Summary
カンジダ・アルビカンスのバイオフィルムの内部特徴を見て定量化するために、屈折率マッチングによって明らかにされた固定無傷の標本を用意します。そして、光学断面顕微鏡を用いれば、バイオフィルムの厚みを完全にもった3次元画像データを得ることができる。
Abstract
微生物菌カンディダ・アルビカンスは、酵母形態の成長から催眠成長に切り替える能力と強く相関する、コメンサルコロニー形成から毒性への変化を受ける可能性がある。このプロセスを始める細胞は、表面および互いに接着し、その結果、バイオフィルムコロニーの開発が行われます。これは一般的に酵母感染症の粘膜組織表面だけでなく、カテーテルなどの医療用インプラントでも起こります。バイオフィルム細胞は抗真菌薬に耐性があり、バイオフィルムから流れた細胞は危険な全身感染につながる可能性があることはよく知られています。バイオフィルムは、屈折不均一性のために、重く半透明から不透明までさまざまです。そのため、真菌バイオフィルムは光学顕微鏡による研究が困難である。内部構造、細胞、細胞下の特徴を可視化するために、最適な屈折率の一致点に段階的に溶媒交換を行い、固定インタクトバイオフィルムを明らかにする。C.アルビカンスバイオフィルムの場合、十分な明確化がメチルサリチル酸塩(n = 1.537)で達成され、600μmのバイオフィルムの共焦点顕微鏡をわずか減衰で600μmのバイオフィルムで可能にします。この可視化プロトコルでは、位相差屈折法、実験室用バイオフィルムの成長、固定、染色、溶媒交換、共焦点蛍光顕微鏡のセットアップ、および代表的な結果を概説する。
Introduction
カンディダアルビカンスは、ヒトでは一般的にコメンサルである微生物真菌である。生物は複数の形態を持っているので、生物学者にとって基本的な関心事です。例えば、特定の環境的手掛かりやストレッサーに応答して、酵母形態の出芽細胞は、ヒファエとして知られている非常に細長い細胞のセプテッティング鎖として糸状増殖に切り替わる。この転移は、単細胞遺伝子発現プログラムと多細胞遺伝子発現プログラムとの間の切り替えの表現型発現の一例として重要である。同様に、C.アルビカンスは生物がよく知られている日和見病原体であるため、生物医学的に関心がある。ツグミ(口腔カンジダ症)、泌尿生殖器感染症、免疫学的に弱体化した患者における危険な侵襲的または全身感染の原因などの粘膜酵母感染症の原因です。
この生物の毒性の可能性は、その遺伝的多様性の複数の形態型および他の側面に密接に関連している1,2,3,4.胚芽管延長は、催眠成長への移行の第1の目に見える段階で、包込まれたC.アルビカン細胞が食細胞から抜け出し、それによって宿主5の細胞免疫応答の初期段階を逃れることを可能にするのに十分な速さで起こる。さらに、フィラメンテーションは、アテシン6、7、8、9として知られている細胞壁タンパク質のいくつかのクラスの調節発現に起因する細胞間接着および細胞対地接着の大幅な増加を伴う前に伴う。多種多様な条件下で、付着とフィラメンテーションの組み合わせは、プランクトン、単細胞成長からバイオフィルムを形成する表面関連植民地成長への劇的なシフトをもたらします。C. アルビカンスバイオフィルムは、静脈カテーテルなどの一般的な埋め込み医療機器上で開発する可能性があります。このようなバイオフィルムが酵母細胞から芽を出し始め、それらを循環血液に流し始めると、播種感染が生じる可能性があります。複数の研究は、バイオフィルム細胞がプランクトニック細胞10,11よりも抗真菌薬に対して耐性があることを示している。さらに、バイオフィルムの高い全体的な付着は、宿主組織1へのヒファエの効率的な侵襲的増殖に必要なアンカーを提供し得る。
屈折率マッチングによるC.アルビカンスバイオフィルムの光学的解明は、この微生物群集の構造を可視化し、遺伝子発現と表現型の関係を発見する能力に大きな影響を与えました。48時間液体培養培地下の試験表面上の実験室で成長したバイオフィルムは、不透明になるほど緻密で厚い白っぽいコーティングとして現れる(図1)。したがって、バイオフィルムの多くの興味深いフェオチの特徴は、視界から隠されています。YPD、RPMI-1640、またはスパイダー培地で成長した24h野生型バイオフィルムは、厚さ300μmまでの範囲で、48時間のバイオフィルムはしばしば500μmに達する。不透明度は、屈折不均一性から生じる光散乱によるものです:真菌細胞壁は周囲の媒体よりも屈折性が高く、細胞質は細胞壁よりもわずかに屈折します。ネイティブバイオフィルムの高い光学密度は、従来の顕微鏡や共焦点スキャナで見ると、深さ30μmを超える全ての構造を覆い隠す(図2)。しかし、主要な細胞構成成分の屈折率にほぼ一致する高屈折率液を有する固定バイオフィルムを浸潤させることにより、大きな程度の明確化が達成できる。明確化後、サブミクロン分解能でのイメージングは、ほぼ全てのC.アルビカンバイオフィルム13の全厚を通して共焦点顕微鏡で行うことができる。野生型の標本では、バイオフィルムが長く絡み合ったヒファエ、新芽酵母形態細胞またはシュードヒスファル細胞のクラスター、空隙、およびある程度の細胞外マトリックスから成り立っていることがわかります。さらに、バイオフィルムは一般に階層化され、細胞型、細胞密度、および出芽細胞または分岐細胞の存在における空間的に変異形態学的な違いを示す。これらの特徴の1つ以上の多くのバリエーションは、変異株14、15によって開発されたバイオフィルムにおいて観察されている。また、レポーター株は、遺伝子発現16、9、13における空間的な差をその中で示す。この比較的簡単で安価なアプローチで得られる驚くべき程度の明確化はまた、多くのバイオフィルムが数ミリメートルの距離に伸びる有端な催眠催眠および基底侵襲性ヒファエを含むことも可能にする。
この可視化プロトコルでは、単純な細胞壁マーカーを染色体として用いたC.アルビカンバイオフィルムの固定、標識、明確化、およびイメージングを実証する。プロトコルの現在のバージョンの起源は、ホルムアルデヒド固定バイオフィルムに97%グリコールメタクリレート(GMA)を浸透させたときに観察した改善された明瞭さであり、その後、適度に高い屈折率(n = 1.49)を有する硬質プラスチックにバイオフィルムを埋め込むために重合した。次に、従来の位相差顕微鏡検査と一連の屈折率基準液を用いて、バイオフィルムのコントラスト反転(最大透明性)のポイントをより正確に決定した(図3)。C. アルビカンスバイオフィルムの場合、これはn = 1.530に近い状態で発生し、ヘアケラチンなどの緻密なタンパク質構造がわずかに屈折(1.54-1.55)に過ぎないことを考えると驚くほど高かった。図3では最適範囲の上限に位置していますが、古くから発生・組織学の顕微鏡検査の解明剤として用いられてきたため、現在のプロトコルではメチルサリチル酸(冬緑の油分n=1.537)を採用しており、毒性が低く、蒸気圧が低く、中程度NA油浸出光学系を用いた試験で優れた結果を出しました。
ここで4つのポイントを作る必要があります:
(1)いくつかの例外を除いて、顕微鏡における理想的な状況は、試料の屈折率が対物レンズ浸出液17、18、13の屈折率と等しくなるべきである。深い焦点を合わせる必要がある3次元(3D)イメージング研究では、これは常に重要です。
(2) 最適なクリアリング(n = 1.525-1.535)の実験結果は、標準的な浸漬油(n = 1.515,1.518)よりもわずかに高いため、点(1)に違反するため、標準的な油浸光学を使用する場合に球面収差の発生源を導入します。この問題の解決策の1つは、より高い範囲の浸漬指数用に設計された目的の使用である。クリアされた標本のイメージングへの関心の復活のために、必要な補正を伴う特殊目標が利用可能になりつつあります。もう一つの解決策は、最適な油浸性性能のために少量のブタノール(n = 1.399)を添加することによって、明確化媒体の指数を1.515または1.518まで調整し、わずかに劣化した透明度を受け入れることです。
(3)無傷のバイオフィルム(およびこのスケールの他の標本)の顕微鏡検査は、標本の厚さに対応するためにかなりの作業距離を必要とする。これは、大きな実用的な考慮事項です。長い作動距離は、解像度を制限するだけでなく、球面収差の重症度を制限する中程度の数値開口(NA = 0.6-1.25)に光学を制限します。
(4)明確化のための最適な屈折率は、他のタイプの固定試料で異なることがある。試料は、図3に示すように、位相コントラストと一連の屈折率参照液を使用して、それに応じてテストする必要があります。
Protocol
バイオフィルム文化の成長
注意:カンディダアルビカンはヒトの病原体です。いくつかの施設では、この生物の培養にはBSL-2封じ込めが必要です。
- 酵母エキスペプトンデキストロース(YPD)寒天プレート上の選択された株をストリークアウトし、30°Cで48時間成長する。
- プレートから1つのコロニーを選択して、30°Cで一晩の有酸素成長(カルーセル回転翼、52〜55rpm)のための15 mL培養管内の5mLのYPD培地を接種します。
- 一晩培養物の40~50倍希釈を用いて細胞密度を決定する。セル密度をシリコーンサブストラタの場合は 3 x 106セル/mL に、コンカナリン A (ConA) または小麦胚芽凝集剤 (WGA) で処理したカバー ガラス表面の場合は 0.6 ~1.2 x 106セル/mL にする希釈係数を計算します (説明を参照)。
- 12ウェルプレート(図1)でのバイオフィルムの成長のために、各ウェルに2.0mLの無菌フィラメント培地を分配し、加湿インキュベーターでプレートを37°Cに温めます。様々な培地は、より強く、高温(37°C)で、そして加えた血清で、フィラメンテーションを誘導します。牛胎児血清(FBS)が推奨されます。推奨メディアは、YPD、スパイダーマンニトール、RPMI-1640です。
- 滅菌ピンセットで、温めたプレートの各井戸に準備された下部層を入れ、気泡を取り除きます。一晩培養から接種を加えて、各ウェルのステップ1.3で推奨される細胞密度に到達する。接種のない井戸は、視覚的な空白と汚染に対する制御として機能します。
- 60 rpmの軌道ミキサーにプレートを加湿した37°Cの空気インキュベーターに90分間置き、細胞接着に時間を割きます。90分後、培地および未接続の細胞を取り出し、滅菌培地またはリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で洗浄し、接種された皮層を培養皿またはプリウォームフィラメント培地を含む別のマルチウェルプレートに入れます。マルチウェルプレートでは、洗浄された接種された細分化を受け取るために、洗浄工程用の第2プレートと、2.0 mLのプレウォームド培地を用いた第3プレートを使用するのが非常に便利です。各転送の前にピンセットを殺菌します。
- プレートを37°C加湿周囲空気インキュベーターに戻し、バイオフィルムを60 rpmの軌道混合で48時間まで成長させ、通気のために混合します。開発中のバイオフィルムが酵母形態細胞を流していない限り、各培養物にプランクトニック成長はほとんどないはずです。このようにして成長したバイオフィルムを図1に示します。
2. イメージング用の検体加工
注意:アルデヒド固定剤は揮発性で危険です。バイオセーフティキャビネットではなく、ヒュームフードに固定希釈液を用意します。生細胞に使用されるインキュベーターに固定剤を入れないでください。ヒュームフードまたは換気の良いベンチトップエリアのカバーされた皿の希釈された固定液と一緒に働きます。固定液と後修正洗浄液を有害廃棄物として処分する。
- 新鮮な固定剤、4%ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドをPBSで準備し、必要に応じて最大2%グルタルアルデヒドを使用します。4%に希釈されたホルマリンは、日常業務に使用してもよい。
注:特にグルタルアルデヒドは、ブロードバンド自家蛍光を増加させ、dTomatoのような表現可能なタグの蛍光を減衰させる可能性があります。 - 培養液を検体から取り出し、PBSに置き換え、血清タンパク質を希釈するか、そのサブストラタムのバイオフィルムをPBSに数分間移します。
- 試料を固定剤に移し、覆われた皿を低速軌道ミキサーに20分間セットします。各皿に十分な固定容積を加えて、皿の内側に任意のバイオフィルムの成長を浸す必要があります。
- 固定剤を取り除き、残存固定剤を洗い流すためにPBSで皿を補充します。固定剤を有害廃棄物として処分する。いくつかの短期のするを繰り返し、その後、残りの固定剤がバイオフィルムまたは寒天ブロックから拡散するための時間を可能にするために、より長くのくすを行う。洗浄期間は、固定に許容される時間によって異なります(説明を参照)。
- 必要な汚れの量は、バイオフィルム質量に依存します。染色する前に培養皿の非標本領域からすべてのバイオフィルムを除去するか、または染色の前に新しい皿に固定標本を移す。バイオフィルムを水切りまたは乾燥させないでください。 PBSに浸したままにしてください。
- 皿に汚れを加え(ディスカッションを参照)、覆われた皿を一晩遅い軌道ミキサーにセットします(ディスカッションを参照)。光から守る。
- 朝、染色液を取り出し、PBSで皿を補充し、バインドされていない汚れを希釈します。数時間のデステインに遅い軌道ミキサーに料理を設定します。
3. 明確化プロトコル:インパー意味のサブストラタのバイオフィルム
- 明確化されたバイオフィルムは、視覚的に見分けるのは難しいです。したがって、必要に応じて、各皮層の片側を傷でマークし、接種する側を指定します。
- 溶剤の交差汚染を避けるために、後続のすべての廃棄物および溶媒の移動にラベル付き長いパスツールピペットを使用してください。
- ピンセットを使用して、固定バイオフィルムをPBSから50:50 PBSの5 mLに移し、バイオフィルムを上に向けて20 mLガラスバイアルにメタノールします。手動で軌道運動と1分間隔で5分間混ぜ合わせます(説明を参照)。
- 溶媒を廃ボトルに除去し、ピペットとバイオフィルム、またはバイオフィルムとバイアルとの接触を避けるように注意してください。3 mLのきちんとしたメタノールをそっと補充します。手動で軌道運動と1分間隔で3分間混合します。
- 廃ボトルに溶剤を取り出し、5mLのメタノールで直ちに補充します。手動で軌道運動と5〜10分間隔で混合し、廃棄物ボトルに溶媒を取り除き、3 mLのメタノールですぐに補充します。バイオフィルムは、この時点で最初の外観よりも不透明に見えることがよくあります。
- 廃ボトルに溶剤を取り出し、50:50メタノール:メチルサリチル酸の5 mLで速やかにバイアルを補充します。手動で軌道運動と1分間隔で5〜10分の間隔で混合します。バイオフィルムは、この混合溶媒で半透明でなければなりません.
- 廃ボトルに溶剤を取り除きます。きちんとしたメチルサリチル酸(MS)の3 mLでバイアルを静かに補充します。手動で軌道運動と1分間隔で3分間混合します。
- 廃液瓶に溶剤を取り出し、5 mLの清楚なMSで直ちに補充します。この時点で、バイオフィルムは透明でなければなりません。廃ボトルに溶剤を取り出し、すぐにきちんとしたMSの3 mLでバイアルを補充します。処理されたバイオフィルムは、この溶媒において安定である。
- 寒天上のバイオフィルム(議論参照)については、寒天を使用して水と溶媒の拡散を可能にするために、すべての交換期間を延長します。必要な期間は、寒天への進入溶媒を見るために暗視野の照明を用いる低電力解剖顕微鏡を使用して推定することができる。このプロトコルは、2%の寒天を使用すると良好な明確化と大きな収縮効果を達成しませんが、ピンセットで処理しながら絞ると明確な寒天が凝縮します。へらを使用することをお勧めします。
4. 共焦点顕微鏡用イメージングセットアップ
- 以下の手順は、反転顕微鏡を使用するためのものです。カバーガラス底を備えた耐溶剤性の皿を使用して、顕微鏡のステージに反転標本を保持します(説明参照)。
- 逆の標本のサポートのためのスペーサーを準備しなさい。顕微鏡スライド(厚さ1,000 μm)、カバーグラス(170 μm)、または13mmシリコーンリング(330 μm、材料表を参照)から切り取られた小さな長方形を使用します。腫れによる焦点ドリフトを最小限に抑えるために、1時間のメチルサリチル酸塩でリングを予め取ります。
- 医療グレードのシリコーン四角形のバイオフィルムの場合、正方形を反転(すなわち、バイオフィルムを下にして)、皿の中のサリチル酸メチルのプール内のスペーサーにセットする(図2)。標本の下の泡を避けるようにしてください。
- 皿を顕微鏡のステージにしっかりと取り付け、目的に油浸しを取り付けます(議論参照)。
- 半月板が表面張力によってスペーサーにしっかりと試料を保持するように、皿の中のMSの量を調整します。逆角の部分の上にMSの液滴を置いて、マット仕上げからの光の散乱を減らし、蒸発を制限するためにガラス板で皿を覆います。イメージングの前に、試料がスペーサーに落ち着くのに数分待ちます。
- 透過光を使用して視野を視覚的に検査し、反転バイオフィルムの補助領域と基底領域に対する現在の焦点位置を特定します。凝縮器照明の数値開口(INA)を最小に設定し(凝縮器アイリスを閉じる)コントラストを高める場合、それ以外の場合は、明確化されたバイオフィルムはほとんど見えなくなります。完了したら、送信された光源をオフにします。
- 共焦点蛍光に切り替え、バイオフィルムを広げるために必要なシリアルフォーカス画像スタックの下限と上限を設定します。推奨される上向きフォーカスドライブステッピングは、まずカバーガラスに落ち着いた外れた細胞と、ガラスの上に置かれている非常に長い頭蓋催眠ヒファエを示します。配列の上端で、創始細胞は、バイオフィルムの基部の下部に付着して見られるべきである。ピンホールの直径、イメージ平面のピクセル間隔、フォーカスステップの増分を、「ディスカッション」で概説した一般的な基準を使用して設定します。
Representative Results
図1のようなバイオフィルムは、不透明に対して重く半透明であるが、上記のプロトコルを採用することによって日常的に明確化され、画像化される。図2は、インデックスマッチング後の同じバイオフィルムと比較して、PBSにおける固定バイオフィルムにおける焦点深度を有する蛍光の強い減衰を示す。図3に示すように、直列に混和性の溶媒を使用して屈折率を最大にし、明瞭化を迅速に推定することができる。これは、最小コントラスト(最大透明性)のポイントを見つけるために、従来の位相コントラスト顕微鏡によって精製されています。この最適は、均質なインデックスマッチングでは達成されないことは明らかです。これは、細胞内構造が屈折率が若干異なるためです。この場合、細胞壁に細胞質よりもわずかに低い溶媒指数でコントラスト反転が生じた。カンディダ・アルビカンスのバイオフィルムの場合、最適はn= 1.530に近いところに起こります。図4Aの48h野生型およびcak1 DX変異型バイオフィルムは厚さが500μmであったが、塩基の酵母細胞は頂端細胞とほぼ同じくらい鋭く画像化された。同様に、図4Cに示すように、蛍光の減衰は焦点深度と強く相関していなかった。図5は、表面バイオフィルムの下に数百マイクロメートルの寒天下の侵襲性ヒファエを示す。成熟した侵襲性ヒファエは、一貫してヒファラル鎖の中でセプタに近い側出芽酵母を産生し、侵襲性の催眠に沿って一定の間隔で酵母様細胞のサブコロニーを生じさせる。
図1:明確化前のバイオフィルム培養物10%FBSを添加した液体培地のシリコーンスクエア上の12ウェルプレートのC.アルビカンの補体efg1δ/Δ株の分離株から成長した24時間のバイオフィルム。無菌ブランクは、よくC4にあります。 インセットは、侵襲性ヒファエを示す同じ媒体の3.75mm寒天ベースの6ウェルプレートで成長した96時間の野生型バイオフィルムの切断断面を示す。両方のパネルが同じスケールになります。スケールバー= 2.0 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:インデックスマッチングによるディープイメージングの改善図は、ConA-Alexafluor 594で固定され染色された48時間の野生型バイオフィルムからの共焦点画像スタックのサイドビュー投影を示しています。(A)試料を63x 1.0 NA直接水浸し目的を用いてPBSで画像化した。30μmの焦点深さで減衰が厳しかった。(B) プロトコルステップ3.3~3.8で明確化した後、同じバイオフィルムを40x 0.85 NA油浸出目的を用いて最小限の減衰でメチルサリチル酸で画像化した。3D 画像スタックの背景の減算とサイドビューの投影後、比較のために 40x データを空間的に再スケールして 63x データと一致させました。(C) クリアした試料の反転取り付けを示す模式図(MSから)を、黒色陽極酸化されたアルミニウム皿に入れ、シートガラス底部を固めた(議論参照)。スケールバー= 50 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:位相差屈折測定は、最適なインデックスマッチングの範囲における細胞特徴のコントラスト反転を示す。カバーグラス上の固定バイオフィルムを、PBSからメタノールに交換し、次いでキシレン(n = 1.496)に交換した。これらのバイオフィルムは、キシレンから一組の屈折率基準液体(シリーズE、カージル研究所、材料表を参照)にそれぞれ交換し、視覚的に並んで検査し、最高の透明性を与えるインデックス範囲を決定しました。(上部パネル)位相コントラスト画像:1つのバイオフィルムを、キシレンと狭い基準液体の間で連続的に交換した。交換後、40x 0.85 NA Ph2油浸相対比目標とPh2コンデンサーを用いたカバーガラスを用いて、同じ分野を再配置し、見た。すべての画像は、正確に表示変更を表示するために、同じランプ設定とカメラ露出で記録されました。増加指数では、コントラスト反転は、まず、細胞壁のn = 1.530で見られ、次いでn = 1.535の細胞質が続きます。スケールバー= 10 μm(下部パネル)最大透明性の点での平均バイオフィルム輝度の最小値を示すグラフ。バイオフィルム内の光の強い散乱は、平均明るさが空白のフィールドを超える原因となります。孤立したセルは空白のフィールドよりも暗く表示され、1.530 ~ 1.535 の範囲で反転がコントラストを合わします。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:変異型及び野生型C型アルビカンスバイオフィルムの深層イメージング野生型株(DAY185)および細胞周期関連タンパク質キナーゼ減少発現株(cak1 DX)14を、液体YPD培地中のシリコーンサブストラタ上で37°Cで48時間成長させた。バイオフィルムを固定し、ConA-Alexafluor 594で染色し、溶媒交換プロトコルを用いてメチルサリチル酸に分けて明らかにした。3D共焦点顕微鏡は、両方のバイオフィルムが〜500μmの厚さであることを示した。ImageJ または Fiji (https://imagej.nih.gov/ij/またはhttp://fiji.sc) で画像データを 32 ビット形式に変換し、50 ピクセルのローリング ボール半径を持つ減算バックグラウンド関数を使用して処理し、負のピクセルをゼロに設定するしきい値、変更、最大強度投影を使用してサイド ビューを生成しました。(A) 軸および側面図のプロジェクション: 野生型バイオフィルムは、558平面共焦点画像スタックの側面図投影に見られるように、502 μmの厚さに成長しました。スケールバー= 100 μm(左手パネル)40面のアキシャル突起は、頂点(上)からベース(下)への、バイオフィルムの異なる層における細胞タイプの変動を示す。この例は特徴的な野生型構造を示した:塩基の付着細胞は、シュードヒュファルおよび酵母様細胞の密な中間ゾーンに上昇するヒファエを生じさせる。中ゾーンの上に、ヒファエが再び出現し、出芽酵母のクラスターを生み出しました。有端帯に見られる長いヒファエは、生きているバイオフィルムの培養培地に広がった可能性が高いが、検体処理中にバイオフィルムの表面に折り畳まれた。cak1 DXバイオフィルムは、556平面画像スタックのサイドビュー投影に見られるように、500 μmの厚さに成長しました。この変異体は、誘起応力14の無い場合に糸状成長を経て知られており、劇的に異なるアーキテクチャを生み出した。サイドビューと軸方向の両方の突起(右手パネル)に見られるように、多くの分岐細胞は放射状の成長を生み出した。(B) cak1 DXバイオフィルム内での分岐性ヒファの例。スケールバー= 10 μm(C)明らかにされた野生型バイオフィルムの深度を有する蛍光減衰は、背景ピクセルをマスキングすることによって定量化し、次に各画像平面の全非背景ピクセルの平均デジタル信号を計算した。レクチンによって明るくタグ付けされた素端の催眠ヒファエを除いて、焦点深度を持つ強い減衰傾向はなかった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:寒天中の侵襲性ヒファエ、C.アルビカンスの表面バイオフィルムは、寒天下層部からミリ波までの距離に浸透する(図1参照)。明確化後、侵襲的な構造は、バイオフィルムを使用して下方に見ることができるか、寒天の底面から上向きに見ることができる。後者は、より大きな労働距離を要求します。あるいは、固定後、染色と溶剤交換の前に、寒天はメスまたはカミソリの刃で垂直に1〜2mmのスラブに切断され、側面に回転させ、染色および明確化後に直接側面図で画像化することができます。この手順を推奨します。213 μm平方の視野のこの投影では、虹色スケールを使用して75μmの範囲を超える軸位置を符号化しました:青い特徴は近くにあり、赤い特徴はページの平面に深く入っています。この図は、亜コロニーを生じさせる半規則的な間隔で横酵母形態細胞から長いヒファが芽を出すことを示している。スケールバー= 50 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
光学断面、分解、速度、収差の回避または補償、マルチチャネル獲得、およびコンピューティングパワーにおける蛍光顕微鏡の進歩は、無傷の標本のイメージングの復活を引き起こしている。固定標本の場合、古典と新しい両方の明確化と拡張方法は、大きな影響を与えた 19,20,21,22,23,24.この場合、高速で単純な溶媒ベースのインデックスマッチングアプローチを適用し、不透明に対して重く半透明の真菌バイオフィルムの構造を研究しました。
上記のプロトコルは、さまざまな標本でテストされています。当研究室ではカンジダ・アルビカンスのバイオフィルムは、最も頻繁に医療グレードのシリコーンゴムのシートから切り取られた14のミリメートルの正方形で成長しています(材料表を参照)。この皮質は、液体培養培地に沈んだPDMS(ポリジメチルシロキサン)の成長が、医療用インプラント、特にインカテーテルに関連する感染症の重要なインビトロモデルとして確立されているために使用される。フィラメンテーションを開始するストレス細胞は、PDMSなどの非極性表面に素早く付着します。実際には、オートクレーブ(ドライサイクル)で洗浄され再殺菌された使用された正方形は、特定の株に対して最も一貫したバイオフィルムを与える。バイオフィルムはまた、一般的にカバーグラス、カバーガラス底培養料理、標準的な細菌学グレードのポリスチレン料理、寒天で栽培されています。C.アルビカンス細胞はガラスにうまく付着しないので、カバーグラスは細胞壁多糖類を結合するレクチンで処理されるべきである。各カバースリップ表面に滅菌水で1mg/mL ConAまたはWGAの40 μLを塗布します。乾燥後、カバーグラスは、タンパク質を不溶性フィルムに架橋するために3分間、1%グルタルアルデヒドの40 μLで処理されます。その後、滅菌蒸留水で洗浄し、固定液および可溶性レクチンを除去し、空気乾燥します。必要に応じて、処理されたカバーグラスまたは皿は、10分間、殺菌性のUVランプの下で再殺菌される。
標本の厚さは、プロトコルで必要なインキュベーション期間に影響を与えます。300 μmバイオフィルムへの固定拡散には、平衡化に数分かかります。この期間は、試料の厚さの正方形として増加し、2〜3ミリメートルの厚さである可能性があり、非常に厚いバイオフィルムまたは寒天ブロック標本のために1時間以上に拡張する必要があります。染色のための平衡時間はまた、固定および洗い流しのために記載されているように標本の厚さによっても依存する。しかし、レクチンは低MW固定剤よりもゆっくりと拡散するため、特に寒天ゲル内では染色を一晩延長する必要があります。過剰な汚れの洗い流しに対して同じことが行われるべきです。
種々のタイプの汚れは、プロトコルに組み込まれてもよい。構造イメージングには細胞壁染色を使用し、最も一般的にはカルコフルオールホワイトM2R(Fluor.ブライトナー#28)またはConA-Alexafluor 594またはWGA-Alexafluor 594などの染料タグ付きレクチン。注意は、タンパク質の価に支払われるべきです.ConA四量体は、バイオフィルムの有端領域における高い柔軟性の高いヒファエの架橋を引き起こす可能性がある。これは WGA ダイマーでは明らかではありません。これらのマーカーの正規特異性は、キチンのカルコフルオール、マンノース残基のConA、N-アセチルD-グルコサミンおよびシアル酸残基のWGAである。
溶剤交換プロトコルは、メタノールをメチルサリチル酸にしながらPBSまたは水から等級付けされるため、検体容器は溶剤耐性でなければなりません。メチルサリチル酸(MS)はすぐにポリスチレンプラスチック製品を柔らかくし、ゆっくりと他のプラスチックを柔らかくします。きちんとしたメタノールの使用までのプロトコルステップはプラスチック製品で行うことができますが、プロトコルのその時点で我々は一般的に溶剤耐性スクリューキャップを備えた標準的な20 mLガラスシンチレーションバイアルに切り替えます。バイアルは、正方形がピックアップし、細かいピンセットを使用して転送することができるので、シリコーン正方形のサブストラタ上のバイオフィルムに便利です。また、バイアルを排出し、バイオフィルムがガラスに接触しないように、内側の湾曲した表面に平らな正方形を残して再充填することができます。それは直立バイアルに浸漬されている場合、下層部はバイオフィルムアップする必要があります。バイアルは長期の標本の貯蔵のために優秀である。
明確化プロトコルでは、より多くの等級の溶媒交換ステップは、溶媒混合効果による検体変形のリスクを最小にする。基本プロトコルの速度と利便性のために、4つのステップがあります:1)ステップ3.3、PBSから50:50 PBS:メタノール。2)ステップ3.4と3.5、PBS:メタノールから清楚なメタノール、3)ステップ3.6、メタノール50:50にきちんとしたメタノール:MS;そして4)ステップ3.7および3.8、メタノール:MSはきちんとしたMS.メタノールに移行的な違和感を提供する。しかし、水とMSはほぼ混入しないので、MSの導入前にすべての水がメタノールによって変位することが不可欠です。残留メタノールの蒸発は、試料内の屈折率変動を引き起こす。4段階のシーケンス内で、きちんとした溶媒の別の変化、あるいは第3の変化を加えることによって第2および第4のステップを繰り返し、お勧めです。特に壊れやすい標本の場合、溶媒の変化は、より小さいパーセントのステップで処方することができる。
寒天ブロック標本では、ステップ3.4および3.5(きちんとしたメタノール)は、メタノール中の残留PBS塩の溶解性のために寒天内の塩結晶の出現を引き起こす可能性があります。これは、水:メタノール交換中に塩を希釈するためにPBSの代わりに第1混合溶媒ステップで蒸留水(DW)を使用することによって回避することができます。固定バイオフィルムの代替溶媒交換シーケンスは、次のステップで構成されています: 1) ステップ 3.3, 50:50 DW:メタノールにPBSから標本を転送 (寒天を介して拡散のための余分な時間を許可します);2)ステップ3.4、標本を50:50 DW:メタノールからきちんとしたメタノールに移す(ステップ3.5のようにメタノールで2倍繰り返す)。3)ステップ3.6、メタノールから50:50メタノール:メチルサリチル酸に標本を移す;4)ステップ3.7、試料を50:50メタノール:MSからきちんとしたMSに移す(ステップ3.8のようにMSで2倍を繰り返す)。
サリチル酸メチルはポリスチレンプラスチック製品を素早く軟化させるため、蓋ガラス底部を備えた陽極酸化アルミニウム皿を使用して、反転顕微鏡のステージ上で透明化バイオフィルムを保持しています。カバーガラスはUV硬化光学セメントを用いて所定の位置に保持されます(ノーランド光学接着剤#61、材料表を参照してください)。MSがイソプロパノールで皿を洗い、続いて石鹸水とすすいで洗うことによって一日の終わりに取り除かれる場合、セメントカバーガラスは何ヶ月も役立ちます。
球面収差を最小限に抑えることの重要性と十分な作業距離の必要性から、透明な標本の大規模なイメージングにおいて、対物レンズの選択は非常に重要です。これらの研究では3つの目的を持つ経験があります。逆顕微鏡のセットアップでは、カバーガラスの上の皿に酸サリチル酸メチルに浸漬したバイオフィルムを用いてカバーガラスの下に浸漬した長い作業距離、適度な数値開口(NA)対物油を使用します。私たちの仕事のほとんどはツァイスユニバーサルシリーズの同色性の目的、タイプ461708、40x 0.85NA Oel 160/1.5、名目無限共役(IC)互換性のための負の160 mmの焦点距離アダプターと使用されて行われました。この目的は、もともと0.35 mmの作業距離25で1.5ミリメートル顕微鏡スライドを通して油浸漬観察のために設計されました。標準カバーガラス(0.17 mm)と併用すると、動作距離は1.5 + 0.35-0.17 = 1.68mm = 1,680 μmと非常に大きくなります。また、新しいツァイスマルチ浸漬目標、タイプ420852、25x 0.8NA LD LCIプランアポクロマートを540μmを超える作動距離で使用し、浸漬補正を「オイル」のハイサイドに設定します。この目的は非常に修正され、すばらしいイメージを作り出す。直立顕微鏡スタンドでは、新しいニコン多浸性目標、タイプMRD71120、10x 0.5NA CFIプランアポクロマート、5,000 μm(5mm)を超える作動距離)を使用し、浸漬補正を「オイル」(n = 1.518)のハイサイドに設定しました。この目的は他のものより低いNAを有するが、それは、メチルサリチル酸に直接浸漬されるという利点を有する。
速度と分解能の点でデータ取得を最適化するために、共焦点顕微鏡の設定は、理想的には、横方向および軸方向のナイキストサンプリング密度18の両方を満たす必要があります。従来の基準を使用して、共焦点ピンホール径を公称1 Airyユニットに設定します。拡大座標では、
dP (μm) = 1.22 x 倍率 x (μmの発光波長) / NA
横断サンプリング(ピクセル間隔)は、(1/2)×アッベの解像度制限を超えないようにしてください。オブジェクト空間座標では、
δ x,δ y = (nmの発光波長) / (4 NA)
軸サンプリング(フォーカス増分)は、逆軸帯域幅を超えてはならない。
δ z = (浸漬指数) x (nmの発光波長) / (NA2)
共焦点光学系は顕微鏡の帯域幅を拡大し、少なくとも1/√2によって横方向および軸方向の決断を両方シャープにする。
我々が最も頻繁に利用する40x 0.85 NAの目的については、600 nmの発光波長(Alexa Fluor 594)に対するこれらの式の結果については表1を参照してください。
| 式 | x 1/√2 | セット (標準) | |
| dP (μm) | 34.5 μm | - | 25または50 μm |
| Δ x, じられないほど | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
| Δ z | 1200 nm | 848 nm | 900 nm |
表1:600 nmの発光波長の共焦点ピンホール径、横サンプリング、および軸サンプリング値
これらの設定と1,392 x 1,040ピクセルのスキャンフィールドを持つ回転ディスク共焦点スキャナを使用して、バイオフィルム標本からのデータを合理的な速度と解像度で取得することができます。一般的な単色の 3D イメージ スタックは 0.35 ~ 1.55 GB です。
広く使用される明確化媒体は、有意な屈折率範囲に及ぶ。暗視野照明と目視検査により、固定C.アルビカンバイオフィルムがn = 1.5以上で最も透明であることがわかりました。これは、n = 1.530-1.535に位相対視によって精製されました。実際的な理由として、我々は最終指標一致溶媒として、サリチル酸メチル(n = 1.537)を使用します。溶媒交換は、標本変形または他の人工物のリスクをもたらすが、固定された、明確な標本の細胞は、生きた標本と同様の細胞の体の寸法、ヒファ直径、および間皮間の長さの次元を有する。
溶媒交換プロセスの多くのバリエーションが可能である(例えば、別の移行溶媒、または別の最終溶媒を使用)。メタノールは高い極性と急速な拡散のために選ばれましたが、エタノールは赤蛍光タンパク質(RFP)量子収量26を過渡溶媒としてより良く保存することが示されました。サリチル酸メチルは、その指標、中程度の極性、低蒸気圧、および多くの染色、染料、および蛍光タンパク質との相溶性のために選択されました。しかしながら、わずかに低いインデックスを有する最終溶媒、またはブタノールのような低インデックス溶媒とメチルサリチル酸塩の混合物が、より良く役に立つ場合がある。
予想外に、バイオフィルムを通して見る能力は、その階層化された内部特徴を明らかにするだけでなく、特定の下層部に長く、絡み合わない有形の催眠ヒファエや侵襲的な基底ヒファのような拡張構造の起源を見るのに役立ちます。C.アルビカンスにおける日和見的な毒性は、その遺伝的汎用性(すなわち、催眠成長への切り替え、細胞の下層および細胞細胞の遵守のアップレギュレーション、細胞の芽出芽および伸びのための浸透のための浸透性および代替栄養素の使用)に依存する。催眠拡張は、貪食性免疫細胞からの個々のC.アルビカンス細胞のブレイクアウトを可能にするが、また、侵入のために不可欠である。バイオフィルムの接着と催眠絡み合いは、効率的に下層に侵入するために催眠に必要な表面の固定を提供するように見えます。その皮層が宿主組織である場合、病原性の増加が生じる可能性がある。
インタクトバイオフィルムをイメージングすることで、遺伝子発現、モデル組織の皮層、天然バイオフィルムに見られる細菌などの他の生物を含むレポーター株を利用した膨大な数の有益な実験が可能になります。細胞壁染色を用いた純粋に構造的なイメージングの最も単純な場合でも、その後、その後、定量化し、遺伝子解析することができることをその中で明らかにされている。
Disclosures
著者らは開示する競合する利益を持っていません。
Acknowledgments
この研究の一部は、NIHがA.P.ミッチェルにR01 AI067703、R21 AI100270、R21 AI135178を助成金によって支えられた。著者らは、本研究で使用される長時間作動距離油浸漬目的を提供してくれたグリーンフィールド'キップ'スラダーと、直接メチルサリチル酸浸漬による共焦点顕微鏡検査のためのダニエル・シワルスキーに感謝している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator - 30 °C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator - 37 °C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5 W | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13 mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n = 1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
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