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Bioengineering

शामिल माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ बायोप्रेरित सॉफ्ट रोबोट

Published: February 28, 2020 doi: 10.3791/60717
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1
1Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2School of Medicine, Jiangsu University, 3Tech4Health and Neuroscience Institutes, NYU Langone Health, 4Department of Electronics and Telecommunication, Politecnico di Torino

Summary

एक बायोप्रेरित पाड़ यांत्रिक रूप से मजबूत और विद्युत रूप से संचालित हाइड्रोगेल का उपयोग करके एक नरम फोटोलिथोग्राफी तकनीक द्वारा निर्मित है। माइक्रोपैटर्नयुक्त हाइड्रोगेल दिशात्मक कार्डियोमायोसाइट सेल संरेखण प्रदान करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक्शुअल डायरेक्शन होता है। लचीला माइक्रोइलेक्ट्रोड भी पाड़ में एकीकृत करने के लिए एक आत्म एक्चुएटिंग हृदय ऊतक के लिए बिजली की नियंत्रण क्षमता लाने के लिए कर रहे हैं ।

Abstract

जैव प्रेरित नरम रोबोट सिस्टम जो इंजीनियर मांसपेशियों के ऊतकों और बायोमैटेरियल्स का उपयोग करके जीवित जीवों की नकल करते हैं, वर्तमान बायोरोबोटिक्स प्रतिमान में क्रांतिकारी बदलाव कर रहे हैं, विशेष रूप से जैव चिकित्सा अनुसंधान में। कृत्रिम जीवन की तरह एक्टयूशन गतिशीलता को पुनः बनाने के एक नरम रोबोट प्रणाली के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, सटीक नियंत्रण और एक्ट्यूएशन व्यवहार की ट्यूनिंग अभी भी आधुनिक नरम रोबोट प्रणालियों की मुख्य चुनौतियों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है । यह विधि एक कम लागत, अत्यधिक स्केलेबल, और आसान ी से उपयोग करने की प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए जीवन की तरह आंदोलनों के साथ एक विद्युत नियंत्रणीय नरम रोबोट बनाने के लिए है कि सक्रिय और एक micropatterned स्टिंग पर हृदय मांसपेशी ऊतक के संकुचन से नियंत्रित है रे की तरह हाइड्रोजेल पाड़। सॉफ्ट फोटोलिथोग्राफी विधियों का उपयोग सॉफ्ट रोबोटिक सिस्टम में कई घटकों को सफलतापूर्वक एकीकृत करना संभव बनाता है, जिसमें कार्बन नैनोट्यूब (सीएनटी) एम्बेडेड जिलेटिन मेथाक्रिलोइल (सीएनटी-जेलमा) के साथ माइक्रोपैटर्न्ड हाइड्रोगेल आधारित मचान शामिल हैं, पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) डायक्रिलेट (पेगडा), लचीला सोना (एयू) माइक्रोइलेक्ट्रोड, और कार्डियक मांसपेशियों के ऊतक। विशेष रूप से, हाइड्रोगेल संरेखण और माइक्रोपैटर्न स्टिंग रे की मांसपेशियों और उपास्थि संरचना की नकल करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। विद्युत रूप से चालू सीएनटी-जेलमा हाइड्रोजेल एक सेल पाड़ के रूप में कार्य करता है जो कार्डियोमायोसाइट्स के परिपक्वता और संकुचन व्यवहार में सुधार करता है, जबकि यांत्रिक रूप से मजबूत पेगडा हाइड्रोगेल पूरे नरम रोबोट को संरचनात्मक उपास्थि की तरह समर्थन प्रदान करता है। धातु आधारित माइक्रोइलेक्ट्रोड की कठोर और भंगुर प्रकृति को दूर करने के लिए, हमने एक टेढ़ा पैटर्न तैयार किया जिसमें उच्च लचीलापन है और कार्डियोमायोसाइट्स की धड़कन गतिशीलता को बाधित करने से बच सकते हैं। शामिल लचीला Au माइक्रोइलेक्ट्रोड नरम रोबोट भर में विद्युत उत्तेजना प्रदान करते हैं, जिससे हृदय ऊतक के संकुचन व्यवहार को नियंत्रित करना आसान हो जाता है।

Introduction

आधुनिक अत्याधुनिक नरम रोबोट कई जीवित जीवों की पदानुक्रमित संरचनाओं और मांसपेशियों की गतिशीलता की नकल कर सकते हैं, जैसे जेलीफिश1,2,स्टिंग रे2,ऑक्टोपस3,बैक्टीरिया4,और शुक्राणु5। प्राकृतिक प्रणालियों की गतिशीलता और वास्तुकला की नकल करना ऊर्जावान और संरचनात्मक दक्षतादोनोंके संदर्भ में उच्च प्रदर्शन प्रदान करता है । यह आंतरिक रूप से प्राकृतिक ऊतक की नरम प्रकृति से संबंधित है (उदाहरण के लिए, त्वचा या मांसपेशियों के ऊतकों के साथ एक युवा के मॉड्यूलस के साथ 104−109 पीए) जो मानक इंजीनियर एक्टुएटर (जैसे, एक युवा के मॉड्यूलर आमतौर पर 109−1012 पीए)6के बीच की तुलना में स्वतंत्रता और बेहतर विरूपण और अनुकूलनशीलता की उच्च डिग्री के लिए अनुमति देता है। कार्डियक मांसपेशी आधारित सॉफ्ट-एक्टुएटर, विशेष रूप से, यांत्रिक रूप से आधारित रोबोटिक सिस्टम7की तुलना में ऑटोरिपेयर और पुनर्जनन के लिए उनकी क्षमता के कारण बेहतर ऊर्जा दक्षता दिखाते हैं। हालांकि, नरम रोबोटों का निर्माण एक प्रणाली में विभिन्न भौतिक, जैविक और यांत्रिक गुणों के साथ विभिन्न घटकों को एकीकृत करने की आवश्यकता के कारण चुनौतीपूर्ण है। उदाहरण के लिए, इंजीनियर सिंथेटिक सिस्टम को जीवित जैविक प्रणालियों के साथ एकीकृत करने की आवश्यकता है, न केवल उन्हें संरचनात्मक समर्थन प्रदान करना बल्कि उनके एकता व्यवहार को प्रभावित और मॉड्यूल करना भी है। इसके अलावा, कई माइक्रोफैब्रिकेशन विधियों में कठोर/साइटोटॉक्सिक प्रक्रियाओं और रसायनों की आवश्यकता होती है जो किसी भी जीवित घटकों की व्यवहार्यता और कार्य को कम करते हैं । इसलिए, नरम रोबोटों की कार्यक्षमता को बढ़ाने और उनके व्यवहार को नियंत्रित करने और मिलाना करने के लिए नए दृष्टिकोण आवश्यक हैं।

अच्छी व्यवहार्यता के साथ जीवित घटकों को सफलतापूर्वक एकीकृत करने के लिए, एक हाइड्रोगेल-आधारित पाड़ एक नरम रोबोट के शरीर को बनाने के लिए एक उत्कृष्ट सामग्री है। एक हाइड्रोगेल के भौतिक और यांत्रिक गुणों को मांसपेशियों के ऊतकों8,9जैसे जीवित घटकों के लिए माइक्रोवातावरण बनाने के लिए आसानी से ट्यून किया जा सकता है। इसके अलावा, यह विभिन्न माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों को आसानी से अपना सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च निष्ठा1,2,10के साथ पदानुक्रमित संरचनाओं का निर्माण होता है। बिजली की उत्तेजना के साथ अपने व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए लचीला इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों को नरम रोबोट में शामिल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोजेनिक कोशिकाओं (जैसे, कार्डियोमायोसाइट्स) को इंजीनियर करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक तकनीकों का उपयोग किया गया है, जो प्रकाश पर निर्भर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सक्रियण दिखाते हैं, का उपयोग एक पॉलीडिमिथाइलसिलिऑक्स्ना (पीडीएफ) विकसित करने के लिए किया गया है- प्रकाश द्वारा निर्देशित नरम रोबोटिक स्टिंग रे जो विट्रो2में मछली के अण्डलाक्षआंदोलन को फिर से बनाने में सक्षम था। यद्यपि ऑप्टोजेनेटिक तकनीकों ने उत्कृष्ट नियंत्रणता दिखाई है, प्रस्तुत किए गए कार्य विद्युत उत्तेजना, एक पारंपरिक और पारंपरिक सिमुलेशन विधि का उपयोग करता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि लचीला माइक्रोइलेक्ट्रोड के माध्यम से विद्युत उत्तेजना ऑप्टोजेनेटिक तकनीकों की तुलना में आसान और सरल है, जिसके लिए व्यापक विकास प्रक्रियाओं11की आवश्यकता होती है। लचीले इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों के उपयोग से दीर्घकालिक उत्तेजना और मानक/सरल निर्माण प्रक्रियाओं के साथ - साथ tunable बायोcompatibility और भौतिक और यांत्रिक गुण12,13के लिए अनुमति दे सकते हैं ।

यहां, हम एक बायोप्रेरित सॉफ्ट रोबोट बनाने के लिए एक अभिनव विधि पेश करते हैं, जो इंजीनियर कार्डियक मांसपेशियों के ऊतकों की धड़कन से प्रेरित होता है और एम्बेडेड फ्लेक्सिबल एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड के माध्यम से विद्युत उत्तेजना द्वारा नियंत्रित होता है। नरम रोबोट स्टिंग रे की मांसपेशी और उपास्थि संरचना की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। स्टिंग रे एक जीव है जिसमें अन्य तैराकी प्रजातियों की तुलना में संरचना और आंदोलन की नकल करने में अपेक्षाकृत आसान है। मांसपेशियों को एक विद्युत रूप से चालक हाइड्रोगेल माइक्रोपैटर्न पर कार्डियोमाइओसाइट्स को सीडिंग करके विट्रो में निर्मित किया जाता है। जैसा कि पहले बताया गया था, जेल्मा हाइड्रोगेल में सीएनटी जैसे विद्युत रूप से चालक नैनोकणों को शामिल करना न केवल हृदय ऊतक के विद्युत युग्मन में सुधार करता है, बल्कि एक उत्कृष्ट इन विट्रो ऊतक वास्तुकला और व्यवस्था8,9को भी प्रेरित करता है। उपास्थि जोड़ों को यांत्रिक रूप से मजबूत पेगडा हाइड्रोजेल पैटर्न का उपयोग करके नकल की जाती है जो पूरी प्रणाली के यांत्रिक रूप से मजबूत सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है। एक टेढ़ा पैटर्न के साथ लचीला Au माइक्रोइलेक्ट्रोड स्थानीय रूप से और विद्युत रूप से हृदय ऊतक को प्रोत्साहित करने के लिए PEGDA पैटर्न में एम्बेडेड हैं।

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Protocol

यह अध्ययन राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों की प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के अनुसार सख्ती से किया गया था । इस प्रोटोकॉल को ब्रिघम और महिला अस्पताल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसयूसी) ने मंजूरी दी थी ।

1. जेल्मा संश्लेषण

  1. 50 डिग्री सेल्सियस पर चुंबकीय उभारा का उपयोग करके डुल्बेकको के फॉस्फेट-बफर्ड लवण (डीपीबीएस) के 100 मिलीग्राम में 10 ग्राम जिलेटिन भंग करें।
  2. 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर जिलेटिन प्रीपॉलिमर समाधान सरगर्मी करते हुए धीरे-धीरे मेथेक्रेलिक एंहाइड्राइड के 8 मिलील जोड़ें। 50 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीटेड डीपीबीएस के साथ प्रतिक्रिया प्राप्त जिलेटिन समाधान को पतला करें।
  3. पतला समाधान को डायलिसिस झिल्ली (आणविक वजन कटऑफ = 12-14 केडीए) में स्थानांतरित करें और उन्हें डिओनाइज्ड (डीआई) पानी में रखें। करीब 1 सप्ताह तक 40 डिग्री सेल्सियस पर डायलिसिस करें।
  4. एक बाँझ फिल्टर (पोर आकार = 0.22 माइक्रोन) का उपयोग करके डायलिसि जेल्मा प्रीपॉलिमर समाधान को फ़िल्टर करें और समाधान के 25 या 30 मिलील को 50 मिलीग्राम ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 2 दिनों के लिए - 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. फ्रीज-5 दिनों के लिए एक फ्रीज ड्रायर का उपयोग कर जमे हुए GelMA prepolymer समाधान सूखी ।

2. पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) डायक्रिलेट (PEGDA) प्रीपॉलिमर समाधान की तैयारी

  1. डीपीबीएस के 1 मिलील में 2-हाइड्रोक्सी-4-(2-हाइड्रोक्सिएथॉक्सी) के 5 मिलीग्राम (कुल समाधान का 0.5%) के साथ पेगडा (मेगावाट = 1,000) के 200 मिलीग्राम (कुल समाधान का 20%) भंग करें।
  2. 5 मिन के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर प्रीपॉलिमर समाधान को इनक्यूबेट करलें।

3. जेलमा-लेपित सीएनटी फैलाया स्टॉक समाधान की तैयारी

  1. डीपीबीएस के 4 मिलील में 80 मिलीग्राम जेलमा (बायोसर्फेक्टेंट के रूप में उपयोग किया जाता है) को भंग करें और फिर गेलमा प्रीपॉलिमर समाधान में 20 मिलीग्राम सीओओएच कार्यात्मक कार्बन नैनोट्यूब (एमडब्ल्यूसीएएनटी) जोड़ें।
  2. 1 घंटे (0.66Hz, 100 वाट) के लिए MWCNT-लादेन GelMA प्रीपॉलिमर समाधान काकेट करें।
    नोट: ध्वनि प्रक्रिया के दौरान, तापमान में वृद्धि के कारण सॉल्वेंट के वाष्पीकरण को रोकने के लिए समाधान को ~ 15 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में डुबोया जाना चाहिए।

4. 1 मिलीग्राम/mL सीएनटी की तैयारी जिसमें 5% जेलमा प्रीपॉलिमर समाधान होता है

  1. 10 मीटर के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर डीपीबीएस के 0.8 मिलीग्राम में पीआई के 50 मिलीग्राम और पीआई के 5 मिलीग्राम (कुल समाधान का 0.5%) भंग करें।
  2. तैयार सीएनटी स्टॉक सॉल्यूशन (स्टेप 3) का 0.2 मिलील जोड़ें। भंवर और 10 मिन के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर समाधान इनक्यूबेट।

5. 3-(ट्राइमेथॉक्सीसिलल) प्रोफिल मेथेक्रिलेट (टीएमएसपीएमए) कोटेड ग्लास स्लाइड की तैयारी

  1. शुद्ध इथेनॉल के साथ कांच की स्लाइड (मोटाई = 1 मिमी, आकार = 5.08 सेमी x 7.62 सेमी) धोएं।
  2. एक 250 मिलीकर में खड़ी साफ स्लाइड ढेर और उनमें से शीर्ष पर TMSPMA के 3 mL फैल एक सिरिंज का उपयोग कर। टीएमएसपीएमए के वाष्पीकरण को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बीकर को कवर करें।
  3. स्लाइड्स में 1 दिन के लिए 80 डिग्री सेल्सियस ओवन।
  4. कोपित ग्लास स्लाइड को शुद्ध इथेनॉल में डुबोकर धोएं, फिर सूख जाएं।
  5. कमरे के तापमान (आरटी) पर एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे कोटेड ग्लास स्लाइड स्टोर करें।
    नोट: TMSPMA-लेपित ग्लास स्लाइड की सतहों को छूने को कम करने की कोशिश करें।

6. लचीला Au माइक्रोइलेक्ट्रोड का निर्माण

  1. कंप्यूटर-एडेड डिजाइन(सप्लीमेंट्री फाइल 3)का उपयोग करके छाया मुखौटा डिजाइन करें।
  2. एक छाया मुखौटा बनाना और खरीदते हैं।
  3. ग्लास स्लाइड (मोटाई = 1 मिमी, आकार = 3 सेमी x 4 सेमी) को एसीटोन के साथ धोएं और एक संकुचित हवा बंदूक के साथ सूखें।
  4. डबल तरफा टेप का उपयोग करके ग्लास सब्सट्रेट्स के लिए छाया मुखौटा संलग्न करें, फिर उन्हें ई-बीम वाष्पीकरण में रखें और तब तक इंतजार करें जब तक कि कक्ष दबाव कम से कम10-6 टोर तक न पहुंच जाए।
    नोट: टेप के दो टुकड़ों को ग्लास की मेजबानी करने के लिए पर्याप्त दूरी पर समर्थन पर मैन्युअल रूप से रखा गया था और पूरे पैटर्न को फिट करने के लिए काफी बड़ा था। यह कदम 45-60 मिन के आसपास लेता है।
  5. ई-बीम वाष्पीकरण द्वारा 200 एनएम मोटी एयू लेयर जमा करें (उदाहरण के लिए, डेंटन ईई-4 के साथ, वैक्यूम = 10-6 टोर, पावर = 2.6%, दर = 2 Å/s) और एक डिडिंग सॉ मशीन (इलेक्ट्रोड आकार = 7.38 मिमी x 8.9 मिमी x 200 एनएम) का उपयोग करके निर्मित माइक्रोइलेक्ट्रोड में कटौती करें।

7. एक Au माइक्रोइलेक्ट्रोड-एकीकृत माइक्रोपैटर्नेड मल्टीलेयर्ड हाइड्रोगेल पाड़ का निर्माण

नोट: इस प्रक्रिया का परिणाम एक झिल्ली है जहां एक माइक्रोपैटर्नेड पेगडा हाइड्रोजेल नीचे की परत में है, एक माइक्रोपैटर्नेड सीएनटी-जेलमा हाइड्रोजेल शीर्ष पर है, और एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड दो परतों के बीच हैं। यह विन्यास इलेक्ट्रोड के लिए एक बेहतर लचीलापन सुनिश्चित करता है और तोड़ने के जोखिम को सीमित करता है।

  1. माइक्रोपैटर्नेड पेगडा (1सेंट फोटोमास्क) और सीएनटी-जेल्मा हाइड्रोगेल (2एनडी फोटोमास्क) परतें बनाने के लिए दो फोटोमास्क डिजाइन और फैब्रिकेट करें। पूरक फाइल 2-3देखें । सीएडी सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल कर डिजाइन किया जा सकता है।
    नोट: देखें आंकड़ा 2बी, ई।
  2. एक TMSPMA कोटेड ग्लास पर वाणिज्यिक अदृश्य टेप (मोटाई: 50 μm) की एक परत स्टैकिंग द्वारा बनाए गए 50 माइक्रोन स्पेसर रखें। टीएमएसपीएमए कोटेड ग्लास के शीर्ष पर 20% पेगडा प्रीपॉलिमर समाधान के 15 माइक्रोन डालें, फिर गोल्ड माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ कवर करें। सोने के माइक्रोइलेक्ट्रोड के शीर्ष पर ग्लास स्लाइड (माइक्रोपैटर्नेड पेगडीए) के लिए पहला फोटोमास्क रखें और पूरे निर्माण को यूवी लाइट (320-390 एनएम फिल्टर के साथ 200 डब्ल्यू पारा वाष्प शॉर्ट आर्क लैंप) को 800 मीटर तीव्रता और 110 एस के लिए 8 सेमी दूरी पर बेनकाब करें।
    नोट: देखें आंकड़ा 1ए।
  3. ग्लास स्लाइड को घेरने के लिए डीपीबीएस जोड़ें और माइक्रोपैटर्नवाले पेगडा हाइड्रोगेल को 5-10 मिनट के बाद ध्यान से 5-10 मिनट के बाद एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ अलग करें जिसमें एयू के साथ माइक्रोपैटर्नेड पेगडा हाइड्रोगेल है माइक्रोइलेक्ट्रोड।
    नोट: देखें चित्र 1बी। टीएमएसपीएमए कोटिंग के कारण, निर्माण अनकोटेड ग्लास सब्सट्रेट से टीएमएसपीएमए-कोटेड कोटेड में स्थानांतरित किया जाता है। ध्यान से अलग क्योंकि Au माइक्रोइलेक्ट्रोड इस कदम के दौरान आसानी से तोड़ सकते हैं(चित्रा 3)।
  4. पेट्री डिश के नीचे वाणिज्यिक पारदर्शी टेप (मोटाई = 50 माइक्रोन) की दो परतों को स्टैकिंग करके बनाए गए 100 माइक्रोन स्पेसर रखें। स्पेसर्स के बीच 20 माइक्रोन सीएनटी-जेलमा प्रीपॉलिमर समाधान की एक बूंद जमा करें और फिर 7.3 में प्राप्त ग्लास स्लाइड को फ्लिप करें और इसे चिपकने वाले टेप के साथ डिश पर ठीक करें।
  5. डिवाइस को उल्टा घुमाएं और ग्लास स्लाइड के ऊपर 2nd फोटोमास्क रखें। तीव्रता के 800 मीटर और 200 एस के लिए 8 सेमी दूरी पर यूवी प्रकाश के तहत बेनकाब करें।
    नोट: देखें चित्र 1सी। 2 मुखौटा का संरेखण महत्वपूर्ण है।
  6. प्राप्त पाड़ को डीपीबीएस के साथ धोएं और सेल कल्चर मीडियम के साथ जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) शामिल है।
  7. कोशिकाओं को बोने से पहले उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर छोड़ दें।

8. नवजात चूहा कार्डियोमायोसाइट्स अलगाव और संस्कृति

  1. एनिमल केयर8पर संस्थान की समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के बाद 2 दिन पुराने स्प्राग-डाले चूहों से दिलों को अलग करें ।
  2. एक ठंडे कमरे में एचबीएस में EDTA के बिना 0.05% ट्रिप्सिन में रात भर (लगभग 16 घंटे) शेकर पर दिल के टुकड़े रखो।
  3. एक पिपेट बंदूक के साथ दिल के टुकड़े ले लीजिए और ट्रिप्सिन की मात्रा को कम करें, फिर उन्हें गर्म कार्डियक मीडिया (10% एफबीएस, 1% पी/एस, 1% एल-ग्लूटामाइन) के 10 एमएल के साथ 50 एमएल ट्यूब में रखें।
  4. 7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में धीरे-धीरे (~ 60 आरपीएम) भंवर करें। 10 मीटर पाइपेट के साथ ट्यूब से मीडिया को ध्यान से निकालें और दिल के टुकड़ों को ट्यूब में छोड़ दें।
  5. एचबीएसएसएस में 01% कोलेजेनेज टाइप 2 का 7 एल जोड़ें और 10 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में भंवर करें।
  6. दिल के टुकड़ों को बाधित करने के लिए धीरे से 10 mL पिपेट 10x के साथ मिलाएं। एक 1 mL पिपेट के साथ ट्यूब से मीडिया निकालें।
  7. एचबीएसएस में 0.1% कोलेजेनेज टाइप 2 का 10 एमएल जोड़ें और 10 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में जल्दी से (~ 120-180 आरपीएम) घूमता है, फिर जांच ें कि दिल के टुकड़े भंग हो रहे हैं या नहीं।
  8. 10 mL पिपेट के साथ मिलाएं, फिर पिछले दिल के टुकड़ों को तोड़ने के लिए 1 एमएल पिपेट के साथ दोहराएं।
  9. एक बार समाधान सजातीय दिखता है, एक नया 50 मीटर ट्यूब पर एक 70 माइक्रोन सेल छलनी रखें और छलनी पर एक समय में समाधान 1 mL को पिलेट करें।
  10. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 180 x ग्राम पर दिल की कोशिका समाधान को सेंट्रलाइज करें।
    नोट: यदि अभी भी कुछ दिल के टुकड़े या बलगम हैं जो भंग नहीं हुए हैं, तो 8.7-8.9 कदम फिर से दोहराएं।
  11. सावधानी से सेल गोली के ऊपर सभी तरल को हटा दें और कार्डियक मीडिया के 2 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दें।
  12. कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने और उन्हें तोड़ने से बचने के लिए ट्यूब की दीवार से कार्डियक मीडिया के 2 मिलील को ध्यान से जोड़ें।
  13. निलंबित कोशिकाओं को ड्रॉप द्वारा गर्म हृदय मीडिया ड्रॉप के साथ एक T175 फ्लास्क में जोड़ें। कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट को नीचे से अटैच करने की अनुमति देने के लिए फ्लास्क को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: इस प्रीप्लेटिंग कदम पर, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट फ्लास्क से जुड़ा होगा जबकि कार्डियोमायोसाइट्स निलंबन माध्यम में रहेंगे।
  14. कुप्पी से मीडिया को लीजिए जिसमें कार्डियोमायोसाइट्स होते हैं और इसे 50 मिलीट्यूब में डाल देते हैं।
  15. कोशिकाओं की गणना करें, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 260 x ग्राम पर अपकेंद्री।
  16. 7 चरण में निर्मित नरम रोबोट के शीर्ष पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित और बीज करें। डिवाइस की पूरी सतह पर ड्रॉप करके 1.95 × 106 सेल/एमएल ड्रॉप की एकाग्रता पर कार्डियोमायोसाइट्स के साथ कार्डियक मीडिया की विशिष्ट मात्रा डालें।
  17. नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और सीडिंग के बाद पहले और दूसरे दिन 2% एफबीएस और 1% एल-ग्लूटामाइन के साथ 5 एमएएल सेल कल्चर मीडिया के साथ मीडिया को बदल ें। मीडिया का रंग बदलें हर बार मीडिया का रंग शिफ्ट हो जाता है।

9. संरेखण विश्लेषण के लिए सेल धुंधला

  1. मीडिया को हटादें और आरटी में 5 मिन के लिए डीपीबीएस से धोलें।
  2. आरटी में 20 मिन के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का उपयोग करके कोशिकाओं को ठीक करें। इसके बाद आरटी में 5 मिन के लिए डीपीबीएस से धो लें।
  3. आरटी में 1 एच के लिए डीबीएस में ०.१% ट्राइटन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें । आरटी में 5 मिन के लिए पीबीएस के साथ 3x धोएं ।
  4. 1 घंटे के लिए आरटी में डीपीबीएस में 10% बकरी सीरम के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. डीपीबीएस में 10% बकरी सीरम में ~ 14-16 घंटे के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी (सरकोरिक α-actinin और connexin-43) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. आरटी में 5 मिन के लिए डीपीबीएस के साथ 3x धोएं। 1 घंटे के लिए आरटी में डीपीबीएस में 10% बकरी सीरम में सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  7. आरटी में 5 मिन के लिए डीपीबीएस के साथ 3x धोएं, फिर आरटी में 5 मिन के लिए डीपीबीएस के साथ 3x धोएं, फिर डीआई वॉटर (1:1,000) में 4',6-डिमिडिनो-2-फेनिलिंडॉल (डीपीआई) के साथ काउंटरदाग कोशिकाएं।
  8. उल्टे लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरेसेंस छवियां लें।

10. एक्टूएटर परीक्षण और व्यवहार मूल्यांकन

  1. नरम रोबोट पर कार्डियोमायोसाइट्स की सहज पिटाई
    1. इनक्यूबेट बायोप्रेरित एक्टुएटर 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर और 1 और 2 दिन मीडिया को ताज़ा करें और जब आवश्यक हो (यानी, जब मीडिया पीला हो जाता है)। दैनिक छवियों (5x और/या 10x) लेने के लिए एक उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें । रिकॉर्ड सेल आंदोलनों 30 के लिए माइक्रोस्कोप लाइव विंडो पर वीडियो कैप्चर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 20 फ्रेम प्रति सेकंड (5x और/या 10x) पर जब संकुचन गतिविधि शुरू होता है (आम तौर पर 3 दिन के आसपास) ।
    2. 5 दिन में, एक कवर स्लाइड के साथ किनारे से धीरे से उठाने के द्वारा झिल्ली अलग ।
      नोट: यदि कोशिकाएं एक मजबूत पिटाई व्यवहार दिखाती हैं, तो संकुचन की यांत्रिक कार्रवाई के कारण झिल्ली खुद से अलग हो जाएगी।
  2. थोक विद्युत संकेत उत्तेजना
    1. एक धारक के रूप में एक 3 सेमी दूरी PDMS का उपयोग करना, एक 6 सेमी पेट्री कार्ड में प्लेटिनम (पीटी) तार के साथ दो कार्बन रॉड इलेक्ट्रोड प्रत्यय हृदय मीडिया से भरा । फिर नरम रोबोट को पेट्री डिश में सावधानी से स्थानांतरित करें।
    2. 50 एमएस पल्स चौड़ाई, डीसी ऑफसेट वैल्यू 0 वी और 0.5 और 6 वी के बीच पीक वोल्टेज आयाम के साथ एक वर्ग तरंग लागू करें। आवृत्ति क्रमशः 2.5%, 5%और 10% के बीच ड्यूटी चक्र के साथ 0.5, 1.0 और 2.0 हर्ट्ज के बीच भिन्न होती है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कैमरे का उपयोग करके मैक्रोस्केल संकुचन रिकॉर्ड करें।
  3. Au माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ विद्युत उत्तेजना
    1. Au माइक्रोइलेक्ट्रोड-एकीकृत बहुस्तरीय हाइड्रोगेल पाड़ के निर्माण के बाद, चांदी के पेस्ट का उपयोग करके एक बाहरी वर्ग बंदरगाह हालांकि एयू इलेक्ट्रोड के लिए दो तांबे के तार संलग्न करते हैं।
    2. 5 मिन के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर प्रीईक्योर ्डी पछाज के साथ सिल्वर पेस्ट को कवर करें। इसके बाद 5 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर सैंपल डालकर पूरी तरह से पीडीएम को क्रॉसलिंक करें।
    3. कार्डियोमायोसाइट को सीडिंग करने के बाद, डीसी ऑफसेट वैल्यू 1 वी, 1.5 और 5 वी के बीच पीक वोल्टेज आयाम, और क्रमशः 0.5, 1.0 और 2.0 हर्ट्ज की आवृत्तियों के साथ तांबे के तारों पर एक वर्ग तरंग विद्युत प्रोत्साहन लागू करें।

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Representative Results

Au माइक्रोइलेक्ट्रोड-शामिल बायोप्रेरित सॉफ्ट रोबोट के विकास के लिए चरणों का प्रवाह आरेख
नरम रोबोट डिजाइन का उद्देश्य न्यूनतम जटिलता के साथ तैराकी आंदोलन को चालू करने में सक्षम झिल्ली का निर्माण करना था। संरचना समय (लगभग 1 हर्ट्ज) के साथ बार-बार मजबूत फ्लेक्स को बनाए रखने में सक्षम होनी चाहिए और एक मजबूत पिटाई प्राप्त करते हुए इसके आकार को बनाए रखने में सक्षम होना चाहिए। फोटोमास्क का उपयोग करके बहुलक को क्रॉसलिंक करके, हमने एक पदानुक्रमित संरचित पाड़ बनाया जिसमें एक माइक्रोपैटर्नेड पेगडा हाइड्रोगेल परत, एक लचीला Au माइक्रोइलेक्ट्रोड परत, और एक माइक्रोपैटर्नेड सीएनटी-जेलमा हाइड्रोगेल परत शामिल है। प्रोटोकॉल में वर्णित नरम रोबोट की निर्माण प्रक्रिया की एक योजनाबद्ध आरेख और वास्तविक छवियां चित्र 1में दिखाई जाती हैं। संक्षेप में, एम्बेडेड एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ बायोप्रेरित सॉफ्ट रोबोट के लिए तीन मुख्य निर्माण कदम थे: सबसे पहले, 1 फोटोमास्क(चित्रा 1ए, बी)का उपयोग करके यूवी क्रॉसलिंकिंग द्वारा एक माइक्रोपैटर्नेड पेगडा हाइड्रोगेल प्राप्त किया गया था। दूसरा, एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड, माइक्रोपैटर्नेड सीएनटी-गेलमा से बना एक बहुस्तरीय निर्माण, और पेगडा हाइड्रोगेल को 2 फोटोमास्क(चित्रा 1सी)का उपयोग करके यूवी क्रॉसलिंकिंग द्वारा निर्मित किया गया था। अंत में, सॉफ्ट रोबोट(चित्रा 1डी)को एक्ट्युएशन प्रदान करने के लिए गढ़े गए तीन-परत निर्माण पर कार्डियोमायोसाइट्स को वरीयता दी गई थी।

नरम रोबोट के विभिन्न डिजाइन
नरम रोबोट के आकार के बारे में, शुरुआत में, हमने दो अलग-अलग जलीय जानवरों के पैटर्न को बायोमिमिक करके दो बायोप्रेरित आकार तैयार किए। पहला डिजाइन एक कैरिबिक स्टारफिश(चित्रा 2ए, बी, सी)की उपस्थिति से प्रेरित था, क्योंकि स्टारफिश को दो-आयामी (2डी) वस्तु में सरल बनाया जा सकता है, एक कठिन रीढ़ की हड्डी है, और इसमें एक लचीला हिस्सा है जो पानी में स्थानांतरित होने के लिए एक साथ जुड़ता है, आवश्यक आंदोलन को कम करता है। दूसरा डिवाइस एक मंता रे(चित्रा 2डी, ई, एफ)के आकार पर आधारित था जो 2डी डिवाइस में पुन: पेश करना आसान है। मंता रे अद्वितीय आंदोलनों का उपयोग करजल्दी तैर सकता है। हमने फोटोमास्क स्टेप के दौरान क्रॉसलिंक होने की कम जटिलता के साथ बेसिक ज्यामितीय आकृतियों का उपयोग करके मंता रे को स्केच किया। इलेक्ट्रोड, संरचना के मिडलाइन के साथ रखा गया था, एक लहराती पैटर्न के साथ डिजाइन किया गया था, बिजली की दालों और लचीलेपन के बेहतर प्रसार के लिए अनुमति(चित्रा 2डी)। बायोप्रेरित सॉफ्ट रोबोट को विकसित करने के लिए, मंता रे-प्रेरित आकार का चयन किया गया था और इस अध्ययन में अच्छी तरह से परीक्षण किया गया था।

सीएनटी-जेलमा और पेगडा हाइड्रोगेल के बीच एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड को एम्बेड करने की चुनौती
गढ़े रोबोट शरीर में 200 एनएम मोटी Au माइक्रोइलेक्ट्रोड का एनकैप्सुलेशन स्थानीय रूप से विद्युत उत्तेजना प्रदान करके निर्माण को नियंत्रित कर सकता है। हालांकि इलेक्ट्रोड सतह पर सीधे सीएनटी-गेल्मा और पेगडा हाइड्रोगेल पैटर्न दोनों की यूवी क्रॉसलिंकिंग ने इलेक्ट्रोड के डेलामिनेशन को बाधित किया, लेकिन इसने नरम रोबोट में इलेक्ट्रोड के सफल समावेश की गारंटी दी। हालांकि, पेगडा हाइड्रोगेल पर एयू इलेक्ट्रोड स्थानांतरित करने के बाद, पेगडा हाइड्रोगेल(चित्रा 3ए, बी, सी)की सूजन के कारण निर्माण प्रक्रिया के दौरान आयताकार आकार और चौड़ी चौड़ाई (>1 मिमी) के साथ एयू इलेक्ट्रोड आसानी से टूट गया था। इसलिए, हमें यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता थी कि माइक्रोइलेक्ट्रोड को सफलतापूर्वक पेगडा हाइड्रोगेल में स्थानांतरित कर दिया गया था और सीएनटी-गेल्मा और पेगडा हाइड्रोगेल के बीच एम्बेडेड किया गया था, जबकि बरकरार है। इसलिए, टेढ़ा पैटर्न (मोटाई = 200 माइक्रोन) के साथ एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड को डिजाइन किया गया था और नरम लिथोग्राफी के साथ गढ़ा गया था। माइक्रोपैटर्नेड पेगडा हाइड्रोगेल(चित्रा 3डी, ई, एफ)पर परिवहन के बाद इलेक्ट्रोड पर फ्रैक्चर के संकेतों का निरीक्षण करने के लिए विभिन्न आवर्धन और चरणों के साथ चरण विपरीत माइक्रोस्कोप चित्र लिए गए थे।

हाइड्रोगेल माइक्रोपैटर्न के बीच अंतर का अनुकूलन
कार्डियोमायोसाइट वरीयता प्राप्त सीएनटी-जेल्मा परत पैटर्न दूरी के अनुसार अलग-अलग धड़कन व्यवहार दिखाया गया(चित्र4ए, बी)। यह लाइनों की दूरी के आधार पर झिल्ली की सतह से जुड़ी विभिन्न तरीकों से कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। 50 माइक्रोन दूरी के मामले में, कोशिकाएं बहुत पैक थीं और वांछित संगठित विन्यास नहीं था। आंशिक रूप से जुड़े और पंखों पर गठबंधन कोशिकाओं सभी एक साथ तैराकी आंदोलन के लिए योगदान नहीं कर रहे थे । इसलिए, कार्डियोमायोसाइट द्वारा उत्पन्न बल पंखों को मोड़ने के लिए पर्याप्त नहीं था। 150 माइक्रोन दूरी पर, कोशिकाओं को बहुत अच्छी तरह से गठबंधन किया गया। हालांकि, वे मुख्य रूप से नाली में बैठे थे और ऊपरी परतों में कोशिकाओं के बीच कुछ इंटरकनेक्शन थे, जिसके परिणामस्वरूप कमजोर धड़कन हुई। एक 75 μm दूरी पर, कोशिकाओं को नीचे भाग में गठबंधन किया गया और ऊपरी हिस्से में परस्पर, सबसे मजबूत मार दिखा। इसके अलावा, कार्डियोमायोसाइट्स की गतिशील पिटाई के दौरान नरम रोबोट के अपरिवर्तनीय पूर्ण रोलिंग को रोकने के लिए, हमने पेगडा हाइड्रोगेल समर्थन परत के पैटर्न को 300 माइक्रोन(चित्रा 4सी)तक अनुकूलित किया। अंत में, इस पैरामीटरेशन प्रक्रिया के बाद, हमने 300 माइक्रोन दूरी पेगडा पैटर्न और 75 माइक्रोन दूरी सीएनटी-जेल्मा पैटर्न के साथ मंता रे के आकार की झिल्ली पर अधिक ध्यान केंद्रित करने का फैसला किया। माइक्रोपैटर्नेड पेगडा और सीएनटी-जेल्मा पैटर्न पर कार्डियक टिश्यू को फेज/कंट्रास्ट इमेजेज और एफ-ऐक्टिन/डीएपीआई कॉन्फोकल इमेजेज(फिगर 4बी)ने भी दिखाया था ।

माइक्रोपैटर्नेड पेगडा- और सीएनटी-जेल्मा हाइड्रोगेल पर हृदय ऊतक के आंदोलन का विश्लेषण
एक्ट्यूएटर के आंदोलन का विश्लेषण करने के लिए, हमने कार्बन रॉड इलेक्ट्रोड का उपयोग करके बिजली के क्षेत्र को लागू करते समय एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड के बिना झिल्ली के वीडियो लिए। चित्रा 4डी संकुचन रिकॉर्ड से लिए गए कुछ फ्रेम दिखाता है। यह स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा था कि मंता रे के आकार का एक्टुएटर उम्मीद के मुताबिक पंखों को झुका रहा था। पूंछ थोड़ा सीधा करके संरचना को संतुलित कर रही थी और पंख बीच में मजबूती से बंद हो रहे थे। कुछ झिल्ली ने गलत रूप से माइक्रोपैटर्नेड सीएनटी-गेलमा और पेगडा हाइड्रोगेल(चित्रा 4ई और वीडियो 1)के कारण करार करते हुए घूर्णन आंदोलन दिखाया। इस मामले में, आंदोलन को पिछले एक की तुलना में कम परिभाषित किया गया था लेकिन संकुचन अभी भी घूर्णन आंदोलन के संकरण की अनुमति देने के लिए काफी मजबूत था। एक पूरे सर्कल को पूरा करने के लिए कुल समय 45 एस के आसपास था।

बहुस्तरीय नरम रोबोट पर कार्डियोमायोसाइट्स का लक्षण वर्णन और विद्युत उत्तेजना द्वारा व्यवहार को मात देने का नियंत्रण
बायोप्रेरित रोबोटिक सिस्टम(चित्रा 5ए)पर कार्डियोमायोसाइट्स की सीडिंग और परिपक्वता के बाद, सीएनटी-जेल्मा पैटर्न की दिशा में हृदय ऊतक का संरेखण(चित्रा 5बी-ई)एफ-ऐक्टिन/डीपीआई और सैकेरोमिक/कोनेक्सिन-43/डीपीआई इम्यूनोस्टेनिंग दोनों द्वारा देखा गया था । कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस छवियों ने सीएनटी-जेलमा हाइड्रोगेल पैटर्न(चित्र 5बी, सी)पर अच्छी तरह से विस्तारित और गठबंधन कार्डियोमायोसाइट्स दिखाया। पैटर्न वाले क्षेत्रों(चित्रा 5डी)पर आंशिक यूनिक्सियल सरकोरे संरेखण और परस्पर सरकोरे संरचना देखी गई। माइक्रोइलेक्ट्रोड के ऊपर सीधे स्थित हृदय ऊतकों की अच्छी तरह से परस्पर सरकोरे संरचनाएं भी देखी गईं(चित्र5ई)। बायोप्रेरित सॉफ्ट रोबोट का आकलन करने के लिए, हमने दो तरीकों का उपयोग करके अपने कार्य का पता लगाया: सबसे पहले, हमने नरम रोबोट के लिए एक बिफासिक इलेक्ट्रिकल पल्स लागू किया, हालांकि कृत्रिम ट्यूनिंग के लिए कार्बन रॉड इलेक्ट्रोड और पिटाई व्यवहार को नियंत्रित करते हैं। दूसरा, हम पूरे रोबोट निर्माण के माध्यम से एक बिजली के संकेत पैदा करने के लिए Au इलेक्ट्रोड के सबसे बाहरी छोर के लिए दो तांबे के तारों से जुड़े । जब हमने एयू इलेक्ट्रोड से जुड़े बाहरी कार्बन इलेक्ट्रोड या तांबे के तार के माध्यम से विद्युत उत्तेजना लागू की, तो उत्तेजना सीमा वोल्टेज विभिन्न आवृत्तियों (0.5, 1.0 और 2.0 हर्ट्ज, चित्रा 5एफ)पर अलग था।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध आरेख और वास्तविक छवियां जो लचीले Au माइक्रोइलेक्ट्रोड के एकीकरण के माध्यम से विद्युत संकेत द्वारा विद्युत रूप से नियंत्रित जैव प्रेरित बहुस्तरीय सॉफ्ट रोबोट की निर्माण प्रक्रिया को दर्शाती हैं। (ए)1सेंट फोटोमास्क का उपयोग करके पेगडा हाइड्रोजेल की पैटर्निंग और क्रॉसलिंकिंग। (ख)स्टेप(ए)के बाद प्राप्त टीएमएसपीएमए ग्लास पर एनकैप्सुलेटेड एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ माइक्रोपैटर्नेड पेगडा हाइड्रोजेल । (C)2फोटोमास्क का उपयोग करके सीएनटी-जेल्मा पैटर्न वाले हाइड्रोजेल को क्रॉसलिंक करना। (D)बहुस्तरीय निर्माण पर कार्डियोमाइओसाइट्स की सीडिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बायोप्रेरित सॉफ्ट रोबोट का डिजाइन। (A)असली स्टारफिश चित्र और त्रि-आयामी (3 डी) सीएडी मॉडल के विभिन्न विचार घटकों और धारियों को इंगित करते हैं। (ख)स्टारफिश आकार के लिए सीएनटी-जेल्मा पैटर्न, पेगडा पैटर्न और एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड के लिए मास्क डिजाइन। (ग)स्टारफिश आकार के लिए माइक्रोपैटर्नेड सीएनटी-जेलमा और पेगडा पैटर्न की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि। (D)असली मंता रे चित्र और घटकों की ओर इशारा करते हुए 3 डी सीएडी मॉडल के विभिन्न विचार। (ई)सीएनटी-जेल्मा पैटर्न, पेगडा पैटर्न, और मंता रे आकार के लिए एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड के लिए मास्क डिजाइन, सु Ryon एट अलसेअनुमति के साथ अनुकूलित। (एफ)मंता रे आकार के लिए माइक्रोपैटर्नेड सीएनटी-जेलमा और पेगडा पैटर्न की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: लचीला Au माइक्रोइलेक्ट्रोड का डिजाइन। (A)आयताकार आकृतियों और चौड़ी चौड़ाई के साथ गढ़े गए Au इलेक्ट्रोड की तस्वीर। (बी और सी)एयू इलेक्ट्रोड की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवियां जो पेगिडा हाइड्रोगेल में स्थानांतरित करने में विफल रही। (डी)लहरदार Au माइक्रोइलेक्ट्रोड से पहले और बाद(ई और एफ)माइक्रोनमूनों पेगडा हाइड्रोजेल पर स्थानांतरित किया जा रहा है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: माइक्रोपैटर्नेड पेगडा और सीएनटी-जेल्मा हाइड्रोगेल का अनुकूलन और नरम रोबोटों का आंदोलन विश्लेषण। (A)सीएनटी-जेल्मा हाइड्रोजेल पैटर्न पर कार्डियोमायोसाइट्स की ऑप्टिकल छवियां 50, 75 और 150 माइक्रोन स्पेसिंग के साथ। (ख)पेगडा पर कार्डियोमायोसाइट्स की ऑप्टिकल इमेज और एफ-ऐक्टिन/डीपीआई धुंधला और सीएनटी-जेल्मा हाइड्रोजेल पैटर्न क्रमशः ३०० माइक्रोन और ७५ माइक्रोन स्पेसिंग के साथ । (ग)बायोप्रेरित की रोलिंग मॉर्फोलोज 300 माइक्रोन स्पेसिंग के साथ माइक्रोपैटर्नेड पेगडा हाइड्रोजेल के साथ और बिना निर्माण करती है। (D)इलेक्ट्रिक उत्तेजना लागू करते समय रिकॉर्ड किए गए मुक्त खड़े बायोप्रेरित सॉफ्ट रोबोट वीडियो के फ्रेम। (ई)नरम रोबोट के घूर्णन आंदोलन रिकॉर्डिंग वीडियो से लिया चार अलग फ्रेम का महाविद्यालय । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: Au माइक्रोइलेक्ट्रोड-शामिल नरम रोबोट और विद्युत उत्तेजना द्वारा व्यवहार की धड़कन के नियंत्रण पर कार्डियोमायोसाइट्स का लक्षण वर्णन। (A)पेगडा और सीएनटी-जेल्मा हाइड्रोगेल के बीच संलग्न एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड पर सुसंस्कृत कार्डियोमायोसाइट्स की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि। (ख)एफ-ऐक्टिन/डीएपीआई फ्लोरेसेंस इमेज सीएनटी-जेलमा हाइड्रोगेल माइक्रोपैटर्न पर अच्छी तरह से लम्बी और गठबंधन कार्डियोमाइओसाइट्स को दिखाती है । (C-E) गढ़े हुए नरम रोबोट पर सरकोवर संरेखण और परस्पर सरकोमेर संरचनाओं को दिखाने वाली कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस छवियां:(सी और डी)सीएनटी-जेल्मा हाइड्रोगेल माइक्रोपैटर्न पर सुसंस्कृत कार्डियोमायोसाइट्स, और(ई)एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड के पास। (एफ)कार्बन रॉड इलेक्ट्रोड और एम्बेडेड Au माइक्रोइलेक्ट्रोड के माध्यम से विद्युत उत्तेजना लागू करते समय विभिन्न आवृत्तियों (0.5, 1.0 और 2.0 हर्ट्ज) पर आवश्यक उत्तेजना सीमा वोल्टेज की आवश्यकता होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Video 1
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Discussion

इस विधि का उपयोग करते हुए, हम एक मल्टीलेयर संरचित पाड़ पर एक एकीकृत स्व-एक्ट्यूएटिंग कार्डियक ऊतक के साथ एक बैटॉइड मछली की तरह बायोप्रेरित सॉफ्ट रोबोट को सफलतापूर्वक निर्मित करने में सक्षम थे जो एम्बेडेड एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड द्वारा नियंत्रित किया जाता है। पेगिडा और सीएनटी-जेल्मा हाइड्रोगेल से बने दो अलग-अलग माइक्रोपैटर्नवाले हाइड्रोगेल परतों के कारण, बायोप्रेरित पाड़ ने अच्छी यांत्रिक स्थिरता और आदर्श सेल संरेखण और परिपक्वता दिखाई। पेगडा पैटर्न परत, जो स्टिंग रे में कंकाल वास्तुकला के उपास्थि संयुक्त के रूप में कार्य करती है, पूरे रोबोट शरीर के लिए यांत्रिक समर्थन प्रदान करती है। विशेष रूप से, इसने हृदय ऊतक संकुचन और विश्राम के दौरान यांत्रिक स्थिरता बनाए रखी, जबकि संकुचन के बाद झिल्ली तनाव को जारी करने की क्षमता के कारण कुशल पिटाई की अनुमति दी। इसके अलावा, माइक्रोइलेक्ट्रोड (200 एनएम) की नैनोमेट्रिक मोटाई, साथ ही उनके टेढ़ा पैटर्न, उन्हें हृदय ऊतक(चित्रा 2)के संकुचन में बाधा या प्रभाव न डालने के लिए पर्याप्त लचीला होने की अनुमति दी। बिना किसी टूटने के हाइड्रोगेल सतह पर माइक्रोइलेक्ट्रोड को आसानी से स्थानांतरित करने के लिए, एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड को टाइटनियम जैसे किसी भी आसंजन परत के बिना ग्लास पर गढ़ा गया था, जिसका उपयोग आमतौर पर ग्लास और एयू के बीच मजबूत आसंजन बनाने के लिए किया जाता है। इस बीच, सीएनटी-जेल्मा परत, जो कार्डियोमायोसाइट अटैचमेंट और संरेखण के लिए समर्थन प्रदान करती है, पेगडा हाइड्रोगेल पैटर्न(चित्रा 3)के अभिविन्यास के लिए लंबवत पैटर्न के साथ बनाई गई थी। परिपक्वता के बाद, शीर्ष परत पर कार्डियोमाइओसाइट्स ने पूरे पाड़ के लिए आत्म-एक्ट्युशन प्रदान किया। शामिल Au लचीला माइक्रोइलेक्ट्रोड के स्थानीय विद्युत उत्तेजना के माध्यम से, हम उस पर हृदय ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना रोबोट की पिटाई आवृत्ति को मिलाना सकता है। हालांकि इस निर्माण विधि को सीखना और पुन: पेश करना आसान है, फिर भी निर्माण प्रक्रिया में कुछ तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कदम हैं जिन पर जोर देने की आवश्यकता है।

सॉफ्ट बायोरोबोट के निर्माण के लिए पांच महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) जेलमा हाइड्रोगेल में सीएनटी का सही फैलाव; 2) टीएमएसपीएमए-लेपित ग्लास पर पेगडा और सीएनटी-जेल्मा हाइड्रोगेल की सफल यूवी क्रॉसलिंकिंग; 3) एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड को सपोर्ट ग्लास से हाइड्रोगेल पैटर्न में स्थानांतरित करें; 4) सहायक ग्लास स्लाइड से एक्टूलेटर की सही टुकड़ी; 5) एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड और तरंग जनरेटर के कनेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले तारों के बीच अच्छे विद्युत संपर्क का निर्माण।

प्राचीन जेलमा सब्सट्रेट्स की तुलना में, सीएनटी का समावेश जेलमा हाइड्रोजेल को उन्नत यांत्रिक गुणों और उन्नत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल कार्यों के साथ प्रदान करता है जो उच्च सहज समकालिक पिटाई दरों और मायोकार्डियल ऊतक9की कम उत्तेजना सीमा में योगदान देते हैं। सीएनटी साइटोटॉक्सिकिटी की समस्या को न केवल सतह कार्यात्मक सीएनटी का उपयोग करके बल्कि जेल्मा हाइड्रोगेल मैट्रिक्स में नैनोस्ट्रक्चर को 5.0 मिलीग्राम/mL9की एकाग्रता तक शामिल करके रोका जाता है। वास्तव में, सीएनटी साइडवॉल के साथ जेल्मा हाइड्रोगेल के हाइड्रोफोबिक खंडों के बीच बातचीत हाइड्रोगेल असुरक्षित मैट्रिक्स14में सीएनटी के एन्कैप्सुलेशन का कारण बनती है। यह न केवल उन्हें संभावित विषाक्त समुच्चय बनाने से रोकता है, बल्कि यह खारे समाधानों (जैसे, डीपीबीएस या सेल संस्कृति माध्यम) में सीएनटी घुलनशीलता को भी बढ़ाता है।

PEGDA और सीएनटी-GelMA हाइड्रोगेल के बीच Au माइक्रोइलेक्ट्रोड को सफलतापूर्वक शामिल करने के लिए, प्रत्येक एक परत के यूवी क्रॉसलिंकिंग में विशिष्ट ध्यान देने की आवश्यकता है। विशेष रूप से, पेगडा हाइड्रोगेल परत पर एयू माइक्रोइलेक्ट्रोड स्थानांतरित करने के लिए, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि हाइड्रोगेल समाधान छीलने के चरण के दौरान इलेक्ट्रोड के टूटने से बचने के लिए पूरे इलेक्ट्रोड क्षेत्र को कवर करता है। इसलिए, टीएमएसपीएमए ग्लास कोटिंग की गुणवत्ता ग्लास सब्सट्रेट पर पेगडा हाइड्रोगेल के इष्टतम आसंजन की गारंटी देने के लिए मौलिक है, जिससे माइक्रोइलेक्ट्रोड के स्थानांतरण चरण के दौरान इसकी टुकड़ी को रोका जा सके।

विधि का एक और महत्वपूर्ण कदम सहायक ग्लास स्लाइड से बायोएक्टर की टुकड़ी है। इस समस्या को आसानी से हल किया जा सकता है जब हृदय ऊतकों की सहज पिटाई सिंक्रोनस है और काफी मजबूत करने के लिए स्वाभाविक रूप से कांच स्लाइड से समर्थन हाइड्रोजेल छील । इस कारण से, जैसा कि पहले बताया गया है, एक कार्यात्मक और सिंक्रोनस हृदय ऊतक के संगठन के लिए अनुकूल एक विशिष्ट सेल संरेखण को प्रेरित करने के लिए हाइड्रोगेल पैटर्न को अनुकूलित करना मौलिक है।

माइक्रोइलेक्ट्रोड को तरंग जनरेटर से विद्युत रूप से जोड़ने के लिए, माइक्रोइलेक्ट्रोड पर विद्युत कनेक्शन बनाए जाने चाहिए। इस चरण के दौरान, साइटोटॉक्सिक प्रभावों से बचने के लिए तांबे के तार से माइक्रोइलेक्ट्रोड से संपर्क करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चांदी के गोंद को पूरी तरह से समझाना महत्वपूर्ण है। यह सफलतापूर्वक विद्युत संपर्क के शीर्ष पर पीडीएम की एक पतली बूंद जमा करके हासिल किया जाता है।

यह विधि न केवल मौजूदा ऑप्टोजेनेटिक तकनीकों की सीमाओं को दूर कर सकती है, जैसे जटिल निर्माण प्रक्रियाएं, लंबे निर्माण समय और ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों की संभावित विषाक्तता, बल्कि सेल-आधारित के प्रदर्शन को भी दृढ़ता से बढ़ाया जा सकता है कम लागत और आसानी से संभालने वाली तकनीकों का उपयोग करके वास्तविक समय उत्तेजना के लिए अग्रणी एक्टुएटर। यद्यपि हमारे वर्तमान जैव प्रेरित एक्ट्यूएटर का डिजाइन आगे प्रणोदन उत्पन्न नहीं कर सका, स्वायत्त सेल-आधारित रोबोटों के क्षेत्र में इसकी सफलता बहुत रुचि को आकर्षित कर सकती है। यह विधि संभावित रूप से पूरे रोबोट शरीर के लिए वायरलेस रूप से संचालित प्रत्यारोपण पैच के विकास में भी योगदान दे सकती है। यह विधि नरम-बायोरोबोटके भविष्य के वायरलेस विद्युत उत्तेजना का मार्ग प्रशस्त करती है, हालांकि हाइड्रोगेल-आधारित पाड़ में सीधे लचीले आरएफ सर्किट का एकीकरण।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस पेपर को नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ (R01AR074234, R21EB026824, R01 AR073822-01), ब्रिघम रिसर्च इंस्टीट्यूट स्टेपिंग स्ट्रॉन्ग इनोवेटर अवार्ड और एएचए इनोवेटिव प्रोजेक्ट अवार्ड (19IPLOI34660079) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL Beaker PYREX 1000-250CNEa
2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma-Aldrich 410896
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Milipore M6514
37° Water bath VWR W6M
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
50mL Conical Centrifuge Tubes Falcon 14-959-49A
70 µm Cell Strainer Falcon 352350
80° incubator VWR 1370GM
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11037
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379
Antibiotic/Antimycotic solution ThermoFisher Scientific 15240062
Anti-Connexin 43/GJAI antibody Abcam ab11370 Rabbit polyclonal
Anti-Sarcomeric α-actinin Abcam ab9465 Mouse monoclonal
Benchtop Freeze Dryers Labconco 77500-00 K
Biosafety cabinet Sterilgard A/B3
Carbon rod electrodes SGL Carbon Group 6971105
Centrifuge Eppendorf 5804
CO2 incubator Forma Scientific 3110
Collagenase, Type II, Powder Gibco 17-101-015
Confocal Microscope Zeiss LSM 880
COOH Functionalized Carbon Nanotubes NanoLab PD30L5-20-COOH
Dicing saw machine Giorgio Technology DAD-321
DMEM, High Glucose Gibco 11-965-118
DPBS without Calcium and Magnesium Gibco 14-190-144
E-beam evaporator CHA 57367
Fetal Bovine Serum Gibco 10-437-028
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Type B, 300 bloom from porcine skin
Glass slide VWR 48382-180
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red Gibco 14-175-079
Inverted optical microscope Olympus CK40
Magnetic hotplate Corning PC-420
methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 276695 Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor
Nunc EasYFlask 175cm2 ThermoFisher Scientific 159910
Olicscope Siglent SDS1052DL+
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% Electron Microscopy Sciences 15710
PDMS SYLGARD 184 Sigma-Aldrich 761036
Photomask Mini micro stencil inc
Platinum wire Alfa Aesar AA43014BU
Polyethylene glycol dimethcrylate Polysciences Inc. 15178-100
Regenerated Cellulose Dialysis Tubing Fisherbrand 21-152-14
Silver Epoxy Adhesive MG Chemicals 8330S
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System Millipore S2GPU02RE
Ultra sonicator Qsonica Q500
UV Curing System OmniCure S2000
Vortex mixer Scientific Industry SI-0246A
Waveform generator Agilent 33500B
Wrap Aluminium foil Reynolds N/A

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References

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बायोइंजीनियरिंग इश्यू 156 कार्बन नैनोट्यूब फ्लेक्सिबल माइक्रोइलेक्ट्रोड बायोमैटेरियल्स बायोप्रेरणा बायो-एक्टुएटर कार्डियक टिश्यू इंजीनियरिंग
शामिल माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ बायोप्रेरित सॉफ्ट रोबोट
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Wang, T., Migliori, B., Miccoli, B., … More

Wang, T., Migliori, B., Miccoli, B., Shin, S. R. Bioinspired Soft Robot with Incorporated Microelectrodes. J. Vis. Exp. (156), e60717, doi:10.3791/60717 (2020).

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