Summary
Et bioinspireret stillads fremstilles af en blød fotolithografiteknik ved hjælp af mekanisk robuste og elektrisk ledende hydrogeler. De mikromønstrede hydrogeler giver retningsbestemt kardiomyocyt celle tilpasning, hvilket resulterer i en skræddersyet retning af aktivering. Fleksible mikroelektroder er også integreret i stilladset for at bringe elektrisk kontrol for et selvaktiverende hjertevæv.
Abstract
Bioinspired soft robot systemer, der efterligner levende organismer ved hjælp af manipuleret muskelvæv og biomaterialer revolutionerer den nuværende biorobotics paradigme, især i biomedicinsk forskning. Genskabelse af kunstig livslignende aktiveringsdynamik er afgørende for et soft-robotsystem. Men den præcise kontrol og tuning af aktivering adfærd stadig udgør en af de største udfordringer i moderne bløde robotsystemer. Denne metode beskriver en billig, meget skalerbar og brugervenlig procedure til fremstilling af en elektrisk kontrollerbar blød robot med livagtige bevægelser, der aktiveres og styres af sammentrækning af hjertemuskelvæv på en mikromønstret brod ray-lignende hydrogel stillads. Brugen af bløde fotolithografimetoder gør det muligt at integrere flere komponenter i det bløde robotsystem, herunder mikromønstrede hydrogelbaserede stilladser med carbon nanorør (CNT'er) indlejret gelatine methacryloyl (CNT-GelMA), poly (ethylenglycol) diacrylat (PEGDA), fleksible guld (Au) mikroelektroder og hjertemuskelvæv. Især hydrogels tilpasning og mikromønster er designet til at efterligne muskel og brusk struktur af brod ray. Den elektrisk ledende CNT-GelMA hydrogel fungerer som en celle stillads, der forbedrer modning og sammentrækning adfærd kardiomyocytter, mens den mekanisk robuste PEGDA hydrogel giver strukturel brusk-lignende støtte til hele bløde robot. For at overvinde den hårde og sprøde karakter af metal-baserede mikroelektroder, vi designet en serpentin mønster, der har høj fleksibilitet og kan undgå at hæmme slå dynamik cardiomyocytter. De indbyggede fleksible Au-mikroelektroder giver elektrisk stimulation på tværs af den bløde robot, hvilket gør det lettere at styre vævs sammentrækningsadfærd.
Introduction
Moderne state-of-the-art bløde robotter kan efterligne de hierarkiske strukturer og muskel dynamik af mange levende organismer, såsom vandmænd1,2,brod stråle2,blæksprutte3,bakterier4,ogsæd5. Efterligner dynamikken og arkitekturen i naturlige systemer tilbyder højere præstationer i form af både energisk og strukturel effektivitet6. Dette er uløseligt forbundet med den bløde karakter af naturligt væv (f.eks hud eller muskelvæv med en Young's modulus mellem 104−109 Pa), som giver mulighed for højere grader af frihed og overlegen deformation og tilpasningsevne sammenlignet med standard manipuleret aktuatorer (f.eks en Young's modulus normalt mellem 109−1012 Pa)6. Hjertemusklen-baserede soft-aktuatorer, især, viser overlegen energieffektivitet på grund af deres selvaktiverende samt deres potentiale for autorepair og regenerering i forhold til en mekanisk baseret robot system7. Men fremstillingaf bløde robotter er udfordrende på grund af nødvendigheden af at integrere forskellige komponenter med forskellige fysiske, biologiske og mekaniske egenskaber i det ene system. For eksempel skal manipulerede syntetiske systemer integreres med levende biologiske systemer, ikke kun at give dem strukturel støtte, men også påvirke og modulere deres aktivering adfærd. Desuden kræver mange mikrofabrikationsmetoder barske/cytotoksiske processer og kemikalier, der mindsker levedygtigheden og funktionen af alle levende komponenter. Derfor er nye tilgange nødvendige for at forbedre funktionaliteten af de bløde robotter og for at kontrollere og modulere deres adfærd.
For at kunne integrere levende komponenter med god levedygtighed er et hydrogelbaseret stillads et fremragende materiale til at skabe kroppen af en blød robot. En hydrogel fysiske og mekaniske egenskaber kan nemt indstilles til at skabe mikromiljøer til levende komponenter såsom muskelvæv8,9. Også, det kan nemt vedtage forskellige mikrofabrikation teknikker, hvilket resulterer i oprettelsen af hierarkiske strukturer med high fidelity1,2,10. Fleksible elektroniske enheder kan indarbejdes i den bløde robot for at styre dens adfærd med elektrisk stimulation. For eksempel, optogenetiske teknikker til ingeniør elektrogene celler (f.eks kardiomyocytter), som viser en lys-afhængig elektrofysiologisk aktivering, er blevet brugt til at udvikle en polydimethylsiloxan (PDMS)-baserede blød robot stik stråle styret af lys, der var i stand til at genskabe den undulatory bevægelse af fisk in vitro2. Selv om optogenetiske teknikker har vist fremragende kontrollerbarhed, det præsenterede arbejde bruger elektrisk stimulation, en konventionel og traditionel simulering metode. Dette skyldes, at elektrisk stimulation via fleksible mikroelektroder er nem og enkel i forhold til optogenetiske teknikker, som kræver omfattende udviklingsprocesser11. Brugen af fleksible elektroniske anordninger kan give mulighed for langsigtet stimulering og standard/enkel fabrikationsprocesser samt afstemmelige biokompatibilitet og fysiske og mekaniske egenskaber12,13.
Her præsenterer vi en innovativ metode til at fabrikere en bioinspireret blød robot, aktiveret ved at slå manipuleret hjertemuskelvæv og kontrolleres af elektrisk stimulation gennem indlejrede fleksible Au-mikroelektroder. Den bløde robot er designet til at efterligne muskel- og bruskstrukturen i brodstrålen. Brodden ray er en organisme med en relativt let at efterligne struktur og bevægelse i forhold til andre svømning arter. Musklerne er genskabt in vitro ved såning kardiomyocytter på en elektrisk ledende hydrogel mikromønster. Som tidligere rapporteret, indarbejde elektrisk ledende nanopartikler såsom CNT i GelMA hydrogel ikke kun forbedrer den elektriske kobling af hjertevæv, men også inducerer en fremragende in vitro væv arkitektur og arrangement8,9. Bruskleddene efterlignes derefter ved hjælp af et mekanisk robust PEGDA hydrogelmønster, der fungerer som det mekanisk robuste underlag i hele systemet. Fleksible Au-mikroelektroder med serpentinmønster er indlejret i PEGDA-mønsteret for lokalt og elektrisk at stimulere hjertevævet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen om pleje og anvendelse af laboratoriedyr fra De Nationale Sundhedsinstitutter. Protokollen blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepleje og -anvendelse (IACUC) på Brigham and Women's Hospital.
1. GelMA syntese
- 10 g gelatine opløses i 100 ml dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) ved hjælp af en magnetisk omrører ved 50 °C.
- Tilsæt 8 ml methakrylanhydrid langsomt under omrøring af gelatineprepolymeropløsningen ved 50 °C i 2 timer. Fortyndes den reagerede gelatineopløsning med forvarmet DPBS ved 50 °C.
- Overfør den fortyndede opløsning til dialysemembraner (molekylvægtcut = 12-14 kDa) og læg dem i deioniseret (DI) vand. Dialyse ved 40 °C i ca. 1 uge.
- Den dialyzerede GelMA prepolymeropløsning filtreres med et sterilt filter (porestørrelse = 0,22 μm) og overføres 25 eller 30 ml af opløsningen til 50 ml rør og opbevares ved -80 °C i 2 dage.
- Fryseden tørres af den frosne GelMA prepolymeropløsning ved hjælp af en frysetørrer i 5 dage.
2. Forberedelse af poly (ethylenglycol) diacrylat (PEGDA) prepolymer opløsning
- 200 mg (20 % af den samlede opløsning) af PEGDA (MW = 1.000) opløses med 5 mg (0,5 % af den samlede opløsning) på 2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (fotoinitiator, PI) i 1 ml DPBS.
- Præpolymeropløsningen ved 80 °C i 5 min.
3. Forberedelse af gelmabelagt CNT-dispergeret lageropløsning
- 80 mg GelMA (anvendes som biosurfactant) opløses i 4 ml DPBS, og der tilsættes derefter 20 mg COOH-funktionaliserede flervæggede kulstofnanorør (MWCNT'er) i GelMA prepolymer-opløsningen.
- Sonikere MWCNT-lastet GelMA prepolymer løsning til 1 h (0,66 Hz, 100 Watt).
BEMÆRK: Under sonikeringsprocessen skal opløsningen nedsænkes i et vandbad ved ~ 15 °C for at forhindre fordampning af opløsningsmiddel på grund af temperaturstigningen.
4. Præparat af 1 mg/ml CNT indeholdende 5% GelMA prepolymer opløsning
- 50 mg GelMA opløses og 5 mg (0,5 % af den samlede opløsning) pi i 0,8 ml DPBS ved 80 °C i 10 min.
- Der tilsættes 0,2 ml af den forberedte CNT-lagerløsning (trin 3). Vortex og inkuberopløsningen ved 80 °C i 10 min.
5. Forberedelse af en 3-(trimethoxysilyl)propyl methacryl (TMSPMA) belagt glas dias
- Glasskredne vaskes (tykkelse = 1 mm, størrelse = 5,08 cm x 7,62 cm) med ren ethanol.
- Stak de rensede dias lodret i et 250 ml bl bægerglas og spred 3 ml TMSPMA oven på dem ved hjælp af en sprøjte. Dæk bægeret med aluminiumsfolie for at forhindre fordampning af TMSPMA.
- Kuer gliderne i en 80 °C ovn i 1 dag.
- Vask de belagte glasglas ved at dyppe dem i ren ethanol, derefter tør.
- Opbevar de belagte glasdias pakket ind i aluminiumsfolie ved stuetemperatur (RT).
BEMÆRK: Prøv at minimere berøring af overfladerne på de TMSPMA-belagte glasdias.
6. Fremstilling af de fleksible Au-mikroelektroder
- Design en skyggemaske ved hjælp af computerstøttet design (Supplerende fil 3).
- Fabriker og køb en skyggemaske.
- Glassliden vaskes (tykkelse = 1 mm, størrelse = 3 cm x 4 cm) med acetone og tør med en trykluftpistol.
- Fastgør skyggemasken til glasunderlagene ved hjælp af dobbeltklæbende tape, og læg dem derefter i en E-beam fordamper og vent, indtil kammerettrykket når mindst 10-6 Torr.
BEMÆRK: De to stykker tape blev placeret manuelt på støtten i en afstand kort nok til at være vært for glasset og stor nok til at passe hele mønsteret. Dette trin tager omkring 45-60 min. - Deponering en 200 nm tyk Au lag af E-beam fordamper (f.eks med Denton EE-4, vakuum = 10-6 Torr, magt = 2,6%, sats = 2 Å / s) og skære de fabrikerede mikroelektroder ved hjælp af en terning savmaskine (elektroder størrelse = 7,38 mm x 8,9 mm x 200 nm).
7. Fabrikation af et Au mikroelektrodeintegreret mikromønstret flerlaget hydrogelstillads
BEMÆRK: Resultatet af denne procedure er en membran, hvor en mikromønstret PEGDA hydrogel er i det nederste lag, en mikromønstret CNT-GelMA hydrogel er på toppen, og Au mikroelektroderne er mellem de to lag. Denne konfiguration sikrer en bedre fleksibilitet til elektroden og begrænser risikoen for at bryde.
- Design og fabriker to fotomasker for at skabe den mikromønstrede PEGDA (1st fotomaske) og CNT-GelMA hydrogel (2nd fotomaske) lag. Se supplerende fil 2-3. Designet kan gøres ved hjælp af CAD-software.
BEMÆRK: Se figur 2B, E. - Placer 50 μm afstandsstykker lavet ved stabling et lag af kommercielle usynlige tape (Tykkelse: 50 μm) på en TMSPMA belagt glas. Hæld 15 μL 20% PEGDA prepolymer opløsning oven på TMSPMA belagt glas, derefter dække med guld mikroelektrode. Fotomasken for glassliden (micropatterned PEGDA) placeres oven på guldmikroelektroden, og dæk hele konstruktionen til UV-lys (200 W kviksølvdampkort lysbuelampe med 320-390 nm filter) ved 800 mW intensitet og 8 cm afstand til 110 s.
BEMÆRK: Se figur 1A. - Tilføj DPBS at omgive glasdiaset og afmontere den mikromønstrede PEGDA hydrogel sammen med Au-mikroelektroderne fra det ubestrøget glassubstrat omhyggeligt efter 5-10 minutter for at opnå glasrutsjebanen, der har den mikromønstrede PEGDA hydrogel med Au mikroelektroder.
BEMÆRK: Se figur 1B. På grund af TMSPMA-belægningen overføres konstruktionen fra det ubestrøget glassubstrat til tmspmabelagt. Afbryd forsigtigt, fordi Au-mikroelektroderne let kan bryde i løbet af dette trin (figur 3). - Placer 100 μm afstandssten lavet ved at stable to lag af kommerciel gennemsigtig tape (tykkelse = 50 μm) på bunden af en petriskål. Der deponeres en dråbe på 20 μL CNT-GelMA prepolymer opløsning mellem afstandsstykkerne og vend derefter glassliden opnået i 7,3, og fastgør den på skålen med tape.
- Drej enheden på hovedet, og placer den andenfotomaske oven på glassliden. Udsæt under UV-lys ved 800 mW intensitet og 8 cm afstand i 200 s.
BEMÆRK: Se figur 1C. Justering af anden maske er vigtig. - Vask det opnåede stillads med DPBS og med cellekulturmedium, der omfatter 10% føtal kvægserum (FBS).
- Lad dem ligge natten over i 37 °C-inkubatoren, før cellerne sås.
8. Neonatal rotte kardiomyocytter isolation og kultur
- Isoler hjerter fra 2-dages gamle Sprague-Dawley rotter efter protokoller godkendt af Instituttets Komité for Dyrepleje8.
- Sæt hjertet stykker på shaker natten over (omkring 16 h) i 0,05% trypsin uden EDTA i HBSS i et koldt rum.
- Saml hjertestykkerne med en pipettepistol, og minimer mængden af trypsin, og læg dem derefter i et 50 ml rør med 10 ml varme hjertemedier (10% FBS, 1% P/S, 1% L-glutamin).
- Swirl langsomt (~ 60 rpm) i en 37 °C vandbad i 7 min. Fjern mediet forsigtigt fra røret med en 10 ml pipette og lad hjertet stykker i røret.
- Der tilsættes 7 ml 0,1% kollagentype 2 i HBSS og hvirvles i et 37 °C vandbad i 10 min.
- Bland med en 10 ml pipette 10x forsigtigt at forstyrre hjertet stykker. Fjern mediet fra røret med en 1 ml pipette.
- Tilføj 10 ml 0,1% kollagen nase type 2 i HBSS og hvirvle hurtigt (~ 120-180 rpm) i en 37 °C vandbad i 10 min, derefter kontrollere, om hjertet stykker er opløsning.
- Bland med en 10 ml pipette, derefter gentage med en 1 ml pipette til at bryde de sidste hjertestykker.
- Når opløsningen ser homogen ud, skal du placere en 70 μm cellesi på et nyt 50 ml rør og pipette opløsningen 1 ml ad gangen på si.
- Hjertecelleopløsningen centrifugeres ved 180 x g i 5 min ved 37 °C.
BEMÆRK: Hvis der stadig er nogle hjertestykker eller slim, som ikke blev opløst, skal du gentage trin 8.7-8.9 igen. - Fjern forsigtigt al væsken over cellepellet og ophængt cellerne i 2 ml hjertemedier.
- Tilføj 2 ml hjertemedier fra rørvæggen omhyggeligt for at ophænge cellerne igen og undgå at bryde dem.
- Tilsæt de ophængte celler i en T175 kolbe med varm hjertemedia dråbe for dråbe. Kolben anbringes i en 37 °C-inkubator i 1 time for at tillade hjertefibroblaster at binde sig til bunden.
BEMÆRK: På dette foretag vil hjertefibroblasterne fastgøres til kolben, mens kardiomyocytter forbliver i suspensionsmediet. - Indsamle medierne fra kolben, der indeholder kardiomyocytter og sætte det i en 50 ml rør.
- Tæl cellerne, centrifugeres derefter ved 260 x g i 5 min ved 37 °C.
- Resuspendering og frø cellerne på toppen af den fabrikerede bløde robot i trin 7. Hæld specifik volumen af hjertemedier med kardiomyocytter i en koncentration på 1,95 × 106 cell/ml dråbe ved dråbe på hele enhedens overflade.
- Inkuber prøverne ved 37 °C, og mediet ændres med 5 ml cellekulturmedier med 2% FBS og 1% L-glutamin på den første og anden dag efter såning. Skift mediet, hver gang mediets farve skifter.
9. Cellefarvning til justeringsanalyse
- Fjern mediet og vask med DPBS i 5 min. på RT.
- Fastgør cellerne ved hjælp af 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min på RT. Vask derefter med DPBS i 5 minutter på RT.
- Inkuber cellerne med 0,1% triton i DPBS på RT i 1 time. Vask 3x med PBS i 5 min på RT.
- Inkuber cellerne med 10% gedeserum i DPBS ved RT i 1 time.
- Inkubercellerne med et primært antistof (sarkomeric α-actinin og connexin-43) i 10% gedeserum i DPBS ved 4 °C for ~14-16 h.
- Vask 3x med DPBS i 5 min ved RT. Inkuber cellerne med det sekundære antistof i 10% gedeserum i DPBS ved RT i 1 time.
- Vask 3x med DPBS i 5 min på RT, derefter counterstain celler med 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i DI vand (1:1,000) i 10 min på RT. Vask 3x med DPBS i 5 min på RT.
- Tag fluorescens billeder ved hjælp af en omvendt laser scanning konfokale mikroskop.
10. Aktuator test og adfærd evaluering
- Spontan tæsk af kardiomyocytter på den bløde robot
- Inkuberbioinspirerede aktuatorer ved 37 °C i 5 dage, og opdater mediet på dag 1 og 2, og når det er nødvendigt (dvs. når mediet bliver gult). Brug et omvendt optisk mikroskop til at tage billeder dagligt (5x og/eller 10x). Optag cellebevægelser ved hjælp af videooptagelsessoftware på mikroskopets livevindue i 30 s ved 20 billeder i sekundet (5x og/eller 10x), når kontraktionsaktiviteten starter (normalt omkring dag 3).
- På dag 5 løsnes membranerne ved forsigtigt at løfte fra kanten med et dæksel.
BEMÆRK: Hvis cellerne viser en stærk slå adfærd, membraner vil løsne af sig selv på grund af den mekaniske virkning af sammentrækninger.
- Masse elektrisk signal stimulation
- Brug en 3 cm afstand PDMS som holder, anbringe to carbon rod elektroder med platin (Pt) wire i en 6 cm Petri skål fyldt med hjertemedier. Overfør derefter forsigtigt den bløde robot ind i petriskålen.
- Påfør en kvadratisk bølgeform med 50 ms pulsbredde, DC offset værdi 0 V og peak voltage amplitude mellem 0,5 og 6 V. Frekvensen varierer mellem 0,5, 1,0 og 2,0 Hz med en afgiftscyklus på mellem henholdsvis 2,5 %, 5 % og 10 %. Optag makroskalasammentrækninger ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kamera.
- Elektrisk stimulation med Au-mikroelektroderne
- Efter fremstilling af Au mikroelektrode-integrerede flerlagede hydrogel stillads, vedhæfte to kobbertråde til Au elektroder ne gennem en ekstern firkantet port ved hjælp af sølv pasta.
- Dæk sølvpastaen med et tyndt lag PDMS precured ved 80 °C i 5 min. Derefter anbringes prøverne på en kogeplade ved 45 °C i 5 timer for at krydsforbinde PDMS fuldstændigt.
- Efter såning cardiomyocyte, anvende en firkantet bølge elektrisk stimulus på kobberledninger med DC offset værdi 1 V, peak spænding amplitude mellem 1,5 og 5 V, og frekvenser på 0,5, 1,0, og 2,0 Hz hhv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flowdiagram over trinene til udvikling af au mikroelektrode-inkorporeret bioinspireret blød robot
Formålet med det bløde robotdesign var at bygge en membran, der kunne aktivere en svømmebevægelse med minimal kompleksitet. Strukturen skal være i stand til at opretholde stærke fleksioner gentagne gange over tid (ca. 1 Hz) og være i stand til at holde sin form og samtidig opnå en stærk slå. Ved selektivt foto krydsforbinder polymeren ved hjælp af fotomasker, fabrikerede vi et hierarkisk struktureret stillads bestående af et mikromønstret PEGDA hydrogellag, et fleksibelt Au-mikroelektrodelag og et mikromønstret CNT-GelMA hydrogellag. Et skemadiagram og faktiske billeder af fremstillingsproceduren for den bløde robot som beskrevet i protokollen er vist i figur 1. Kort, der var tre vigtigste fabrikation trin for bioinspirerede bløde robot med indlejrede Au mikroelektroder: For det første, en mikromønstret PEGDA hydrogel med indarbejdet Au mikroelektroder blev opnået ved UV crosslinking ved hjælp af 1: t fotomaske(Figur 1A, B). For det andet blev en flerlaget konstruktion bestående af Au-mikroelektroder, mikromønstrede CNT-GelMA og PEGDA-hydrogelerne fremstillet af UV-crosslinking ved hjælp af den anden fotomaske (figur 1C). Endelig blev kardiomyocytter seedet på den fabrikerede trelagskonstruktion for at give aktivering til den bløde robot (Figur 1D).
Forskellige designs af den bløde robot
Med hensyn til formen af den bløde robot, i begyndelsen, designede vi to bioinspirerede former ved at biomimicting mønstreaf to forskellige vanddyr. Det første design var inspireret af udseendet af en caraibic søstjerne(Figur 2A, B, C), fordi søstjerner kan forenkles til en to-dimensionel (2D) objekt, har en hård rygrad, og har en fleksibel del, der slutter sig sammen for at bevæge sig i vandet, minimere den nødvendige bevægelse. Den anden enhed var baseret på formen af en manta stråle(Figur 2D, E, F), som er let at reproducere i en 2D-enhed. Manta-strålen kan svømme hurtigt ved hjælp af unikke bevægelser. Vi skitserede mantastrålen ved hjælp af grundlæggende geometriske former med reduceret kompleksitet, der skal korskobles under fotomasken trin. Elektroden, placeret langs midterlinjen af strukturen, blev designet med en bølget mønster, der giver mulighed for en bedre spredning af elektriske impulser og fleksibilitet (Figur 2D). For at udvikle den bioinspirerede bløde robot blev manta stråleinspireret form udvalgt og testet grundigt i denne undersøgelse.
Udfordringen med at integrere Au-mikroelektroderne mellem CNT-GelMA og PEGDA hydrogels
Indkapslingen af 200 nm tykke Au mikroelektroder i den fabrikerede robot krop kunne lokalt styre konstruere ved at give elektrisk stimulation. Selv om UV-krydssammenkædningen af både CNT-GelMA- og PEGDA-hydrogelmønstrene direkte på elektrodeoverfladen hæmmede elektrodernes aflaminering, garanterede den en vellykket inkorporering af elektroden i den bløde robot. Men efter at have overført Au elektroden på PEGDA hydrogels, Au elektrode med en rektangulær form og bred bredde (>1 mm) blev let brudt under fremstillingsprocessen på grund af hævelse af PEGDA hydrogel(Figur 3A, B, C). Derfor var vi nødt til at sikre, at mikroelektroderne blev overført til PEGDA hydrogel og indlejret mellem CNT-GelMA og PEGDA hydrogels mens intakt. Derfor blev Au-mikroelektroder med serpentinmønster (tykkelse = 200 μm) designet og fremstillet med blød litografi. Fase kontrast mikroskop billeder med forskellige forstørrelser og faser blev taget for at inspicere tegn på fraktur på elektroden efter transport på mikromønstrede PEGDA hydrogels(Figur 3D, E, F).
Optimering af afstanden mellem hydrogel mikromønstre
Den cardiomyocyte seedede CNT-GelMA lag viste forskellige slå adfærd i henhold til mønster afstande(Figur 4A, B). Dette kan tilskrives de forskellige måder, celler fastgjort til membranens overflade afhængigt af linjernes afstande. I tilfælde af 50 μm-afstanden var cellerne for pakket og havde ikke den ønskede organiserede konfiguration. De delvist indbyrdes forbundne og ikke justerede celler på vingerne bidrog ikke alle samtidig til svømmebevægelsen. Derfor var den kraft, der genereres af kardiomyocyten, ikke nok til at bøje vingerne. På en afstand på 150 μm var cellerne meget godt justeret. Men de sad hovedsageligt i rillen, og der var få sammenkoblinger mellem celler i de øverste lag, hvilket resulterede i svag tæsk. På en 75 μm afstand, cellerne blev justeret i den nederste del og forbundet i den øverste del, viser den stærkeste slå. For at forhindre irreversibel komplet rulning af den bløde robot under den dynamiske tæsk af kardiomyocytterne optimerede vi desuden mønsterafstanden for PEGDA hydrogelstøttelaget til 300 μm (figur 4C). Endelig besluttede vi efter denne parameteriseringsproces at fokusere mere på den manta stråleformede membran med 300 μm afstand PEGDA mønstre og 75 μm afstand CNT-GelMA mønstre. Hjertevæv på mikromønstrede PEGDA- og CNT-GelMA mønstre blev også vist ved fase/kontrastbilleder og F-actin/DAPI konfokale billeder (figur 4B).
Analyse af bevægelse af hjertevævet på mikromønstrede PEGDA- og CNT-GelMA hydrogels
For at analysere aktuatorens bevægelse tog vi videoer af membranen uden Au-mikroelektroderne, mens vi anvendte et elektrisk felt ved hjælp af en carbon rodelektrode. Figur 4D viser nogle rammer taget fra sammentrækningsoptegnelserne. Det var tydeligt, at manta stråleformede aktuator bøjede vingerne som forventet. Halen var balancering strukturen ved at rette lidt op og vingerne var stærkt lukker i midten. Nogle af membranerne viste en roterende bevægelse, mens de påtog sig på grund af skæve mikromønstrede CNT-GelMA og PEGDA hydrogels (Figur 4E og Video 1). I dette tilfælde var bevægelsen mindre defineret i forhold til den foregående, men sammentrækningen var stadig stærk nok til at tillade aktivering af en roterende bevægelse. Den samlede tid til at fuldføre en hel cirkel var omkring 45 s.
Karakteriseringen af kardiomyocytter på den flerlagede bløde robot og kontrol af slå adfærd ved elektrisk stimulation
Efter såning og modning af kardiomyocytter på det bioinspirerede robotsystem (figur 5A)blev der observeret tilpasning af hjertevævet i retning af CNT-GelMA-mønstrene (figur 5B-E) af både F-actin/DAPI og sacromeric/connexin-43/DAPI-immunfarvning. Konfokale fluorescensbilleder viste velaflange og justerede kardiomyocytter på CNT-GelMA hydrogelmønsteret (Figur 5B, C). Delvis enaksial sarcomere-tilpasning og sammenkoblet sarcomere-struktur blev observeret på de mønstrede områder (figur 5D). Godt indbyrdes forbundne sarcomere strukturer af hjertevæv placeret direkte over mikroelektroder blev også observeret (figur 5E). For at vurdere den bioinspirerede bløde robot, opdagede vi dens funktion ved hjælp af to metoder: For det første har vi anvendt en bipasisk elektrisk puls på den bløde robot selvom carbon rod elektroder for kunstig tuning og kontrollere slå adfærd. For det andet har vi tilsluttet to kobbertråde til den yderste ende af Au elektroden til at generere et elektrisk signal gennem hele robotkonstruktionen. Når vi anvendte en elektrisk stimulation gennem den eksterne kulstofelektrode eller kobbertråd, der var forbundet til Au-elektroden, var spændingen ved citatet anderledes ved forskellige frekvenser (0,5, 1,0 og 2,0 Hz, figur 5F).
Figur 1: Skemadiagram og faktiske billeder, der viser fremstillingsprocessen for den bioinspirerede flerlagede bløde robot, der styres elektrisk af elektrisk signal via integration af fleksible Au-mikroelektroder. (A) Mønstre og krydssammenkædning af PEGDA hydrogel ved hjælp af 1st fotomaske. (B) Micropatterned PEGDA hydrogel med indkapslet Au mikroelektroder på TMSPMA glas opnået efter trin (A). C) Krydsning af CNT-GelMA mønstrede hydrogel ved hjælp af andenfotomaske. (D) Såning af kardiomyocytter på den flerlagede konstruktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Design af de bioinspirerede bløde robotter. (A) Real søstjerner billede og forskellige visninger af de tre-dimensionelle (3D) CAD model påpege komponenter og striber. (B) Maskedesign til CNT-GelMA-mønster, PEGDA-mønster og Au-mikroelektroder til søstjerners form. (C) Optisk mikroskopbillede af de mikromønstrede CNT-GelMA- og PEGDA-mønstre for søstjerners form. (D) Real manta ray billede og forskellige visninger af 3D CAD model påpege komponenterne. (E) Maske design for CNT-GelMA mønster, PEGDA mønster, og Au mikroelektroder til manta ray form, tilpasset med tilladelse fra Su Ryon et al.10. (F) Optisk mikroskop billede af mikromønstrede CNT-GelMA og PEGDA mønstre for manta ray form. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Design af de fleksible Au-mikroelektroder. (A) Fotografi af fabrikerede Au elektroder med rektangulære former og brede bredder. (B og C) Optiskmikroskop billeder af Au elektroder, der undlod at overføre til PEGDA hydrogels. (D) Bølgede Au mikroelektroder før og efter (E og F) overføres på den mikromønstrede PEGDA hydrogel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Optimering af mikromønstrede PEGDA og CNT-GelMA hydrogels og bevægelsesanalyse af bløde robotter. (A) Optiske billeder af kardiomyocytter på CNT-GelMA hydrogel mønster med 50, 75 og 150 μm afstand. B) Optiske billeder og F-actin/DAPI farvning af kardiomyocytter på PEGDA- og CNT-GelMA hydrogelmønstrene med henholdsvis 300 μm og 75 μm afstand. C) De rullende morfoologier af de bioinspirerede konstruktioner med og uden den mikromønstrede PEGDA hydrogel med 300 μm afstand. (D) Rammer af den fritstående bioinspirerede bløde robot video optaget samtidig anvende den elektriske stimulus. (E) Collage af fire forskellige billeder taget fra videooptagelsen den roterende bevægelse af den bløde robot. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Karakterisering af kardiomyocytter på Au mikroelektrode-indarbejdet blød robot og kontrol af slå adfærd ved elektrisk stimulation. (A) Optisk mikroskop billede af de dyrkede kardiomyocytter på Au mikroelektroder indkapslet mellem PEGDA og CNT-GelMA hydrogels. (B) F-actin/DAPI fluorescensbillede, der viser de velaflange og justerede kardiomyocytter på CNT-GelMA hydrogelmikromønsteret. (C-E) Konfokale fluorescensbilleder, der viser sarcomerejustering og sammenkoblede sarcomerestrukturer på den fabrikerede bløde robot: (C og D) dyrkede kardiomyocytter på CNT-GelMA hydrogelmikromønsteret og (E) i nærheden af Au-mikroelektroderne. (F) Påkrævet excitation tærskel spænding ved forskellige frekvenser (0,5, 1,0, og 2,0 Hz) ved anvendelse af elektrisk stimulation via carbon rod elektrode og indlejrede Au mikroelektroder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1. Klik her for at se denne video (højreklik for at downloade).
Supplerende fil 1. Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).
Supplerende fil 2. Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).
Supplerende fil 3. Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af denne metode, vi var i stand til at fremstille en batoid fisk-lignende bioinspireret blød robot med en integreret selvaktiverende hjertevæv på en flerlags struktureret stillads, der kontrolleres af indlejrede Au mikroelektroder. På grund af to forskellige mikromønstrede hydrogellag lavet af PEGDA og CNT-GelMA hydrogels viste det bioinspirerede stillads god mekanisk stabilitet og ideel celletilpasning og modning. PEGDA mønsterlaget, der fungerer som en brusksamling af skeletarkitekturen i en stingstråle, giver mekanisk støtte til hele robotkroppen. Specifikt, det fastholdt mekanisk stabilitet under hjertevæv sammentrækning og afslapning, samtidig med at der gives mulighed for effektiv slå på grund af sin evne til at frigive membranspænding efter sammentrækning. Desuden tillod mikroelektrodernes nanometriske tykkelse (200 nm) samt deres serpentinmønster dem at være fleksible nok til ikke at hindre eller påvirke sammentrækningen af hjertevævet (figur 2). For nemt at overføre mikroelektroder på hydrogeloverfladen uden brud blev Au-mikroelektroder fremstillet på glasset uden sammenvoksningslag, såsom titanium, som almindeligvis bruges til at skabe stærk vedhæftning mellem glasset og Au. I mellemtiden blev CNT-GelMA-laget, som understøtter kardiomyocytefastgørelse og -tilpasning, lavet med mønstre vinkelret på pegda hydrogelmønsterets retning (figur 3). Efter modning, kardiomyocytter på det øverste lag forudsat selvaktivering for hele stilladset. Gennem den lokale elektriske stimulering af de indbyggede Au fleksible mikroelektroder, kunne vi modulere bankenfrekvens af robotten uden at skade hjertevæv på den. Selv om denne fabrikation metode er let at lære og at reproducere, er der stadig et par teknisk udfordrende skridt i fremstillingsprocessen, der skal understreges.
Der er fem kritiske trin til fremstilling af den bløde biorobot: 1) korrekt spredning af CNT'erne i GelMA hydrogel; 2) vellykket UV crosslinking af PEGDA og CNT-GelMA hydrogels på TMSPMA-belagt glas; 3) overførsel af Au mikroelektroder fra støtteglasset til hydrogelmønsteret 4) korrekt løsrivelse af aktuatoren fra den bærende glasrutsjebane 5) skabelse af god elektrisk kontakt mellem Au mikroelektroder og ledninger, der anvendes til tilslutning til bølgeform generator.
Sammenlignet med uberørte GelMA substrater, inkorporering af CNT'er giver GelMA hydrogel med forbedrede mekaniske egenskaber og avancerede elektrofysiologiske funktioner, der bidrager til højere spontane synkrone slå satser og en lavere excitation tærskel for myokardievæv9. Problemet med CNT-cytotoksicitet forebygges ikke blot ved hjælp af overfladefunktionsstoffer, men også ved at inkorporere nanostrukturerne i GelMA hydrogelmatrixen op til en koncentration på 5,0 mg/ml9. Faktisk fører samspillet mellem gelmahydrogelens hydrofobiske segmenter med CNT'ernes sidevægge til indkapsling af CNT'er i hydrogelporøs matrix14. Dette forhindrer dem ikke kun i at danne potentielt giftige aggregater, men det øger også CNT'er opløselighed i saltvandsopløsninger (f.eks. DPBS eller cellekulturmedium).
For at kunne inkorporere Au-mikroelektroderne mellem PEGDA og CNT-GelMA hydrogels skal der lægges særlig vægt på UV-krydssammenkædningen af hvert enkelt lag. Konkret er det nødvendigt at sikre, at hydrogelopløsningen dækker hele elektrodeområdet for at undgå brud på elektroderne under peeling-trinnet. Derfor er kvaliteten af TMSPMA glasbelægningen afgørende for at sikre en optimal vedhæftning af PEGDA-hydrogelen på glassubstratet, hvilket forhindrer dens løsrivelse under mikroelektrodernes overførselstrin.
Et andet kritisk skridt i metoden er adskillelsen af bioaktuatoren fra den understøttende glasrutsjebane. Dette problem kan nemt løses, når den spontane slå af hjertevæv er synkron og stærk nok til naturligt at skrælle den understøttende hydrogel fra glasdiaset. Af denne grund, som rapporteret før, er det afgørende at optimere hydrogel mønstre til at fremkalde en bestemt celle tilpasning gunstige for tilrettelæggelsen af en funktionel og synkron hjertevæv.
For elektrisk at forbinde mikroelektroderne til bølgegeneratoren skal der oprettes elektriske forbindelser på mikroelektroderne. Under dette trin er det vigtigt helt at indkapsle sølvlimen, der anvendes til at kontakte mikroelektroderne til kobbertråden for at undgå cytotoksiske virkninger. Dette opnås med succes ved at deponere en tynd dråbe PDMS på toppen af den elektriske kontakt.
Denne metode kunne ikke kun overvinde begrænsningerne i eksisterende optogenetiske teknikker, såsom komplicerede fabrikationsprocesser, lange fabrikationstider og potentiel toksicitet af optogenetiske værktøjer, men også i høj grad forbedre ydeevnen af cellebaserede aktuatorer, der fører til stimulering i realtid ved hjælp af billige og lethåndterende teknikker. Selv om udformningen af vores nuværende bioinspirerede aktuatorer ikke kunne generere fremdrivning, dens succes inden for autonome cellebaserede robotter kunne tiltrække en masse interesse. Denne metode kan også potentielt bidrage til udviklingen af trådløst drevne implantable patches til en hel robotkrop. Denne metode baner vejen for fremtidig trådløs elektrisk stimulation af soft-biorobots gennem integration af fleksible RF kredsløb direkte i hydrogel-baserede stillads.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette dokument blev finansieret af National Institutes of Health (R01AR074234, R21EB026824, R01 AR073822-01), Brigham Research Institute Stepping Strong Innovator Award og AHA Innovative Project Award (19IPLOI346660079).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Beaker | PYREX | 1000-250CNEa | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Milipore | M6514 | |
| 37° Water bath | VWR | W6M | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | |
| 80° incubator | VWR | 1370GM | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Anti-Connexin 43/GJAI antibody | Abcam | ab11370 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Sarcomeric α-actinin | Abcam | ab9465 | Mouse monoclonal |
| Benchtop Freeze Dryers | Labconco | 77500-00 K | |
| Biosafety cabinet | Sterilgard | A/B3 | |
| Carbon rod electrodes | SGL Carbon Group | 6971105 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| CO2 incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Collagenase, Type II, Powder | Gibco | 17-101-015 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| COOH Functionalized Carbon Nanotubes | NanoLab | PD30L5-20-COOH | |
| Dicing saw machine | Giorgio Technology | DAD-321 | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11-965-118 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-144 | |
| E-beam evaporator | CHA | 57367 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10-437-028 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B, 300 bloom from porcine skin |
| Glass slide | VWR | 48382-180 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-079 | |
| Inverted optical microscope | Olympus | CK40 | |
| Magnetic hotplate | Corning | PC-420 | |
| methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276695 | Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor |
| Nunc EasYFlask 175cm2 | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| Olicscope | Siglent | SDS1052DL+ | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PDMS SYLGARD 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| Photomask | Mini micro stencil inc | ||
| Platinum wire | Alfa Aesar | AA43014BU | |
| Polyethylene glycol dimethcrylate | Polysciences Inc. | 15178-100 | |
| Regenerated Cellulose Dialysis Tubing | Fisherbrand | 21-152-14 | |
| Silver Epoxy Adhesive | MG Chemicals | 8330S | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | S2GPU02RE | |
| Ultra sonicator | Qsonica | Q500 | |
| UV Curing System | OmniCure | S2000 | |
| Vortex mixer | Scientific Industry | SI-0246A | |
| Waveform generator | Agilent | 33500B | |
| Wrap Aluminium foil | Reynolds | N/A |
References
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nature Biotechnology. 30 (8), 792-797 (2012).
- Park, S. J., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Laschi, C., et al. Soft Robot Arm Inspired by the Octopus. Advanced Robotics. 26 (7), 709-727 (2012).
- Alapan, Y., et al. Soft erythocyte-based bacterial microswimmers for cargo delivery. Science Robotics. 3 (17), 4423 (2018).
- Magdanz, V., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Development of a Sperm-Flagella Driven Micro-Bio-Robot. Advanced Materials. 25 (45), 6581-6588 (2013).
- Rus, D., Tolley, M. T. Design, fabrication and control of soft robots. Nature. 521 (7553), 467-475 (2015).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16 (18), 3473-3484 (2016).
- Shin, S. R., et al. Aligned Carbon Nanotube–Based Flexible Gel Substrates for Engineering Biohybrid Tissue Actuators. Advanced Functional Materials. 25 (28), 4486-4495 (2015).
- Shin, S. R., et al. Carbon-nanotube-embedded hydrogel sheets for engineering cardiac constructs and bioactuators. ACS Nano. 7 (3), 2369-2380 (2013).
- Shin, S. R., et al. Electrically Driven Microengineered Bioinspired Soft Robots. Advanced Materials. 30 (10), 1704189 (2018).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
- Jia, Z., et al. Stimulating cardiac muscle by light: cardiac optogenetics by cell delivery. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (5), 753-760 (2011).
- Shin, S. R. Carbon Nanotube Reinforced Hybrid Microgels as Scaffold Materials for Cell Encapsulation. ACS Nano. , (2013).
