Summary
لعرض وتحديد الميزات الداخلية للأفلام الحيوية المبيضات albicans، ونحن إعداد العينات سليمة ثابتة التي يتم توضيحها عن طريق مطابقة مؤشر الانكسار. ثم ، يمكن استخدام المجهر المقطعي البصري للحصول على بيانات صور ثلاثية الأبعاد على الرغم من السماكة الكاملة للبيوفيلم.
Abstract
الفطريات الميكروبية المبيضات ألبيكانس يمكن أن تخضع لتغيير من الاستعمار commensal إلى الفوعة التي ترتبط بقوة مع قدرتها على التحول من نمو الخميرة شكل لنمو الهيفال. تصبح الخلايا التي تبدأ هذه العملية ملتصقة بالأسطح وكذلك ببعضها البعض ، مع التطور الناتج لمستعمرة بيوفيلم. يحدث هذا عادة ليس فقط على أسطح الأنسجة المخاطية في عدوى الخميرة ، ولكن أيضًا على الغرسات الطبية مثل القسطرة. ومن المعروف جيدا أن الخلايا البيوفيلم مقاومة للأدوية المضادة للفطريات، وأن الخلايا التي تسلط من بيوفيلم يمكن أن يؤدي إلى التهابات الجهازية الخطيرة. تتراوح الأغشية الحيوية من الشفافة بشدة إلى المبهمة بسبب عدم التجانس الانكساري. لذلك ، يصعب دراسة الأغشية الحيوية الفطرية عن طريق المجهر البصري. لتصور الميزات الداخلية الهيكلية والخلوية ودون الخلوية ، نوضح الأغشية الحيوية الثابتة عن طريق تبادل المذيبات خطوة إلى نقطة مطابقة مؤشر الانكسار الأمثل. بالنسبة للأغشية الحيوية C. albicans ، يتم الحصول على توضيح كافٍ مع ساليسيلات الميثيل (n = 1.537) لتمكين المجهر المعالبؤر من القمة إلى القاعدة في 600 ميكرومتر من الأغشية الحيوية مع القليل من التوهين. في هذا البروتوكول التصور نحدد مرحلة قياس الانكسار التباين، ونمو الأغشية الحيوية المختبرية، والتثبيت، وتلطيخ، وتبادل المذيبات، وإعداد المجهرية الفلورية الطورية، والنتائج التمثيلية.
Introduction
المبيضات ألبيكانز هو الفطريات الميكروبية التي عادة ما تكون commensal في البشر. هو من أهمية أساسية لعلماء الأحياء لأن الكائن الحي لديه مورفولوجيامتعددة. على سبيل المثال ، استجابة لبعض الإشارات البيئية أو الضغوطات ، ستتحول الخلايا الناشئة على شكل الخميرة إلى النمو الخيطي كسلاسل من الخلايا الممدودة للغاية المعروفة باسم hyphae. الانتقال مهم كمثال على التعبير phenotypic من التحول بين برنامج التعبير الجيني أحادي الخلايا ومتعددة الخلايا. وبالمثل ، C. albicans هو من مصلحة الطب الحيوي لأن الكائن الحي هو عامل ممرض الانتهازية المعروفة. وهي مسؤولة عن التهابات الخميرة المخاطية مثل مرض القلاع (داء المبيضات الفموي) ، والالتهابات التناسلية للنعامين ، وسبب العدوى الغازية أو الجهازية الخطيرة في المرضى الذين يعانون من ضعف المناعة.
وترتبط إمكانات هذا الكائن الحي للفوعة ارتباطا وثيقا بأشكاله المتعددة والجوانب الأخرى من براعة الجينية1،2،3،4. ملحق أنبوب جرثومة، المرحلة الأولى مرئية من الانتقال إلى نمو الهيفال، يحدث مع سرعة كافية لتمكين الخلايا المهق C. التي اجتاحت للخروج من البلعوم وبالتالي الهروب من مرحلة مبكرة من الاستجابة المناعية الخلوية للمضيف5. بالإضافة إلى ذلك ، يسبق خيوط ويرافقه زيادة كبيرة في التمسك خلية إلى خلية وخلية إلى سطح التي يرجع ذلك إلى التعبير المنظم من عدة فئات من البروتينات جدار الخلية المعروفة باسم adhesins6،7،8،9. في ظل مجموعة واسعة من الظروف، يؤدي الجمع بين الالتزام والخيط إلى تحول كبير من النمو العوالق وأحادي ة الخلية إلى النمو الاستعماري المرتبط بالسطح الذي يشكل فيلمًا حيويًا. C. قد تتطور الأفلام الحيوية albicans على الأجهزة الطبية المزروعة الشائعة مثل القسطرة الوريدية. يمكن أن تنتج العدوى المنشورة عندما تبدأ هذه الأغشية الحيوية في التبذيع من خلايا الخميرة وسفكها في الدم المتداول. وقد أظهرت دراسات متعددة أن الخلايا البيوفيلم هي أكثر مقاومة للأدوية المضادة للفطريات من الخلايا العوالق10،11، والتي قد تكون راجعة جزئيا إلى انخفاض التمثيل الغذائي12. وعلاوة على ذلك، فإن الالتزام العام عالية من بيوفيلم قد توفر الرسو اللازمة للنمو الغازية كفاءة من hyphae في الأنسجةالمضيفة 1.
وكان للتوضيح البصري للأفلام الحيوية C. albicans عن طريق مطابقة مؤشر الانكسار تأثير كبير على قدرتنا على تصور بنية هذا المجتمع الميكروبي واكتشاف العلاقات بين التعبير الجيني والنمط الظاهري. الأغشية الحيوية التي تزرع في المختبر على أسطح الاختبار تحت وسط الثقافة السائلة لمدة 48 ساعة تظهر كطلاء أبيض كثيف بما فيه الكفاية وسميكبما يكفي لتكون معتمة(الشكل 1). لذلك ، يتم إخفاء العديد من الميزات المثيرة للاهتمام من البيوفيلم عن الأنظار. 24 ساعة الأغشية الحيوية البرية التي تزرع في YPD، RPMI-1640، أو متوسط العنكبوت في نطاق 37 درجة مئوية تصل إلى 300 ميكرومتر سميكة، مع 48 ساعة الأغشية الحيوية غالبا ما تصل إلى 500 ميكرومتر. يرجع التعتيم إلى تشتت الضوء ، والذي ينشأ من عدم التجانس الانكساري: جدار الخلية الفطرية أكثر انكسارية من الوسط المحيط ، والسيتوبلازم أكثر انكسارية قليلاً من جدار الخلية. الكثافة البصرية العالية الناتجة عن فيلم بيوفيلم الأصلي يحجب جميع الهياكل أكثر من 30 ميكرومتر عميقة عندما ينظر إليها مع المجهر التقليدية أو حتى الماسح الضوئي المعالبؤر(الشكل 2). ومع ذلك، يمكن تحقيق درجة كبيرة من التوضيح عن طريق اختراق الأغشية الحيوية الثابتة مع سائل مؤشر انكسارية عالي يطابق تقريباً الانكسار للمكونات الخلوية الرئيسية. بعد التوضيح ، يمكن إجراء التصوير في دقة submicron عن طريق المجهر البؤري من خلال سمك كامل من أي C. albicans biofilm13. في عينات النوع البري ، من السهل أن نرى أن الأغشية الحيوية تتكون من hyphae متشابكة طويلة ، ومجموعات من خلايا الخميرة في مهدها أو الخلايا الزائفة ، والمساحات الفراغية ، وبعض كمية من المصفوفة خارج الخلية. وعلاوة على ذلك، يتم بشكل عام الأغشية الحيوية الطبقية، والتي تظهر الاختلافات المورفولوجية المتغيرة مكانياً في نوع الخلية، وكثافة الخلايا، ووجود الخلايا الناشئة أو المتفرعة. وقد لوحظت اختلافات كثيرة في واحد أو أكثر من هذه الميزات في الأغشية الحيوية التي وضعتها سلالات متحولة14،15. بالإضافة إلى ذلك، تظهر سلالات المراسل في الموقع الاختلافات المكانية في التعبير الجيني16،9،13. درجة مدهشة من التوضيح يمكن الحصول عليها مع هذا النهج بسيطة نسبيا وغير مكلفة يجعل من الممكن أيضا أن نرى أن العديد من الأغشية الحيوية تشمل hyphae apical وhyphae الغازية القاعدية تمتد إلى مسافات ملليمتر.
في بروتوكول التصور هذا ، نُظهر تحديد ، وضع العلامات ، التوضيح ، والتصوير لـ C. albicans biofilm باستخدام علامة جدار الخلية البسيطة كبقعة. أصل النسخة الحالية من البروتوكول هو تحسين الوضوح لاحظنا عندما تم اختراق الأغشية الحيوية ذات الفورمالديهايد الثابتة مع 97٪ من الميثاكريلات الجلايكول (GMA) ، والتي تم بلمرةها بعد ذلك لتضمين البيوفيلم في البلاستيك الصلب الذي لديه مؤشر انكسار عالي بشكل معتدل (n = 1.49). ثم استخدمنا المجهر التقليدي للتباين في المرحلة وسلسلة من السوائل المرجعية للمؤشر الانكساري لتحديد نقطة انعكاس التباين (أقصى شفافية) للفيلم الحيوي(الشكل 3)بدقة أكبر. لC. albicans biofilms حدث هذا بالقرب من ن = 1.530, الذي كان مرتفعا بشكل مدهش بالنظر إلى أن بنية البروتين الكثيفة مثل الكيراتين الشعر هو فقط أكثر قليلا الانكسار (1.54-1.55). على الرغم من أنه على الطرف العلوي من النطاق الأمثل في الشكل 3، اعتمدنا ساليسيلات الميثيل (زيت wintergreen ، n = 1.537) في البروتوكول الحالي لأنه استخدم منذ فترة طويلة كعامل توضيح للفحص المجهري في علم الأجنة وعلم الأنسجة ، فقد سمية منخفضة وضغط بخار منخفض ، وأعطى نتائج ممتازة في تجاربنا باستخدام بصريات الغمر الزيتية المعتدلة NA.
وينبغي الإشارة إلى أربع نقاط هنا:
(1) مع استثناءات قليلة ، فإن الوضع المثالي في المجهر هو أن مؤشر الانكسار للعينة يجب أن يكون مساوياً لمؤشر الانكسار لسائل الغمر في العدسة الموضوعية17،18،13. بالنسبة لدراسات التصوير ثلاثية الأبعاد (3D) حيث يكون التركيز العميق ضروريًا ، فإن هذا مهم دائمًا.
(2) لدينا نتيجة تجريبية للتطهير الأمثل (ن = 1.525-1.535) هو أعلى قليلا من زيوت الغمر القياسية (ن = 1.515، 1.518) وبالتالي ينتهك نقطة (1)، وبالتالي يقدم مصدرا للانحراف الكروي عند استخدام البصريات الغمر النفط القياسية. أحد الحلول لهذه المشكلة هو استخدام هدف مصمم لمؤشر الغمر في النطاق الأعلى. بسبب عودة الاهتمام في عينات مسح التصوير ، والأهداف المتخصصة مع التصحيح اللازم أصبحت متاحة. الحل الآخر هو ضبط مؤشر الوسط التوضيحي إلى 1.515 أو 1.518 بإضافة كمية صغيرة من البوتانول (n = 1.399) للحصول على الأداء الأمثل لغمر الزيت ، وقبول الوضوح المتدهور قليلاً.
(3) الفحص المجهري للأغشية الحيوية سليمة (وغيرها من العينات على هذا النطاق) يتطلب مسافة عمل كبيرة لاستيعاب سمك العينة. وهذا اعتبار عملي رئيسي. تحد مسافة العمل الطويلة من البصريات إلى فتحة رقمية معتدلة (NA = 0.6-1.25)، مما يحد من الدقة ولكنه يحد أيضًا من شدة الانحراف الكروي.
(4) قد يكون مؤشر الانكسار الأمثل للتوضيح مختلفًا بالنسبة لأنواع أخرى من العينات الثابتة. وينبغي اختبار العينات وفقا لذلك باستخدام تباين المرحلة وسلسلة من السوائل المرجعية للمؤشر الانكساري كما هو مبين في الشكل 3.
Protocol
1. نمو الثقافات البيوفيلم
تنبيه: المبيضات ألبيكانات هو مسببات الأمراض البشرية. في بعض المؤسسات، يتطلب استزراع هذا الكائن الحي احتواء BSL-2.
- خط خارج سلالة مختارة على الخميرة استخراج-بيبتوني-دكستروز (YPD) لوحة أغار وتنمو 48 ساعة في 30 درجة مئوية.
- حدد مستعمرات واحدة من لوحة لتلقيح 5 مل من وسط YPD في 15 أنابيب الثقافة مل للنمو بين عشية وضحاها الهوائية (دوار دائري، 52-55 دورة في الدقيقة) في 30 درجة مئوية.
- تحديد كثافة الخلية باستخدام تخفيف 40-إلى 50 أضعاف من الثقافة بين عشية وضحاها. حساب عامل التخفيف اللازمة لجلب كثافة الخلية إلى 3 × 106 خلية / مل لسيليكون substrata، أو 0.6-1.2 × 106 خلايا / مل لأسطح الزجاج الغطاء تعامل مع concanavalin-A (كونا) أو القمح الجراثيم agglutinin (WGA) (انظر المناقشة).
- لنمو بيوفيلم في لوحة بئر 12(الشكل 1)،الاستغناء 2.0 مل من وسط خيوط العقيمة في كل بئر، وتدفئة لوحة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة. وهناك مجموعة متنوعة من وسائل الإعلام تحفز خيوط، أكثر قوة في درجة حرارة مرتفعة (37 درجة مئوية) ومع مصل المضافة. يوصى بمصل الأبقار الجنيني (FBS). الوسائط الموصى بها هي YPD أو Spider-Mannitol أو RPMI-1640.
- مع ملاقط معقمة، ضع طبقة تحتية معدة في كل بئر في لوحة دافئة وإزاحة فقاعات. إضافة inoculum من الثقافة بين عشية وضحاها للوصول إلى كثافة الخلية الموصى بها في الخطوة 1.3 في كل بئر. بئر واحد دون تلقيح بمثابة فارغة البصرية والسيطرة ضد التلوث.
- ضع اللوحة على خلاط مداري 60 دورة في الدقيقة في حاضنة هواء رطبة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة لإتاحة الوقت لالتصاق الخلية. بعد 90 دقيقة، وإزالة الخلايا المتوسطة وغير المرفقة، وغسل مع معقمة متوسطة أو الفوسفات العازلة المالحة (PBS)، ووضع substrata مموهة في أطباق الثقافة أو لوحة أخرى متعددة الآبار التي تحتوي على وسط خيوط الدفء. مع لوحات متعددة الآبار، فمن المريح جدا لاستخدام لوحة ثانية لخطوة غسل ولوحة ثالثة مع 2.0 مل من متوسطة مُدفئة في البئر لتلقي الطبقات الفرعية المغنة. تعقيم ملاقط قبل كل نقل.
- أعد اللوحة إلى حاضنة الهواء المحيط المرطبة 37 درجة مئوية وزراعة الأغشية الحيوية حتى 48 ساعة مع خلط مداري 60 دورة في الدقيقة للتهوّن. وينبغي أن يكون هناك القليل من النمو العوالق في كل ثقافة ما لم يتم سفك بيوفيلم النامية الخميرة شكل الخلايا. يظهر فيلم بيوفير يزرع بهذه الطريقة في الشكل 1.
2. معالجة العينات للتصوير
تحذير: مثبتات ألدهيد متقلبة وخطرة. إعداد تخفيفات التثبيتية في غطاء الدخان، وليس في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. لا تضع المثبتات في الحاضنات المستخدمة للخلايا الحية. العمل مع مثبتات مخففة في الأطباق المغطاة في غطاء للأبخرة أو منطقة على مقاعد البدلاء جيدة التهوية. التخلص من المثبتات وحلول الغسيل بعد الإصلاح كنفايات خطرة.
- إعداد مثبت جديد، 4٪ الفورمالديهايد أو paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني، اختياريا مع ما يصل إلى 2٪ الجلوتارالدهيد. يمكن استخدام الفورمالين المخفف إلى 4٪ في العمل الروتيني.
ملاحظة: الجلوتارالدهيد على وجه الخصوص سوف تزيد من autofluorescence النطاق العريض ويمكن أن تهيون الفلورمنس من العلامات القابلة للتعبير مثل dTomato. - إزالة الوسط ثقافة من العينة واستبدالها PBS لتخفيف البروتينات المصل بعيدا، أو نقل بيوفيلم على الطبقة التحتية إلى برنامج تلفزيوني، لعدة دقائق.
- نقل العينة إلى مثبت، وتعيين الطبق المغطى على خلاط المداري بطيئة لمدة 20 دقيقة. تمديد الفترة الزمنية عند معالجة عينات أكثر سمكا (انظر المناقشة). وينبغي إضافة حجم التثبيتية كافية لكل طبق لتزج كل نمو بيوفيلم، بما في ذلك أي على الجوانب الداخلية للطبق.
- إزالة المثبت وإعادة ملء الطبق مع برنامج تلفزيوني لغسل التثبيت المتبقية. التخلص من المثبت كنفايات خطرة. كرر العديد من السُلح اتّساق قصيرة المدى، ثمّ تُدفّث أطول لتتيح الوقت للمثبت المتبقي للإنسال من الكتلة البيولوجية أو العقيق. تعتمد فترة الغسيل على الوقت المسموح به للتثبيت (راجع المناقشة).
- كمية اللازمة من وصمة عار سوف تعتمد على كتلة بيوفيلم. إزالة جميع biofilm من المناطق غير عينة من طبق الثقافة قبل تلطيخ، أو نقل العينة الثابتة إلى طبق جديد قبل تلطيخ. لا تسمح للبيوفيلم لاستنزاف أو تجف. يبقيه مغمورة في برنامج تلفزيوني.
- أضف البقعة إلى الطبق (انظر المناقشة) وحدّد الطبق المغطى على خلاط مداري بطيء بين عشية وضحاها (انظر المناقشة). حماية من الضوء.
- في الصباح، وإزالة محلول تلطيخ وإعادة ملء الطبق مع برنامج تلفزيوني لتخفيف وصمة عار غير منضم. تعيين الأطباق على خلاط المداري بطيئة لdestain لعدة ساعات.
3. بروتوكول التوضيح: الأغشية الحيوية على Substrata Impermeant
- من الصعب تمييز الأفلام الحيوية الموضحة بصريًا. لذلك، إذا رغبت في ذلك، ضع علامة على جانب واحد من كل طبقة تحتية بخدش لتعيين الجانب للتلقيح.
- استخدام المسمى ماسور ة باستور طويلة لجميع النفايات اللاحقة ونقل المذيبات لتجنب التلوث عبر المذيبات.
- باستخدام ملاقط، نقل بيوفيلم ثابت من برنامج تلفزيوني إلى 5 مل من 50:50 PBS:methanol في قارورة زجاجية 20 مل مع بيوفيلم التي تواجه ما يصل. مزيج يدويا مع الحركة المدارية في فترات 1 دقيقة لمدة 5 دقيقة (انظر المناقشة).
- إزالة المذيبات إلى زجاجة النفايات، ويجري الحذر لتجنب الاتصال بين ماصة وبيوفيلم، أو بيوفيلم وقارورة. إعادة ملء بلطف مع 3 مل من الميثانول أنيق. مزيج يدويا مع الحركة المدارية في فترات 1 دقيقة لمدة 3 دقيقة.
- إزالة المذيبات إلى زجاجة النفايات، وإعادة ملء على الفور مع 5 مل من الميثانول. مزيج يدويا مع الحركة المدارية في فترات 1 دقيقة لمدة 5-10 دقيقة. إزالة المذيبات إلى زجاجة النفايات، وإعادة ملء على الفور مع 3 مل من الميثانول. الأغشية الحيوية غالبا ما تبدو أكثر غموضا في هذه المرحلة من ظهورها الأولي.
- إزالة المذيبات إلى زجاجة النفايات، وإعادة ملء القارورة على الفور مع 5 مل من 50:50 الميثانول: ساليسيلات الميثيل. مزيج يدويا مع الحركة المدارية في فترات 1 دقيقة لمدة 5-10 دقيقة. يجب أن يكون الفيلم الحيوي شبه شفاف في هذا المذيب المختلط.
- إزالة المذيبات إلى زجاجة النفايات. أعد ملء القارورة برفق بـ 3 مل من ساليسيلات الميثيل الأنيق (MS). مزيج يدويا مع الحركة المدارية في فترات 1 دقيقة لمدة 3 دقيقة.
- قم بإزالة المذيبات إلى زجاجة النفايات، وأعد تعبئتها على الفور بـ 5 مل من التصلب المتعدد الأنيق. عند هذه النقطة ، يجب أن يكون الفيلم الحيوي شفافًا. قم بإزالة المذيبات إلى زجاجة النفايات، وأعد ملء القارورة على الفور بـ 3 مل من التصلب المتعدد الأنيق. الفيلم الحيوي المجهزة مستقرة في هذا المذيب.
- للأفلام الحيوية على أجار (انظر المناقشة) تمديد جميع الفترات الزمنية تبادل للسماح لنشر المياه والمذيبات على الرغم من أجار. يمكن تقدير الفترات الزمنية اللازمة باستخدام مجهر تشريح منخفض الطاقة مع إضاءة darkfield لعرض تقدم المذيبات في أجار. البروتوكول يحقق توضيحا جيدا وليس آثار انكماش كبيرة عند استخدام 2٪ أجار، ولكن أجار توضيح سوف تتكثف إذا تقلص أثناء التعامل مع ملاقط. يوصى باستخدام ملعقة.
4. إعداد التصوير للمجهر كونكالبؤر
- الخطوات التالية هي لاستخدام المجهر المقلوب. استخدم طبقًا مقاومًا للمذيبات يحتوي على قاع زجاجي للاحتفاظ بالنموذج المقلوب على مرحلة المجهر (انظر المناقشة).
- إعداد الفواصل لدعم العينة المقلوبة. استخدام مستطيلات صغيرة مقطعة من شرائح المجهر (1000 ميكرومتر سميكة) ، أو نظارات الغطاء (170 ميكرومتر) ، أو حلقات السيليكون 13 ملم (330 ميكرومتر ، انظر جدول المواد)، والتي قد تكون مكدسة حسب الحاجة. Presoak الحلقات في الساليسيلات الميثيل لمدة 1 ساعة للحد من الانجراف التركيز بسبب تورم.
- لbiofilm على مربع سيليكون الصف الطبي، عكس مربع (أي، تحويله بيوفيلم أسفل) وتعيينه على فاصل في بركة من الساليسيلات الميثيل في الطبق(الشكل 2). تأكد من تجنب أي فقاعات تحت العينة.
- جبل الطبق بقوة على خشبة المسرح من المجهر وجعل النفط اتصال مغمورة مع الهدف (انظر المناقشة).
- ضبط كمية التصلب المتعدد في الطبق بحيث الغضروف المفصلي يحمل العينة بقوة أسفل على فاصل من التوتر السطحي. ضع قطرة من التصلب المتعدد فوق الطبقة التحتية المربعة المقلوبة لتقليل تشتت الضوء من النهاية غير اللامعة ، وغطي الطبق بلوحة زجاجية للحد من التبخر. انتظر عدة دقائق حتى تستقر العينة على الفواصل قبل التصوير.
- استخدام الضوء المرسل لفحص بصري مجال الرؤية وتحديد موقع التركيز الحالي بالنسبة إلى المناطق apical والقاعدية من biofilm مقلوب. تعيين الفتحة العددية مضيئة المكثف (INA) إلى الحد الأدنى (إغلاق القزحية المكثف) لزيادة التباين، وإلا فإن بيوفيلم أوضح سيكون غير مرئي تقريبا. عند الانتهاء، قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء المرسل.
- التبديل إلى الفلورية confocal وتعيين الحدود الدنيا والعليا للمكدس صورة التركيز التسلسلي اللازمة لتمتد biofilm. خطوة محرك الأقراص التركيز التصاعدي، الذي يوصى به، وسوف تظهر أولا الخلايا التي طردت التي استقرت على الزجاج الغطاء وhyphae طويلة جدا التي يستريح على الزجاج. في الطرف العلوي من التسلسل ، يجب أن ينظر إلى الخلايا المؤسس ملتصقة بالطبقة التحتية في قاعدة الفيلم الحيوي. تعيين قطر الثقب، وتباعد البكسل في مستوى الصورة، وزيادة خطوة التركيز باستخدام المعايير العامة الموضحة في المناقشة.
Representative Results
الأغشية الحيوية مثل تلك الموجودة في الشكل 1 شفافة بشكل كبير إلى مبهمة ، ولكن يتم توضيحها بشكل روتيني وتصويرها باستخدام البروتوكول أعلاه. ويبين الشكل 2 التوهين القوي للفلورية مع عمق التركيز في بيوفيلم ثابت في برنامج تلفزيوني، مقارنة بنفس الفيلم الحيوي بعد مطابقة المؤشر. كما هو مبين في الشكل 3، وذلك باستخدام المذيبات المتنوعة المسلسل ة من زيادة مؤشر الانكسار يمكن تقدير الحد الأقصى في الوضوح بسرعة. يتم تحسين هذا بواسطة المجهر على النقيض من المرحلة التقليدية للعثور على نقطة الحد الأدنى من التباين (أقصى قدر من الشفافية). ومن الواضح أن هذا الأمثل لا يتحقق عن طريق مطابقة المؤشر المتجانس. وذلك لأن الهياكل دون الخلوية تختلف قليلا في مؤشر الانكسار. في هذه الحالة ، حدث انعكاس التباين في جدار الخلية عند مؤشر مذيب أقل قليلاً من السيتوبلازم. لالمبيضات albicans biofilms، يحدث الأمثل على مقربة من ن = 1.530. كان نوع 48 h البرية وcak1 الأغشية الحيوية متحولة DX في الشكل 4A 500 ميكرومتر في سمك، ومع ذلك تم تصوير خلايا الخميرة في القاعدة تقريبا بحدة مثل الخلايا apical. وبالمثل ، كما هو مبين في الشكل 4C، لم يكن التوهين من الفلورسة مرتبطًا بقوة بعمق التركيز. ويبين الشكل 5 hyphae الغازية في أجار، مئات ميكرومترتحت بيوفيلم السطح. ناضجة hyphae الغازية تنتج باستمرار الخميرة الناشئة الجانبية القريبة من الحاجز في سلسلة hyphal، مما أدى إلى المستعمرات الفرعية من الخلايا مثل الخميرة على فترات منتظمة على طول الهيفا الغازية.
الشكل 1: ثقافات البيوفيلم قبل التوضيح. A 24 ح بيوفيلم نمت من عزل من efg1 تكملة //× سلالة من C. albicans في لوحة بئر 12 على مربع سيليكون في RPMI-1640 المتوسطة السائلة تستكمل مع FBS 10٪. الفارغة المعقمة في C4 بشكل جيد. Inset يظهر قطع المقطع العرضي من 96 ساعة البرية من نوع بيوفيلم نمت في لوحة 6-جيدا على قاعدة أغار 3.75 ملم في نفس المتوسطة تظهر hyphae الغازية. كلا الفريقين على نفس المقياس. مقياس شريط = 2.0 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحسين التصوير العميق عن طريق مطابقة المؤشر. يظهر الشكل إسقاطات العرض الجانبي لأكوام الصور المعتمة من فيلم بيوفيلم بري من نوع 48 ساعة تم إصلاحه وملطخ بConA-Alexafluor 594. (أ)تم وضع صورة للعينة في برنامج تلفزيوني باستخدام 63x 1.0 NA هدف الغمر المباشر للمياه. وكان التوهين شديداً على عمق تركيز 30 ميكرون. (ب)بعد التوضيح من خلال الخطوات البروتوكول3.3-3.8، تم تصوير نفس الفيلم الحيوي في ساليسيلات الميثيل مع الحد الأدنى من التوهين باستخدام هدف الغمر النفط 40x 0.85 NA. بعد طرح الخلفية وإسقاط العرض الجانبي لمكدسات الصور ثلاثية الأبعاد ، تم إعادة تحجيم بيانات 40x مكانيًا لمطابقة بيانات 63x للمقارنة. (C)رسم تخطيطي يظهر تصاعد مقلوب للعينة المطهرة (من MS) عن طريق نقلها إلى MS في طبق ألومنيوم أسود الأنود مع قاع زجاجي مُستمٍ (انظر المناقشة). مقياس شريط = 50 ميكرون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يظهر قياس الانكسار على تباين الطور انعكاس التباين للميزات الخلوية في نطاق مطابقة المؤشر الأمثل. تم تبادل الأغشية الحيوية الثابتة على نظارات الغلاف من PBS إلى الميثانول ، ثم إلى الزيلين (n = 1.496). ثم تم تبادل هذه الأغشية الحيوية واحدة من كل من الزيلين في مجموعة من السوائل المرجعية للمؤشر الانكساري (السلسلة E ، مختبرات Cargille ، انظر جدول المواد)وفحصها بصريًا جنبًا إلى جنب لتحديد نطاق المؤشر الذي يعطي أعلى شفافية. (اللوحة العليا) صور تباين المرحلة: تم تبادل فيلم حيوي واحد بشكل متسلسل بين الزيلين ومجموعة ضيقة من السوائل المرجعية في هذا النطاق. بعد كل تبادل، تم نقل نفس الحقل ومشاهدته على الرغم من غطاء الزجاج باستخدام 40x 0.85 NA Ph2 النفط الغمر المرحلة الهدف النقيض ومكثف Ph2. تم تسجيل جميع الصور مع إعداد المصباح نفسه والتعرض للكاميرا لعرض التغييرات بدقة. مع زيادة المؤشر ، وينظر إلى انعكاس التباين لأول مرة في ن = 1.530 لجدار الخلية ، تليها السيتوبلازم في ن = 1.535. مقياس شريط = 10 ميكرون. (لوحة أقل) رسم بياني يوضح الحد الأدنى في سطوع البيوفيلم المتوسط عند نقطة الشفافية القصوى. يؤدي التشتت القوي للضوء داخل البيوفيلم إلى تجاوز متوسط السطوع الحقل الفارغ. تظهر الخلايا المعزولة أغمق من الحقل الفارغ، حتى انعكاس التباين في النطاق 1.530-1.535. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التصوير العميق للمتحولة والبرية نوع C. albicans الأغشية الحيوية. سلالة نوع البرية (DAY185) ودورة الخلية البروتين كيناز تقلص سلالة التعبير(cak1 DX)14 نمت في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة على الطبقات الفرعية السيليكون في وسط YPD السائل. تم إصلاح الأغشية الحيوية ، ملطخة بConA-Alexafluor 594 ، وتم توضيحها باستخدام بروتوكول تبادل المذيبات في ساليسيلات الميثيل. أظهر المجهر ثلاثي الأبعاد أن كلا الفيلمين الحيويين كانا بسماكة 500 ميكرومتر. تم تحويل بيانات الصور إلى تنسيق 32 بت في ImageJ أو فيجي (https://imagej.nih.gov/ij/ أو http://fiji.sc) ، ثم تمت معالجتها باستخدام وظيفة طرح الخلفية مع نصف قطر الكرة المتداول 50 بكسل ، والعتبة لتعيين وحدات البكسل السلبية إلى الصفر ، وإعادة البكسل ، واستخدام أقصى قدر من الكثافة الإسقاط لإنتاج وجهات النظر الجانبية. (أ)إسقاطات محورية وجانبية: نما الفيلم الحيوي من النوع البري إلى سمك 502 ميكرومتر كما رأينا في إسقاط العرض الجانبي لكومة الصور المعالبؤرة 558-plane. مقياس شريط = 100 ميكرون. (لوحات اليد اليسرى) 40-plane الإسقاطات المحورية من قمة (أعلى) إلى قاعدة (أسفل) تظهر الاختلاف في أنواع الخلايا في طبقات مختلفة من بيوفيلم. أظهر هذا المثال بنية نوع برية مميزة: الخلايا الملتصقة في القاعدة تؤدي إلى hyphae التي تصعد إلى منطقة وسطية كثيفة من الخلايا الزائفة والخميرة الشبيهة. فوق المنطقة الوسطى، ظهر الهيفي مرة أخرى وأدى إلى مجموعات من الخميرة الناشئة. hyphae طويلة ينظر في منطقة apical من المرجح أن تمتد إلى الوسط الثقافة في الأحياء البيوفيلم ، ولكن مطوية على سطح بيوفيلم أثناء معالجة العينات. نما cak1 DX biofilm إلى سمك 500 ميكرومتر كما رأينا في الإسقاط الجانبي لكومة الصور 556 طائرة. هذا المتحول ، الذي هو معروف للخضوع لنمو خيطي في غياب الضغوط المحفزة14، أنتجت بنية مختلفة بشكل كبير. كما رأينا في كل من العرض الجانبي والإسقاطات المحورية (لوحات اليد اليمنى) ، أدت العديد من الخلايا المتفرعة إلى نمو اتافع شعاعي. (ب)أمثلة من الهيفي المتفرعة داخل cak1 DX بيوفيلم. مقياس شريط = 10 ميكرون. (C)تم قياس توهين الفلور مع العمق في البيوفيلم الحيوي البري ة الموضحة عن طريق إخفاء بكسل الخلفية ، ثم حوسبة متوسط الإشارة الرقمية لجميع وحدات البكسل غير الخلفية في كل مستوى صورة. باستثناء hyphae apical التي تم وضع علامة مشرقة من قبل lectin ، لم يكن هناك اتجاه توهين قوي مع عمق التركيز. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: hyphae الغازية في أجار. C. albicans hyphae في بيوفيلم سطح سوف تخترق الدرجات التحتية أغار إلى ملليمتر المسافات (انظر الشكل 1). بعد التوضيح ، يمكن رؤية الهياكل الغازية إلى الأسفل على الرغم من البيوفيلم ، أو إلى الأعلى من الجانب السفلي من الأجار. وهذا الأخير يتطلب مسافة عمل أكبر. بدلا من ذلك، بعد التثبيت ولكن قبل تلطيخ وتبادل المذيبات، قد يتم قطع أجار عموديا مع مشرط أو شفرة حلاقة إلى ألواح 1-2 ملم التي يمكن بعد ذلك أن تتحول على الجانب وصورة مباشرة في عرض الجانب بعد تلطيخ وتوضيح. يوصى بهذا الإجراء. في هذا الإسقاط لحقل رؤية مربع 213 ميكرومتر، تم استخدام مقياس لون قوس قزح لترميز الموضع المحوري على مدى 75 ميكرومتر: الميزات الزرقاء قريبة والمعالم الحمراء أعمق في مستوى الصفحة. هذا الرأي يظهر أن برعم hyphae طويلة قبالة الخلايا الجانبية الخميرة شكل على فترات شبه منتظمة التي تؤدي إلى subcolonies. مقياس شريط = 50 ميكرون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وقد أدى التقدم في المجهر الفلوري في أقسام البصرية، والقرار، والسرعة، وتجنب أو التعويض من الانحراف، واقتناء القنوات المتعددة، وفي قوة الحوسبة، عودة في عينات التصوير سليمة. بالنسبة للعينات الثابتة ، كان لكل من طرق التوضيح والتوسع الكلاسيكية والجديدة تأثير كبير19،20،21،22،23،24. في هذه الحالة، طبقنا نهج مطابقة مؤشر سريع وبسيط قائم على المذيبات لدراسة بنية الأغشية الحيوية الفطرية التي هي شفافة بشكل كبير إلى مبهمة.
وقد تم اختبار البروتوكولات السابقة مع مجموعة من العينات. في مختبرنا المبيضات albicans الأغشية الحيوية وغالبا ما تزرع على 14 ملم المربعات قطع من ورقة من المطاط السيليكون الصف الطبي (انظر جدول المواد). وتستخدم هذه الطبقة الفرعية لأن النمو على PDMS (بولي-ديميثيلسيلوكسان) المغمورة في وسط الثقافة السائلة قد تم تأسيسها كنموذج مهم في المختبر للالتهابات المرتبطة بالغرسات الطبية، وخاصة القسطرة الساكنة. الخلايا المجهدة التي تبدأ خيوط تلتصق بسرعة إلى الأسطح غير القطبية مثل PDMS. في الممارسة العملية، المربعات المستخدمة التي تم تنظيفها وإعادة تعقيمها في الأوتوكلاف (دورة جافة) تعطي الأغشية الحيوية الأكثر اتساقا لأي سلالة معينة. وتزرع عادة الأغشية الحيوية على نظارات الغطاء، في تغطية الزجاج أسفل الأطباق الثقافة، في أطباق البوليسترين الصف البكتريولوجي القياسية، وعلى أجار. لأن خلايا C. albicans لا تلتزم بشكل جيد للزجاج، وينبغي التعامل مع نظارات الغطاء مع ليكتين التي من شأنها ربط التهاب اتصال جدار الخلية. نحن نطبق 40 ميكرولتر من 1 ملغم /مل كونا أو WGA في الماء المعقم على كل سطح غطاء. بعد التجفيف ، يتم التعامل مع نظارات الغطاء مع 40 ميكرولتر من 1 ٪ الجلوتارالدهيد لمدة 3 دقيقة لخلط البروتين في فيلم غير قابل للذوبان. ثم يتم غسلها بالماء المقطر المعقم لإزالة المثبت وأي الليكتين القابلة للذوبان والهواء المجفف. إذا لزم الأمر ، يتم إعادة تعقيم نظارات الغطاء المعالج أو الأطباق تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية المبيد للجراثيم لمدة 10 دقيقة.
سوف يؤثر سمك العينة على فترات الحضانة المطلوبة في البروتوكولات. يتطلب الانتشار المثبت في فيلم بيوفيزيائي 300 ميكرومتر عدة دقائق للتوازن. هذه الفترة الزمنية يزيد مربع من سمك العينة، وينبغي أن تمتد إلى ساعة أو أكثر لbiofilms سميكة جدا أو عينات كتلة أجار التي قد تكون 2-3 ملم سميكة. تعتمد الفترة الزمنية للتلطيخ أيضًا على سمك العينة كما هو موضح للتثبيت والغسل. ومع ذلك ، لأن الليكتينات تنتشر ببطء أكثر من المثبتات منخفضة ميغاواط ، وخاصة داخل هلام أجار ، يجب تمديد تلطيخ بين عشية وضحاها. وينبغي أن يتم الشيء نفسه لغسل من وصمة عار الزائدة.
ويمكن إدراج البقع من أنواع مختلفة في البروتوكولات. نحن نستخدم وصمة عار جدار الخلية للتصوير الهيكلي، والأكثر شيوعا Calcofluor الأبيض M2R (فلور. السطوع #28) أو ليكتين صبغ الموسومة مثل كونا-أليكسافلور 594 أو WGA-Alexafluor 594. وينبغي إيلاء الاهتمام لصف سبينسي من البروتين. رباعي ة كونا قد يسبب الربط المتبادل من hyphae مرنة للغاية في المنطقة apical من بيوفيلم. هذا هو أقل وضوحا مع ديفر WGA. الخصائص الكنسية لهذه العلامات هي كالكوفلور للكيتين، كونا لمخلفات mannose، وWGA لN-أسيتيل-D-الجلوكوزامين ومخلفات حمض السياليك.
لأن يتم تصنيف بروتوكول تبادل المذيبات من PBS أو الماء على الرغم من الميثانول في ساليسيلات الميثيل ، يجب أن تكون حاويات العينة مقاومة للمذيبات. سوف الساليسيلات الميثيل (MS) تليين بسرعة البوليسترين البلاستيك وتليين ببطء غيرها من البلاستيك. البروتوكول الخطوات تصل إلى استخدام الميثانول أنيق يمكن أن تنفذ في plasticware، ولكن في تلك المرحلة في البروتوكول ونحن عموما التحول إلى معيار 20 مل قارورة التلألة الزجاج مع قبعات المسمار مقاومة للمذيبات. قارورة مريحة للأفلام الحيوية على الطبقات الفرعية مربع السيليكون، لأنه يمكن التقاط المربعات ونقلها باستخدام ملاقط غرامة. أيضا، يمكن أن ينضب قارورة وإعادة تعبئة مع مربع مسطح يستريح على السطح المنحني الداخلي بحيث بيوفيلم لا اتصال الزجاج. يجب أن تكون الطبقة التحتية بيوفيلم المتابعة عندما تكون مغمورة في القارورة تستقيم. القنينات ممتازة لتخزين العينات على المدى الطويل.
في بروتوكول التوضيح ، تقلل خطوات تبادل المذيبات الأكثر تدرجًا من خطر تشوه العينة بسبب تأثيرات خلط المذيبات. للسرعة والراحة في البروتوكول الأساسي، وهناك أربع خطوات: 1) خطوة 3.3، PBS إلى 50:50 PBS:methanol; 2) الخطوات 3.4 و 3.5، PBS: الميثانول إلى الميثانول أنيق، 3) خطوة 3.6، الميثانول أنيق إلى 50:50 الميثانول: MS؛ و 4) الخطوات 3.7 و 3.8، الميثانول: MS إلى MS أنيق. الميثانول يوفر miscibility الانتقالية. ومع ذلك ، لأن المياه والتصلب المتعدد هي شبه قابلة للامتزاج ، فمن الضروري أن يتم تشريد جميع المياه بواسطة الميثانول قبل إدخال أي MS. وبالمثل ، لأن الميثانول متقلبة للغاية ، من المهم أن تحل محل جميع الميثانول من قبل MS. خلاف ذلك ، استمر سوف التبخر الميثانول المتبقية يسبب اختلافات مؤشر الانكسار داخل العينة. ضمن تسلسل الخطوات الأربع ، من المستحسن تكرار الخطوتين الثانية والرابعة بإضافة تغيير آخر في المذيبات الأنيقة ، أو حتى تغيير ثالث. بالنسبة للعينات الهشة بشكل خاص ، يمكن صياغة تغييرات المذيبات في خطوات أصغر في المئة.
مع عينات كتلة أجار، الخطوات 3.4 و 3.5 (الميثانول أنيق) قد يسبب ظهور بلورات الملح داخل أجار بسبب لا قابلية لأملاح PBS المتبقية في الميثانول. ويمكن تجنب ذلك باستخدام الماء المقطر (DW) في أول خطوة مذيب مختلطة بدلا من برنامج تلفزيوني لتخفيف الأملاح أثناء تبادل المياه: الميثانول. تسلسل تبادل المذيبات البديلة للأغشية الحيوية الثابتة ثم يتكون من هذه الخطوات: 1) الخطوة 3.3، ونقل العينة من برنامج تلفزيوني إلى 50:50 DW:الميثانول (السماح بوقت إضافي للانتشار من خلال أجار)؛ 2) الخطوة 3.4، ونقل العينة من 50:50 DW: الميثانول إلى الميثانول أنيق (كرر 2x مع الميثانول كما هو الحال في الخطوة 3.5)؛ 3) الخطوة 3.6، ونقل العينة من الميثانول إلى 50:50 الميثانول: ساليسيلات الميثيل؛ و4) خطوة 3.7، ونقل العينة من 50:50 الميثانول: MS إلى MS أنيق (كرر 2x مع MS كما هو الحال في الخطوة 3.8).
لأن الساليسيلات الميثيل يلين بسرعة البوليسترين البلاستيك، ونحن نستخدم طبق الألومنيوم الأنود مع غطاء أسفل الزجاج لعقد بيوفيلم توضيح على خشبة المسرح من المجهر المقلوب. يقام الزجاج الغطاء في مكان باستخدام الاسمنت الضوئي علاج الأشعة فوق البنفسجية (نورلاند لاصقة بصرية #61، انظر جدول المواد). شريطة إزالة MS في نهاية اليوم عن طريق غسل الطبق مع الأيزوبروبانول تليها المياه الصابونية والرصانة، والزجاج غطاء الاسمنت تخدم لعدة أشهر.
اختيار عدسة الهدف مهم للغاية في التصوير على نطاق واسع من العينات الموضحة بسبب أهمية تقليل الانحراف الكروي والحاجة إلى مسافة عمل كافية. لدينا خبرة في ثلاثة أهداف في هذه الدراسات. في إعداد المجهر المقلوب ، نستخدم مسافة عمل طويلة ، وزيت هدف الفتحة العددية المعتدلة (NA) المغمور تحت زجاج الغلاف مع الفيلم الحيوي المغمور في ساليسيلات الميثيل في الطبق فوق زجاج الغلاف. وقد تم القيام به معظم عملنا مع هدف سلسلة زايس العالمي اللوني، نوع 461708، 40x 0.85NA Oel 160/1.5، وتستخدم مع محول البعد البؤري سالب 160 ملم لالاسمية اللانهائي ة conjugate التوافق (IC). تم تصميم هذا الهدف في الأصل لعرض النفط مغمورة من خلال شرائح المجهر 1.5 ملم مع مسافة عمل 0.35 ملم25. عند استخدامها مع زجاج غطاء قياسي (0.17 مم)، تكون مسافة العمل أكبر بكثير: 1.5 + 0.35-0.17 = 1.68 مم = 1680 ميكرومتر. كما نستخدم هدف Zeiss متعدد الغمر الجديد ، نوع 420852 ، 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat بمسافة عمل تتجاوز 540 ميكرومتر ، مع تعيين تصحيح الغمر إلى الجانب العالي من "الزيت". يتم تصحيح هذا الهدف بشكل كبير وينتج صورة رائعة. على موقف المجهر تستقيم، لقد استخدمنا هدف نيكون متعددة الغمر الجديد، نوع MRD71120، 10x 0.5NA CFI خطة-أبوكرومات مع مسافة عمل تتجاوز 5000 ميكرومتر (5 ملم)، وأيضا مع تصحيح الغمر تعيين إلى الجانب العالي من "النفط" (ن = 1.518). على الرغم من أن هذا الهدف لديه NA أقل من الآخرين، فإنه لديه ميزة كونها غامرة مباشرة في ساليسيلات الميثيل.
لتحسين الحصول على البيانات من حيث السرعة والدقة ، وإعدادات المجهر البؤري مثالي ينبغي أن تلبي كل من الكثافات العينة Nyquist العرضية والمحورية18. باستخدام المعايير التقليدية، قم بتعيين قطر الثقب المتجانس اسميًا إلى وحدة متجددة الهواء 1. في إحداثيات مكبرة،
دP (μm) = 1.22 × التكبير × (الطول الموجي للانبعاثات في ميكرومتر) / NA
يجب ألا يتجاوز أخذ العينات المستعرضة (تباعد البكسل) (1/2) × حد دقة Abbe. في إحداثيات الفضاء الكائن،
⇐ x، ⇐ y = (الطول الموجي للانبعاثات في نانومتر) / (4 NA)
أخذ العينات المحورية (زيادة التركيز) لا ينبغي أن يتجاوز عرض النطاق الترددي المحوري العكسي،
⇐ z = (مؤشر الغمر) x (الطول الموجي للانبعاثات في نانومتر) / (NA2)
يوسع النظام البصري المعالبؤر عرض النطاق الترددي للمجهر ويشحذ كل من الدقة العرضية والمحورية بما لا يقل عن 1/☆2.
للحصول على هدف 40x 0.85 NA الذي نستخدمه في أغلب الأحيان، راجع الجدول 1 للحصول على نتائج هذه الصيغ لطول موجة انبعاث 600 نانومتر (Alexa Fluor 594).
| الصيغه | x 1/☆2 | مجموعة (نموذجي) | |
| دP (ميكرومتر) | 34.5 ميكرومتر | - | 25 أو 50 ميكرون |
| -x، y | 176 نانومتر | 125 نانومتر | 161 نانومتر |
| ⇐z | 1200 نانومتر | 848 نانومتر | 900 نانومتر |
الجدول 1: قطر الثقب المتجانس، وأخذ العينات العرضية، وقيم أخذ العينات المحورية لطول موجي انبعاث 600 نانومتر.
باستخدام ماسح ضوئي دوار القرص مع هذه الإعدادات وحقل مسح 1,040 × 1,040 بكسل، يمكن الحصول على البيانات من عينات بيوفيلم بسرعة ودقة معقولة. تعمل أكوام الصور ثلاثية الأبعاد النموذجية ذات اللون الواحد 0.35-1.55 جيجابايت.
وسائل الإيضاح في استخدام واسع تمتد نطاق مؤشر الانكسار كبيرة. من خلال إضاءة darkfield والتفتيش البصري ، وجدنا أن C. albicans الأغشية الحيوية الثابتة كانت أكثر شفافية فوق n = 1.5. تم صقل هذا بواسطة المجهر على النقيض من المرحلة إلى n = 1.530-1.535. لعدد من الأسباب العملية، ونحن نستخدم الساليسيلات الميثيل (ن = 1.537) كمؤشر المذيبات مطابقة النهائي. على الرغم من تبادل المذيبات يجلب خطر تشوه العينة أو التحف الأخرى، والخلايا في العينات الثابتة، وأوضح لها أبعاد الجسم خلية مماثلة، وقطر هيفا، وأبعاد طول متشابك كعينات حية.
العديد من الاختلافات في عملية تبادل المذيبات ممكنة (على سبيل المثال، باستخدام مذيب انتقالي مختلف، أو مذيب نهائي مختلف). تم اختيار الميثانول لقطبيته العالية وانتشاره السريع ، ولكن ثبت أن الإيثانول يحافظ بشكل أفضل على البروتين الفلوري الأحمر (RFP) الكم26 كمذيب انتقالي. تم اختيار ساليسيلات الميثيل لمؤشرها ، والقطبية المعتدلة ، وانخفاض ضغط البخار ، والتوافق مع العديد من البقع والأصباغ والبروتينات الفلورية. ومع ذلك ، فإن المذيب النهائي مع مؤشر أقل قليلاً ، أو مزيج من ساليسيلات الميثيل ومذيب مؤشر أقل ، مثل البوتانول ، قد يخدم بشكل أفضل.
بشكل غير متوقع ، والقدرة على رؤية من خلال بيوفيلم يكشف ليس فقط عن ميزاته الداخلية الطبقية ، ولكن أيضا يساعد في عرض أصل الهياكل الموسعة مثل طويلة ، غير متشابكة hyphae apical وhyphae القاعدية الغازية على بعض الطبقات الفرعية. الفوعة الانتهازية في C. albicans يعتمد على براعة الجينية (أي التحول إلى نمو الهيفال, upregulation من substratum الخلية والتقيد الخلية, توليد osmolytes لخلايا في مهدها وإسطالتها, واستخدام المواد المغذية البديلة). تمديد Hyphal تمكن من اختراق الخلايا المهق C. الفردية من الخلايا المناعية البلعومة ولكن أيضا ضروري للغزو. يبدو أن التصاق البيوفيلم وتشابك الهيفال يوفران الإرساء السطحي اللازم لـ hyphae لغزو الطبقة التحتية بكفاءة. عندما تكون تلك الطبقة التحتية هي الأنسجة المضيفة، قد ينتج عن ذلك زيادة في الفوعة.
التصوير الأغشية الحيوية سليمة تمكن عددا كبيرا من التجارب الإعلامية باستخدام سلالات المراسل للتعبير الجيني، والطبقات الفرعية الأنسجة نموذج، وإدراج الكائنات الحية الأخرى مثل البكتيريا الموجودة في الأغشية الحيوية الطبيعية. حتى في أبسط حالة من التصوير الهيكلي البحت مع وصمة عار جدار الخلية ، يتم الكشف عن الأنماط الظاهرية في الموقع التي يمكن بعد ذلك قياسها كميا ً وتحليلها وراثيًا.
Disclosures
وليس لصاحبي البلاغ مصالح متنافسة للكشف عنها.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث جزئيًا من خلال منح المعاهد القومية للصحة R01 AI067703، وR21 AI100270، وR21 AI135178 إلى A.P. Mitchell. المؤلفون ممتنون لغرينفيلد 'كيب' سلودر لتوفير طويلة العمل عن بعد النفط الغمر الهدف المستخدمة في هذا العمل، ودانيال شيواركي للمجهر ية مع الغمر الساليسيلات الميثيل المباشر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator - 30 °C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator - 37 °C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5 W | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13 mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n = 1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
References
- Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
- Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144 (2017).
- Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
- Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
- Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226 (2018).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
- Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525 (2012).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
- Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
- Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487 (2016).
- Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787 (2019).
- Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
- Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, Reprinted in 9, 154-166, 1992 1601-1613 (1991).
- Lanni, F., Keller, H. E. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. Yuste, R. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-55 (2011).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
- Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , Oberkochen, West Germany. archive CZO-Mi 823, ed. 1967 48 (1971).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113 (2008).
