Summary
For at se og kvantificere de interne træk ved Candida albicans biofilm forbereder vi faste intakte prøver, der er afklaret ved brydningsindeksmatchning. Derefter kan optisk emikrokopi bruges til at opnå tredimensionelle billeddata gennem den fulde tykkelse af biofilmen.
Abstract
Den mikrobielle svamp Candida albicans kan gennemgå en ændring fra commensal kolonisering til virulens, der er stærkt korreleret med sin evne til at skifte fra gær-form vækst til hyphal vækst. Celler, der indleder denne proces, bliver klæbende til overflader såvel som til hinanden, med den deraf følgende udvikling af en biofilmkoloni. Dette forekommer ofte ikke kun på slimhindevæv overflader i gær infektioner, men også på medicinske implantater såsom katetre. Det er velkendt, at biofilmceller er resistente over for svampemidler, og at celler, der udgår fra biofilmen, kan føre til farlige systemiske infektioner. Biofilm spænder fra stærkt gennemskinnelige til uigennemsigtige på grund af brydningsheterogenitet. Derfor er svampebiofilm vanskelige at studere ved optisk mikroskopi. For at visualisere interne strukturelle, cellulære og subcellulære funktioner tydeliggør vi faste intakte biofilm ved trinvis opløsningsmiddeludveksling til et punkt med optimal brydningsindeksmatchning. For biofilm af C. albicans opnås der tilstrækkelig afklaring med methylsalicylat (n = 1,537) til, at konfokale mikroskopi fra spids til base i 600 μm biofilm med ringe dæmpning. I denne visualiseringprotokol skitserer vi fasekontrastrefraktometri, væksten af laboratoriebiofilm, fiksering, farvning, opløsningsmiddeludveksling, opsætningen til konfokal fluorescensmikroskopi og repræsentative resultater.
Introduction
Candida albicans er en mikrobiel svamp, der typisk er tilsvarende hos mennesker. Det er af grundlæggende interesse for biologer, fordi organismen har flere morfologier. For eksempel, som reaktion på visse miljømæssige signaler eller stressorer, gær-form spirende celler vil skifte til filamentous vækst som septating kæder af meget aflange celler kendt som hyphae. Overgangen er vigtig som et eksempel på fænotypisk udtryk for en overgang mellem et encellet og et flercellet genekspressionsprogram. Ligeledes, C. albicans er af biomedicinsk interesse, fordi organismen er en velkendt opportunistisk patogen. Det er ansvarlig for slimhindegær infektioner såsom trøske (oral candidiasis), genitourinary infektioner, og en årsag til farlige invasive eller systemiske infektioner i immunologisk svækket patienter.
Denne organismes potentiale for virulens er tæt forbundet med dens mange morfotyper og andre aspekter af dens genetiske alsidighed1,2,3,4. Kim rør forlængelse, den første synlige fase af overgangen til hyphal vækst, opstår med tilstrækkelig hurtighed til at gøre det muligt opslugt C. albicans celler til at bryde ud af fagocytter og dermed undslippe en tidlig fase af cellulære immunrespons af værten5. Desuden indledes filamentation en stor stigning i celle-til-celle- og celle-til-overflade-vedhæftning, der skyldes reguleret udtryk for flere klasser af cellevægproteiner kendt som adhæsiner6,7,8,9. Under en bred vifte af betingelser, kombinationen af overholdelse og filamentation resulterer i en dramatisk skift fra planktonisk, encellede vækst til overflade-associerede koloniale vækst, der danner en biofilm. C. albicans biofilm kan udvikle sig på almindeligt implanteret medicinsk udstyr såsom venekateter. Dissemineret infektioner kan resultere, når sådanne biofilm begynder at knop off gær-form celler og kaste dem i cirkulerende blod. Flere undersøgelser har vist , at biofilmceller er mere modstandsdygtige over for svampemidler end planktonceller10,11, hvilket til dels kan skyldes nedsat stofskifte12. Desuden kan den høje samlede overholdelse af en biofilm give den forankring, der er nødvendig for en effektiv invasiv vækst af hyphae i værtsvævet1.
Optisk afklaring af C. albicans biofilm ved brydningsindeks matchning har haft en stor indvirkning på vores evne til at visualisere strukturen i denne mikrobielle samfund og opdage relationer mellem genekspression og fænotype. Biofilm, der dyrkes i laboratoriet på testflader under flydende dyrkningsmedium i 48 timer, fremstår som en hvidlig belægning, der er tæt nok og tyk nok til at være uigennemsigtig (figur 1). Derfor er mange interessante fænotypiske træk ved biofilmen skjult. De 24 h vilde type biofilm dyrket i YPD, RPMI-1640 eller Spider medium ved 37 °C område op til 300 μm tyk, med 48 h biofilm ofte nå 500 μm. Opaciteten skyldes lysspredning, som opstår som følge af brydningsheterogenitet: svampecellevæggen er mere brydningsvæg end det omgivende medium, og cytoplasmaet lidt mere brydningsmiddel end cellevæggen. Den deraf følgende høje optiske tæthed af en indfødt biofilm tilslører alle strukturer, der er mere end 30 μm dybe, når de ses med et konventionelt mikroskop eller endda en konfokal scanner (figur 2). Der kan dog opnås en høj grad af afklaring ved at infiltrere faste biofilm med en høj brydningsindeksvæske, der omtrent matcher de store cellulære bestanddeles brydningsaktivitet. Efter afklaring, billeddannelse ved submicron opløsning kan udføres ved konfokal mikroskopi gennem hele tykkelsen af næsten enhver C. albicans biofilm13. I vilde type prøver, er det let at se, at biofilm består af lange viklet hyphae, klynger af budded gær-form celler eller pseudohyphal celler, tomrum rum, og en vis mængde ekstracellulær matrix. Desuden er biofilm generelt lagdelt, viser rumligt variant morfologiske forskelle i celletype, celletæthed, og tilstedeværelsen af spirende eller forgrenede celler. Mange variationer i en eller flere af disse funktioner er blevet observeret i biofilm udviklet af mutantstammer14,15. Derudover viser reporterstammer in situ rumlige forskelle i genekspression16,9,13. Den overraskende grad af afklaring opnås med denne relativt enkle og billige tilgang gør det også muligt at se, at mange biofilm omfatter apikale hyphae og basal invasive hyphae strækker sig ud til millimeter afstande.
I denne visualiseringsprotokol demonstrerer vi fastgørelse, mærkning, afklaring og billeddannelse af en C. albicans biofilm ved hjælp af en simpel cellevægmarkør som en plet. Oprindelsen af den nuværende version af protokollen er den forbedrede klarhed, vi observerede, da formaldehyd-faste biofilm blev infiltreret med 97% glykol methacrylat (GMA), som derefter blev polymeriseret for at integrere biofilmen i en hård plast med et moderat højt brydningsindeks (n = 1,49). Vi brugte derefter konventionel fase kontrast mikroskopi og en række brydningsindeks reference væsker til mere præcist at bestemme det punkt, kontrast vending (maksimal gennemsigtighed) af biofilm (Figur 3). For C. albicans biofilm skete dette tæt på n = 1,530, hvilket var overraskende højt, da en tæt proteinstruktur såsom hårkeratin kun er lidt mere brydningsaktiv (1,54-1,55). Selv om det er på den øvre ende af det optimale område i figur 3, vi vedtog methyl salicylate (olie af wintergreen, n = 1,537) i den nuværende protokol, fordi det længe har været brugt som et afklaringsmiddel til mikroskopi i embryologi og histologi, det har lav toksicitet og lavt damptryk, og det gav fremragende resultater i vores forsøg ved hjælp af moderat-NA olie nedsænkning optik.
Her bør der fremsættes fire bemærkninger:
(1) Med få undtagelser er den ideelle situation i mikroskopi, at modellens brydningsindeks skal være lig med brydningsindekset for objektivets nedsænkningsvæske17,18,13. For tredimensionale (3D) billeddiagnostiske undersøgelser, hvor dyb fokusering er nødvendig, er dette altid vigtigt.
(2) Vores eksperimentelle resultat for optimal rydning (n = 1,525-1,535) er lidt højere end standard nedsænkning olier (n = 1,515, 1,518) og derfor overtræder punkt (1), og dermed indfører en kilde til sfærisk aberration ved brug af standard olie nedsænkning optik. En løsning på dette problem er brugen af et mål, der er beregnet til et nedsænkningsindeks i det højere område. På grund af en genopblussen af interesse i billedbehandling ryddet prøver, speciale mål med den nødvendige korrektion bliver tilgængelige. Den anden løsning er at justere indekset for det afklarende medium ned til 1,515 eller 1,518 ved tilsætning af en lille mængde butanol (n = 1,399) for optimal olienedsænkning ydeevne, og acceptere den lidt nedbrudte klarhed.
(3) Mikroskopi af intakte biofilm (og andre prøver af denne skala) kræver en betydelig arbejdsafstand for at tage højde for prøvetykkelsen. Det er en vigtig praktisk overvejelse. En lang arbejdsafstand begrænser optik til en moderat numerisk blændeåbning (NA = 0,6-1,25), hvilket begrænser opløsningen, men også begrænser sværhedsgraden af sfærisk aberration.
(4) Det optimale brydningsindeks til afklaring kan være forskelligt for andre typer faste prøver. Prøverne testes i overensstemmelse hermed ved hjælp af fasekontrast og en række brydningsindeksreferencevæsker som vist i figur 3.
Protocol
1. Vækst i Biofilm Kulturer
FORSIGTIG: Candida albicans er et menneskeligt patogen. På nogle institutioner, kultur af denne organisme kræver BSL-2 indeslutning.
- Stribe ud udvalgte stamme på en gær ekstrakt-peptone-dextrose (YPD) agar plade og vokse 48 timer ved 30 °C.
- Vælg enkelte kolonier fra pladen for at pode 5 ml YPD-medium i 15 ml dyrkningsrør til aerob vækst natten over (karruselrotator, 52-55 omdr./min.) ved 30 °C.
- Celletætheden bestemmes ved hjælp af en 40- til 50-fold fortynding af nattens kultur. Fortyndingsfaktoren, der er nødvendig for at bringe celletætheden til 3 x 106 celle/ml for silikonesubstrata, eller 0,6-1,2 x 106 celler/ml for dækglasoverflader behandlet med concanavalin-A (ConA) eller hvedekimagglutinin (WGA) (se diskussion).
- For biofilm vækst i en 12 brønd plade (Figur 1), dispensere 2,0 ml steril glødetrådning medium i hver brønd, og varm pladen til 37 °C i en befugtet inkubator. En række medier vil fremkalde filamentation, stærkere ved en forhøjet temperatur (37 °C) og tilsat serum. Føtal kvægserum (FBS) anbefales. Anbefalede medier er YPD, Spider-Mannitol eller RPMI-1640.
- Med steril e-pincet, placere en forberedt substrat i hver brønd i den opvarmede plade og løsne bobler. Tilsæt inoculum fra natten kultur for at nå celletæthedanbefales i trin 1.3 i hver brønd. En brønd uden inoculum fungerer som en visuel blank og kontrol mod forurening.
- Pladen anbringes på en 60 rpm orbital mixer i en befugtet 37 °C luftinkubator i 90 minutter for at give tid til cellevedhæftning. Efter 90 min fjernes de mellemste og ikke-tilsluttede celler, vaskes med sterilt medium eller fosfat-buffered saltvand (PBS) og inokuleres substrata i dyrkningsretter eller en anden multiwell plade indeholdende fordannet filamentationsmedium. Med multiwell plader, er det meget bekvemt at bruge en anden plade til vask trin og en tredje plade med 2,0 ml forvarmet medium pr godt at modtage den vaskede podede substrata. Steriliser pincet før hver overførsel.
- Pladen tilbagesendes til den 37 °C befugtede ambient air-inkubator, og biofilmene dyrkes op til 48 timer med en orbitalblanding på 60 omdr./min. til beluftning. Der bør være lidt planktonvækst i hver kultur, medmindre den udviklende biofilm kaster gær-form celler. En biofilm, der dyrkes på denne måde, er vist i figur 1.
2. Behandling af prøver til billedbehandling
FORSIGTIG: Aldehyd fiksativer er flygtige og farlige. Forbered fiksative fortyndinger i en røghætte, ikke i et biosikkerhedsskab. Læg ikke fiksativer i væksthuse, der anvendes til levende celler. Arbejde med fortyndet fiksativer i overdækkede retter i en røg hætte eller et godt ventileret benchtop område. Bortskaf fiksativer og efter-fix vaskeopløsninger som farligt affald.
- Forbered frisk fiksativ, 4% formaldehyd eller paraformaldehyd i PBS, eventuelt med op til 2% glutaraldehyd. Formalin fortyndet til 4% kan anvendes til rutinearbejde.
BEMÆRK: Især glutaraldehyd vil øge bredbåndsautofluorescensen og kan dæmpe fluorescensen af ekspresmærker såsom dTomato. - Kulturmediet fjernes fra prøven, og erstatte seriserumproteiner ne fjernes, eller biofilmen overføres på dets substrat til PBS i flere minutter.
- Prøven overføres til fiksativ, og den overdækkede skål indstilles på en langsom orbitalmixer i 20 min. Udlæng tidsperioden, når der behandles tykkere prøver (se Diskussion). Der skal tilsættes tilstrækkeligt fiksativt volumen til hver skål til at nedsænke al biofilmvækst, herunder eventuelle på indersiden af skålen.
- Tag fiksativt ud og fyld skålen op med PBS for at vaske restfikativt ud. Fastsætte som farligt affald bortskaffes. Gentag flere kortsigtede vasker, så længere vasker at give tid til den resterende fiksativ at diffuse ud af biofilm eller agar blok. Vaskeperioden afhænger af den tid, der er afsat til fiksering (se Diskussion).
- Den nødvendige mængde af pletten vil afhænge af biofilm masse. Alle biofilm fjernes fra områder uden prøve af dyrkningsskålen, inden den farvning, eller den faste prøve overføres til en ny skål foran farvningen. Lad ikke biofilmen løbe ud eller tørre. Hold den nedsænket i PBS.
- Tilføj pletten til skålen (se Diskussion) og sæt den overdækkede parabol på en langsom orbital mixer natten over (se Diskussion). Beskyt mod lys.
- Om morgenen fjernes farvningsopløsningen, og skålen fyldes op med PBS for at fortynde den ubundne plet. Indstil retterne på langsom orbital mixer til at destain i flere timer.
3. Præcisering Protokol: Biofilm om Impermeant Substrata
- Afklarede biofilm er svære at skelne visuelt. Derfor, hvis det ønskes, markere den ene side af hver substrat med en ridse for at udpege den side for podning.
- Brug mærket lange Pasteur pipetter til alle efterfølgende affald og opløsningsmiddeloverførsler for at undgå krydskontaminering af opløsningsmidlerne.
- Ved hjælp af en pincet overføres den faste biofilm fra PBS til 5 ml 50:50 PBS:methanol i et 20 ml glasglas glasglas med biofilmen opad. Bland manuelt med orbital bevægelse med 1 min intervaller i 5 min (se Diskussion).
- Fjern opløsningsmidlet til en affaldsflaske, være forsigtig for at undgå kontakt mellem pipette og biofilm, eller biofilm og hætteglas. Genopfyld forsigtigt med 3 ml pæn methanol. Bland manuelt med orbital bevægelse med 1 min intervaller i 3 min.
- Opløsningsmidlet fjernes til en affaldsflaske, og fyld straks med 5 ml methanol. Bland manuelt med orbitalbevægelse med 1 min. intervaller i 5-10 min. Fjern opløsningsmidlet til affaldsflasken, og genopfyld straks med 3 ml methanol. Biofilm ser ofte mere uigennemsigtige ud på dette tidspunkt end deres oprindelige udseende.
- Opløsningsmidlet fjernes til affaldsflasken, og hætteglasset skal straks fyldes op med 5 ml 50:50 methanol:methylsalicylat. Bland manuelt med orbital bevægelse med 1 min intervaller i 5-10 min. Biofilmen skal være halvgennemsigtig i dette blandede opløsningsmiddel.
- Tag opløsningsmidlet ud på en affaldsflaske. Fyld forsigtigt hætteglasset op med 3 ml pæne methylsalicylater (MS). Bland manuelt med orbital bevægelse med 1 min intervaller i 3 min.
- Opløsningsmidlet fjernes til affaldsflasken, og genopfyld straks med 5 ml pæn MS. Bland manuelt med orbitalbevægelse med 1 min. På dette tidspunkt bør biofilmen være gennemsigtig. Opløsningsmidlet fjernes til affaldsflasken, og hætteglasset skal straks fyldes op med 3 ml pæn MS. Den forarbejdede biofilm er stabil i dette opløsningsmiddel.
- For biofilm på agar (se Diskussion) forlænge alle udveksling sperioder for at give mulighed for vand og opløsningsmiddel diffusion selv agar. De nødvendige tidsperioder kan estimeres ved hjælp af et effektfrit dissekeret mikroskop med darkfield belysning for at se opløsningsmidlet rykke ind i agaren. Protokollen opnår god afklaring og ingen større svind effekter, når 2% agar anvendes, men den afklarede agar vil kondensere, hvis klemt under håndtering med pincet. Brug af en spatel anbefales.
4. Billeddannelse Opsætning for Konfokal mikroskopi
- Følgende trin er for brug af et omvendt mikroskop. Brug en opløsningsmiddelfast skål, der har et dækglasbund til at holde den omvendte prøve på mikroskopstadiet (se Diskussion).
- Klargør afstandsstykkerne til støtte for det omvendte prøve. Brug små rektangler, der er skåret af mikroskopglas (1.000 μm tykke), dækbriller (170 μm) eller 13 mm silikoneringe (330 μm, se Materialetabel ), som kan stablesefter behov. Presoak ringene i methyl salicylat i 1 h for at minimere fokus drift på grund af hævelse.
- For en biofilm på en medicinsk kvalitet silikone firkant, invertere pladsen (dvs. drej det biofilm ned) og sæt den på en spacer i en pulje af methylsalicylate i skålen (Figur 2). Sørg for at undgå bobler under prøven.
- Monter skålen fast på mikroskopets scene, og lav olie nedsænket kontakt med målet (se Diskussion).
- Juster mængden af MS i skålen, så menisken holder prøven fast på afstandsstykket ved overfladespænding. Placer en dråbe MS oven på den omvendte firkantede substrat for at reducere lys spredning fra den matte finish, og dække skålen med en glasplade for at begrænse fordampning. Vent flere minutter, før prøven sætter sig på afstandsstykkerne før billeddannelse.
- Brug transmitteret lys til visuelt at inspicere synsfeltet og lokalisere den aktuelle fokusposition i forhold til de apikale og basale områder af den omvendte biofilm. Indstil kondensatoren, der oplyser numerisk blændeåbning (INA) til et minimum (luk kondensatoriris) for at øge kontrasten, ellers vil den afklarede biofilm være næsten usynlig. Når du er færdig, skal du slukke for den transmitterede lyskilde.
- Skift over til konfokal fluorescens og sæt de nedre og øvre grænser for den serielle fokus billedstak er nødvendige for at spænde biofilm. Opadgående fokus drev stepping, hvilket anbefales, vil først vise forrykkede celler, der har bosat sig på dækslet glas og meget lang apikale hyphae, der hviler på glasset. I den øvre ende af sekvensen skal grundlæggercellerne ses klæbet til substratum'et i bunden af biofilmen. Angiv pinholediameteren, pixelafstanden i billedplanet og fokustrinforøgelsen ved hjælp af de generelle kriterier, der er skitseret i diskussionen.
Representative Results
Biofilm som den i figur 1 er stærkt gennemskinnelige til uigennemsigtige, men er rutinemæssigt afklaret og afbildet ved at anvende protokollen ovenfor. Figur 2 viser den stærke dæmpning af fluorescens med fokusdybde i en fast biofilm i PBS sammenlignet med den samme biofilm efter indeksmatchning. Som vist i figur 3kan det hurtigt estimeres, at der ved hjælp af serielt blandbare opløsningsmidler til stigende brydningsindeks hurtigt kan estimeres. Dette er raffineret ved konventionel fase kontrast mikroskopi for at finde det punkt af mindste kontrast (maksimal gennemsigtighed). Det er klart, at dette optimale ikke opnås ved en homogen indekssammenholdelse. Dette skyldes, at subcellulære strukturer afviger en smule i brydningsindeks. I dette tilfælde forekom kontrastvendingen i cellevæggen ved et lidt lavere opløsningsmiddelindeks end i cytoplasmaet. For Candida albicans biofilm sker det optimale tæt på n = 1.530. Den 48 h vilde type og cak1 DX mutant biofilm i figur 4A var 500 μm i tykkelse, men gærcellerne i bunden blev afbildet næsten lige så skarpt som de apikale celler. Som det fremgår af figur 4C,var dæmpningen af fluorescens heller ikke stærkt korreleret med fokusdybde. Figur 5 viser invasive hyphae i agar, hundredvis af mikrometer under en overflade biofilm. Ældre invasive hyphae konsekvent producere lateral spirende gær proksimalt til septa i hyphal kæden, hvilket giver anledning til subkolonier af gær-lignende celler med jævne mellemrum langs en invasiv hypha.
Figur 1: Biofilmkulturer forud for afklaring. En 24 h biofilm dyrket fra et isolere af et suppleret efg1 //▲ stamme af C. albicans i en 12 brøndplade på en silikonefirkant i RPMI-1640 væskemedium suppleret med 10% FBS. Den sterile blanker er i brønd C4. Indsat viser skåret tværsnit af 96-timers vildtype biofilm dyrket i en 6-brønds plade på en 3,75 mm agarbase i samme medium, der viser invasiv hyphae. Begge paneler er i samme skala. Skalabar = 2,0 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Forbedring af dyb billeddannelse efter indeksmatchning. Figuren viser sideview fremskrivninger af konfokale billedstakke fra en 48 h vilde type biofilm, der blev fastsat og farves med ConA-Alexafluor 594. (A) Prøven blev afbildet i PBS ved hjælp af en 63x 1.0 NA direkte vand-nedsænkning mål. Dæmpningen var alvorlig ved en fokusdybde på 30 μm. (B) Efter præcisering ved protokoltrin 3.3-3.8 blev den samme biofilm afbildet i methylsalicylat med minimal dæmpning ved hjælp af et mål for olienedsænkning på 40x 0,85 NA. Efter baggrundssubtraktion og sideview projektion af 3D-billedstakke, blev 40x data rumligt omskaleret til at matche 63x data til sammenligning. (C) Skematisk diagram, der viser omvendt montering af den klare de klare de klare de klare de klare de klare de klare de klare de klare de klare de klare de klare de fikser (fra MS) ved overførsel til MS i en sortangivet aluminiumsskål med cementeret dækglasbund (se Diskussion). Skalabar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fasekontrastrefraktometri viser kontrastvending af cellefunktioner inden for området for optimal indeksmatchning. Faste biofilm på dækglas blev vekslet fra PBS til methanol, derefter til xylen (n = 1,496). Disse biofilm blev derefter udvekslet en hver fra xylen til et sæt brydningsindeksreferencevæsker (Serie E, Cargille Laboratories, se Tabel over Materialer) og visuelt undersøgt side om side for at bestemme indeksområdet, der giver den højeste gennemsigtighed. (øverste panel) Fase kontrast billeder: En biofilm blev serielt udvekslet mellem xylen og et smalt sæt referencevæsker i dette område. Efter hver udveksling, blev det samme felt flyttet og set om et dækglas ved hjælp af en 40x 0,85 NA Ph2 olie nedsænkning fase kontrast mål og Ph2 kondensator. Alle billeder blev optaget med samme lampeindstilling og kameraeksponering for præcist at vise ændringer. Med stigende indeks ses kontrastvending først ved n = 1,530 for cellevæggen, efterfulgt af cytoplasma ved n = 1,535. Skalabar = 10 μm. (nederste panel) Graf, der viser minimumi den gennemsnitlige lysstyrke i biofilm på det punkt, hvor størst mulig gennemsigtighed er størst. Stærk spredning af lys i biofilmen får den gennemsnitlige lysstyrke til at overstige det tomme felt. Isolerede celler ser mørkere ud end det tomme felt, op til kontrastvending i området 1.530-1.535. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Dyb billeddannelse af mutant og vilde biofilm af type C. albicans. En vildtypestamme (DAG185) og en cellecyklusrelateret proteinkinase formindsket ekspressionsstamme(cak1 DX)14 blev dyrket ved 37 °C i 48 timer på silikonesubstrata i flydende YPD-medium. Biofilmene blev fikseret, plettet med ConA-Alexafluor 594 og præciseret ved hjælp af opløsningsmiddeludvekslingsprotokollen til methylsalicylat. 3D-mikroskopiet viste, at begge biofilm var ~500 μm tykke. Billeddata blev konverteret til 32-bit format i ImageJ eller Fiji (https://imagej.nih.gov/ij/ eller http://fiji.sc), derefter behandlet ved hjælp af subtralektor baggrund funktion med en 50-pixel rullende bold radius, tærskelfor at indstille negative pixels til nul, reslicing, og ved hjælp af maksimal intensitet projektion til at producere side visninger. (A) Aksiale og side-view fremskrivninger: Den vilde type biofilm voksede til en tykkelse på 502 μm som det ses i sidevisning projektion af 558-plan konfokale billede stak. Skalabar = 100 μm. (venstre paneler) 40-plan aksiale fremskrivninger fra spids (top) til base (nederst) viser variationen i celletyper i forskellige lag af biofilmen. Dette eksempel viste karakteristiske vilde type struktur: klæbende celler i bunden giver anledning til hyphae at stige op i en tæt midterste zone af pseudohyphal og gær-lignende celler. Over midzone, hyphae dukket op igen og gav anledning til klynger af spirende gær. Den lange hyphae ses i den apikale zone sandsynligvis udvidet ind i kulturmediet i den levende biofilm, men foldet over på overfladen af biofilm under prøvebehandling. Cak1 DX biofilmen voksede til en tykkelse på 500 μm som det ses i side-view projektionen af 556-plan billedstakken. Denne mutant, som er kendt for at gennemgå filamentous vækst i mangel af inducerende understreger14, produceret en dramatisk anderledes arkitektur. Som det ses i både sideview og aksiale fremskrivninger (højre hånd paneler), mange forgrenede celler gav anledning til radiale udvækster. (B) Eksempler på forgrening hyphae i cak1 DX biofilm. Skalabar = 10 μm. (C) Fluorescensdæmpning med dybde i den klarede biofilm af vild type blev kvantificeret ved at maskere baggrundspixel, hvorefter det gennemsnitlige digitale signal for alle ikke-baggrundspixel i hvert billedplan blev beregnet. Med undtagelse af apikale hyphae, der er stærkt mærket af lectin, var der ingen stærk dæmpning tendens med fokus dybde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Invasive hyphae i agar. C. albicans hyphae i en overflade biofilm vil trænge ind i en agar substratum til millimeter afstande (se figur 1). Efter afklaring, invasive strukturer kan ses nedad om biofilm, eller opad fra den nederste side af agar. Sidstnævnte kræver større arbejdsafstand. Alternativt, efter fiksering, men før farvning og opløsningsmiddel udveksling, agar kan skæres lodret med en skalpel eller barberblad i 1-2 mm plader, som derefter kan vendes på en side og afbildes direkte i sidevisning efter farvning og afklaring. Denne procedure anbefales. I denne projektion af et 213 μm kvadratisk synsfelt blev der brugt en regnbuefarveskala til at kode aksial position over et 75 μm område: blå funktioner er i nærheden, og røde funktioner er dybere ind i sidens plan. Denne opfattelse viser, at lange hyphae knop off lateral gær-form celler med semiregelmæssige intervaller, der giver anledning til subkolonier. Skalabar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Fremskridt inden for fluorescensmikroskopi i optisk skæring, opløsning, hastighed, undgåelse eller kompensation for aberration, erhvervelse af flere kanaler og i computerkraft har forårsaget en genopblussen af billeddannelse af intakte prøver. For faste prøver har både klassiske og nye afklarings - og ekspansionsmetoder haft stor betydning19,20,21,22,23,24. I dette tilfælde anvendte vi en hurtig og enkel opløsningsmiddelbaseret indeksmatchingtilgang for at studere strukturen af svampebiofilm, der er stærkt gennemskinnelige til uigennemsigtige.
De foregående protokoller er blevet testet med en række prøver. I vores laboratorium Candida albicans biofilm er oftest dyrkes på 14 mm firkanter skåret fra et ark medicinsk kvalitet silikone gummi (se Tabel over materialer). Dette substrat anvendes, fordi vækst på PDMS (poly-dimethylsiloxan) nedsænket i flydende dyrkningmedium er blevet etableret som en vigtig in vitro-model for infektioner i forbindelse med medicinske implantater, især iboende katetre. Stressede celler, der indleder filamentation, klæber hurtigt til ikke-polære overflader som f.eks. I praksis giver brugte firkanter, der er blevet rengjort og resteriliseret i en autoklave (tør cyklus), de mest konsekvente biofilm for en bestemt stamme. Biofilm også er almindeligt dyrket på dækglas, i dækning glas bund kultur retter, i standard bakteriologisk kvalitet polystyren retter, og på agar. Fordi C. albicans celler ikke klæber godt til glas, bør dække briller behandles med en lectin, der vil binde celle væg polysaccharider. Vi anvender 40 μL 1 mg/ml ConA eller WGA i sterilt vand på hver dækskopoverflade. Efter tørring behandles dækbrillerne med 40 μL 1% glutaraldehyd i 3 minutter for at krydsforbinde proteinet til en uopløselig film. De vaskes derefter med sterilt destilleret vand for at fjerne fiksativ og opløselig lectin og lufttørret. Om nødvendigt resteriliseres de behandlede dækbriller eller -fade under en bakteriedræbende UV-lampe i 10 min.
Prøvetykkelsen påvirker de nødvendige inkubationsperioder i protokollerne. Fiksativ diffusion i en 300 μm biofilm kræver flere minutter at ligevægte. Denne periode øges som kvadratet på prøvetykkelsen og bør udvides til en time eller mere for meget tykke biofilm eller agarblokprøver, der kan være 2-3 mm tykke. Ækvilibreringstiden for farvning afhænger også af prøvetykkelsen som beskrevet for fastgørelse og udvaskning. Men fordi lektiner spredes langsommere end lav-MW fiksativer, især inden for en agar gel, farvning bør forlænges natten over. Det samme bør gøres for udvaskning af overskydende plet.
Pletter af forskellige typer kan indarbejdes i protokollerne. Vi bruger en celle væg plet til strukturel billeddannelse, oftest Calcofluor White M2R (Fluor. Lysere #28) eller et farvestof-mærket lectin såsom ConA-Alexafluor 594 eller WGA-Alexafluor 594. Der bør lægges vægt på proteinets valens. ConA tetramer kan forårsage krydsbinding af meget fleksibel hyphae i den apikale region af en biofilm. Dette er mindre tydeligt med WGA dimer. De kanoniske særlige forhold ved disse markører er Calcofluor for chitin, ConA for mannoserester og WGA for N-acetyl-D-glucosamin og sialicsyrerester.
Da opløsningsmiddeludvekslingsprotokollen er sorteret fra PBS eller vand om methanol til methylsalicylat, skal prøvebeholderne være opløsningsmiddelresistente. Methylsalicylat (MS) vil hurtigt blødgøre polystyren plastware og langsomt blødgøre andre plast. Protokollen trin op til brugen af den pæne methanol kan udføres i plast, men på det tidspunkt i protokollen vi generelt skifte over til standard 20 ml glas scintillation hætteglas med opløsningsmiddel-resistente skruehætter. Hætteglassene er praktiske til biofilm på silikone firkantede substrata, fordi firkanterne kan afhentes og overføres ved hjælp af fine pincet. Desuden kan et hætteglas tømmes og fyldes op med den flade firkant hvilende på den indre buede overflade, så biofilmen ikke kommer i kontakt med glasset. Substratum skal biofilm-up, når det er nedsænket i opretstående hætteglas. Hætteglassene er fremragende til langtidsopbevaring af prøver.
I afklaringsprotokollen minimerer mere graduerede opløsningsmiddeludvekslingstrin risikoen for prøvedeformation på grund af opløsningsmiddelblandingseffekter. For hastighed og bekvemmelighed i basisprotokollen, er der fire trin: 1) trin 3,3, PBS til 50:50 PBS: methanol; 2) trin 3.4 og 3.5, PBS:methanol til pæn methanol, 3) trin 3.6, pæn methanol til 50:50 methanol:MS; og 4) trin 3.7 og 3.8, methanol:MS til pæn MS. Methanol giver overgangsfejl. Da vand og ms imidlertid næsten er uudgængelige, er det vigtigt, at alt vand forskydes med methanol, før der indføres en MS. På samme måde er det vigtigt at fortrænge al methanol efter MS. fordampning af restmethanol vil medføre refraktive indeksvariationer i prøven. Inden for de fire trin sekvens, gentage det andet og fjerde trin ved at tilføje en anden ændring af pæne opløsningsmiddel, eller endda en tredje ændring, er tilrådeligt. For særligt skrøbelige prøver kan ændringer i opløsningsmidler formuleres i mindre procenttrin.
Med agarblokprøver kan trin 3.4 og 3.5 (pæn methanol) forårsage saltkrystaller i agaren på grund af opløsningsmiddel af resterende PBS-salte i methanolen. Dette kan undgås ved at bruge destilleret vand (DW) i det første blandede opløsningsmiddeltrin i stedet for PBS til at fortynde salte under vand:methanoludvekslingen. Den alternative opløsningsmiddeludvekslingssekvens for faste biofilm består derefter af disse trin: 1) trin 3.3, overfør prøven fra PBS til 50:50 DW:methanol (giv ekstra tid til diffusion gennem agar); 2) trin 3.4, overføres fra 50:50 DW:methanol til pæn methanol (gentag 2x med methanol som i trin 3.5) 3) trin 3.6, overføres fra methanol til 50:50 methanol:methylsalicylat; trin 3.7 overføres prøven fra 50:50 methanol:MS til pæn MS (gentag 2x med MS som i trin 3.8).
Fordi methylsalicylat hurtigt blødgør polystyren plastudstyr, bruger vi en annodiseret aluminium skål med et dækglas bund til at holde den afklarede biofilm på scenen af en omvendt mikroskop. Dækglasset holdes på plads ved hjælp af UV-hærdende optisk cement (Norland Optical Adhesive #61, se Materialetabel). Forudsat at MS fjernes i slutningen af dagen ved at vaske skålen med isopropanol efterfulgt af sæbevand og skylning, vil det cementerede dækglas tjene i mange måneder.
Objektiv linsevalg er af afgørende betydning i storstilet billeddannelse af afklarede prøver på grund af vigtigheden af at minimere sfærisk aberration og behovet for tilstrækkelig arbejdsafstand. Vi har erfaring med tre mål i disse undersøgelser. I den omvendte mikroskop setup, bruger vi en lang arbejdsafstand, moderat numerisk blænde (NA) objektiv olie nedsænket under dækslet glas med biofilm nedsænket i methylsalicylat i skålen over dækslet glas. Det meste af vores arbejde er blevet udført med en Zeiss Universal serie akromatisk mål, type 461708, 40x 0,85NA Oel 160/1.5, der anvendes med en negativ 160 mm brændvidde adapter til nominel uendelig-konjugat (IC) kompatibilitet. Dette mål oprindeligt var designet til olie nedsænket visning gennem 1,5 mm mikroskop dias med 0,35 mm arbejdsafstand25. Når det bruges med et standarddækglas (0,17 mm), er arbejdsafstanden meget større: 1,5 + 0,35–0,17 = 1,68 mm = 1.680 μm. Vi bruger også en ny Zeiss multi-nedsænkning mål, type 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat med en arbejdsafstand på over 540 μm, med nedsænkning korrektion indstillet til den høje side af 'olie'. Dette mål er meget korrigeret og giver et fantastisk billede. På en opretstående mikroskop stander, har vi brugt en ny Nikon multi-nedsænkning mål, type MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat med en arbejdsafstand på over 5.000 μm (5 mm), også med nedsænkning korrektion indstillet til den høje side af 'olie' (n = 1,518). Selv om dette mål har en lavere NA end de andre, det har den fordel, at være direkte nedsænkbar i methylsalicylat.
For at optimere dataindsamlingen med hensyn til hastighed og opløsning bør konfokale mikroskopindstillinger ideelt set opfylde både tværgående og aksiale Nyquist-prøvetagningstætheder18. Sæt den konfokale pinholediameter nominelt til 1 luftig enhed ved hjælp af konventionelle kriterier. I forstørrede koordinater
dP (μm) = 1,22 x forstørrelse x (emissionsbølgelængde i μm) / NA
Tværgående prøvetagning (pixelafstand) må ikke overstige (1/2) x Abbes opløsningsgrænse. I objektrumkoordinater
▲x, ▌y = (emissionsbølgelængde i nm) / (4 NA)
Aksial prøvetagning (fokusforøgelse) må ikke overstige den invendte aksiale båndbredde,
▲z = (nedsænkningsindeks) x (emissionsbølgelængde i nm) / (NA2)
Det konfokale optiske system udvider mikroskopets båndbredde og skærper både den tværgående og aksiale opløsning med mindst 1/√2.
For 40x 0,85 NA mål, som vi bruger oftest, se tabel 1 for resultaterne af disse formler for en 600 nm emission bølgelængde (Alexa Fluor 594).
| Formel | x 1/√2 | sæt (typisk) | |
| dP (μm) | 34,5 μm | - | 25 eller 50 μm |
| ▲x, ▌y | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
| ▲z | 1200 nm | 848 nm | 900 nm |
Tabel 1: Konfokal pinholediameter, tværgående prøvetagning og aksiale prøvetagningsværdier for en bølgelængde på 600 nm.
Ved hjælp af en roterende-disk konfokal scanner med disse indstillinger og en 1.392 x 1.040 pixel scanning felt, data fra biofilm prøver kan erhverves med rimelig hastighed og opløsning. Typiske 3D-billedstakke med én farve kører 0,35-1,55 GB.
Afklaringsmedier i bred brug strækker sig over et betydeligt brydningsindeksområde. Ved darkfield belysning og visuel inspektion, fandt vi, at faste C. albicans biofilm var mest gennemsigtige over n = 1,5. Dette blev raffineret ved fase kontrast mikroskopi til n = 1,530-1,535. Af en række praktiske årsager bruger vi methylsalicylat (n = 1,537) som det endelige indeksmatchende opløsningsmiddel. Selvom opløsningsmiddeludveksling indebærer risiko for prøvedeformation eller andre artefakter, har celler i faste, afklarede prøver lignende cellekropsdimensioner, hyphadiameter og interseptale længdedimensioner som levende prøver.
Mange variationer i opløsningsmiddeludvekslingsprocessen er mulige (f.eks. ved hjælp af et andet overgangsopløsningsmiddel eller et andet endeligt opløsningsmiddel). Methanol blev valgt for sin høje polaritet og hurtig diffusion, men ethanol viste sig bedre at bevare rødt fluorescerende protein (RFP) kvanteudbytte26 som et overgangsopløsningsmiddel. Methylsalicylat blev valgt for sit indeks, moderat polaritet, lavt damptryk, og kompatibilitet med mange pletter, farvestoffer, og fluorescerende proteiner. Men et endeligt opløsningsmiddel med lidt lavere indeks, eller en blanding af methylsalicylat og et lavere indeks opløsningsmiddel, såsom butanol, kan tjene bedre.
Uventet, evnen til at se gennem en biofilm afslører ikke kun dens lagdelte interne funktioner, men også hjælpemidler i at se oprindelsen af udvidede strukturer såsom lange, ufiltrede apikale hyphae og invasive basal hyphae på visse substrata. Opportunistisk virulens i C. albicans afhænger af dens genetiske alsidighed (dvs. overgang til hyphal vækst, opregulering af celle substratum og celle-celle tilslutning, generation af osmolytes til celle spirende og forlængelse, og brug af alternative næringsstoffer). Hyphal forlængelse muliggør udbrud af individuelle C. albicans celler fra fagocytiske immunceller, men også er afgørende for invasion. Biofilm vedhæftning og hyphal sammenfiltring synes at give overfladen forankring er nødvendig for hyphae til effektivt at invadere et substrat. Når dette substrat er værtsvæv, kan øget virulens resultere.
Imaging intaktbiofilm muliggør en lang række informative eksperimenter, der anvender reporterstammer til genekspression, modelvævssubstrata og inddragelse af andre organismer såsom bakterier, der findes i naturlige biofilm. Selv i det enkleste tilfælde af rent strukturel billeddannelse med en cellevæg plet, in situ fænotyper er afsløret, at så kan kvantificeres og genetisk analyseret.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev delvist støttet af NIH tilskud R01 AI067703, R21 AI100270, og R21 AI135178 til A.P. Mitchell. Forfatterne er taknemmelige for Greenfield 'Kip' Sluder for at give den lange arbejdsafstand olie nedsænkning mål, der anvendes i dette arbejde, og at Daniel Shiwarski for konfokal mikroskopi med direkte methylsalicylate nedsænkning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator - 30 °C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator - 37 °C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5 W | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13 mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n = 1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
References
- Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
- Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144 (2017).
- Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
- Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
- Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226 (2018).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
- Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525 (2012).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
- Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
- Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487 (2016).
- Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787 (2019).
- Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
- Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, Reprinted in 9, 154-166, 1992 1601-1613 (1991).
- Lanni, F., Keller, H. E. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. Yuste, R. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-55 (2011).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
- Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , Oberkochen, West Germany. archive CZO-Mi 823, ed. 1967 48 (1971).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113 (2008).
