Summary
Um andaime bioinspirado é fabricado por uma técnica de fotolitografia macia usando hidrogéis mecanicamente robustos e eletricamente condutores. Os hidrogéis micropadronizados fornecem alinhamento direcional das células cardiomiócitos, resultando em uma direção personalizada de atuação. Microeletrodos flexíveis também são integrados ao andaime para trazer controle elétrico para um tecido cardíaco auto-atuante.
Abstract
Sistemas robóticos macios bioinspirados que imitam organismos vivos usando tecido muscular projetado e biomateriais estão revolucionando o paradigma atual da biorobótica, especialmente na pesquisa biomédica. Recriar dinâmica suação artificial semelhante à vida é crucial para um sistema robótico suave. No entanto, o controle preciso e a sintonia do comportamento de atuação ainda representam um dos principais desafios dos sistemas robóticos macios modernos. Este método descreve um procedimento de baixo custo, altamente escalável e fácil de usar para fabricar um robô macio eletricamente controlável com movimentos semelhantes à vida que é ativado e controlado pela contração de tecido muscular cardíaco em uma picada micropadronizada andaime de hidrogel como raios. O uso de métodos de fotolitografia macia torna possível integrar com sucesso vários componentes no sistema robótico macio, incluindo andaimes à base de hidrogel micropadronizados com nanotubos de carbono (CNTs) embutidos de gelatina (CNT-GelMA), diacrito de poli(etileno glicol) (PEGDA), microeletrodos flexíveis de ouro (Au) e tecido muscular cardíaco. Em particular, o alinhamento dos hidrogéis e o micropadrão são projetados para imitar a estrutura muscular e cartilagem do raio de picada. O hidrogel CNT-GelMA eletricamente condutor age como um andaime celular que melhora o comportamento de maturação e contração de cardiomiócitos, enquanto o hidrogel PEGDA mecanicamente robusto fornece suporte estrutural semelhante à cartilagem para todo o robô macio. Para superar a natureza dura e frágil dos microeletrodos à base de metal, projetamos um padrão serpentino que tem alta flexibilidade e pode evitar dificultar a dinâmica de espancamento dos cardiomiócitos. Os microeletrodos Au flexíveis incorporados fornecem estimulação elétrica em todo o robô macio, facilitando o controle do comportamento de contração do tecido cardíaco.
Introduction
Robôs macios modernos de última geração podem imitar as estruturas hierárquicas e a dinâmica muscular de muitos organismos vivos, como a água-viva1,2, raio de picada2,polvo3,bactérias4, eesperma5. Imitar a dinâmica e a arquitetura dos sistemas naturais oferece maiordesempenho em termos de eficiência energética e estrutural6. Isso está intrinsecamente relacionado à natureza macia do tecido natural (por exemplo, tecido de pele ou músculo com o módulo de um Jovem entre 104 -109 Pa) que permite graus mais elevados de liberdade e deformação superior e adaptabilidade quando comparado com atuadores projetados padrão (por exemplo, um módulo de Jovem geralmente entre 109-1012 Pa)6. Atuadores macios à base de músculos cardíacos, especialmente, mostram eficiência energética superior devido à sua auto-atuação, bem como seu potencial de autoreparo e regeneração quando comparados a um sistema robótico de base mecânica7. No entanto, a fabricação de robôs macios é desafiadora devido à necessidade de integrar diferentes componentes com diferentes propriedades físicas, biológicas e mecânicas em um único sistema. Por exemplo, sistemas sintéticos projetados precisam ser integrados com sistemas biológicos vivos, não apenas fornecendo-lhes suporte estrutural, mas também influenciando e modulando seu comportamento de atuação. Além disso, muitos métodos de microfabricação requerem processos e produtos químicos severos/citotóxicos que diminuem a viabilidade e a função de quaisquer componentes vivos. Portanto, novas abordagens são necessárias para melhorar a funcionalidade dos robôs macios e controlar e modular seu comportamento.
Para integrar com sucesso componentes vivos com boa viabilidade, um andaime à base de hidrogel é um excelente material para criar o corpo de um robô macio. As propriedades físicas e mecânicas de um hidrogel podem ser facilmente sintonizadas para criar microambientes para componentes vivos, como tecidos musculares8,9. Além disso, pode facilmente adotar várias técnicas de microfabricação, resultando na criação de estruturas hierárquicas com alta fidelidade1,2,10. Dispositivos eletrônicos flexíveis podem ser incorporados ao robô macio para controlar seu comportamento com estimulação elétrica. Por exemplo, técnicas optogenéticas para projetar células eletrogênicas (por exemplo, cardiomiócitos), que mostram uma ativação eletrofisiológica dependente da luz, têm sido usadas para desenvolver um raio de picada robótico macio baseado em polidimetilexino (PDMS) guiado pela luz que foi capaz de recriar o movimento undulatório do peixe in vitro2. Embora as técnicas optogenéticas tenham mostrado excelente controle, o trabalho apresentado utiliza estimulação elétrica, um método convencional e tradicional de simulação. Isso porque a estimulação elétrica através de microeletrodos flexíveis é fácil e simples em comparação com técnicas optogenéticas, que requerem extensos processos de desenvolvimento11. O uso de dispositivos eletrônicos flexíveis pode permitir estimulação a longo prazo e processos de fabricação padrão/simples, bem como biocompatibilidade tunable e propriedades físicas e mecânicas12,13.
Aqui, apresentamos um método inovador para fabricar um robô macio bioinspirado, acionado pela batida de tecido muscular cardíaco projetado e controlado por estimulação elétrica através de microeletrodos Au flexíveis incorporados. O robô macio foi projetado para imitar a estrutura muscular e cartilagem do raio de picada. O raio de picada é um organismo com uma estrutura e movimento relativamente fáceis de imitar em comparação com outras espécies de natação. Os músculos são recriados in vitro por sedar cardiomiócitos em um micropadrão de hidrogel eletricamente condutor. Como relatado anteriormente, incorporar nanopartículas eletricamente condutoras como a CNT no hidrogel GelMA não só melhora o acoplamento elétrico do tecido cardíaco, mas também induz uma excelente arquitetura e arranjo de tecido in vitro8,9. As articulações de cartilagem são então imitadas usando um padrão de hidrogel PEGDA mecanicamente robusto que age como o substrato mecanicamente robusto de todo o sistema. Microeletrodos Au flexíveis com padrão serpentino estão incorporados no padrão PEGDA para estimular local e eletricamente o tecido cardíaco.
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Protocol
Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações no Guia de Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) de Brigham e Hospital da Mulher.
1. Síntese gelMA
- Dissolva 10 g de gelatina em 100 mL do salo tampão de fosfato de Dulbecco (DPBS) usando um agitador magnético a 50 °C.
- Adicione 8 mL de anidrito metocrílico lentamente enquanto mexe a solução pré-polímero de gelatina a 50 °C por 2 h. Diluir a solução de gelatina reaquecida com DPBS pré-aquecido a 50 °C.
- Transfira a solução diluída para membranas de diálise (corte de peso molecular = 12-14 kDa) e coloque-as em água deionizada (DI). Faça diálise a 40 °C por cerca de 1 semana.
- Filtrar a solução de pré-polímero GelMA dialado usando um filtro estéril (tamanho do poro = 0,22 μm) e transfira 25 ou 30 mL da solução para tubos de 50 mL e armazene a -80 °C por 2 dias.
- Congele a solução pré-polímero gelma congelada usando um secador de congelamento por 5 dias.
2. Preparação da solução pré-polímero poli(etileno glicol) (PEGDA)
- Dissolver 200 mgs (20% da solução total) de PEGDA (MW = 1.000) com 5 mg (0,5% da solução total) de 2-hidroxi-4-(2-hidroxyethoxy)-2-metilpropiophenona (foto-iniciador, PI) em 1 mL de DPBS.
- Incubar a solução pré-polímero a 80 °C por 5 min.
3. Preparação da solução de estoque dispersa CNT revestida de GelMA
- Dissolva 80 mg de GelMA (usado como biosurfactante) em 4 mL de DPBS e, em seguida, adicione 20 mg de nanotubos de carbono multiparedeizados de COOH (MWCNTs) na solução pré-polímero GelMA.
- Sonicate a solução pré-polímero GelMA carregada de MWCNT por 1 h (0,66Hz, 100 Watt).
NOTA: Durante o processo de sonsoação, a solução deve ser imersa em um banho de água a ~15 °C para evitar a evaporação do solvente devido ao aumento da temperatura.
4. Preparação de 1 mg/mL CNT contendo solução pré-polímero GelMA de 5%
- Dissolver 50 mg de GelMA e 5 mgs (0,5% da solução total) de PI em 0,8 mL de DPBS a 80 °C para 10 min.
- Adicione 0,2 mL da solução de ações CNT preparada (passo 3). Vórtice e incubar a solução a 80 °C por 10 min.
5. Preparação de um tocracrito revestido de 3(trimethoxysilyl)propyl (TMSPMA)
- Lave os slides de vidro (espessura = 1 mm, tamanho = 5,08 cm x 7,62 cm) com etanol puro.
- Empilhe os slides limpos verticalmente em um béquer de 250 mL e espalhe 3 mL de TMSPMA em cima deles usando uma seringa. Cubra o béquer com papel alumínio para evitar a evaporação do TMSPMA.
- Incubar os slides em um forno de 80 °C por 1 dia.
- Lave os slides de vidro revestidos mergulhando-os em etanol puro, depois seque.
- Guarde os slides de vidro revestidos envoltos em papel alumínio à temperatura ambiente (RT).
NOTA: Tente minimizar o toque nas superfícies dos slides de vidro revestidos de TMSPMA.
6. Fabricação dos microeletrodos Au flexíveis
- Projete uma máscara de sombra usando design auxiliado por computador (Arquivo Complementar 3).
- Fabricar e comprar uma máscara de sombra.
- Lave o escorregador de vidro (espessura = 1 mm, tamanho = 3 cm x 4 cm) com acetona e seque com uma pistola de ar comprimida.
- Conecte a máscara de sombra aos substratos de vidro usando fita dupla lateral, em seguida, coloque-as em um evaporador de feixe eletrônico e espere até que a pressão da câmara atinja pelo menos 10-6 Torr.
NOTA: As duas fitas foram colocadas manualmente no suporte a uma distância curta o suficiente para hospedar o vidro e grandes o suficiente para se adequar em todo o padrão. Este passo leva em torno de 45-60 min. - Deposite uma camada Au de 200 nm de espessura por evaporador de feixe eletrônico (por exemplo, com Denton EE-4, vácuo = 10-6 Torr, potência = 2,6%, taxa = 2 Å/s) e corte os microeletrodos fabricados usando uma máquina de serra de dicing (tamanho eletrodos = 7,38 mm x 8,9 mm x 200 nm).
7. Fabricação de um andaime multicamada sed multicamadas integrado a ua
NOTA: O resultado deste procedimento é uma membrana onde um hidrogel PEGDA micropadronizado está na camada inferior, um hidrogel CNT-GelMA micropadronizado está por cima, e os microeletrodos Au estão entre as duas camadas. Essa configuração garante uma melhor flexibilidade ao eletrodo e limita o risco de quebra.
- Projete e forje duas máscaras fotográficas para criar as camadas PEGDA(1ª fotomáscara) micropadronizadas e as camadas de hidrogel CNT-GelMA (fotomáscara 2nd). Consulte o Arquivo Suplementar 2-3. O design pode ser feito usando o software CAD.
NOTA: Veja figura 2B, E. - Coloque espaçadores de 50 μm feitos empilhando uma camada de fita invisível comercial (Espessura: 50 μm) em um vidro revestido TMSPMA. Despeje 15 μL de 20% de solução de pré-polímero PEGDA em cima do vidro revestido TMSPMA e cubra com microeletrodo dourado. Coloque a 1ª fotomáscara para o slide de vidro (PEGDA micropadronizado) em cima do microeletrodo dourado e exponha toda a construção à luz UV (200 W vapor de lâmpada de arco curto vapor de mercúrio com filtro de 320-390 nm) a 800 mW de intensidade e 8 cm de distância para 110 s.
NOTA: Veja a Figura 1A. - Adicione DPBS para cercar o escorregador de vidro e desative o hidrogel PEGDA micropadronizado junto com os microeletrodos Au do substrato de vidro não revestido cuidadosamente após 5-10 min para obter o slide de vidro que tem o hidrogel PEGDA micropadronizado com o Au microeletrodos.
NOTA: Veja a Figura 1B. Devido ao revestimento TMSPMA, a construção é transferida do substrato de vidro não revestido para o tmspma revestido. Desapare-se cuidadosamente porque os microeletrodos Au podem quebrar facilmente durante esta etapa (Figura 3). - Coloque 100 μm espaçadores feitos empilhando duas camadas de fita transparente comercial (espessura = 50 μm) na parte inferior de uma placa de Petri. Deposite uma gota de 20 μL SOLUÇÃO pré-polímero CNT-GelMA entre os espaçadores e, em seguida, gire o slide de vidro obtido em 7.3 e fixe-o no prato com fita adesiva.
- Gire o dispositivo de cabeça para baixo e coloque a fotomáscara de 2nd em cima do slide de vidro. Expor luz UV a 800 mW de intensidade e 8 cm de distância para 200 s.
NOTA: Veja a Figura 1C. O alinhamento da 2ª máscara é importante. - Lave o andaime obtido com DPBS e com meio de cultura celular que inclui 10% de soro bovino fetal (FBS).
- Deixe-os durante a noite na incubadora de 37 °C antes de semear as células.
8. Cardiomiócitos de ratos neonatais isolamento e cultura
- Isolar corações de ratos sprague-dawley de 2 dias de idade seguindo protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais8do Instituto .
- Coloque as peças do coração no shaker durante a noite (cerca de 16 h) em 0,05% de trypsin sem EDTA no HBSS em uma sala fria.
- Colete os pedaços do coração com uma arma de pipeta e minimize a quantidade de trippsina, em seguida, coloque-os em um tubo de 50 mL com 10 mL de mídia cardíaca quente (10% FBS, 1% P/S, 1% L-glutamina).
- Redemoinho lentamente (~60 rpm) em um banho de água de 37 °C por 7 min. Remova a mídia cuidadosamente do tubo com uma pipeta de 10 mL e deixe as peças do coração no tubo.
- Adicione 7 mL de 0,1% coloagenase tipo 2 em HBSS e gire em um banho de água de 37 °C por 10 min.
- Misture com uma pipeta de 10 mL 10x suavemente para interromper as peças do coração. Remova a mídia do tubo com uma pipeta de 1 mL.
- Adicione 10 mL de 0,1% coloagenase tipo 2 em HBSS e gire rapidamente (~120-180 rpm) em um banho de água de 37 °C por 10 min, em seguida, verifique se as peças do coração estão se dissolvendo.
- Misture com uma pipeta de 10 mL, depois repita com uma pipeta de 1 mL para quebrar as últimas peças do coração.
- Uma vez que a solução pareça homogênea, coloque um filtro de célula de 70 μm em um novo tubo de 50 mL e pipeta a solução 1 mL de cada vez no filtro.
- Centrífuga a solução de células cardíacas em 180 x g por 5 min a 37 °C.
NOTA: Se ainda houver alguns pedaços de coração ou muco que não se dissolveram, repita os passos 8.7-8.9 novamente. - Remova cuidadosamente todo o líquido acima da pelota celular e resuspendeu as células em 2 mL de mídia cardíaca.
- Adicione 2 mL de mídia cardíaca da parede do tubo cuidadosamente para resuspender as células e evite quebrá-las.
- Adicione as células suspensas em um frasco T175 com queda de mídia cardíaca quente por queda. Coloque o frasco em uma incubadora de 37 °C por 1 h para permitir que fibroblastos cardíacos se conectem à parte inferior.
NOTA: Nesta etapa de pré-plating, os fibroblastos cardíacos se ligarão ao frasco enquanto os cardiomiócitos permanecerão no meio de suspensão. - Colete a mídia do frasco que contém os cardiomiócitos e coloque-o em um tubo de 50 mL.
- Conte as células, depois centrífuga sem 260 x g por 5 min a 37 °C.
- Resuspender e semea as células em cima do robô macio fabricado na etapa 7. Despeje volume específico de mídia cardíaca com os cardiomiócitos a uma concentração de 1,95 × 106 células/mL queda por queda em toda a superfície do dispositivo.
- Incubar as amostras a 37 °C e mudar a mídia com 5 mL cell culture media com 2% FBS e 1% L-glutamina no primeiro e no segundo dias após a semeação. Mude a mídia toda vez que a cor da mídia muda.
9. Coloração celular para análise de alinhamento
- Remova a mídia e lave com DPBS por 5 min na RT.
- Fixar as células usando 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 min na RT. Em seguida, lave com DPBS por 5 min na RT.
- Incubar as células com 0,1% de tritão em DPBS na RT por 1h. Lave 3x com PBS por 5 min na RT.
- Incubar as células com 10% de soro de cabra na DPBS na RT por 1h.
- Incubar as células com um anticorpo primário (sarcomeric α-actinin e connexin-43) em 10% de soro de cabra em DPBS a 4 °C por ~14-16 h.
- Lave 3x com DPBS por 5 min na RT. Incubar as células com o anticorpo secundário em 10% de soro de cabra em DPBS na RT por 1 h.
- Lave 3x com DPBS por 5 min na RT, depois contra-manchas com 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) em água DI (1:1.000) por 10 min na RT. Wash 3x com DPBS por 5 min na RT.
- Tire imagens de fluorescência usando um microscópio confocal de varredura a laser invertido.
10. Teste de actuator e avaliação de comportamento
- Espancamento espontâneo dos cardiomiócitos no robô macio
- Incubam atuadores bioinspirados a 37 °C por 5 dias e atualizem a mídia nos dias 1 e 2 e quando necessário (ou seja, quando a mídia fica amarela). Use um microscópio óptico invertido para tirar imagens diariamente (5x e/ou 10x). Movimentos de células recordes usando software de captura de vídeo na janela ao vivo do microscópio por 30 s a 20 quadros por segundo (5x e/ou 10x) quando a atividade contraída começa (geralmente por volta do dia 3).
- No dia 5, desapego as membranas levantando suavemente da borda com um slide de tampa.
NOTA: Se as células apresentarem um forte comportamento de espancamento, as membranas se desprenderão sozinhas devido à ação mecânica das contrações.
- Estimulação de sinal elétrico a granel
- Usando um PDMS espaçado de 3 cm como suporte, afixadois eletrodos de barras de carbono com fio platina (Pt) em uma placa petri de 6 cm cheia de mídia cardíaca. Em seguida, transfira cuidadosamente o robô macio para a placa de Petri.
- Aplique uma forma de onda quadrada com largura de pulso de 50 ms, dc offset value 0 V e amplitude de tensão de pico entre 0,5 e 6 V. A frequência varia entre 0,5, 1,0 e 2,0 Hz com ciclo de plantão entre 2,5%, 5% e 10%, respectivamente. Grave contrações de macroescala usando uma câmera comercialmente disponível.
- Estimulação elétrica com os microeletrodos Au
- Após a fabricação de andaimes multicamadas multicamadas integrados a microeletrodos au, conecte dois fios de cobre aos eletrodos Au, embora uma porta quadrada externa usando pasta de prata.
- Cubra a pasta prateada com uma fina camada de PDMS precurada a 80 °C por 5 min. Em seguida, coloque as amostras em uma placa quente a 45 °C por 5 h para cruzar totalmente o PDMS.
- Após semear cardiomiócito, aplique um estímulo elétrico de ondas quadradas nos fios de cobre com o valor de deslocamento DC 1 V, amplitude de tensão máxima entre 1,5 e 5 V, e frequências de 0,5, 1,0 e 2,0 Hz, respectivamente.
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Representative Results
Diagrama de fluxo dos passos para o desenvolvimento do robô macio bioinspirado de microeletrodo incorporado a ua
O objetivo do design de robôs macios era construir uma membrana capaz de atuar um movimento de natação com mínima complexidade. A estrutura deve ser capaz de sustentar fortes flexões repetidamente ao longo do tempo (cerca de 1 Hz) e ser capaz de manter sua forma enquanto alcança uma forte batida. Ao cruzar seletivamente o polímero usando fotomáscaras, fabricamos um andaime hierárquico eestruturado composto por uma camada de hidrogel PEGDA micropadronizada, uma camada flexível de microeletrodos Au e uma camada de hidrogel CNT-GelMA micropadronizada. Um diagrama esquemático e imagens reais do procedimento de fabricação do robô macio, conforme descrito no protocolo, são mostrados na Figura 1. Resumidamente, foram obtidos três etapas principais de fabricação para o robô macio bioinspirado com microeletrodos Au incorporados: Primeiro, um hidrogel PEGDA micropadronizado com microeletrodos Au incorporados foi obtido por crosslinking UV usando a 1ª fotomáscara(Figura 1A, B). Em segundo lugar, uma construção multicamadas composta por microeletrodos Au, o CNT-GelMA micropadronizado, e os hidrogéis PEGDA foi fabricado por crosslinking UV usando a 2ª fotomáscara(Figura 1C). Finalmente, os cardiomiócitos foram semeados na construção fabricada de três camadas para fornecer atuação ao robô macio(Figura 1D).
Diferentes desenhos do robô macio
Em relação à forma do robô macio, no início, projetamos duas formas bioinspiradas bioimitando os padrões de dois animais aquáticos diferentes. O primeiro design foi inspirado no aparecimento de uma estrela-do-mar caraibica (Figura 2A, B, C), pois a estrela-do-mar pode ser simplificada em um objeto bidimensional (2D), tem uma espinha dorsal dura, e tem uma parte flexível que se une para se mover na água, minimizando o movimento necessário. O segundo dispositivo foi baseado na forma de um raio de manta (Figura 2D, E, F) que é fácil de reproduzir em um dispositivo 2D. O raio de manta pode nadar rapidamente usando movimentos únicos. Esboçamos o raio de manta usando formas geométricas básicas com complexidade reduzida para serem interligados durante a etapa fotomáscara. O eletrodo, colocado ao longo da linha média da estrutura, foi projetado com um padrão ondulado, permitindo uma melhor disseminação de pulsos elétricos e flexibilidade(Figura 2D). Para desenvolver o robô macio bioinspirado, a forma inspirada em raios manta foi selecionada e testada minuciosamente neste estudo.
O desafio de incorporar os microeletrodos Au entre hidrogéis CNT-GelMA e PEGDA
O encapsulamento de microeletrodos Au de 200 nm de espessura no corpo de robô fabricado poderia controlar localmente a construção fornecendo estimulação elétrica. Embora a crosslinking UV dos padrões de hidrogel CNT-GelMA e PEGDA diretamente na superfície do eletrodo dificultou a delaminação dos eletrodos, garantiu a incorporação bem sucedida do eletrodo no robô macio. No entanto, após a transferência do eletrodo Au nos hidrogéis PEGDA, o eletrodo Au com forma retangular e largura larga (>1 mm) foi facilmente quebrado durante o processo de fabricação devido ao inchaço do hidrogel PEGDA (Figura 3A, B, C). Por isso, precisávamos ter certeza de que os microeletrodos foram transferidos com sucesso para o hidrogel PEGDA e embutidos entre os hidrogéis CNT-GelMA e PEGDA enquanto estavam intactos. Portanto, microeletrodos Au com padrão serpentino (espessura = 200 μm) foram projetados e fabricados com litografia macia. Imagens de microscópio de contraste de fase com diferentes ampliações e estágios foram tiradas a fim de inspecionar sinais de fratura no eletrodo após o transporte nos hidrogéis PEGDA micropadronizados(Figura 3D, E, F).
A otimização do espaçamento entre micropadrões de hidrogel
A camada cnt-gelma semeada de cardiomiócito apresentou diferente comportamento de espancamento de acordo com as distâncias padrão(Figura 4A, B). Isso pode ser atribuído às diferentes maneiras pelas quais as células se prendem à superfície da membrana, dependendo das distâncias das linhas. No caso da distância de 50 μm, as células estavam muito embaladas e não tinham a configuração organizada desejada. As células parcialmente interconectadas e não alinhadas nas asas não estavam contribuindo simultaneamente para o movimento da natação. Assim, a força gerada pelo cardiomiócito não foi suficiente para dobrar as asas. A uma distância de 150 μm, as células estavam muito bem alinhadas. No entanto, eles se sentaram principalmente no sulco e havia poucas interconexões entre as células nas camadas superiores, resultando em batidafraca. A uma distância de 75 μm, as células estavam alinhadas na parte inferior e interconectadas na parte superior, mostrando o espancamento mais forte. Além disso, para evitar o rolamento completo irreversível do robô macio durante a batida dinâmica dos cardiomiócitos, otimizamos o espaçamento padrão da camada de suporte de hidrogel PEGDA a 300 μm(Figura 4C). Finalmente, após esse processo de parametrização, decidimos focar mais na membrana em forma de raio de manta com padrões PEGDA de 300 μm de distância e padrões CNT-GelMA de 75 μm de distância. O tecido cardíaco em padrões PEGDA e CNT-GelMA micropadronizados também foi mostrado por imagens de fase/contraste e imagens confocais F-actin/DAPI(Figura 4B).
A análise do movimento do tecido cardíaco em hidrogéis PEGDA e CNT-GelMA micropadronizados
Para analisar o movimento do atuador, pegamos vídeos da membrana sem os microeletrodos Au enquanto aplicamos um campo elétrico usando um eletrodo de barras de carbono. A Figura 4D mostra alguns quadros retirados dos registros de contração. Era claramente visível que o atuador em forma de raio de manta estava dobrando as asas como esperado. A cauda estava equilibrando a estrutura endireitando-se um pouco e as asas estavam fortemente fechando no meio. Algumas das membranas apresentaram um movimento rotativo durante a contração devido aos hidrogéis CNT-GelMA e PEGDA mal padronizados(Figura 4E e Vídeo 1). Neste caso, o movimento foi menos definido em relação ao anterior, mas a contração ainda era forte o suficiente para permitir a atuação de um movimento rotativo. O tempo total para completar um círculo inteiro foi de cerca de 45 s.
A caracterização dos cardiomiócitos no robô macio multicamadas e o controle do comportamento de espancamento por estimulação elétrica
Após a semeade e maturação de cardiomiócitos no sistema robótico bioinspirado (Figura 5A), foi observado o alinhamento do tecido cardíaco ao longo da direção dos padrões CNT-GelMA ( Figura5B-E) tanto por F-actin/DAPI quanto pela imunomarca sacromérica/connexin-43/DAPI. Imagens de fluorescência confocal mostraram cardiomiócitos bem alongados e alinhados no padrão de hidrogel CNT-GelMA(Figura 5B, C). Observou-se alinhamento parcial de sarcomere uniaxial e estrutura sarcomere interconectada nas áreas padronizadas (Figura 5D). Estruturas sarcomere bem interconectadas de tecidos cardíacos localizados diretamente acima dos microeletrodos também foram observadas (Figura 5E). Para avaliar o robô macio bioinspirado, detectamos sua função usando dois métodos: Primeiro, aplicamos um pulso elétrico bifásico ao robô macio, embora a haste de carbono eletrodos para afinação artificial e controle do comportamento de espancamento. Em segundo lugar, conectamos dois fios de cobre à extremidade mais externa do eletrodo Au para gerar um sinal elétrico através de toda a construção de robôs. Quando aplicamos uma estimulação elétrica através do eletrodo de carbono externo ou fio de cobre conectado ao eletrodo Au, a tensão do limiar de excitação foi diferente em diferentes frequências (0,5, 1,0 e 2,0 Hz, Figura 5F).
Figura 1: Diagrama esquemática e imagens reais que retratam o processo de fabricação do robô macio multicamadaed bioinspirado controlado eletricamente por sinal elétrico através da integração de microeletrodos Au flexíveis. (A)Padronização e crosslinking do hidrogel PEGDA usando a1ª fotomáscara. (B)Hidrogel PEGDA micropadronizado com os microeletrodos Au encapsulados no vidro TMSPMA obtido após etapa(A). (C) Crosslinking do hidrogel padrão CNT-GelMA usando a fotomáscara 2nd. (D)Semeade dos cardiomiócitos na construção multicamadas. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Design dos robôs macios bioinspirados. (A) Imagem real da estrela-do-mar e diferentes vistas do modelo CAD tridimensional (3D) apontando os componentes e listras. (B) Design de máscara para padrão CNT-GelMA, padrão PEGDA e microeletrodos Au para a forma de estrela-do-mar. (C) Imagem de microscópio óptico dos padrões CNT-GelMA micropadronizados e PEGDA para a forma de estrela-do-mar. (D) Imagem de raio de manta real e diferentes visualizações do modelo CAD 3D apontando os componentes. (E) Design de máscara para padrão CNT-GelMA, padrão PEGDA e microeletrodos Au para a forma de ray manta, adaptado com permissão de Su Ryon et al.10. (F)Imagem de microscópio óptico dos padrões CNT-GelMA micropadronizados e PEGDA para a forma de raios manta. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Design dos microeletrodos Au flexíveis. (A)Fotografia de eletrodos Au fabricados com formas retangulares e larguras largas. (B e C) Imagens de microscópio óptico de eletrodos Au que não conseguiram transferir para os hidrogéis PEGDA. (D) Microeletrodos Wavy Au antes e depois(E e F)sendo transferidos no hidrogel PEGDA micropadronizado. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: A otimização de hidrogéis PEGDA e CNT-GelMA micropadronizados e análise de movimento de robôs macios. (A) Imagens ópticas de cardiomiócitos no padrão de hidrogel CNT-GelMA com espaçamento de 50, 75 e 150 μm. (B) Imagens ópticas e f-actin/dapi de cardiomiócitos nos padrões de hidrogel PEGDA e CNT-GelMA com 300 μm e espaçamento de 75 μm, respectivamente. (C) As morfologias rolando das construções bioinspiradas com e sem o hidrogel PEGDA micropadronizado com espaçamento de 300 μm. (D) Quadros do vídeo de robô macio bioinspirado gratuito gravado sem a aplicação do estímulo elétrico. (E)Colagem de quatro quadros diferentes retirados do vídeo gravando o movimento rotativo do robô macio. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Caracterização de cardiomiócitos em robô macio incorporado ao microeletrodo Au e controle do comportamento de espancamento por estimulação elétrica. (A)Imagem de microscópio óptico dos cardiomiócitos cultivados nos microeletrodos Au encapsulados entre hidrogéis PEGDA e CNT-GelMA. (B) Imagem de fluorescência F-actin/DAPI mostrando os cardiomiócitos bem alongados e alinhados no micropadrão de hidrogel CNT-GelMA. (C-E) Imagens de fluorescência confocal mostrando alinhamento sarcomere e estruturas sarcomere interconectadas no robô macio fabricado: (C e D)cardiomiócitos cultivados no micropadrão de hidrogel CNT-GelMA, e(E)perto dos microeletrodos Au. (F) Exigiu tensão de limiar de excitação em diferentes frequências (0,5, 1,0 e 2,0 Hz) ao aplicar estimulação elétrica via eletrodo de barras de carbono e microeletrodos Au incorporados. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Usando este método, conseguimos fabricar com sucesso um robô macio bioinspirado em peixes batoides com um tecido cardíaco auto-atuante integrado em um andaime estruturado multicamadas que é controlado por microeletrodos Au incorporados. Devido a duas camadas distintas de hidrogel micropadronizado feitas de hidrogéis PEGDA e CNT-GelMA, o andaime bioinspirado mostrou boa estabilidade mecânica e alinhamento e maturação celular ideal. A camada padrão PEGDA, que serve como uma articulação de cartilagem da arquitetura esquelética em um raio de picada, fornece suporte mecânico para todo o corpo robô. Especificamente, manteve a estabilidade mecânica durante a contração e relaxamento do tecido cardíaco, ao mesmo tempo em que permitiu uma batida eficiente devido à sua capacidade de liberar a tensão da membrana após a contração. Além disso, a espessura nanométrica dos microeletrodos (200 nm), bem como seu padrão serpentino, permitiram que eles fossem flexíveis o suficiente para não impedir ou influenciar a contração do tecido cardíaco(Figura 2). Para transferir facilmente microeletrodos na superfície do hidrogel sem qualquer quebra, os microeletrodos Au foram fabricados no vidro sem qualquer camada de adesão, como o titânio, que é comumente usado para criar forte adesão entre o vidro e a UA. Enquanto isso, a camada CNT-GelMA, que fornece suporte para apego e alinhamento cardiomiócitos, foi feita com padrões perpendiculares à orientação do padrão de hidrogel PEGDA(Figura 3). Após o amadurecimento, os cardiomiócitos na camada superior forneceram auto-atuação para todo o andaime. Através da estimulação elétrica local dos microeletrodos flexíveis Au incorporados, poderíamos modular a frequência de espancamento do robô sem prejudicar o tecido cardíaco nele. Embora este método de fabricação seja fácil de aprender e se reproduzir, ainda há algumas etapas tecnicamente desafiadoras no processo de fabricação que precisam ser enfatizadas.
Há cinco passos críticos para a fabricação do biorobô macio: 1) dispersão correta das CNTs no hidrogel GelMA; 2) crosslinking UV bem sucedido dos hidrogéis PEGDA e CNT-GelMA no vidro revestido TMSPMA; 3) transferência dos microeletrodos Au do vidro de suporte para o padrão de hidrogel; 4) desprendimento correto do atuador do slide de vidro de suporte; 5) criação de bom contato elétrico entre os microeletrodos Au e os fios utilizados para a conexão com o gerador de forma de onda.
Em comparação com substratos de GelMA imaculados, a incorporação de CNTs fornece o hidrogel GelMA com propriedades mecânicas aprimoradas e funções eletrofisiológicas avançadas que contribuem para maiores taxas de batida síncrona espontânea e um limiar de excitação menor do tecido miocárdio9. O problema da citotoxicidade cnt é evitado não apenas pelo uso de CNTs funcionais superficiais, mas também pela incorporação das nanoestruturas na matriz de hidrogel GelMA até uma concentração de 5,0 mg/mL9. De fato, a interação entre os segmentos hidrofóbicos do hidrogel GelMA com as paredes laterais cnts leva ao encapsulamento de CNTs na matriz porosa hidrogel14. Isso não só os impede de formar agregados potencialmente tóxicos, mas também aumenta a solubilidade das CNTs em soluções salinas (por exemplo, DPBS ou meio de cultura celular).
Para incorporar com sucesso os microeletrodos Au entre os hidrogéis PEGDA e CNT-GelMA, a atenção específica precisa ser colocada na crosslinking UV de cada camada única. Especificamente, para transferir os microeletrodos Au na camada de hidrogel PEGDA, é necessário garantir que a solução de hidrogel cubra toda a área de eletrodo para evitar a ruptura dos eletrodos durante a etapa de peeling. Portanto, a qualidade do revestimento de vidro TMSPMA é fundamental para garantir uma adesão ideal do hidrogel PEGDA no substrato de vidro, impedindo assim seu desprendimento durante a etapa de transferência dos microeletrodos.
Outro passo crítico do método é o desprendimento do bioatonte do deslizamento de vidro de suporte. Este problema pode ser facilmente resolvido quando a batida espontânea dos tecidos cardíacos é síncrona e forte o suficiente para naturalmente descascar o hidrogel de suporte do deslizamento de vidro. Por essa razão, como relatado anteriormente, é fundamental otimizar os padrões de hidrogel para induzir um alinhamento celular específico favorável à organização de um tecido cardíaco funcional e síncrono.
Para ligar eletricamente os microeletrodos ao gerador de forma de onda, as conexões elétricas devem ser criadas nos microeletrodos. Durante esta etapa, é importante encapsular completamente a cola de prata usada para entrar em contato com os microeletrodos no fio de cobre para evitar efeitos citotóxicos. Isso é conseguido depositando uma fina gota de PDMS na parte superior do contato elétrico.
Este método poderia não só superar as limitações das técnicas optogenéticas existentes, como processos complicados de fabricação, longos tempos de fabricação e potencial toxicidade de ferramentas optogenéticas, mas também melhorar fortemente o desempenho da base celular atuadores que levam à estimulação em tempo real usando técnicas de baixo custo e fáceis de manusear. Embora o design de nossos atuais atuadores bioinspirados não pudesse gerar propulsão para a frente, seu sucesso no campo de robôs autônomos baseados em células poderia atrair muito interesse. Este método também pode potencialmente contribuir para o desenvolvimento de patches implantáveis sem fio para todo um corpo robô. Este método abre caminho para futura sem fio estimulação elétrica de biorobôs macios, embora a integração de circuitos RF flexíveis diretamente no andaime à base de hidrogel.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este artigo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01AR074234, R21EB026824, R01 AR073822-01), pelo Brigham Research Institute Stepping Strong Innovator Award e pelo AHA Innovative Project Award (19IPLOI3460079).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Beaker | PYREX | 1000-250CNEa | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Milipore | M6514 | |
| 37° Water bath | VWR | W6M | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | |
| 80° incubator | VWR | 1370GM | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Anti-Connexin 43/GJAI antibody | Abcam | ab11370 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Sarcomeric α-actinin | Abcam | ab9465 | Mouse monoclonal |
| Benchtop Freeze Dryers | Labconco | 77500-00 K | |
| Biosafety cabinet | Sterilgard | A/B3 | |
| Carbon rod electrodes | SGL Carbon Group | 6971105 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| CO2 incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Collagenase, Type II, Powder | Gibco | 17-101-015 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| COOH Functionalized Carbon Nanotubes | NanoLab | PD30L5-20-COOH | |
| Dicing saw machine | Giorgio Technology | DAD-321 | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11-965-118 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-144 | |
| E-beam evaporator | CHA | 57367 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10-437-028 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B, 300 bloom from porcine skin |
| Glass slide | VWR | 48382-180 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-079 | |
| Inverted optical microscope | Olympus | CK40 | |
| Magnetic hotplate | Corning | PC-420 | |
| methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276695 | Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor |
| Nunc EasYFlask 175cm2 | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| Olicscope | Siglent | SDS1052DL+ | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PDMS SYLGARD 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| Photomask | Mini micro stencil inc | ||
| Platinum wire | Alfa Aesar | AA43014BU | |
| Polyethylene glycol dimethcrylate | Polysciences Inc. | 15178-100 | |
| Regenerated Cellulose Dialysis Tubing | Fisherbrand | 21-152-14 | |
| Silver Epoxy Adhesive | MG Chemicals | 8330S | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | S2GPU02RE | |
| Ultra sonicator | Qsonica | Q500 | |
| UV Curing System | OmniCure | S2000 | |
| Vortex mixer | Scientific Industry | SI-0246A | |
| Waveform generator | Agilent | 33500B | |
| Wrap Aluminium foil | Reynolds | N/A |
References
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