Summary
Un échafaudage bioinspiré est fabriqué par une technique de photolithographie douce à l’aide d’hydrogels mécaniquement robustes et électriques. Les hydrogels micropatterned fournissent l’alignement directionnel de cellules de cardiomyocyte, ayant pour résultat une direction adaptée de l’actionnement. Des microélectrodes flexibles sont également intégrées dans l’échafaudage pour apporter une contrôlabilité électrique pour un tissu cardiaque auto-actionnant.
Abstract
Les systèmes robotiques souples bioinspirés qui imitent les organismes vivants à l’aide de tissus musculaires et de biomatériaux modifiés révolutionnent le paradigme actuel de la biorobotique, en particulier dans la recherche biomédicale. Recréer une dynamique d’actionnement artificielle réaliste est crucial pour un système robotique en douceur. Cependant, le contrôle précis et l’ajustement du comportement d’actionnement représente toujours l’un des principaux défis des systèmes robotiques souples modernes. Cette méthode décrit une procédure peu coûteuse, très évolutive et facile à utiliser pour fabriquer un robot mou contrôlable électriquement avec des mouvements réalistes qui sont activés et contrôlés par la contraction du tissu musculaire cardiaque sur une piqûre micromodèle échafaudage hydrogel en ressemblant à un rayon. L’utilisation de méthodes de photolithographie souple permet d’intégrer avec succès plusieurs composants dans le système robotique souple, y compris des échafaudages à base d’hydrogel à motif micromodèle avec des nanotubes de carbone (CNT) méthacryloyl de gélatine embarquée (CNT-GelMA), diacrylate poly(éthylène glycol) (PEGDA), microélectrodes d’or flexible (Au) et tissu musculaire cardiaque. En particulier, l’alignement des hydrogels et le micromotif sont conçus pour imiter la structure musculaire et cartilagineuse du rayon piqueur. L’hydrogel CNT-GelMA électriquement conducteur agit comme un échafaudage cellulaire qui améliore le comportement de maturation et de contraction des cardiomyocytes, tandis que l’hydrogel PEGDA mécaniquement robuste fournit un soutien structurel ressemblant à un cartilage à l’ensemble du robot mou. Pour surmonter la nature dure et cassante des microélectrodes à base de métal, nous avons conçu un motif serpentin qui a une grande flexibilité et peut éviter d’entraver la dynamique de battement des cardiomyocytes. Les microélectrodes Au flexibles incorporées fournissent une stimulation électrique à travers le robot mou, ce qui facilite le contrôle du comportement de contraction du tissu cardiaque.
Introduction
Les robots mous modernes de pointe peuvent imiter les structures hiérarchiques et la dynamique musculaire de beaucoup d’organismes vivants, tels que la méduse1,2, rayon de piqûre2, poulpe3, bactéries4, et le sperme5. Imiter la dynamique et l’architecture des systèmes naturels offre des performances plus élevées en termes d’efficacité énergétique et structurelle6. Ceci est intrinsèquement lié à la nature molle des tissus naturels (p. ex., tissu cutané ou musculaire avec un modulus de Young entre 104et 109 Pa) qui permet des degrés plus élevés de liberté et de déformation supérieure et d’adaptabilité par rapport aux actionneurs standard (par exemple, un modulus de Young habituellement entre 109et 1012 Pa)6. Les actionneurs à base de muscle cardiaque, en particulier, montrent une efficacité énergétique supérieure en raison de leur auto-actionnement ainsi que leur potentiel d’autoréparation et de régénération par rapport à un système robotique à base mécanique7. Cependant, la fabrication de robots mous est difficile en raison de la nécessité d’intégrer différents composants avec différentes propriétés physiques, biologiques et mécaniques dans le système unique. Par exemple, les systèmes synthétiques conçus doivent être intégrés aux systèmes biologiques vivants, non seulement en leur fournissant un soutien structurel, mais aussi en influençant et en modulant leur comportement d’actionnement. En outre, de nombreuses méthodes de microfabrication nécessitent des processus durs/cytotoxiques et des produits chimiques qui diminuent la viabilité et la fonction de tous les composants vivants. Par conséquent, de nouvelles approches sont nécessaires pour améliorer la fonctionnalité des robots mous et pour contrôler et moduler leur comportement.
Pour intégrer avec succès des composants vivants avec une bonne viabilité, un échafaudage à base d’hydrogel est un excellent matériau pour créer le corps d’un robot doux. Les propriétés physiques et mécaniques d’un hydrogel peuvent facilement être réglées pour créer des microenvironnements pour les composants vivants tels que les tissus musculaires8,9. En outre, il peut facilement adopter diverses techniques de microfabrication, résultant en la création de structures hiérarchiques avec haute fidélité1,2,10. Des appareils électroniques flexibles peuvent être incorporés dans le robot souple pour contrôler son comportement avec la stimulation électrique. Par exemple, des techniques optogénétiques pour concevoir des cellules électrogéniques (p. ex., des cardiomyocytes), qui montrent une activation électrophysiologique dépendante de la lumière, ont été utilisées pour développer un rayon de piqûre robotique douce à base de polydiméthylsiloxane (PDMS) guidé par la lumière qui a pu recréer le mouvement ondulatoire du poisson in vitro2. Bien que les techniques optogénétiques aient montré une excellente maniabilité, le travail présenté utilise la stimulation électrique, une méthode de simulation conventionnelle et traditionnelle. C’est parce que la stimulation électrique par l’intermédiaire de microélectrodes flexibles est facile et simple comparée aux techniques optogénétiques, qui exigent des processus étendus de développement11. L’utilisation d’appareils électroniques flexibles peut permettre une stimulation à long terme et des procédés de fabrication standard/simples ainsi que des biocompatibilités et des propriétés physiques et mécaniques12,13.
Ici, nous présentons une méthode innovante pour fabriquer un robot doux bioinspiré, actionné par le battement du tissu musculaire cardiaque d’ingénierie et contrôlé par la stimulation électrique par des microélectrodes Flexibles intégrées Au. Le robot doux est conçu pour imiter la structure musculaire et cartilagineuse du rayon piqueur. Le raies piqueurs est un organisme dont la structure et le mouvement sont relativement faciles à imiter par rapport à d’autres espèces nageant. Les muscles sont recréés in vitro par l’ensemencement de cardiomyocytes sur un micromotif hydrogel électriquement conducteur. Comme indiqué précédemment, l’incorporation de nanoparticules conductrices électriques telles que le CNT dans l’hydrogel GelMA améliore non seulement le couplage électrique du tissu cardiaque, mais induit également une excellente architecture et arrangement tissu l’in vitro8,9. Les joints de cartilage sont alors imités à l’aide d’un motif hydrogel PEGDA mécaniquement robuste qui agit comme le substrat mécaniquement robuste de l’ensemble du système. Les microélectrodes Flexibles Au avec un modèle serpentin sont incorporées dans le modèle PEGDA pour stimuler localement et électriquement le tissu cardiaque.
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Protocol
Cette étude a été réalisée dans le strict respect des recommandations du Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’hôpital Brigham and Women’s.
1. Synthèse GelMA
- Dissoudre 10 g de gélatine dans 100 ml de saline tamponnée de phosphate (DPBS) de Dulbecco à l’aide d’un agitateur magnétique à 50 oC.
- Ajouter lentement 8 mL d’anhydride methacrylique en remuant la solution de prépolymère de gélatine à 50 oC pendant 2 h. Diluer la solution de gélatine réagie avec du DPBS préchauffé à 50 oC.
- Transférer la solution diluée dans des membranes de dialyse (coupure de poids moléculaire de 12 à 14 kDa) et les placer dans de l’eau déionisée (DI). Effectuer la dialyse à 40 oC pendant environ 1 semaine.
- Filtrer la solution de prépolymère GelMA dialysée à l’aide d’un filtre stérile (taille de la pore à 0,22 m) et transférer 25 ou 30 ml de la solution dans des tubes de 50 ml et stocker à -80 oC pendant 2 jours.
- Faire sécher la solution congelée de prépolymère GelMA à l’aide d’un séchoir à congélation pendant 5 jours.
2. Préparation de la solution de prépolymère poly(éthylène glycol) (PEGDA)
- Dissoudre 200 mg (20% de la solution totale) de PEGDA (MW - 1.000) avec 5 mg (0.5% de la solution totale) de 2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-méthylpropiophenone (photo-initiateur, PI) dans 1 mL de DPBS.
- Incuber la solution prépolymère à 80 oC pendant 5 min.
3. Préparation de la solution de stock dispersée CNT enduite de GelMA
- Dissoudre 80 mg de GelMA (utilisé comme biosurfactant) dans 4 ml de DPBS, puis ajouter 20 mg de nanotubes de carbone multi-murs fonctionnalisés COOH (MWCNTs) dans la solution de prépolymère GelMA.
- Sonicate la solution de prépolymère GelMA chargée de MWCNT pendant 1 h (0,66Hz, 100 Watt).
REMARQUE : Pendant le processus de sonication, la solution doit être immergée dans un bain d’eau à 15 oC pour éviter l’évaporation du solvant en raison de la hausse de la température.
4. Préparation de 1 mg/mL CNT contenant 5% gelMA solution prépolymère
- Dissoudre 50 mg de GelMA et 5 mg (0,5 % de la solution totale) d’IP dans 0,8 ml de DPBS à 80 oC pendant 10 min.
- Ajouter 0,2 ml de la solution de stock CNT préparée (étape 3). Vortex et incuber la solution à 80 oC pendant 10 min.
5. Préparation d’une glissière en verre enduite de 3-(trimethoxysilyl)propyl (TMSPMA)
- Laver les lames de verre (épaisseur de 1 mm, taille 5,08 cm x 7,62 cm) avec de l’éthanol pur.
- Empilez les glissières nettoyées verticalement dans un bécher de 250 ml et étalez 3 ml de TMSPMA sur eux à l’aide d’une seringue. Couvrir le bécher de papier d’aluminium pour éviter l’évaporation de TMSPMA.
- Incuber les lames dans un four à 80 oC pendant 1 jour.
- Laver les lames de verre enduites en les trempant dans de l’éthanol pur, puis les sécher.
- Conservez les lames de verre enduites enveloppées dans du papier d’aluminium à température ambiante (RT).
REMARQUE : Essayez de minimiser le toucher des surfaces des lames de verre recouvertes de TMSPMA.
6. Fabrication des microélectrodes Au flexibles
- Concevoir un masque d’ombre à l’aide d’une conception assistée par ordinateur(Fichier supplémentaire 3).
- Fabriquez et achetez un masque d’ombre.
- Laver la glissière en verre (épaisseur de 1 mm, taille de 3 cm x 4 cm) à l’acétone et sécher à l’air comprimé.
- Fixez le masque d’ombre aux substrats de verre à l’aide de ruban adhésif double face, puis mettez-les dans un évaporateur à faisceau E et attendez que la pression de la chambre atteigne au moins 10-6 Torr.
REMARQUE : Les deux morceaux de ruban adhésif ont été placés manuellement sur le support à une distance assez courte pour accueillir le verre et assez grand pour s’adapter à l’ensemble du motif. Cette étape prend environ 45 à 60 min. - Déposez une couche Au de 200 nm d’épaisseur par evaporateur e-faisceau (p. ex., avec Denton EE-4, vide de 10à 6 Torr, puissance de 2,6 %, taux de 2 /s) et coupez les microélectrodes fabriquées à l’aide d’une machine à scie à découper (taille des électrodes 7,38 mm x 8,9 mm x 200 nm).
7. Fabrication d’un échafaudage hydrogel multicouches micro-électrodes intégré au microélectrode Au
REMARQUE : Le résultat de cette procédure est une membrane où un hydrogel PEGDA micropatterné est dans la couche inférieure, un hydrogel micropatterned de CNT-GelMA est sur le dessus, et les microélectrodes d’Au sont entre les deux couches. Cette configuration assure une meilleure flexibilité à l’électrode et limite le risque de rupture.
- Concevoir et fabriquer deux photomasques pour créer les couches micropatterned PEGDA (1st photomask) et les couches d’hydrogel CNT-GelMA (2nd photomask). Voir le fichier supplémentaire 2-3. La conception peut être faite en utilisant le logiciel CAO.
REMARQUE: Voir Figure 2B, E. - Placez 50 minuteiseurs fabriqués en empilant une couche de ruban invisible commercial (Épaisseur : 50 m) sur un verre enduit TMSPMA. Verser 15 ll de 20 % de solution prépolymère PEGDA sur le verre enduit TMSPMA, puis recouvrir de microélectrode dorée. Placez le 1er photomasque pour la glissière de verre (pegDA micromodèle) sur le dessus de la microélectrode dorée et exposez l’ensemble de la construction à la lumière UV (200 W lampe à arc court à vapeur de mercure avec filtre 320-390 nm) à 800 mW d’intensité et 8 cm de distance pour 110 s.
REMARQUE: Voir Figure 1A. - Ajouter DPBS pour entourer la glissière de verre et détacher l’hydrogel PEGDA micropatterned avec les microélectrodes Au du substrat de verre non couché soigneusement après 5-10 min pour obtenir la glissière en verre qui a l’hydrogel PEGDA micropatterned avec l’Au Microélectrodes.
REMARQUE: Voir Figure 1B. En raison du revêtement TMSPMA, la construction est transférée du substrat de verre non couché à celui enduit de TMSPMA. Détachez-vous soigneusement car les microélectrodes Au peuvent se briser facilement au cours de cette étape (Figure 3). - Placez 100 minuteiseurs de m fabriqués en empilant deux couches de ruban transparent commercial (épaisseur de 50 m) sur le fond d’un plat Petri. Déposez une goutte de 20 l de solution de prépolymère CNT-GelMA entre les espaceurs, puis retournez la glissière en verre obtenue en 7,3 et fixez-la sur le plat avec du ruban adhésif.
- Faites pivoter l’appareil à l’envers et placez le photomasque 2nd sur le dessus de la glissière en verre. Exposer sous la lumière UV à 800 mW d’intensité et 8 cm de distance pour 200 s.
REMARQUE: Voir Figure 1C. L’alignement du 2ème masque est important. - Laver l’échafaudage obtenu avec DPBS et avec le milieu de culture cellulaire qui comprend 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
- Laissez-les passer la nuit dans l’incubateur de 37 oC avant d’ensemencer les cellules.
8. Les cardiomyocytes de rat néonatal s’isolation et culture
- Isoler les cœurs des rats Sprague-Dawley de 2 jours suivant des protocoles approuvés par le Comité des soins aux animaux8de l’Institut.
- Mettre les morceaux de coeur sur le shaker pendant la nuit (environ 16 h) dans 0.05% trypsin sans EDTA dans HBSS dans une chambre froide.
- Recueillir les morceaux de cœur avec un pistolet pipette et minimiser la quantité de trypsine, puis les mettre dans un tube de 50 ml avec 10 ml de médias cardiaques chauds (10% FBS, 1% P / S, 1% L-glutamine).
- Tourbillonnez lentement (60 tr/min) dans un bain d’eau de 37 oC pendant 7 min. Retirez soigneusement le support du tube à l’air d’une pipette de 10 ml et laissez les morceaux de cœur dans le tube.
- Ajouter 7 mL de 0,1 % de collagène de type 2 dans le HBSS et faire tourbillonner dans un bain d’eau de 37 oC pendant 10 min.
- Mélanger avec une pipette 10 ml 10x doucement pour perturber les morceaux de coeur. Retirer le support du tube à l’air d’une pipette de 1 ml.
- Ajouter 10 ml de collagène de 0,1 % de type 2 dans le HBSS et tourbillonner rapidement (120 à 180 tr/min) dans un bain d’eau de 37 oC pendant 10 min, puis vérifier si les morceaux de cœur se dissolvent.
- Mélanger avec une pipette de 10 ml, puis répéter avec une pipette de 1 ml pour briser les derniers morceaux de coeur.
- Une fois que la solution semble homogène, placez une passoire cellulaire de 70 m sur un nouveau tube de 50 ml et une pipette la solution 1 ml à la fois sur la passoire.
- Centrifuger la solution de cellules cardiaques à 180 x g pendant 5 min à 37 oC.
REMARQUE : S’il y a encore des morceaux de coeur ou du mucus qui ne se sont pas dissous, répétez les étapes 8.7-8.9 encore. - Retirez soigneusement tout le liquide au-dessus de la pastille cellulaire et rensez les cellules dans 2 ml de support cardiaque.
- Ajouter 2 ml de support cardiaque de la paroi du tube soigneusement pour resuspendre les cellules et éviter de les briser.
- Ajouter les cellules suspendues dans un flacon T175 avec des médias cardiaques chauds goutte à goutte. Mettre le flacon dans un incubateur de 37 oC pendant 1 h pour permettre aux fibroblastes cardiaques de se fixer au fond.
REMARQUE : À cette étape de préplaquage, les fibroblastes cardiaques se fixent au flacon tandis que les cardiomyocytes resteront dans le milieu de suspension. - Recueillir les médias du flacon qui contient les cardiomyocytes et le mettre dans un tube de 50 ml.
- Compter les cellules, puis centrifuger à 260 x g pendant 5 min à 37 oC.
- Resuspendre et ensemencer les cellules sur le dessus du robot doux fabriqué dans l’étape 7. Verser un volume spécifique de support cardiaque avec les cardiomyocytes à une concentration de 1,95 à 106 cellules/mL goutte à goutte sur toute la surface de l’appareil.
- Incuber les échantillons à 37 oC et changer les médias avec un support de culture cellulaire de 5 ml avec 2 % de FBS et 1 % de L-glutamine le premier et le deuxième jour après l’ensemencement. Changez les médias chaque fois que la couleur des médias change.
9. Coloration cellulaire pour l’analyse de l’alignement
- Retirez les médias et lavez-les avec DPBS pendant 5 min à RT.
- Fixer les cellules en utilisant 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 20 min à RT. Ensuite, laver avec DPBS pendant 5 min à RT.
- Incuber les cellules avec 0,1% de triton en DPBS à RT pendant 1 h. Laver 3x avec PBS pendant 5 min à RT.
- Incuber les cellules avec 10% de sérum de chèvre dans DPBS à RT pendant 1 h.
- Incuber les cellules avec un anticorps primaire (sarcomérique et connexine-43) dans 10% de sérum de chèvre dans DPBS à 4 oC pour 14 à 16 h.
- Laver 3x avec DPBS pendant 5 min à RT. Incuber les cellules avec l’anticorps secondaire dans 10% sérum de chèvre dans DPBS à RT pour 1 h.
- Laver 3x avec DPBS pendant 5 min à RT, puis contre-taches cellules avec 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dans l’eau DI (1:1,000) pendant 10 min à RT. Wash 3x avec DPBS pour 5 min à RT.
- Prenez des images de fluorescence à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser inversé.
10. Test d’actuateur et évaluation du comportement
- Battement spontané des cardiomyocytes sur le robot doux
- Incuber les actionneurs bioinspirés à 37 oC pendant 5 jours et rafraîchir les médias les jours 1 et 2 et, au besoin, lorsque le média devient jaune. Utilisez un microscope optique inversé pour prendre des images quotidiennement (5x et/ou 10x). Enregistrez les mouvements cellulaires à l’aide d’un logiciel de capture vidéo sur la fenêtre en direct du microscope pour 30 s à 20 images par seconde (5x et/ou 10x) lorsque l’activité contractile commence (généralement vers le jour 3).
- Au jour 5, détacher les membranes en soulevant doucement du bord avec une glissière de couverture.
REMARQUE: Si les cellules montrent un comportement de battement fort, les membranes se détacheront par elles-mêmes en raison de l’action mécanique des contractions.
- Stimulation du signal électrique en vrac
- À l’aide d’un PDMS espacé de 3 cm, apposez deux électrodes de tige de carbone avec du fil de platine (Pt) dans un plat Petri de 6 cm rempli de supports cardiaques. Ensuite, transférez délicatement le robot mou dans le plat Petri.
- Appliquer une forme d’onde carrée avec une largeur d’impulsion de 50 ms, une valeur de compensation DC 0 V et une amplitude de tension de pointe entre 0,5 et 6 V. La fréquence varie entre 0,5, 1,0 et 2,0 Hz avec un cycle de service entre 2,5 %, 5 % et 10 %, respectivement. Enregistrez les contractions macro-échelle à l’aide d’une caméra disponible dans le commerce.
- Stimulation électrique avec les microélectrodes Au
- Après la fabrication de l’échafaudage hydrogel multicouches intégré au microélectrode Au, attachez deux fils de cuivre aux électrodes Au par l’entremise d’un port carré externe à l’aide d’une pâte d’argent.
- Couvrir la pâte d’argent d’une fine couche de PDMS précurée à 80 oC pendant 5 min. Ensuite, placez les échantillons sur une plaque chauffante à 45 oC pendant 5 h pour croiser complètement le PDMS.
- Après l’ensemencement cardiomyocyte, appliquer un stimulus électrique d’onde carrée sur les fils de cuivre avec la valeur de compensation de DC 1 V, l’amplitude de tension de pointe entre 1.5 et 5 V, et les fréquences de 0.5, 1.0, et 2.0 Hz respectivement.
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Representative Results
Diagramme de flux des étapes pour le développement du robot doux bioinspiré bio-inspiré de microélectrode Au
L’objectif de la conception du robot doux était de construire une membrane capable d’actionner un mouvement de natation avec une complexité minimale. La structure doit être en mesure de soutenir de fortes flexions à plusieurs reprises au fil du temps (environ 1 Hz) et être en mesure de garder sa forme tout en réalisant une forte raclée. En croisant sélectivement le polymère à l’aide de photomasques, nous avons fabriqué un échafaudage structuré hiérarchiquement composé d’une couche d’hydrogel PEGDA micromodèle, d’une couche de microélectrodes Flexible au, et d’une couche d’hydrogel CNT-GelMA à motifs micropatternés. Un diagramme schématique et des images réelles de la procédure de fabrication du robot mou tel que décrit dans le protocole sont montrés dans la figure 1. En bref, il y avait trois étapes principales de fabrication pour le robot doux bioinspiré avec les microélectrodes au intégrées d’Au : d’abord, un hydrogel micropatterned de PEGDA avec les microélectrodes incorporées d’Au a été obtenu par le crosslinking UV utilisant le 1er photomask (figure 1A, B). Deuxièmement, une construction multicouche composée de microélectrodes Au, le CNT-GelMA micropatterned, et les hydrogels PEGDA a été fabriqué par crosslinking UV à l’aide du 2ème photomask (Figure 1C). Enfin, des cardiomyocytes ont été ensedus sur la construction fabriquée à trois couches pour fournir l’actionnement au robot mou (Figure 1D).
Différentes conceptions du robot doux
En ce qui concerne la forme du robot doux, au début, nous avons conçu deux formes bioinspirées en biomitant les motifs de deux animaux aquatiques différents. La première conception a été inspirée par l’apparition d’une étoile de mer caraïbique (Figure 2A, B, C), parce que l’étoile de mer peut être simplifiée en un objet bidimensionnel (2D), a une colonne vertébrale dure, et a une partie flexible qui se réunit pour se déplacer dans l’eau, en minimisant le mouvement requis. Le deuxième dispositif était basé sur la forme d’un rayon manta (Figure 2D, E, F) qui est facile à reproduire dans un dispositif 2D. Le rayon manta peut nager rapidement en utilisant des mouvements uniques. Nous avons esquissé le rayon manta en utilisant des formes géométriques de base avec une complexité réduite à être reliés entre eux pendant l’étape du photomasque. L’électrode, placée le long de la ligne médiane de la structure, a été conçue avec un motif ondulé, permettant une meilleure propagation des impulsions électriques et de la flexibilité (Figure 2D). Pour développer le robot doux bioinspiré, la forme d’inspiration rayon manta a été sélectionnée et testée à fond dans cette étude.
Le défi de l’intégration des microélectrodes Au entre les hydrogels CNT-GelMA et PEGDA
L’encapsulation de 200 nm d’épaisseur Au microélectrodes dans le corps du robot fabriqué pourrait localement contrôler la construction en fournissant une stimulation électrique. Bien que le rattachement UV des modèles d’hydrogel CNT-GelMA et PEGDA directement sur la surface de l’électrode ait entravé la délamination des électrodes, il a garanti l’incorporation réussie de l’électrode dans le robot mou. Cependant, après le transfert de l’électrode Au sur les hydrogels PEGDA, l’électrode Au avec une forme rectangulaire et une large largeur (-1 mm) a été facilement brisée pendant le processus de fabrication en raison de l’enflure de l’hydrogel PEGDA (Figure 3A, B, C). Par conséquent, nous devions nous assurer que les microélectrodes étaient transférés avec succès à l’hydrogel PEGDA et intégrés entre les hydrogels CNT-GelMA et PEGDA alors qu’ils étaient intacts. Par conséquent, les microélectrodes Au avec un motif serpentin (épaisseur de 200 m) ont été conçues et fabriquées avec une lithographie douce. Des images de microscope de contraste de phase avec différents grossissements et étapes ont été prises afin d’inspecter les signes de fracture sur l’électrode après le transport sur les hydrogels PEGDA micropatterned(figure 3D, E, F).
L’optimisation de l’espacement entre les micromodèles hydrogel
La couche cNT-GelMA ensevaçante de cardiomyocyte a montré un comportement de battement différent selon les distances de modèle (figure 4A, B). Cela peut être attribué aux différentes façons dont les cellules attachées à la surface de la membrane en fonction des distances des lignes. Dans le cas de la distance de 50 m, les cellules étaient trop emballées et n’avaient pas la configuration organisée souhaitée. Les cellules partiellement interconnectées et non alignées sur les ailes ne contribuaient pas toutes simultanément au mouvement de natation. Par conséquent, la force générée par le cardiomyocyte n’était pas suffisante pour plier les ailes. À une distance de 150 m, les cellules étaient très bien alignées. Cependant, ils se sont surtout assis dans la rainure et il y avait peu d’interconnexions entre les cellules dans les couches supérieures, ce qui a entraîné une faible raclée. À une distance de 75 m, les cellules étaient alignées dans la partie inférieure et interconnectées dans la partie supérieure, montrant le battement le plus fort. En outre, afin d’éviter le roulement complet irréversible du robot mou pendant le battement dynamique des cardiomyocytes, nous avons optimisé l’espacement de modèle de la couche de support hydrogel DEPEG à 300 m (figure 4C). Enfin, à la suite de ce processus de paramétation, nous avons décidé de nous concentrer davantage sur la membrane en forme de rayon manta avec des motifs PEGDA de 300 m de distance et des motifs CNT-GelMA de 75 m de distance. Le tissu cardiaque sur les modèles PEGDA- et CNT-GelMA micropatterned a été également montré par des images de phase/contraste et des images confocales de F-actin/DAPI (figure 4B).
L’analyse du mouvement du tissu cardiaque sur les hydrogels PEGDA- et CNT-GelMA micropatterned
Pour analyser le mouvement de l’actionneur, nous avons pris des vidéos de la membrane sans microélectrodes Au tout en appliquant un champ électrique à l’aide d’une électrode de tige de carbone. La figure 4D montre certains cadres tirés des enregistrements de contraction. Il était clairement visible que l’actionneur en forme de rayon de manta pliait les ailes comme prévu. La queue équilibrait la structure en redressant un peu et les ailes se refermaient fortement au milieu. Certaines membranes présentaient un mouvement rotatif lors de la contraction en raison d’hydrogels CNT-GelMA et PEGDA mal alignés(figure 4E et vidéo 1). Dans ce cas, le mouvement était moins défini par rapport au précédent, mais la contraction était encore assez forte pour permettre l’actionnement d’un mouvement rotatif. Le temps total pour compléter un cercle entier était d’environ 45 s.
La caractérisation des cardiomyocytes sur le robot doux multicouches et le contrôle du comportement de battement par stimulation électrique
Après l’ensemencement et la maturation des cardiomyocytes sur le système robotique bioinspiré (figure 5A),l’alignement du tissu cardiaque le long de la direction des modèles CNT-GelMA a été observé (Figure 5B-E) par F-actin/DAPI et sacromeric/connexin-43/DAPI immunostaining. Les images de fluorescence confocale ont montré des cardiomyocytes bien allongés et alignés sur le modèle d’hydrogel CNT-GelMA (Figure 5B, C). L’alignement partiel des sarcores uniaxiaux et la structure interconnectée du sarcore ont été observés sur les zones à motifs(figure 5D). Des structures sarcoques bien reliées de tissus cardiaques situés directement au-dessus des microélectrodes ont également été observées (figure 5E). Pour évaluer le robot doux bioinspiré, nous avons détecté sa fonction en utilisant deux méthodes : premièrement, nous avons appliqué une impulsion électrique biphasique au robot mou par des électrodes de tige de carbone pour l’accordage artificiel et le contrôle du comportement de battement. Deuxièmement, nous avons relié deux fils de cuivre à l’extrémité extérieure de l’électrode Au pour générer un signal électrique à travers toute la construction du robot. Lorsque nous avons appliqué une stimulation électrique à travers l’électrode de carbone externe ou le fil de cuivre relié à l’électrode Au, la tension du seuil d’excitation était différente à différentes fréquences (0,5, 1,0 et 2,0 Hz, figure 5F).
Figure 1 : Diagramme schématique et images réelles illustrant le processus de fabrication du robot souple multicouches bio-inspiré électriquement contrôlé par le signal électrique via l’intégration de microélectrodes Au flexibles. (A) Patterning et crosslinking de l’hydrogel PEGDA à l’aide du1er photomask. (B) Hydrogel PEGDA micropatterned avec les microélectrodes Encapsulées Au sur le verre TMSPMA obtenues après étape (A). (C) Crosslinking de l’hydrogel à motifs CNT-GelMA à l’aide du photomask 2nd. (D) Ensemencement des cardiomyocytes sur la construction multicouches. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Conception des robots mous bioinspirés. (A) Image d’étoile de mer réelle et différentes vues du modèle CAO en trois dimensions (3D) soulignant les composants et les rayures. (B) Conception de masque pour le modèle CNT-GelMA, le motif PEGDA et les microélectrodes Au pour la forme des étoiles de mer. (C) Image au microscope optique des modèles micropatterned CNT-GelMA et PEGDA pour la forme d’étoile de mer. (D) Image de rayon manta réel et différentes vues du modèle 3D CAD soulignant les composants. (E) Conception de masque pour le modèle CNT-GelMA, le motif PEGDA, et les microélectrodes Au pour la forme de rayon de manta, adapté avec la permission de Su Ryon et autres10. (F) Image au microscope optique des modèles micropatterned CNT-GelMA et PEGDA pour la forme de rayon de manta. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Conception des microélectrodes Au flexibles. (A) Photographie d’électrodes Fabriquées au plus avec des formes rectangulaires et de larges largeurs. (B et C) Images au microscope optique des électrodes Au qui n’ont pas réussi à se transférer aux hydrogels PEGDA. (D) Les microélectrodes Wavy Au avant et après (E et F) étant transférées sur l’hydrogel PEGDA micropatterned. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : L’optimisation des hydrogels PEGDA et CNT-GelMA et l’analyse des mouvements des robots mous. (A) Images optiques de cardiomyocytes sur le modèle d’hydrogel CNT-GelMA avec un espacement de 50, 75 et 150 m. (B) Images optiques et coloration F-actin/DAPI des cardiomyocytes sur les motifs hydrogel PEGDA- et CNT-GelMA avec respectivement 300 et 75 'm d’espacement. (C) Les morphologies de roulement des constructions bioinspirées avec et sans l’hydrogel PEGDA micropatterned avec l’espacement de 300 m. (D) Cadres de la vidéo de robot doux bio-inspiré autonome enregistrée tout en appliquant le stimulus électrique. (E) Collage de quatre images différentes tirées de la vidéo enregistrant le mouvement rotatif du robot mou. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Caractérisation des cardiomyocytes sur le robot mou au microélectrode et contrôle du comportement de battement par stimulation électrique. (A) Image au microscope optique des cardiomyocytes cultivés sur les microélectrodes Au encapsulées entre les hydrogels PEGDA et CNT-GelMA. (B) Image de fluorescence F-actin/DAPI montrant les cardiomyocytes bien allongés et alignés sur le micromodèle hydrogel CNT-GelMA. (C-E) Images de fluorescence confocale montrant l’alignement des sarcoques et les structures sarcoques interconnectées sur le robot doux fabriqué : (C et D) cardiomyocytes cultivés sur le micromotif hydrogel CNT-GelMA, et (E) près des microélectrodes Au. (F) Tension de seuil d’excitation requise à différentes fréquences (0,5, 1,0 et 2,0 Hz) lors de l’application de la stimulation électrique par électrode de tige de carbone et microélectrodes Au intégrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
En utilisant cette méthode, nous avons été en mesure de fabriquer avec succès un robot chauve-souris bioinspiré bio-inspiré avec un tissu cardiaque intégré auto-actionnant sur un échafaudage structuré multicouche qui est contrôlé par des microélectrodes Au intégrées. En raison de deux couches d’hydrogel micropatternées distinctes faites d’hydrogels PEGDA et CNT-GelMA, l’échafaudage bioinspiré a montré une bonne stabilité mécanique et un alignement et une maturation idéales des cellules. La couche de motif PEGDA, qui sert de cartilage de l’architecture squelettique dans un rayon piqueur, fournit un soutien mécanique pour l’ensemble du corps du robot. Plus précisément, il a maintenu la stabilité mécanique pendant la contraction et la relaxation de tissu cardiaque, tout en permettant le battement efficace dû à sa capacité de libérer la tension de membrane suivant la contraction. De plus, l’épaisseur nanométrique des microélectrodes (200 nm), ainsi que leur motif serpentin, leur ont permis d’être suffisamment souples pour ne pas entraver ou influencer la contraction du tissu cardiaque (Figure 2). Pour transférer facilement les microélectrodes sur la surface de l’hydrogel sans aucune rupture, au-dessus des microélectrodes ont été fabriquées sur le verre sans aucune couche d’adhérence, telle que le titane, qui est couramment employé pour créer l’adhérence forte entre le verre et Au. Pendant ce temps, la couche CNT-GelMA, qui fournit un soutien pour l’attachement et l’alignement cardiomyocytes, a été faite avec des modèles perpendiculaires à l’orientation du modèle d’hydrogel PEGDA (Figure 3). Après maturation, les cardiomyocytes sur la couche supérieure ont fourni l’auto-actionnement pour l’ensemble de l’échafaudage. Grâce à la stimulation électrique locale des microélectrodes flexibles Au incorporées, nous avons pu moduler la fréquence de battement du robot sans endommager le tissu cardiaque sur lui. Bien que cette méthode de fabrication soit facile à apprendre et à reproduire, il y a encore quelques étapes techniquement difficiles dans le processus de fabrication qui doivent être soulignées.
Il y a cinq étapes critiques pour la fabrication du biorobot doux : 1) dispersion correcte des CNT dans l’hydrogel de GelMA ; 2) le crosslinking UV réussi des hydrogels DE PEGDA et de CNT-GelMA sur le verre TMSPMA-enduit ; 3) transfert des microélectrodes Au du verre de support au modèle d’hydrogel ; 4) détachement correct de l’actionneur de la glissière de verre de soutien; 5) création d’un bon contact électrique entre les microélectrodes Au et les fils utilisés pour la connexion au générateur de forme d’onde.
Par rapport aux substrats Vierges de GelMA, l’incorporation des CNT fournit à l’hydrogel gel de GelMA des propriétés mécaniques améliorées et des fonctions électrophysiologiques avancées qui contribuent à des taux de battement synchrones spontanés plus élevés et à un seuil d’excitation plus bas du tissu myocardique9. Le problème de la cytotoxicité cNT est évité non seulement en utilisant des CNT fonctionnalisés de surface, mais aussi en incorporant les nanostructures dans la matrice hydrogel GelMA jusqu’à une concentration de 5,0 mg/mL9. En fait, l’interaction entre les segments hydrophobes de l’hydrogel GelMA avec les parois latérales des CNT conduit à l’encapsulation des CNT dans la matrice poreuse d’hydrogel14. Cela les empêche non seulement de former des agrégats potentiellement toxiques, mais il améliore également la solubilité des CNT dans les solutions salines (p. ex., DPBS ou milieu de culture cellulaire).
Pour intégrer avec succès les microélectrodes Au entre les hydrogels PEGDA et CNT-GelMA, une attention particulière doit être accordée au lien croisé UV de chaque couche. Plus précisément, pour transférer les microélectrodes Au sur la couche d’hydrogel PEGDA, il est nécessaire de s’assurer que la solution hydrogel couvre toute la zone de l’électrode pour éviter la rupture des électrodes pendant l’étape d’épluchage. Par conséquent, la qualité du revêtement en verre TMSPMA est fondamentale pour garantir une adhérence optimale de l’hydrogel PEGDA sur le substrat de verre, empêchant ainsi son détachement lors de l’étape de transfert des microélectrodes.
Une autre étape critique de la méthode est le détachement du bioactuateur de la glissière de verre de soutien. Ce problème peut être facilement résolu lorsque le battement spontané des tissus cardiaques est synchrone et assez fort pour éplucher naturellement l’hydrogel de soutien de la glissière de verre. Pour cette raison, comme indiqué précédemment, il est fondamental d’optimiser les modèles d’hydrogel pour induire un alignement spécifique de cellules favorable à l’organisation d’un tissu cardiaque fonctionnel et synchrone.
Pour connecter électriquement les microélectrodes au générateur de forme d’onde, des connexions électriques doivent être créées sur les microélectrodes. Au cours de cette étape, il est important d’encapsuler complètement la colle argentée utilisée pour entrer en contact avec les microélectrodes au fil de cuivre pour éviter les effets cytotoxiques. Ceci est réalisé avec succès en déposant une mince goutte de PDMS sur le dessus du contact électrique.
Cette méthode pourrait non seulement surmonter les limites des techniques optogénétiques existantes, telles que des processus de fabrication compliqués, de longs temps de fabrication et la toxicité potentielle des outils optogénétiques, mais aussi améliorer fortement la performance des cellules actionneurs conduisant à une stimulation en temps réel en utilisant des techniques peu coûteuses et faciles à manipuler. Bien que la conception de nos actionneurs bioinspirés actuels ne pourrait pas générer la propulsion vers l’avant, son succès dans le domaine des robots cellulaires autonomes pourrait attirer beaucoup d’intérêt. Cette méthode peut également potentiellement contribuer au développement de patchs implantables sans fil pour tout un corps de robot. Cette méthode ouvre la voie à la stimulation électrique sans fil future des biorobots mous grâce à l’intégration de circuits RF flexibles directement dans l’échafaudage à base d’hydrogel.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce document a été financé par les National Institutes of Health (R01AR074234, R21EB026824, R01 AR073822-01), le Brigham Research Institute Stepping Strong Innovator Award et le AHA Innovative Project Award (19IPLOI34660079).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Beaker | PYREX | 1000-250CNEa | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Milipore | M6514 | |
| 37° Water bath | VWR | W6M | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | |
| 80° incubator | VWR | 1370GM | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Anti-Connexin 43/GJAI antibody | Abcam | ab11370 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Sarcomeric α-actinin | Abcam | ab9465 | Mouse monoclonal |
| Benchtop Freeze Dryers | Labconco | 77500-00 K | |
| Biosafety cabinet | Sterilgard | A/B3 | |
| Carbon rod electrodes | SGL Carbon Group | 6971105 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| CO2 incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Collagenase, Type II, Powder | Gibco | 17-101-015 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| COOH Functionalized Carbon Nanotubes | NanoLab | PD30L5-20-COOH | |
| Dicing saw machine | Giorgio Technology | DAD-321 | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11-965-118 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-144 | |
| E-beam evaporator | CHA | 57367 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10-437-028 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B, 300 bloom from porcine skin |
| Glass slide | VWR | 48382-180 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-079 | |
| Inverted optical microscope | Olympus | CK40 | |
| Magnetic hotplate | Corning | PC-420 | |
| methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276695 | Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor |
| Nunc EasYFlask 175cm2 | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| Olicscope | Siglent | SDS1052DL+ | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PDMS SYLGARD 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| Photomask | Mini micro stencil inc | ||
| Platinum wire | Alfa Aesar | AA43014BU | |
| Polyethylene glycol dimethcrylate | Polysciences Inc. | 15178-100 | |
| Regenerated Cellulose Dialysis Tubing | Fisherbrand | 21-152-14 | |
| Silver Epoxy Adhesive | MG Chemicals | 8330S | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | S2GPU02RE | |
| Ultra sonicator | Qsonica | Q500 | |
| UV Curing System | OmniCure | S2000 | |
| Vortex mixer | Scientific Industry | SI-0246A | |
| Waveform generator | Agilent | 33500B | |
| Wrap Aluminium foil | Reynolds | N/A |
References
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nature Biotechnology. 30 (8), 792-797 (2012).
- Park, S. J., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Laschi, C., et al. Soft Robot Arm Inspired by the Octopus. Advanced Robotics. 26 (7), 709-727 (2012).
- Alapan, Y., et al. Soft erythocyte-based bacterial microswimmers for cargo delivery. Science Robotics. 3 (17), 4423 (2018).
- Magdanz, V., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Development of a Sperm-Flagella Driven Micro-Bio-Robot. Advanced Materials. 25 (45), 6581-6588 (2013).
- Rus, D., Tolley, M. T. Design, fabrication and control of soft robots. Nature. 521 (7553), 467-475 (2015).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16 (18), 3473-3484 (2016).
- Shin, S. R., et al. Aligned Carbon Nanotube–Based Flexible Gel Substrates for Engineering Biohybrid Tissue Actuators. Advanced Functional Materials. 25 (28), 4486-4495 (2015).
- Shin, S. R., et al. Carbon-nanotube-embedded hydrogel sheets for engineering cardiac constructs and bioactuators. ACS Nano. 7 (3), 2369-2380 (2013).
- Shin, S. R., et al. Electrically Driven Microengineered Bioinspired Soft Robots. Advanced Materials. 30 (10), 1704189 (2018).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
- Jia, Z., et al. Stimulating cardiac muscle by light: cardiac optogenetics by cell delivery. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (5), 753-760 (2011).
- Shin, S. R. Carbon Nanotube Reinforced Hybrid Microgels as Scaffold Materials for Cell Encapsulation. ACS Nano. , (2013).
