Summary
En bioinspirerad byggnadsställning tillverkas av en mjuk fotolitografiteknik med mekaniskt robusta och elektriskt ledande hydrogeler. De mikromönstrade hydrogelerna ger riktningskardiomyocytcelljustering, vilket resulterar i en skräddarsydd riktning för aktivering. Flexibla mikroelektroder är också integrerade i byggnadsställningen för att få elektrisk styrbarhet för en självaktivering av hjärtvävnad.
Abstract
Bioinspirerade mjuka robotsystem som efterliknar levande organismer med hjälp av konstruerad muskelvävnad och biomaterial revolutionerar det nuvarande biorobotparadigmet, särskilt inom biomedicinsk forskning. Återskapa artificiell verklighetsliknande aktiveringsdynamik är avgörande för ett mjukt robotsystem. Men den exakta kontrollen och justeringen av aktiveringsbeteende representerar fortfarande en av de största utmaningarna i moderna mjuka robotsystem. Denna metod beskriver en billig, mycket skalbar och lättanvänd förfarande för att tillverka en elektriskt kontrollerbar mjuk robot med verklighetstrogna rörelser som aktiveras och styrs av sammandragning av hjärtmuskelvävnad på ett mikromönstrad sting ray-liknande hydrogel byggnadsställning. Användningen av mjuka fotolitografimetoder gör det möjligt att framgångsrikt integrera flera komponenter i det mjuka robotsystemet, inklusive mikromönstrade hydrogelbaserade byggnadsställningar med kolnanorör (CNTs) inbäddade gelatinmecryloyl (CNT-GelMA), poly(etylenglykol) diakrylaterat (PEGDA), flexibla guld (Au) mikroelektroder och hjärtmuskelvävnad. I synnerhet hydrogeler anpassning och mikromönster är utformade för att efterlikna muskel och brosk struktur sting ray. Den elektriskt ledande CNT-GelMA hydrogel fungerar som en cell byggnadsställning som förbättrar mognad och kontraktion beteende kardiomyocyter, medan mekaniskt robust PEGDA hydrogel ger strukturella brosk-liknande stöd till hela mjuk robot. För att övervinna den hårda och spröda karaktären av metallbaserade mikroelektroder, utformade vi en serpentin mönster som har hög flexibilitet och kan undvika att hämma den slående dynamiken i kardiomyocyter. Den inbyggda flexibla Au mikroelektroder ger elektrisk stimulering över den mjuka roboten, vilket gör det lättare att kontrollera kontraktion beteende hjärtvävnad.
Introduction
Moderna state-of-the-art mjuka robotar kan efterlikna hierarkiska strukturer och muskeldynamik i många levande organismer, såsom maneter1,2,sting ray2,bläckfisk3, bakterier4,och spermier5. Härma dynamiken och arkitekturen i naturliga system erbjuder högre prestanda när det gäller både energisk och strukturell effektivitet6. Detta är i sig relaterat till den mjuka naturen hos naturlig vävnad (t.ex. hud- eller muskelvävnad med en Youngs modulus mellan 104−109 Pa) vilket möjliggör högre frihetsgrader och överlägsen deformation och anpassningsförmåga jämfört med standardiserade ställdon (t.ex. en Youngs modulus vanligtvis mellan 109−1012 Pa)6. Hjärt muskel-baserade mjuk-ställdon, särskilt, visar överlägsen energieffektivitet på grund av deras självaktivering samt deras potential för autorepair och förnyelse jämfört med ett mekaniskt baserat robotsystem7. Tillverkningen av mjuka robotar är dock utmanande på grund av nödvändigheten av att integrera olika komponenter med olika fysiska, biologiska och mekaniska egenskaper i ett system. Till exempel måste konstruerade syntetiska system integreras med levande biologiska system, inte bara ge dem strukturellt stöd utan också påverka och modulera deras aktiveringsbeteende. Dessutom kräver många mikrotillverkningsmetoder hårda/cytototoxiska processer och kemikalier som minskar livskraften och funktionen hos eventuella levande komponenter. Därför är nya metoder nödvändiga för att förbättra funktionaliteten hos de mjuka robotarna och för att kontrollera och modulera deras beteende.
För att framgångsrikt integrera levande komponenter med god lönsamhet är en hydrogelbaserad byggnadsställning ett utmärkt material för att skapa kroppen av en mjuk robot. En hydrogel fysiska och mekaniska egenskaper kan enkelt justeras för att skapa mikromiljöer för levande komponenter såsom muskelvävnader8,9. Dessutom kan det enkelt anta olika microfabrication tekniker, vilket resulterar i skapandet av hierarkiska strukturer med high fidelity1,2,10. Flexibla elektroniska apparater kan införlivas i den mjuka roboten för att styra sitt beteende med elektrisk stimulering. Till exempel, optogenetiska tekniker för att konstruera elektrogena celler (t.ex. kardiomyocyter), som visar en ljusberoende elektrofysiologisk aktivering, har använts för att utveckla en polydimethylsiloxane (PDMS)-baserade mjuk robot sting ray styrs av ljus som kunde återskapa den böljande rörelsen av fisken in vitro2. Även om optogenetiska tekniker har visat utmärkt kontrollerbarhet, använder det presenterade arbetet elektrisk stimulering, en konventionell och traditionell simuleringsmetod. Detta beror på att elektrisk stimulering via flexibla mikroelektroder är enkel och enkel jämfört med optogenetiska tekniker, som kräver omfattande utvecklingsprocesser11. Användning av flexibla elektroniska apparater kan möjliggöra långsiktig stimulering och standard /enkel tillverkning processer samt intekande biokompatibilitet och fysiska och mekaniska egenskaper12,13.
Här presenterar vi en innovativ metod för att tillverka en bioinspirerad mjuk robot, aktiveras av misshandel av konstruerad hjärtmuskelvävnad och styrs av elektrisk stimulering genom inbäddade flexibla Au mikroelektroder. Den mjuka roboten är utformad för att efterlikna muskel- och broskstrukturen i stingstrålen. Stingstrålen är en organism med en relativt lätt att efterlikna struktur och rörelse jämfört med andra badarter. Musklerna återskapas in vitro genom sådd kardiomyocyter på ett elektriskt ledande hydrogel mikromönster. Som tidigare rapporterats, införliva elektriskt ledande nanopartiklar såsom CNT i GelMA hydrogel inte bara förbättrar den elektriska kopplingen av hjärtvävnaden, men också inducerar en utmärkt in vitro vävnad arkitektur och arrangemang8,9. Brosklederna härmar sedan med hjälp av ett mekaniskt robust PEGDA hydrogelmönster som fungerar som det mekaniskt robusta substratet i hela systemet. Flexibla Au-mikroelektroder med serpentinmönster är inbäddade i PEGDA-mönstret för att lokalt och elektriskt stimulera hjärtvävnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie genomfördes i strikt enlighet med rekommendationerna i guide för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institutes of Health. Protokollet godkändes av den institutionella kommittén för djurvård och användning (IACUC) vid Brigham and Women's Hospital.
1. Gelma syntes
- Lös upp 10 g gelatin i 100 ml Dulbeccos fosfatbuffbuffrad koks (DPBS) med hjälp av en magnetisk omrörare vid 50 °C.
- Tillsätt 8 ml methacrylic anhydrid långsamt under omrörning gelatinprepolymerlösningen vid 50 °C för 2 h. Späd den reagerade gelatinlösningen med förvärmd DPBS vid 50 °C.
- Överför den utspädda lösningen till dialysmembran (molekylviktcutoff = 12–14 kDa) och placera dem i avjoniserat (DI) vatten. Utför dialys vid 40 °C i ca 1 vecka.
- Filtrera den dialyzed GelMA prepolymer lösningen med hjälp av ett sterilt filter (por storlek = 0,22 μm) och överför 25 eller 30 ml av lösningen till 50 ml rör och lagra på -80 °C i 2 dagar.
- Frystorka den frusna GelMA prepolymer lösningen med en frystork i 5 dagar.
2. Beredning av poly(etylenglykol) diakryler (PEGDA) prepolymerlösning
- Lös upp 200 mg (20% av den totala lösningen) av PEGDA (MW = 1 000) med 5 mg (0,5% av den totala lösningen) av 2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-metylpropiophenone (fotoinitierare, PI) i 1 ml DPBS.
- Inkubera prepolymerlösningen vid 80 °C i 5 min.
3. Beredning av Gelma-belagda CNT-dispergerat lagerlösning
- Lös upp 80 mg GelMA (används som bioyfactant) i 4 ml DPBS och tillsätt sedan 20 mg COOH-funktionaliserade multiwalled kolnanorör (MWCNTs) i GelMA prepolymer lösning.
- Sonicate MWCNT-lastad GelMA prepolymer lösning för 1 h (0.66Hz, 100 Watt).
OBS: Under ultraljudsprocessen måste lösningen sänkas ned i ett vattenbad vid ~15 °C för att förhindra avdunstning av lösningsmedel på grund av temperaturökningen.
4. Beredning av 1 mg/mL CNT som innehåller 5% Gelma prepolymerlösning
- Lös upp 50 mg GelMA och 5 mg (0,5% av den totala lösningen) av PI i 0,8 ml DPBS vid 80 °C i 10 min.
- Lägg till 0,2 ml av den beredda CNT-lagerlösningen (steg 3). Virvel och inkubera lösningen vid 80 °C i 10 min.
5. Beredning av en 3-(trimethoxysilyl)propylmetakrylat (TMSPMA) belagd glasbild
- Tvätta glasrutschbanorna (tjocklek = 1 mm, storlek = 5,08 cm x 7,62 cm) med ren etanol.
- Stapla de rengjorda bilderna vertikalt i en 250 ml bägare och sprida 3 ml TMSPMA ovanpå dem med hjälp av en spruta. Täck bägaren med aluminiumfolie för att förhindra avdunstning av TMSPMA.
- Inkubera rutschkanorna i en 80 °C ugn i 1 dag.
- Tvätta de belagda glasrutschbanorna genom att doppa dem i ren etanol, torka sedan.
- Förvara de belagda glasrutschbanorna insvepta i aluminiumfolie vid rumstemperatur (RT).
OBS: Försök att minimera vidröra ytorna på TMSPMA-belagda glasdiabilder.
6. Tillverkning av de flexibla Au-mikroelektroderna
- Designa en skuggmask med datorstödd design (kompletterande fil 3).
- Tillverka och köp en skuggmask.
- Tvätta glasbilden (tjocklek = 1 mm, storlek = 3 cm x 4 cm) med aceton och torka med tryckluftspistol.
- Fäst skuggmasken på glassubstraten med dubbelsidig tejp och lägg dem sedan i en E-balkförångare och vänta tills kammarens tryck når minst 10-6 Torr.
OBS: De två bitar av tejp placerades manuellt på stödet på ett avstånd tillräckligt kort för att vara värd för glaset och tillräckligt stor för att passa hela mönstret. Detta steg tar runt 45-60 min. - Sätt in ett 200 nm tjockt Au-lager av E-balkförångare (t.ex. med Denton EE-4, vakuum = 10-6 Torr, effekt = 2,6%, hastighet = 2 Å/s) och skär de tillverkade mikroelektroderna med hjälp av en tärningssågmaskin (elektroderstorlek = 7,38 mm x 8,9 mm x 200 nm).
7. Tillverkning av en Au mikroelektrodintegrerad mikromönstrad hydrogelbyggnadsställning
OBS: Resultatet av detta förfarande är ett membran där en mikromönstrad PEGDA hydrogel är i det nedre lagret, en mikromönstrad CNT-GelMA hydrogel är på toppen, och Au microelektroder är mellan de två skikten. Den här konfigurationen säkerställer en bättre flexibilitet för elektroden och begränsar risken för att bryta.
- Designa och tillverka två fotomasker för att skapa de mikromönstrade PEGDA-skikten (1st photomask) och CNT-GelMA-hydrogelen (2nd photomask). Se tilläggsfil 2–3. Designen kan göras med hjälp av CAD-programvara.
SE figur 2B, E. - Placera 50 μm distanser som gjorts genom stapling ett lager av kommersiell osynlig tejp (Tjocklek: 50 μm) på ett TMSPMA belagt glas. Häll 15 μl av 20% PEGDA prepolymer lösning ovanpå TMSPMA belagt glas, täck sedan med guld mikroelektrod. Placera den första fotomasken för glasbilden (mikromönstrad PEGDA) ovanpå guldmikroelektroden och utsätt hela konstruktionen för UV-ljus (200 W kvicksilverånga kort ljuslampa med 320–390 nm filter) på 800 mW intensitet och 8 cm avstånd för 110 s.
SE bild 1A. - Tillsätt DPBS för att omge glasbilden och lossa den mikromönstrade PEGDA hydrogeltillsammans med Au-mikroelektroderna från det obelagda glassubstratet noggrant efter 5–10 min för att få glasbilden som har den mikromönstrade PEGDA-hydrogelen med Au mikroelektroder.
SE bild 1B. På grund av TMSPMA beläggningen överförs konstruktionen från det obelagda glassubstratet till TMSPMA-belagda. Lossa försiktigt eftersom Au microelektroder kan bryta lätt under detta steg (Figur 3). - Placera 100 μm distanser gjorda genom stapling två lager av kommersiell transparent tejp (tjocklek = 50 μm) på botten av en Petri skålen. Sätt in en droppe på 20 μL CNT-GelMA prepolymer lösning mellan distanserna och sedan vända glasbilden erhålls i 7,3 och fixa den på skålen med tejp.
- Rotera enheten upp och ner och placera den2: a fotomask ovanpå glasbilden. Exponera under UV-ljus vid 800 mW intensitet och 8 cm avstånd för 200-talet.
OBS: Se figur 1C. Justering av 2: a masken är viktigt. - Tvätta den erhållna byggnadsställningen med DPBS och med cellodlingsmedium som inkluderar 10% fetalt bovinserum (FBS).
- Lämna dem över natten i 37 °C-inkubatorn innan de sås cellerna.
8. Neonatal råtta kardiomyocyter isolering och kultur
- Isolera hjärtan från 2-dagars gamla Sprague-Dawley råttor efter protokoll som godkänts av institutets kommitté för djurvård8.
- Sätt hjärtat bitar på shaker natten (ca 16 h) i 0,05% trypsin utan EDTA i HBSS i ett kallt rum.
- Samla hjärtat bitar med en pipett pistol och minimera mängden trypsin, sedan lägga dem i en 50 ml rör med 10 ml varmt hjärtmedia (10% FBS, 1% P / S, 1% L-glutamin).
- Snurra långsamt (~ 60 rpm) i en 37 ° C vattenbad i 7 min. Ta bort media försiktigt från röret med en 10 ml pipett e och lämna hjärtat bitar i röret.
- Tillsätt 7 ml 0,1 % kollagen typ 2 i HBSS och snurra i ett vattenbad på 37 °C i 10 min.
- Blanda med en 10 ml pipett 10x försiktigt för att störa hjärtat bitar. Ta bort mediet från röret med en 1 ml pipett.
- Tillsätt 10 ml 0,1 % kollagen typ 2 i HBSS och snurra snabbt (~120–180 rpm) i ett vattenbad på 37 °C i 10 min, kontrollera sedan om hjärtbitarna upplöses.
- Blanda med en 10 ml pipett, upprepa sedan med en 1 ml pipett för att bryta de sista hjärtbitarna.
- När lösningen ser homogen ut placerar du en 30 μm cellsil på ett nytt 50 ml-rör och rör lösningen 1 ml åt gången på sil.
- Centrifugera hjärtcelllösningen vid 180 x g i 5 min vid 37 °C.
OBS: Om det fortfarande finns några hjärtbitar eller slem som inte upplöstes, upprepa steg 8,7–8,9 igen. - Ta försiktigt bort all vätska ovanför cellpelleten och återsuspenderade cellerna i 2 ml hjärtmedier.
- Tillsätt 2 ml hjärtmedia från rörväggen noggrant för att återsuspendera cellerna och undvika att bryta dem.
- Tillsätt de upphängda cellerna i en T175-kolv med varma hjärtmedier droppe för droppe. Lägg kolven i en 37 °C-inkubator i 1 h för att hjärtfibroblaster ska kunna fästas på botten.
OBS: Vid detta preplating steg, hjärt fibroblaster kommer att fästa på kolven medan kardiomyocyter kommer att finnas kvar i suspensionen medium. - Samla in media från kolven som innehåller kardiomyocyter och lägg den i ett 50 ml-rör.
- Räkna cellerna och centrifugera sedan vid 260 x g i 5 min vid 37 °C.
- Resuspend och frö cellerna ovanpå den tillverkade mjuka roboten i steg 7. Häll specifik volym av hjärtmedia med kardiomyocyter vid en koncentration av 1,95 × 106 cell/ml droppe för fall på hela ytan av enheten.
- Inkubera proverna vid 37 °C och ändra media med 5 ml cellkulturmedia med 2% FBS och 1% L-glutamin på första och andra dagarna efter sådd. Ändra media varje gång färgen på mediet skiftar.
9. Cellfärgning för justeringsanalys
- Ta bort mediet och tvätta med DPBS i 5 min på RT.
- Fixa cellerna med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min på RT. Tvätta sedan med DPBS i 5 min på RT.
- Inkubera cellerna med 0,1% triton i DPBS på RT för 1 h. Tvätta 3x med PBS i 5 min på RT.
- Inkubera cellerna med 10% getserum i DPBS på RT för 1 h.
- Inkubera cellerna med en primär antikropp (sarkomeric α-aktinin och connexin-43) i 10% getserum i DPBS vid 4 °C för ~14–16 h.
- Tvätta 3x med DPBS i 5 min på RT. Inkubera cellerna med sekundär antikropp i 10% getserum i DPBS på RT för 1 h.
- Tvätta 3x med DPBS i 5 min på RT, sedan counterstain celler med 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) i DI vatten (1:1,000) för 10 min på RT. Tvätta 3x med DPBS i 5 min på RT.
- Ta fluorescensbilder med hjälp av ett inverterat laserscanningkonfokalmikroskop.
10. Vidställdonstestning och beteendeutvärdering
- Spontan misshandel av kardiomyocyter på den mjuka roboten
- Inkubera bioinspirerade ställdon vid 37 °C i 5 dagar och uppdatera mediet dag 1 och 2 och vid behov (dvs. när media blir gula). Använd ett inverterat optiskt mikroskop för att ta bilder dagligen (5x och/eller 10x). Spela in cellrörelser med hjälp av videoinspelningsprogram på mikroskopets livefönster i 30-tal vid 20 bildrutor per sekund (5x och/eller 10x) när kontraktilaktiviteten startar (i allmänhet runt dag 3).
- Dag 5, lossa membranen genom att försiktigt lyfta från kanten med en täckglidning.
OBS: Om cellerna visar en stark slå beteende, membranen kommer att lossna av sig själva på grund av den mekaniska effekten av sammandragningar.
- Bulk elektrisk signal stimulering
- Använd en 3 cm fördelad PDMS som hållare, fäst två kolstångselektroder med platina (Pt) tråd i en 6 cm Petri-skål fylld med hjärtmedia. Överför sedan försiktigt den mjuka roboten till Petriskålen.
- Applicera en fyrkantig vågform med 50 ms pulsbredd, DC-offsetvärde 0 V och högspänningsamplitud mellan 0,5 och 6 V. Frekvensen varierar mellan 0,5, 1,0 respektive 2,0 Hz med en arbetscykel mellan 2,5 %, 5 %respektive 10 %. Spela in sammandragningar av makroskala med hjälp av en kommersiellt tillgänglig kamera.
- Elektrisk stimulering med Au-mikroelektroderna
- Efter tillverkning av Au microelectrode-integrerade flerskiktade hydrogel byggnadsställning, fäst två koppartrådar till Au elektroder om en extern fyrkantig port med silverpasta.
- Täck silverpastan med ett tunt lager PDMS precured vid 80 °C i 5 min. Lägg sedan proverna på en värmeplatta vid 45 °C för 5 h för att helt korsa PDMS.
- Efter sådd kardiomyocyte, applicera en fyrkantig våg elektrisk stimulans på koppartrådar med DC offset värde 1 V, toppspänning amplitud mellan 1,5 och 5 V, och frekvenser på 0,5, 1,0 och 2,0 Hz respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flödesdiagram över stegen för att utveckla Au microelectrode-incorporated bioinspirerad mjuk robot
Syftet med den mjuka robotdesignen var att bygga ett membran som kan aktivera en simrörelse med minimal komplexitet. Strukturen måste kunna upprätthålla starka flexions upprepade gånger över tiden (ca 1 Hz) och kunna hålla formen samtidigt uppnå en stark stryk. Genom att selektivt foto korsa polymeren med fotomasker, tillverkade vi en hierarkiskt strukturerad byggnadsställning bestående av en mikromönstrad PEGDA hydrogel lager, en flexibel Au microelectrodes lager, och en mikromönstrad CNT-GelMA hydrogel lager. Ett schemadiagram och faktiska bilder av den mjuka robotens tillverkningsförfarande enligt beskrivningen i protokollet visas i figur 1. Kort fanns det tre huvudsakliga tillverkningssteg för bioinspirerad mjuk robot med inbäddade Au microelektroder: För det första, en mikromönstrad PEGDA hydrogel med inbyggd Au microelektroder erhölls genom UV crosslinking med hjälp av 1: a fotomask(Figur 1A, B). För det andra tillverkades en flerskiktad konstruktion bestående av Au microelektroder, den mikromönstrade CNT-GelMA och PEGDA-hydrogelerna av UV-tvärbindning med hjälp av den 2: a fotomasken(figur 1C). Slutligen var kardiomyocyter seedade på den tillverkade trelagerskonstruktionen för att ge aktivering till den mjuka roboten(figur 1D).
Olika mönster av den mjuka roboten
När det gäller formen på den mjuka roboten, i början, designade vi två bioinspirerade former genom att biomima mönstren på två olika vattenlevande djur. Den första designen var inspirerad av utseendet på en caraibic sjöstjärna(Figur 2A, B, C), eftersom sjöstjärnan kan förenklas till ett tvådimensionellt (2D) objekt, har en hård ryggrad, och har en flexibel del som går samman för att flytta i vattnet, minimera den nödvändiga rörelsen. Den andra enheten baserades på formen på en mantastråle(figur 2D, E, F)som är lätt att reproducera i en 2D-enhet. Manta ray kan simma snabbt med unika rörelser. Vi skissade mantaray med hjälp av grundläggande geometriska former med minskad komplexitet som ska korslänkas under fotomasksteget. Elektroden, placerad längs mitten av strukturen, utformades med ett vågigt mönster, vilket möjliggör en bättre spridning av elektriska pulser och flexibilitet(figur 2D). För att utveckla den bioinspirerade mjukroboten valdes den manta ray-inspirerade formen ut och testades noggrant i denna studie.
Utmaningen att bädda in Au-mikroelektroderna mellan CNT-GelMA och PEGDA hydrogeler
Inkapsling av 200 nm tjocka Au mikroelektroder i den tillverkade robotkroppen kan lokalt styra konstruktionen genom att ge elektrisk stimulering. Även om UV-tvärbindningen av både CNT-GelMA- och PEGDA-hydrogelmmönstren direkt på elektrodytan hämmade elektrodernas delaminering, garanterade den elektrodens framgångsrika införlivande i den mjuka roboten. Efter att ha överfört Au-elektroden på PEGDA hydrogelerna bröts au-elektroden med rektangulär form och bred bredd (>1 mm) lätt under tillverkningsprocessen på grund av svullnaden av PEGDA-hydrogelen(figur 3A, B, C). Därför behövde vi se till att mikroelektroderna framgångsrikt överfördes till PEGDA hydrogel och inbäddade mellan CNT-GelMA och PEGDA hydrogeler medan intakt. Därför utformades och tillverkades Au-mikroelektroder med serpentinmönster (tjocklek = 200 μm) med mjuk litografi. Fas kontrast mikroskop bilder med olika förstoringsglas och stadier togs för att inspektera tecken på fraktur på elektroden efter transport på mikromönstrade PEGDA hydrogeler(Figur 3D, E, F).
Optimering av avstånd mellan hydrogelmikromönster
Kardiomyocyteseedade CNT-GelMA-skiktet visade olika slagbeteende enligt mönsteravstånden (figur 4A, B). Detta kan hänföras till de olika sätt celler som är knutna till membranets yta beroende på linjernas avstånd. När det gäller avståndet på 50 μm var cellerna för packade och hade inte önskad organiserad konfiguration. De delvis sammankopplade och inte anpassade cellerna på vingarna bidrog inte samtidigt till simrörelsen. Därför var den kraft som genereras av kardiomyocyt inte tillräckligt för att böja vingarna. På ett avstånd på 150 μm var cellerna mycket väl anpassade. Men de satt främst i spåret och det fanns få sammankopplingar mellan celler i de övre skikten, vilket resulterade i svag misshandel. På ett avstånd på 75 μm justerades cellerna i den nedre delen och sammankoppladei den övre delen, vilket visar den starkaste misshandeln. Dessutom, för att förhindra irreversibel komplett rullande av den mjuka roboten under dynamisk stryk av kardiomyocyter, optimerade vi mönstret avstånd pegda hydrogel stödskikt till 300 μm(figur 4C). Slutligen, efter denna parameteriseringprocess, bestämde vi oss för att fokusera mer på manta ray-formade membran med 300 μm avstånd PEGDA mönster och 75 μm avstånd CNT-GelMA mönster. Hjärtvävnad på mikromönstrade PEGDA- och CNT-GelMA-mönster visades också av fas-/kontrastbilder och F-aktin/DAPI-konfokala bilder (figur 4B).
Analysen av hjärtvävnadens rörelse på mikromönstrade PEGDA- och CNT-GelMA hydrogeler
För att analysera manöverdonets rörelse tog vi videor av membranet utan Au-mikroelektroderna samtidigt som vi applicerade ett elektriskt fält med hjälp av en kolstångselektrod. Bild 4D visar några ramar tagna från kontraktionsposterna. Det var tydligt att manta ray-formad ställdon böjde vingarna som förväntat. Svansen balanserade strukturen genom att räta upp lite och vingarna var starkt stängning i mitten. Några av membranen visade en roterande rörelse medan upphandlande på grund av feljusterade mikromönstrade CNT-GelMA och PEGDA hydrogels(figur 4E och Video 1). I detta fall var rörelsen mindre definierad jämfört med den tidigare men sammandragningen var fortfarande stark nog att möjliggöra aktivering av en roterande rörelse. Den totala tiden för att slutföra en hel cirkel var cirka 45 s.
Kardiomyocyternas kardiomyocyter på den flerskiktade soft roboten och kontroll av misshandelsbeteendet genom elektrisk stimulering
Efter sådd och mognad av kardiomyocyter på bioinspirerade robotsystem (figur 5A), anpassning av hjärtvävnaden längs riktningen av CNT-GelMA mönster observerades(figur 5B-E) av både F-actin/ DAPI och helgerån/connexin-43/DAPI immunstaining. Konfokal fluorescens bilder visade väl långsträckta och anpassade kardiomyocyter på CNT-GelMA hydrogel mönster (Figur 5B, C). Partiell uniaxial sarkomre anpassning och sammankopplade sarkomre struktur observerades på mönstrade områden(figur 5D). Väl sammankopplade sarkomstrukturer av hjärtvävnader som ligger direkt ovanför mikroelektroderna observerades också (figur 5E). För att bedöma den bioinspirerade mjukroboten upptäckte vi dess funktion med två metoder: För det första tillämpade vi en bifasisk elektrisk puls på den mjuka roboten men kolstavelektroder för artificiell justering och styrning av misshandeln. För det andra kopplade vi två koppartrådar till den yttersta änden av Au-elektroden för att generera en elektrisk signal genom hela robotkonstruktionen. När vi applicerade en elektrisk stimulering genom den externa kolelektroden eller koppartråden ansluten till Au-elektroden var excitettröskelns tröskelspänningen annorlunda vid olika frekvenser (0,5, 1,0 och 2,0 Hz, figur 5F).
Figur 1: Schemaschema diagram och faktiska bilder som visar tillverkningsprocessen för den bioinspirerade flerskiktade mjukroboten som styrs elektriskt med elektrisk signal via integrering av flexibla Au-mikroelektroder. (A)Mönster och korskoppling av PEGDA hydrogel med hjälp av 1st fotomask. B)Mikromönstrad PEGDA hydrogel med inkapslade Au-mikroelektroder på TMSPMA-glaset som erhålls efter steg(A). (C)Korskoppling av CNT-GelMA mönstrad hydrogel med hjälp av den2: a fotomasken. (D)Sådd av kardiomyocyter på den flerskiktade konstruktionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Design av bioinspirerade mjuka robotar. (A) Real sjöstjärna bild och olika vyer av den tredimensionella (3D) CAD-modellen pekar ut komponenter och ränder. (B)Maskdesign för CNT-GelMA-mönster, PEGDA-mönster och Au-mikroelektroder för sjöfiskformen. (C)Optisk mikroskopbild av de mikromönstrade CNT-GelMA- och PEGDA-mönstren för sjöfiskformen. (D)Verklig manta ray bild och olika vyer av 3D CAD-modellen pekar ut komponenterna. (E)Maskdesign för CNT-GelMA-mönster, PEGDA-mönster och Au-mikroelektroder för mantastrålformen, anpassad med tillstånd från Su Ryon et al.10. (F)Optisk mikroskopbild av de mikromönstrade CNT-GelMA- och PEGDA-mönstren för mantastrålformen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Design av de flexibla Au-mikroelektroderna. A) Fotografi av fabricerade Au elektroder med rektangulära former och breda bredder. (B och C)Optiska mikroskopbilder av Au-elektroder som inte kunde överföras till PEGDA-hydrogelerna. (D)Wavy Au-mikroelektroder före och efter(E och F)överförs på den mikromönstrade PEGDA hydrogelen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Optimering av mikromönstrade PEGDA och CNT-GelMA hydrogeler och rörelseanalys av mjuka robotar. (A)Optiska bilder av kardiomyocyter på CNT-GelMA hydrogel mönster med 50, 75 och 150 μm avstånd. (B)Optiska bilder och F-aktin/DAPI-färgning av kardiomyocyter på PEGDA- och CNT-GelMA hydrogel-mönstren med 300 μm respektive 75 μm avstånd. (C)De bioinspirerade konstruktionernas rullande morfoser med och utan den mikromönstrade PEGDA hydrogelen med 300 μm avstånd. (D)Ramar av den fristående bioinspirerade soft robotvideo som spelats in samtidigt som den elektriska stimulansen appliceras. (E)Collage av fyra olika ramar tagna från videon inspelning den roterande rörelsen av den mjuka roboten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Kardiomyocyter på Au microelectrode-incorporated mjuk robot och kontroll av slå beteende genom elektrisk stimulering. (A)Optiskmikroskopbild av de odlade kardiomyocyterna på Au-mikroelektroderna inkapslade mellan PEGDA och CNT-GelMA hydrogeler. (B)F-aktin/DAPI-fluorescensbild som visar de väl avlånga och justerade kardiomyocyterna på CNT-Gelma hydrogelmikromönstret. (C-E) Konfokal fluorescens bilder som visar sarkomre anpassning och sammankopplade sarkomre strukturer på den tillverkade mjuka roboten: (C och D)odlade kardiomyocyter på CNT-GelMA hydrogel mikromönster, och (E) nära Au microelektrods. (F)Krävs excitationtröskelspänning vid olika frekvenser (0,5, 1,0 och 2,0 Hz) vid användning av elektrisk stimulering via kolstångselektrod och inbäddade Au-mikroelektroder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1. Klicka här för att se den här videon (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande fil 1. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande fil 2. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande fil 3. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med denna metod kunde vi framgångsrikt tillverka en batoid fiskliknande bioinspirerad mjuk robot med en integrerad självaktivering hjärtvävnad på en flerskiktsstrukturerad byggnadsställning som styrs av inbäddade Au mikroelektroder. På grund av två distinkta mikromönstrade hydrogelskikt av PEGDA och CNT-GelMA hydrogels visade den bioinspirerade byggnadsställningen god mekanisk stabilitet och idealisk celljustering och mognad. PEGDA-mönstret lager, som fungerar som en brosk gemensamma av skelettet arkitektur i en sting ray, ger mekaniskt stöd för hela roboten kroppen. Specifikt behöll den mekanisk stabilitet under hjärtvävnadskontraktion och avkoppling, samtidigt som den möjliggör effektiv misshandel på grund av dess förmåga att frigöra membranspänningen efter kontraktion. Dessutom tillät den nanometriska tjockleken hos mikroelektroderna (200 nm), liksom deras serpentinmönster, dem att vara tillräckligt flexibla för att inte hindra eller påverka sammandragningen av hjärtvävnaden(figur 2). För att enkelt överföra mikroelektroder på hydrogelytan utan brott tillverkades Au microelektroder på glaset utan vidhäftningsskikt, såsom titan, som ofta används för att skapa stark vidhäftning mellan glaset och Au. Under tiden gjordes CNT-GelMA-skiktet, som ger stöd för kardiomyocytfast fäste och anpassning, med mönster vinkelrätt mot orienteringen av PEGDA hydrogelmönster (figur 3). Efter mognad, kardiomyocyter på det översta lagret som självaktivering för hela byggnadsställningen. Genom den lokala elektriska stimuleringav den inbyggda Au flexibla mikroelektroder, kunde vi modulera slå frekvensen av roboten utan att skada hjärtvävnaden på den. Även om denna tillverkningsmetod är lätt att lära sig och att reproducera, det finns fortfarande några tekniskt utmanande steg i tillverkningsprocessen som måste betonas.
Det finns fem kritiska steg för tillverkning av den mjuka bioroboten: 1) korrekt spridning av CNTs i GelMA hydrogel; 2) framgångsrik UV-korskoppling av PEGDA och CNT-GelMA hydrogeler på TMSPMA-belagda glas; 3) Överföring av Au-mikroelektroderna från stödglaset till hydrogelmönstret. 4) korrekt avlossning av ställdonet från den stödjande glasbilden. 5) Skapande av god elektrisk kontakt mellan Au-mikroelektroderna och de ledningar som används för anslutningen till vågformens generator.
Jämfört med orörda GelMA substrat, införlivandet av CNTs ger GelMA hydrogel med förbättrade mekaniska egenskaper och avancerade elektrofysiologiska funktioner som bidrar till högre spontana synkrona slå priser och en lägre excitation tröskel för hjärtekarvävnad9. Problemet med CNT cytotoxicitet förhindras inte bara genom att använda ytfunktionella CNTs, utan också genom att införliva nanostrukturerna i GelMA hydrogelmatrisen upp till en koncentration på 5,0 mg/ml9. I själva verket leder samspelet mellan de hydrofoba segmenten i GelMA hydrogel med CNTs sidoväggar till inkapsling av CNTs i hydrogelporous matris14. Detta hindrar dem inte bara från att bilda potentiellt giftiga aggregat, men det förbättrar också CNTs löslighet i saline lösningar (t.ex. DPBS eller cell odling medium).
För att framgångsrikt införliva Au-mikroelektroderna mellan PEGDA och CNT-GelMA hydrogeler måste särskild uppmärksamhet läggas i UV-tvärbindningen av varje enskilt skikt. Specifikt, för att överföra Au microelektroder på PEGDA hydrogel skiktet, är det nödvändigt att se till att hydrogellösningen täcker hela elektrodområdet för att undvika bristning av elektroderna under peeling steget. Därför är kvaliteten på TMSPMA glasbeläggning en grundläggande för att garantera en optimal vidhäfting av PEGDA hydrogel på glassubstratet, vilket förhindrar dess lossnande under överföringen steg av mikroelektroderna.
Ett annat kritiskt steg i metoden är avlossningen av bioactuatorn från den stödjande glasbilden. Detta problem kan enkelt lösas när den spontana misshandeln av hjärtvävnaderna är synkron och stark nog att naturligt skala den stödjande hydrogelfrån glasbilden. Av denna anledning, som rapporterats tidigare, är det grundläggande att optimera hydrogel mönster för att inducera en specifik cell justering gynnsam för organisationen av en funktionell och synkron hjärtvävnad.
För att elektriskt ansluta mikroelektroderna till vågformen generator, måste elektriska anslutningar skapas på mikroelektroderna. Under detta steg är det viktigt att helt kapsla in silverlim som används för att kontakta mikroelektroderna till koppartråden för att undvika cytotoxiska effekter. Detta uppnås framgångsrikt genom att deponera en tunn droppe PDMS på toppen av den elektriska kontakten.
Denna metod kunde inte bara övervinna begränsningarna i befintliga optogenetiska tekniker, såsom komplicerade tillverkningsprocesser, långa tillverkningstider och potentiell toxicitet av optogenetiska verktyg, men också starkt förbättra prestandan hos cellbaserade ställdon som leder till stimulering i realtid med hjälp av billiga och lätthandstekniker. Även om utformningen av våra nuvarande bioinspirerade ställdon inte kunde generera framdrivning, kan dess framgång inom autonoma cellbaserade robotar locka till sig ett stort intresse. Denna metod kan också potentiellt bidra till utvecklingen av trådlöst drivna implanterbara patchar för en hel robot kropp. Denna metod banar väg för framtida trådlös elektrisk stimulering av mjuk-biorobotar men integrationen av flexibla RF-kretsar direkt i hydrogel-baserade byggnadsställning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta dokument finansierades av National Institutes of Health (R01AR074234, R21EB026824, R01 AR073822-01), Brigham Research Institute Stepping Strong Innovator Award och AHA Innovative Project Award (19IPLOI34660079).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Beaker | PYREX | 1000-250CNEa | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Milipore | M6514 | |
| 37° Water bath | VWR | W6M | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | |
| 80° incubator | VWR | 1370GM | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Anti-Connexin 43/GJAI antibody | Abcam | ab11370 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Sarcomeric α-actinin | Abcam | ab9465 | Mouse monoclonal |
| Benchtop Freeze Dryers | Labconco | 77500-00 K | |
| Biosafety cabinet | Sterilgard | A/B3 | |
| Carbon rod electrodes | SGL Carbon Group | 6971105 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| CO2 incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Collagenase, Type II, Powder | Gibco | 17-101-015 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| COOH Functionalized Carbon Nanotubes | NanoLab | PD30L5-20-COOH | |
| Dicing saw machine | Giorgio Technology | DAD-321 | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11-965-118 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-144 | |
| E-beam evaporator | CHA | 57367 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10-437-028 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B, 300 bloom from porcine skin |
| Glass slide | VWR | 48382-180 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-079 | |
| Inverted optical microscope | Olympus | CK40 | |
| Magnetic hotplate | Corning | PC-420 | |
| methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276695 | Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor |
| Nunc EasYFlask 175cm2 | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| Olicscope | Siglent | SDS1052DL+ | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PDMS SYLGARD 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| Photomask | Mini micro stencil inc | ||
| Platinum wire | Alfa Aesar | AA43014BU | |
| Polyethylene glycol dimethcrylate | Polysciences Inc. | 15178-100 | |
| Regenerated Cellulose Dialysis Tubing | Fisherbrand | 21-152-14 | |
| Silver Epoxy Adhesive | MG Chemicals | 8330S | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | S2GPU02RE | |
| Ultra sonicator | Qsonica | Q500 | |
| UV Curing System | OmniCure | S2000 | |
| Vortex mixer | Scientific Industry | SI-0246A | |
| Waveform generator | Agilent | 33500B | |
| Wrap Aluminium foil | Reynolds | N/A |
References
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nature Biotechnology. 30 (8), 792-797 (2012).
- Park, S. J., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Laschi, C., et al. Soft Robot Arm Inspired by the Octopus. Advanced Robotics. 26 (7), 709-727 (2012).
- Alapan, Y., et al. Soft erythocyte-based bacterial microswimmers for cargo delivery. Science Robotics. 3 (17), 4423 (2018).
- Magdanz, V., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Development of a Sperm-Flagella Driven Micro-Bio-Robot. Advanced Materials. 25 (45), 6581-6588 (2013).
- Rus, D., Tolley, M. T. Design, fabrication and control of soft robots. Nature. 521 (7553), 467-475 (2015).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16 (18), 3473-3484 (2016).
- Shin, S. R., et al. Aligned Carbon Nanotube–Based Flexible Gel Substrates for Engineering Biohybrid Tissue Actuators. Advanced Functional Materials. 25 (28), 4486-4495 (2015).
- Shin, S. R., et al. Carbon-nanotube-embedded hydrogel sheets for engineering cardiac constructs and bioactuators. ACS Nano. 7 (3), 2369-2380 (2013).
- Shin, S. R., et al. Electrically Driven Microengineered Bioinspired Soft Robots. Advanced Materials. 30 (10), 1704189 (2018).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
- Jia, Z., et al. Stimulating cardiac muscle by light: cardiac optogenetics by cell delivery. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (5), 753-760 (2011).
- Shin, S. R. Carbon Nanotube Reinforced Hybrid Microgels as Scaffold Materials for Cell Encapsulation. ACS Nano. , (2013).
