Summary
Vi beskriver en metode til tilbagesporing af Drosophila embryonale motor neuroner ved hjælp af lipofile fluorescerende farvestoffer.
Abstract
Vi beskriver en teknik til tilbage mærkning af motoriske neuroner i Drosophila. Vi bruger en olie-opløst lipofile farvestof og levere en lille dråbe til en embryonal filet forberedelse af en mikroinjektor. Hver motor neuron, hvis membran er kontaktet af dråbe kan derefter hurtigt mærkes. Individuelle motoriske neuroner mærkes kontinuerligt, så fine strukturelle detaljer kan visualiseres tydeligt. I betragtning af, at lipofile farvestoffer kommer i forskellige farver, teknikken giver også et middel til at få tilstødende neuroner mærket i flerfarvet. Denne sporings teknik er derfor nyttig til at studere neuronal morfogenesis og synaptisk konnektivitet i motorens neuron system af Drosophila.
Introduction
Den embryonale motor neuron system af Drosophila tilbyder en kraftfuld eksperimentel model til at analysere de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af centralnervesystemet (CNS)1,2,3. Motoren neuron systemet er modtagelig for biokemiske, genetiske, billeddannelse, og elektrofysiologiske teknikker. Ved hjælp af teknikker, genetiske manipulationer og funktionelle analyser kan udføres på niveau med enkelt motor neuroner2,4,5,6.
Under den tidlige udvikling af nervesystemet, Neuro Blaster kløft og generere et stort antal af glia og neuroner. Det rumlige forhold mellem delaminering og Neuro Blaster-profilen for genekspression er tidligere blevet undersøgt i detaljer7,8,9. For så vidt angår motorens neuron system, er dannelsen af embryonale neuromuskulære Junction (nmj) blevet grundigt undersøgt ved hjælp af aCC (anterior Corner Cell), RP2 (rå rejer 2), og RP5 motor neuroner2,10. For eksempel, når RP5 motor neuron danner en spirende synaptisk Junction, den præ-synaptisk og post-synaptisk filopodia er sammenblandet11,12,13. En sådan direkte cellulær kommunikation er afgørende for at initiere NMJ dannelse. I modsætning til hvad vi ved om de perifere nerve grene, er vores viden om, hvordan motor dendritter initierer synaptisk konnektivitet inden for CNS, stadig primitiv.
I denne rapport præsenterer vi en teknik, der tillader tilbage mærkning af motoriske neuroner i embryoner ved hjælp af mikropipette medieret levering af lipofile farvestoffer. Denne teknik gør det muligt for os at spore de 38 motor neuroner endelser hver af de 30 kropsvæg muskler i en Hemi-segment på 15 h efter æglægning (AEL)14. Ved at bruge denne teknik, har vores gruppe grundigt undersøgt talrige gevinst-af-funktion/tab-of-funktion alleler15,16,17. Vi har for nylig trævlet de molekylære mekanismer, der driver initiering af motor dendrit tilslutningsmuligheder og viste, at en Dscam1-Dock-Pak interaktion definerer stedet for dendrit udvækst i aCC motor neuron17. I almindelighed, denne teknik er tilpasningsdygtig til fænotypiske analyse af enhver embryonale motoriske neuroner i vilde type eller mutant stammer, forbedre vores evne til at give ny indsigt i den funktionelle design af Drosophila nervesystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. udstyr og forsyninger
- Materialer til opsamling af embryoner og uddannelse af voksne til at lægge æg
- Forbered filtrerings apparatet ved at afskære et 50 mL rør og skæring Åbn et hul i hætten for at indstille et trådfilter med porer på 100 μm (tabel over materialer) mellem røret og hætten.
Bemærk: Alternativt kan celle filtrere med porer på 100 μm (tabel over materialer) anvendes til filtrerings trinnet for embryo opsamling. - Der fastgøres agarplader med drue agar premix (tabel over materialer) i henhold til de anførte anvisninger. Omrør forsigtigt 1 pakning af pulverblandingen til 500 mL rumtemperatur (RT, 23 °C) dH2O og mikrobølger den opløste blanding til kraftig kogningen. Efter afkøling ned til 70 − 75 °C hældes blandingen i Petri skåle (60 mm). Efter at agar er solidificeret, opbevares pladerne ved 4 °C.
- Forbered gær pasta ved at blande aktiv tør gær (tabel over materialer) og vand til en pasta konsistens, og holde ved 4 °c.
- Brug ægopsamlings bure (til 60 mm Petri skål, tabel over materialer), der giver tilstrækkelig luftstrøm.
- Forbered filtrerings apparatet ved at afskære et 50 mL rør og skæring Åbn et hul i hætten for at indstille et trådfilter med porer på 100 μm (tabel over materialer) mellem røret og hætten.
- Fremstilling af dissektions nåle og Mikropipetter til farve injektion
- Forbered en mikropipette og dissektions kanyle fra samme kapillar slange med en indvendig diameter på 0,6 mm og en udvendig diameter på 1,2 mm (tabel over materialer). Træk kapillar slangen af en mikropipette aftrækker ved 7% fra 170 V maksimal udgang (tabel over materialer) for at skabe en skarp nål med en taper på ~ 0,4 cm i længden.
- Ved farve injektion justeres mikropipetten med en mikropipette facet (tabel over materialer) ved hjælp af en boble affasnings teknik, der er beskrevet i instrumentets manual.
- Kort sagt, sug kværnen med en befugtning middel (tabel over materialer) for at forhindre, at vandet fra ' trække ' nålen spidsen. Placer nålen på mikropipette klemmen ved 25 − 30 °, og sænk spidsen på to tredjedele af radius ud fra midten af den skrå flade. Grind nålen, mens en sprøjte med slanger skubber luft ind i nålen, for at sikre, at mikropipetten vil være fri for glas spåner.
- Marker mikropipetten med en fast markør med fin spids for at indikere positionen af åbningen ved spidsen efter affasning, da det er udfordrende at finde den smalle åbning af mikropipetten, der dannes i en vinkel.
2. forberedelse til embryo opsamling
- Sørg for, at voksne fluer (20 − 40 vildtype Canton-S eller hvide fluer), hanner og hunner, holdes i unge (< 7 dage) og sunde betingelser for den ideelle ægkollektion.
Bemærk: for at stimulere æglægning, er fluer uddannet i deres æg samling bur et par dage før ægsamlingen på agar plader stribede med gær pasta mindst en gang hver dag.
3. embryonal iscenesættelse
- Lad fluerne til at lægge æg natten (eller mindst 15 h) på RT at indsamle embryoner på 15 h AEL, dvs stadie 1618, at se dendritogenesis af ACC og RP3 motor neuroner. Om morgenen opsamles pladen med æggene.
Bemærk: embryonerne på 15 h AEL vil have en særskilt 4-kammer Gut18. Til billeddannelse forskellige stadier følge deres specifikke morfologiske kriterier og aldring betingelser. - For at indsamle embryonerne, dechorionere æggene lagt på pladen med 50% blegemiddel i 5 min.
- Når chorionerne er ryddet, hældes indholdet af pladen gennem filtrerings apparatet eller celle sien for at isolere embryonerne. Brug en klemme flaske vand til at fortynde den blege, der er tilbage på pladen, og Saml så mange embryoner som muligt ved at dekarte blandingen ind i filteret.
- Embryonerne vaskes på filteret 3 − 4X med mere vand, eller indtil blege lugt spredes. Fjern filteret fra apparatet og vask embryonerne på en anden ren plade med vand. Decant vandet fra den nye plade, at embryonerne er på.
- Forbered et glas slide ved at dække det med to lag vinyl tape i midten, der danner et rektangel. Skær en rektangulær pulje ud af båndet ved hjælp af et barberblad. Placer en tynd strimmel dobbeltsidet tape mod den øvre ende af puljen, det er her, embryonerne vil blive placeret som vist i figur 1.
- Ved hjælp af fine pincetter vælger du individuelt 5 − 10 embryoner ved 15-h AEL og placerer dem på den dobbeltsidet tape med Rygsiden opad. Tilsæt insekt Ringer's Saline19 til dissektions puljen for at beskytte embryonerne mod udtørring (figur 1).
4. dissektion og farvning
- Ved hjælp af en glasnål under et dissekere mikroskop (tabel over materialer) skæres gennem midterlinjen af et enkelt embryon på dets overflade fra dets posteriort til dets forreste ende. Træk derefter embryonet ud fra vitellinmembranen fra båndet til glasset (boxed i figur 1). Pas på ikke at beskadige det indvendige væv i embryonet.
- Vend epitel vævet fra midten og fastgør epidermal kant på overfladen af glas diaset (figur 1, Indsæt).
- Ved hjælp af en slange tilsluttet nål med en spids åbning på ~ 300 μm (fremstillet ved at bryde den tynde spids af en dissektion nål), aspirere eller blæse luft til at løsne og fjerne de dorsale langsgående trakeal kufferter såvel som eventuelle resterende tarme.
- Brug 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfat-bufferet saltvand (PBS) til at fastgøre embryonerne i 5 min ved RT. vask embryonerne 3x med PBS.
- Plette embryonerne med 1 μL anti-peberrod-peroxidase-antistof konjugeret med cyanine 3-farvestof (anti-HRP Cy3) (tabel over materialer) i 200 μl PBS i 1 time. vask EMBRYONERNE med PBS 3x efter farvning.
Bemærk: farvestoffet af anti-HRP kan ændres baseret på lipofile farvestoffer af valg til injektion.
5. påfyldning af injektions Mikropipetten
- Varme lipophiske farvestoffer (5 mg/mL DiO eller DiD, tabel over materialer) til 60 °c i en 1:10 blanding af ethanol: vegetabilsk olie før brug.
- Forbered et olie opløst farve glas til injektions mikropipetten. Mikropipetten placeres i kapillar holderen (figur 2, #1). Ved hjælp af micromanipulator (tabel over materialer) justeres mikropipetten til at være over farvestoffet slide. Juster derefter scenen for at placere mikropipetten på farvestoffet (figur 2, #2).
- For at fylde mikropipetten skal du bruge en mikroinjektor (tabel over materialer) (figur 2, #3). Farvestoffet opsamles i mikropipetten ved at indstille Pi (indsprøjtningstrykket) mellem 200 − 500 hPa (hectopascal), Ti (injektionstid) mellem 0,1 − 0,5 s og pc (kompensations tryk) til 0 hPa i 5 min (figur 2, #4).
- Når farvestoffet er blevet indsamlet, skal du fjerne farvestoffet og placere prøven på mikroskopet. Dernæst øges Pc til en række 20 − 60 hPa, før mikropipetten sænkes ind i prøven for at forhindre kontaminering af PBS med kapillarvirkning.
6. farvestof injektion i neuroner
- Find embryonet i midten ved hjælp af mikroskopet med 10x objektiv linse (tabel over materialer) og Juster mikropipetten med fosteret.
Bemærk: størrelsen af farvestoffet dråbe kan justeres ved at ændre Pi eller størrelsen af åbningen af mikropipette spidsen. Dråbe skal være 10 − 20 μm, som er omtrent bredden af 1 muskel. - Skift objektivlinsen til en vand nedsænkning 40x linse (tabel over materialer) og Nedsænk OBJEKTIVET i PBS for at se fosteret.
- Brug Fluorescens mikroskopi til at kontrollere neuronal morfologi markeret med anti-HRP Cy3 og bestemme injektionsstedet.
- Under injektion, brug lysfelt mikroskopi for at se farvestoffet dråbe. Når embryonet er i fokus, skal du ændre mikropipettens position for at gøre den blide kontakt med spidsen af Axon af interesse (f. eks. aCC, RP3).
- Drop farvestoffet i en højre abdominal (a2 − A6) Hemi-segment på den neuromuskulære krydset af aCC eller RP3 (figur 3) med enten DiD eller DiO, ved hjælp af neuroner mærket af anti-HRP Cy3. Brug af hånd kontrol (mus; Figur 2, 5) frigør farvestoffet og fjern mikropipetten efter at have droslet farvestoffet med micromanipulatoren og gå videre til næste injektionssted.
Bemærk: i modsætning til andre farvestoffer (f. eks Lucifer gul, calcein), der spredes i tilstødende celler gennem Gap kryds, lipofile farvestoffer associere med cellemembraner og ikke overføre til naboer. På grund af den relativt store størrelse af farvestoffet dråbe, dog denne teknik resulterer også i mærkning af partnerskab muskler (figur 3A).
- Prøven inkubates ved RT i 1 time efter Dye-drop før billeddannelse.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her før montering, og prøven kan opbevares ved 4 °C natten over. Lipofile farvestoffer kan også leveres ved hjælp af iontophoresis, hvis en intracellulær direkte koblet (DC) forstærker er let tilgængelig20.
7. billeddannelse med et Konfokal mikroskop
- Fjern den dobbeltsidet tape og vinyl tape fra glas diaset ved hjælp af pincet.
- Forbered en følgeseddel (22 x 22 mm2 No. 1 Cover glas) med en lille mængde vakuum fedt (tabel over materialer) på de fire hjørner og forsigtigt sted på prøven, undgå luftbobler. Fjern eventuelle overskydende PBS ved hjælp af opgave VISKERE.
- Skub dæksedlen ned for at justere arbejdsafstanden mellem objektivlinsen og prøven. Helt forsegle kanterne af dækslet slip med neglelak.
- Billede ved 10x og 100x forstørrelse ved hjælp af et Konfokal mikroskop.
- Brug ImageJ software til behandling af RAW-billeder fra mikroskopet (tabel over materialer).
Bemærk: observation skal begynde inden for 10 minutter efter montering for de bedste billeder. Ellers, på RT, vil farvestoffet spredes til websteder støder op til injektionsstedet skabe uønsket baggrund for Imaging. For at bremse spredningen af farvestof, kan prøven opbevares ved 4 °C i et par timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et repræsentativt billede af aCC og RP3 motor neuroner er vist i figur 3C at demonstrere flerfarvet mærkning af motor NEURONER på 15 h AEL. Deres dendritiske morfologier er stort set invariant mellem embryoner. Det farvnings mønster, der opnås med anti-HRP-antistoffer, vises med gråt. En lille dråbe af DiO eller gjorde blev deponeret på NMJ af muskel 1 eller 6/7, hhv. Figur 4 viser evnen til kvantitativt at måle fænotype af interesse. Vi har talt det totale antal af dendrit spidser i en vildtype sammenlignet med en mutant (f. eks. dscam1-/-).
Figur 1: Opsætning af dissektions puljen. Det blå kammer set på glas sliden er skabt med vinyl tape, der holder bufferne indeni. Den dobbeltsidet tape holder på de embryoner, der er korrekt justeret. Også vist i nederste venstre hjørne er et eksempel på en dissekeret embryo i saltvand. Den forreste ende er på toppen i denne og alle efterfølgende tal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: farvestof Indsprøjtnings udstyr. Glas pipette mærkning i figuren viser installationsstedet for glas pipetten (1). EPI-fluorescerende mikroskop er udstyret med en LED-lyskilde og en række filtersæt. Micromanipulatoren (2) og mikroindsprøjtnings enhederne (3) er mærket til højre for mikroskopet. Justerings er et nærbillede af visningen af mikroinjektionanordning (4) med passende værdier af pi, Tiog pc). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: lipofile farve præparater af retrogradely mærkede motoriske neuroner. (A) retrograde-mærket motor neuroner og deres målmuskler. ACC motor neuron endelser muskel 1 (DiO: excitation/emission, 484 nm/501 nm); den RP3 motor neuron endelser muskler 6/7 (gjorde: excitation/emission, 644 nm/665 nm). Bemærk, at musklerne 6/7 også får innervation fra en anden motor neuron (MNISNb/d-is) i larvestadier; MNISNb/d-is har dog ikke en embryonal modpart3. Cirkler indikerer steder af farvestof applikationer. (B) et skematisk diagram overkrop Pens vægmuskler og perifere nerve grene i 15 h AEL. Den ventrale nerveledning (VNC) består af segmentalt gentaget og bilateralt symmetrisk neuromere med hensyn til ventrale midterlinjen (stiplede linje). Body Wall muskler i hver Hemi-segment er innerveret af 38 motor neuroner. Motoren neuroner projekt deres axoner via seks store nerve grene (isn [intersegmental nerve], SNa [segmental nerve a], SNB, SNc, SND, og TN [tværgående nerve]). C) dendritiske grene fra aCC-og RP3-motor neuronerne udviser omfattende overlapning. Begge neuroner er bipolar neuroner, hvilket betyder, at neuronerne etablerer to forskellige populationer af dendritter. Hver neuron projekter en Arbor i ipsilaterale neuropil og en anden i den kontralaterale neuropil. Pilespidser peger på dendritiske spidser. Fluorescensbilleder blev erhvervet med en 10x mål eller en 100x olie nedsænkning mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: aCC dendritogenesis som afsløret med tilbage mærkning i time-15 embryoner. A) i vildtype udvider aCC sine dendritter til både ipsilaterale og kontralateral neuropils. For nemheds skyld viser vi kun ipsilaterale dendritter fra aCC i dette tal. aCC er mærket med DiO, vist med grønt. (B) i dscam1 mutanter (Dscam121/21 fra Dr. Tzumin Lee, janelia Research campus) har aCC kun få ipsilaterale dendritter i de fleste tilfælde observeret17. Arrowheads viser dendritiske spidser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af farvemærkning for at studere neuronal morfologi har flere fordele i forhold til genetiske celle-mærkning teknikker. Den farvemærkning teknik kan minimere mængden af tid, der er nødvendige for mærkning og billeddannelse morfologier af motor neuroner. Den farvemærkning proces er ganske hurtigt, da det tager mindre end 2 h og gør det muligt for os at definere skitse af neuronal projektioner. Som et alternativ, kan man visualisere aCC motor neuron ved at vælge en GAL4 linje, der udtrykker gæren GAL4 transkriptionen faktor i aCC, og krydser det med en grøn fluorescerende protein (g) reporter styres af upstream aktiverings sekvens (UAS)21. En GFP mærknings teknik som sådan kræver et genetisk Kors og dermed tager ekstra par dage.
En anden fordel ved farvestof mærkning er at tillade mærkning af plasma membranen på en ekstremt høj tæthed. En tilstrækkelig tæthed af lipofile farvestoffer kan være til stede på hver del af membranen, hvilket giver os mulighed for at løse de fine detaljer i en mærket struktur. I modsætning hertil er tætheden af GFP-molekyler ofte afhængig af ventetiden, efter at UAS-GAL4 systemet sparker ind. For eksempel, aCC begynder at udtrykke GFP fra 10 h AEL. Med 15 h AEL, når vi observerer, er tætheden af GFP-molekyler utilstrækkelig til at dække hele membranen. Det resulterer i utilstrækkelig mærkning af fine neuronal projektioner (D.K., ikke-offentliggjorte data).
Selv om denne teknik giver flere fordele, er det mindre fordelagtigt, når den fejlagtige projektion af motor axoner er indlysende. I mangel af undvige, for eksempel, motor neuroner vise alvorlige axonal defekter som for tidlig stall, segmental grænsepassage, og overdreven forgrening22. Som følge heraf bliver det besværligt at nå frem til en bestemt Axon-terminal. Effektiviteten af mærkning er også aldersafhængig, at være effektiv i embryoner yngre end 20 h AEL. Som de ekstracellulære matrix proteiner stige med udvikling, mærkning af motoriske neuroner synes at være meget indviklet.
Teknikken beskrevet her giver os mulighed for at måle mange morfologiske parametre som neurite Total længde og antal, og neurite gren mønster og form15,16,17,23,24. Fordi lipofile carbocyanine farvestoffer kommer i mange farver (såsom DiO, DiA, DiI, DiD, og DiR), Flerfarvet mærkning af tilstødende motoriske neuroner er også opnåeligt. Som vist i figur 4overlapper dendritter fra aCC-og RP3-motor neuronerne i udstrakt grad. For at fremme vores forståelse inden for udvikling af motorkredsløb vil mekanismerne i dendrit-dendrit-interaktion blive undersøgt.
Her, vi detaljer den alsidige teknik, der giver en mulighed for at studere neuronal konnektivitet i motor kredsløbet. Selv om demonstrationen er begrænset til aCC og RP3 motoriske neuroner i 15 h AEL, kan denne teknik anvendes på andre motoriske neuroner i forskellige stadier af fosterudviklingen. Hvis en Axon Terminal er tilgængelig med en injektion mikropipette, denne teknik kan også anvendes til mærkning af enhver neuron i larve og voksne stadier af fluer eller endda i andre organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer af Kamiyama Lab for kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en NIH R01 NS107558 (til M.I., K.B. og D.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22x22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. Umemori, H., Hortsch, M. , Springer. New York. 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).
- Drosophila Ringer's solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
