttan dikdörtgen bir havuz kesin. Havuzun üst ucuna doğru ince bir çift taraflı bant şeridi yerleştirin, burada embriyolar Şekil 1'degösterildiği gibi yerleştirilecektir.
- İnce şıklar kullanarak, 15 saat AEL'de 5−10 embriyoyu tek tek seçin ve sırt tarafı yukarı bakacak şekilde çift taraflı bandA yerleştirin. Embriyoları kurutmalardan korumak için böcek Ringer'ın salin19'unu diseksiyon havuzuna ekleyin (Şekil 1).
4. Diseksiyon ve Boyama
- Bir diseksiyon mikroskobu(Malzeme Tablosu)altında cam bir iğne kullanarak, onun arka dan ön ucuna yüzeyinde tek bir embriyonun orta hattı ile kesti. Daha sonra embriyoyu vitellin membranından banttan cama sürükleyin (Şekil 1'dekutulanır). Embriyonun iç dokularına zarar vermemeye dikkat edin.
- Epitel dokuları merkezden çevirin ve epidermal kenarı cam kaydıraktan yüzeye takın(Şekil 1,inset).
- ~300 μm 'lik bir uç açıklığı olan tüpe bağlı bir iğne kullanmak (diseksiyonu iğnenin ince ucunu kırarak hazırlanır), dorsal uzunlamasına trakeal gövdeleri ve kalan bağırsakları ayırmak ve çıkarmak için havayı aspire etmek veya üflemek.
- Embriyoları 5 dakika lığına rt. Wash embriyoları PBS ile 3x yıkamak için fosfat tamponlu salin (PBS) % 4 paraformaldehit (PFA) kullanın.
- 1 saat boyunca 200 μL PBS'de siyanin 3 boya (anti-HRP Cy3)(Malzeme Tablosu)ile konjuge 1 μL anti-horseradish peroksidaz antikor ile embriyoları lekelayın.
NOT: Anti-HRP boya enjeksiyon için tercih lipophilic boyalar dayalı değiştirilebilir.
5. Enjeksiyon Mikro-pipet dolum
- Isı lipophilic boyalar (5 mg / mL DiO veya DiD, Malzeme Tablosu) için 60 °C etanol bir 1:10 karışımı: bitkisel yağ kullanmadan önce.
- Enjeksiyon mikropipeti için yağda çözünmüş bir boya kaydırağı hazırlayın. Mikropipeti kılcal tutucuya yerleştirin(Şekil 2, #1). Mikromanipülörü(Malzeme Tablosu)kullanarak, mikropipeti boya kaydırağının üzerinde olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, mikropipeti boyanın üzerine yerleştirmek için sahneyi ayarlayın(Şekil 2, #2).
- Mikropipeti doldurmak için bir mikroenjektör(Malzeme Tablosu)kullanın (Şekil 2, #3). Pi (enjeksiyon basıncı) 200−500 hPa (hektopascal), Ti (enjeksiyon süresi) 0,1−0,5 s ve Pc (kompanzasyon basıncı) ile 0 hPa arasında 5 dakika(Şekil 2, #4) arasında ayarlayarak boyayı mikropipette toplayın.
- Boya toplandıktan sonra boya kaydırağını çıkarın ve örneği mikroskop aşamasına yerleştirin. Daha sonra, pbs'nin kapiller etki ile kontaminasyonunu önlemek için mikropipeti numuneye indirmeden önce Pc'yi 20−60 hPa aralığına yükseltin.
6. Nöronlara Boya Enjeksiyonu
- 10x objektif lens(Malzeme Tablosu)ile mikroskop kullanarak merkezinde embriyo bulmak ve embriyo ile mikropipet hizalamak.
NOT: Boya damlacığının boyutu Pi veya mikropipet ucunun açılmasının boyutu değiştirilerek ayarlanabilir. Damlacık yaklaşık 1 kas genişliği 10−20 μm olmalıdır. - Objektif lensi bir su daldırma 40x lens(Malzeme Tablosu)ile değiştirin ve embriyoyu görmek için lensi PBS'ye batırın.
- Anti-HRP Cy3 ile işaretlenmiş nöronal morfolojiyi kontrol etmek ve enjeksiyon bölgesini belirlemek için floresan mikroskobu kullanın.
- Enjeksiyon sırasında, boya damlacık görmek için brightfield mikroskobu kullanın. Embriyo odakta olduğunda, ilgi akson ucu ile nazik temas yapmak için mikropipet konumunu değiştirmek (örneğin, aCC, RP3).
- Boyayı anti-HRP Cy3 ile işaretlenmiş nöronları kullanarak, ACC veya RP3 'ün nöromüsküler kavşağında(Şekil 3)DiD veya DiO ile sağ karına (A2−A6) hemi segmentine bırakın. El kontrolünü kullanma (fare; Şekil 2, 5) boyayı bırakın ve mikromanipülatörile boyayı bıraktıktan sonra mikropipeti çıkarın ve bir sonraki enjeksiyon bölgesine geçin.
NOT: Boşluk kavşakları aracılığıyla komşu hücrelere yayılan diğer boyaların (örneğin, Lucifer sarısı, kalsin) aksine, lipophilic boyalar hücre zarları ile ilişkilendirmek ve komşulara transfer olmaz. Boya damlacıknispeten büyük boyutu nedeniyle, ancak, bu teknik de ortak kasların etiketleme ile sonuçlanır (Şekil 3A).
- Görüntülemeden önce boya damlatmadan sonra numuneyi 1 saat boyunca RT'ye yatırın.
NOT: Protokol montajdan önce burada duraklatılabilir ve numune bir gecede 4 °C'de tutulabilir. Lipophilic boyalar da iyontoforez kullanılarak teslim edilebilir, bir hücre içi doğrudan birleştiğinde (DC) amplifikatör hazır ise20.
7. Konfokal Mikroskopile Görüntüleme
- Çift taraflı bandı ve vinil bandı çifenipler yardımıyla cam kaydıraktan çıkarın.
- Dört köşeye az miktarda vakum yağı(Malzeme Tablosu)ile bir kapak fişi (22 x 22 mm22 mm 2 No.1 kapak camı) hazırlayın ve hava kabarcıklarından kaçınarak numunenin üzerine dikkatlice yerleştirin. Görev sileceklerini kullanarak fazla PBS'yi kaldırın.
- Objektif lens ile numune arasındaki çalışma mesafesini ayarlamak için kapak fişini aşağı itin. Tamamen oje ile kapak kayma kenarları mühür.
- Bir konfokal mikroskop kullanarak 10x ve 100x büyütme görüntü.
- Mikroskoptan(Malzeme Tablosu)ham görüntüleri işlemek için ImageJ yazılımını kullanın.
NOT: Gözlem en iyi görüntüler için montaj dan sonra 10 dakika içinde başlamalıdır. Aksi takdirde, RT, boya görüntüleme için istenmeyen arka plan oluşturarak enjeksiyon sitesine bitişik sitelere yayılır. Boyanın difüzyonu yavaşlatmak için numune 4 °C'de birkaç saat saklanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ACC ve RP3 motor nöronların temsili bir görüntüsü Şekil 3C'de motor nöronların 15 saat AEL'de çok renkli etiketlemesini göstermek için gösterilmiştir. Dendritik morfolojileri embriyolar arasında büyük ölçüde değişmezdir. Anti-HRP antikorile elde edilen boyama deseni gri renkte gösterilmiştir. DiO veya DiD küçük bir damlacık kas NMJ yatırıldı 1 veya 6 /7, sırasıyla. Şekil 4, ilginin fenotipini nicel olarak ölçme yeteneğini göstermektedir. Biz vahşi bir tip dendrite ipuçları toplam sayısını saydı, bir mutant ile karşılaştırıldığında (örneğin, dscam1-/-).
Şekil 1: Diseksiyon havuzunun kurulumu. Cam kaydırakta görülen mavi oda, tamponları içeride tutan vinil bantla oluşturulur. Çift taraflı bant düzgün hizalanmış embriyolar üzerinde tutar. Ayrıca sol alt köşesinde gösterilen tuzlu bir parçalanmış embriyo bir örnektir. Ön uç bu ve sonraki tüm rakamlar üst te. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Boya enjeksiyon ekipmanları. Şekildecam pipet etiketleme, cam pipetin montaj alanını göstermektedir (1). Epi-floresan mikroskop bir LED ışık kaynağı ve filtre setleri bir dizi ile donatılmıştır. Mikromanipülatör (2) ve mikroenjeksiyon (3) cihazları mikroskobun sağına etiketlenir. Inset mikroenjeksiyon cihazının ekran yakın çekim (4) Piuygun değerleri ile , Ti, ve Pc). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Retrogradly etiketli motor nöronların lipophilic boya preparatları. (A) Retrograd etiketli motor nöronlar ve hedef kasları. ACC motor nöron innerve kas 1 (DiO: uyarma / emisyon, 484 nm/501 nm); RP3 motor nöron innerve kasları 6/7 (DiD: uyarma / emisyon, 644 nm/665 nm). Kaslar 6/7 da larva aşamalarında başka bir motor nöron (MNISNb / d-Is) innervasyon almak unutmayın; ancak, MNISNb/d-Is bir embriyonik meslektaşıyok 3. Daireler boyama uygulamalarının sitelerini gösterir. (B) Vücut duvarı kaslarının ve periferik sinir dallarının şematik diyagramı 15 saat AEL'de. Ventral sinir kordonu (VNC) ventral orta hat (noktalı çizgi) ile ilgili olarak segmentel olarak tekrarlanan ve bilateral simetrik nöromere oluşur. Her hemi segmentinin vücut duvarı kasları 38 motor nöron tarafından innerve edilir. Motor nöronlar altı ana sinir dalları ile aksonlar proje (ISN [intersegmental sinir], SNa [segmental sinir a], SNb, SNc, SNd, ve TN [enine sinir]). (C) aCC ve RP3 motor nöronlardan gelen dendritik dallar geniş çakışma gösterir. Her iki nöron bipolar nöronlar, nöronlar dendritler iki farklı popülasyon kurmak anlamına gelir. Her nöron bir arbor'u ipsilateral neuropil'e, diğerini de kontralateral nöropil'e dönüştürür. Ok uçları dendritik ipuçlarını işaret ediyor. Floresan görüntüleri 10x hedefi veya 100x yağ daldırma amacı ile elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: saat-15 embriyolarında retrograd etiketleme ile ortaya konan aCC dendritogenezi. (A) Yabani tipte, aCC dendritlerini hem ipsilateral hem de kontralateral nöropillere genişletir. Basitlik için, biz sadece bu şekilde aCC ipsilateral dendrites görüntülemek. aCC, yeşil renkle gösterilen DiO ile etiketlenir. (B) Dscam1 mutantlar(dscam121/21 Dr Tzumin Lee, Janelia Araştırma Kampüsü), aCC çoğu durumda gözlenen birkaç ipsilateral dendritler vardır17. Ok başları dendritik ipuçları gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nöronal morfolojiyi incelemek için boya etiketlemekullanımının genetik hücre etiketleme tekniklerine göre birçok avantajı vardır. Boya etiketleme tekniği, motor nöronların morfolojilerinin etiketlenmesi ve görüntülenmesi için gereken süreyi en aza indirebilir. Boya etiketleme işlemi 2 saatten az sürer ve nöronal projeksiyonların ana hatlarını tanımlamamızı sağladığından oldukça hızlıdır. Alternatif olarak, bir aCC maya GAL4 transkripsiyon faktörü ifade eden bir GAL4 hattı seçerek aCC motor nöron görselleştirmek ve yukarı aktivasyon dizisi (UAS)21tarafından kontrol yeşil floresan protein (GFP) muhabiri ile geçiş . GFP etiketleme tekniği gibi bir genetik haç gerektirir ve böylece, ekstra birkaç gün sürer.
Boya etiketlemenin bir diğer avantajı da plazma zarının son derece yüksek yoğunlukta etiketlemeye izin vermektir. Membranın her yerinde yeterli yoğunlukta lipophilic boyalar bulunabilir, bu da etiketli bir yapının ince ayrıntılarını çözmemizi sağlar. Buna karşılık, GFP moleküllerinin yoğunluğu genellikle UAS-GAL4 sistemi devreye girince bekleme süresine bağlıdır. Örneğin, aCC GFP'yi 10 saat AEL'den ifade etmeye başlar. Gözlemlediğimiz zaman 15 saat AEL ile GFP moleküllerinin yoğunluğu tüm membranı kapsayacak kadar yetersizdir. İnce nöronal projeksiyonların yetersiz etiketleştirilmesiyle sonuçlanır (D.K., yayınlanmamış veriler).
Bu teknik çeşitli avantajlar sağlasa da, motor aksonun hatalı projeksiyonu belirgin olduğunda daha az avantajlıdır. Sidestepyokluğunda , örneğin, motor nöronlar gibi erken durak, segmental sınır kapısı gibi ciddi aksonal defektleri görüntülemek, ve aşırı dallanma22. Sonuç olarak, belirli bir akson terminaline ulaşmak hantal hale gelir. Etiketlemenin etkinliği de yaşa bağlıdır ve 20 saat AEL'den küçük embriyolarda etkilidir. Hücre dışı matriks proteinleri gelişimle birlikte arttıkça, motor nöronların etiketlemesi çok karmaşık görüner.
Burada açıklanan teknik bize neurit toplam uzunluk ve sayı ve neurite dal desen ve şekil15,16,17,23,24gibi birçok morfolojik parametreleri ölçmek için izin verir. Lipophilic karbocyanine boyalar birçok renkte (DiO, DiA, DiI, DiD ve DiR gibi) geldiği için, komşu motor nöronların çok renkli etiketleme de ulaşılabilir. Şekil 4'tegösterildiği gibi, aCC ve RP3 motor nöronlarından gelen dendritler yoğun bir şekilde örtüşmektedir. Motor devresi gelişiminde anlayışımızı ilerletmek için dendrite-dendrite etkileşim mekanizmaları araştırılacaktır.
Burada, motor devresinde nöronal bağlantı çalışması için bir yol sağlayan çok yönlü tekniği ayrıntıları. Gösteri 15 h AEL aCC ve RP3 motor nöronlar ile sınırlı olmasına rağmen, Bu teknik embriyonik gelişimin farklı aşamalarında diğer motor nöronlar için uygulanabilir. Bir akson terminali enjeksiyon mikropipeti ile erişilebilir ise, bu teknik aynı zamanda sinekler ve hatta diğer organizmaların larva ve yetişkin aşamalarında herhangi bir nöron etiketleme için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz el yazması üzerinde yorum için Kamiyama Lab üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R01 NS107558 (M.I., K.B., ve D.K.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22x22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. Umemori, H., Hortsch, M. , Springer. New York. 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).
- Drosophila Ringer's solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
