Summary
칸디다 알비칸스 생물막의 내부 특징을 보고 정량화하기 위해 굴절률 매칭을 통해 명확히 된 고정 된 손상되지 않은 표본을 준비합니다. 이어서, 광학 단면 현미경 검사법은 생물막의 전체 두께를 가하지만 3차원 이미지 데이터를 얻기 위하여 이용될 수 있다.
Abstract
미생물 균 칸디다 알비 칸스는 효모 형태의 성장에서 하이픈 성장으로 전환하는 능력과 강하게 상관 되는 독성에 공동 식민지에서 변화를 겪을 수 있습니다. 이 과정을 시작하여 세포는 생물막 식민지의 결과로 발달과 함께 표면뿐만 아니라 서로에 부착됩니다. 이것은 일반적으로 효모 감염에 있는 점막 조직 표면에 뿐만 아니라, 카테터와 같은 의학 임플란트에 또한 생깁니다. 생물막 세포가 항진균제에 내성이 있고 생물막에서 흘러나온 세포가 위험한 전신 감염으로 이어질 수 있다는 것은 잘 알려져 있습니다. 생물막은 굴절 이질성으로 인해 심하게 반투명에서 불투명에 이르기까지 다양합니다. 따라서 곰팡이 생물막은 광학 현미경 검사법에 의해 연구하기가 어렵습니다. 내부 구조, 세포 및 세포 내 기능을 시각화하기 위해 단계별로 용매 교환을 통해 고정된 고정 된 생물필름을 최적의 굴절률 일치 지점으로 명확히 합니다. C. albicans 생물막의 경우, 메틸 살리실산염(n = 1.537)으로 충분한 설명을 통해 정점부터 정점까지 공초점 현미경을 600 μm의 생물막에 거의 감쇠하지 않은 채 사용할 수 있습니다. 이 시각화 프로토콜에서 우리는 위상 대조 굴절 측정, 실험실 생물막의 성장, 고정, 염색, 용매 교환, 공초점 형광 현미경 검사법 설정 및 대표적인 결과를 설명합니다.
Introduction
칸디다 알비칸스는 일반적으로 인간에게 는 비인간적인 미생물 균입니다. 유기체가 여러 형태를 가지고 있기 때문에 생물학자들에게 근본적인 관심사입니다. 예를 들어, 특정 환경 단서 또는 스트레스 요인에 응답, 효모 형태 신진 세포는 hyphae로 알려진 고도로 긴 세포의 세분 사슬로 필라멘트 성장으로 전환됩니다. 전이는 단세포 및 다세포 유전자 발현 프로그램 사이의 전환의 표현형 발현의 예로서 중요하다. 마찬가지로, C. albicans는 유기체가 잘 알려진 기회 병원체이기 때문에 생물 의학 관심사입니다. 그것은 아구창 (경구 칸디다증), 비뇨 생식기 감염 및 면역학적으로 약화 된 환자에서 위험한 침습적 또는 전신 감염의 원인과 같은 점막 효모 감염에 대한 책임이 있습니다.
이 유기체의 독성 잠재력은 다중 형태형 및 유전적 다기능성의 다른측면과밀접하게 연결되어 있습니다1,2,3,4. 배아관 확장은, 하이프 성장으로의 전환의 첫 번째 가시적 단계는, 침세포에서 탈옥하고 숙주5의세포 면역 반응의 초기 단계를 탈출할 수 있도록 충분한 급속성으로 발생한다. 부가적으로, 필라멘트는 세포대세포 및 세포-표면 순차의 큰 증가를 수반하며 이는 adhesins6,7,8,9로알려진 여러 종류의 세포벽 단백질의 조절발현에 기인한다. 다양한 조건하에서, 준수와 필라멘트의 조합은 플랑크토닉, 단세포 성장에서 생물막을 형성하는 표면 관련 식민지 성장에 극적인 변화를 초래합니다. C. albicans 생물막은 정맥 카테터와 같은 일반적인 이식된 의료 기기에서 개발할 수 있습니다. 이러한 생물막이 효모 형태의 세포를 싹트기 시작하고 순환 혈액으로 흘리기 시작할 때 전파 된 감염이 발생할 수 있습니다. 여러 연구에 따르면 생물막 세포는 플랑크토닉 세포10,11보다항진균제에 더 강하며, 이는 부분적으로신진대사(12)를낮출 수 있다. 더욱이, 생물막의 높은 전반적인 순차성은 숙주 조직 으로의 하이파의 효율적인 침습적 성장에 필요한 앵커링을 제공할 수 있다1.
굴절률 매칭에 의한 C. albicans 생물막의 광학적인 설명은 이 미생물 공동체의 구조를 시각화하고 유전자 발현과 표현형 사이의 관계를 발견하는 우리의 능력에 큰 영향을 미쳤습니다. 48 시간 동안 액체 배양 배지 하에서 시험 표면에 실험실에서 자란 생물막은 불투명할 정도로 충분히 조밀하고 두꺼운 희끄무레한 코팅으로나타난다(도 1). 따라서 생물막의 많은 흥미로운 현상형 특징은 보이지 않습니다. YPD, RPMI-1640 또는 37°C 범위에서 300 μm 두께의 거미 배지에서 자란 24시간 야생 형 생물막은 48시간 바이오필름이 종종 500 μm에 도달합니다. 불투명도는 굴절이 이질성에서 발생하는 광 산란에 기인합니다 : 곰팡이 세포벽은 주변 매체보다 굴절성이 높으며 세포벽보다 약간 더 굴절됩니다. 종래의 현미경 또는 공초점 스캐너로 볼 때, 네이티브 생물막의 높은 광학 밀도는 모든 구조물을 30 μm 이상의 깊이로 모호하게한다(그림 2). 그러나, 주요 세포 성분의 굴절과 거의 일치하는 높은 굴절률 액체로 고정 된 생물 막에 침투함으로써 큰 수준의 설명을 얻을 수 있습니다. 설명 후, 서브미크론 해상도에서의 이미징은 거의 모든 C. albicans 생물막(13)의전체 두께를 통해 공초점 현미경검사법에 의해 수행될 수 있다. 야생 형 표본에서 생물막은 긴 얽힌 하이픈, 신진 효모 형성 세포 또는 의사 형성 세포, 빈 공간 및 일부 세포 외 매트릭스로 구성되어 있음을 쉽게 알 수 있습니다. 더욱이, 생물막은 일반적으로 층화되어 세포 유형, 세포 밀도 및 신진 또는 분기 세포의 존재에 공간적으로 변이체 형태학적 차이를 보여준다. 이들 특징 들 중 하나 이상에서 많은 변이는 돌연변이 균주14,15에의해 개발된 생물막에서 관찰되었다. 또한, 리포터 균주는 유전자 발현16,9,13의공간적 차이를 보여준다. 이 비교적 간단하고 저렴한 접근법으로 얻을 수 있는 놀라운 수준의 설명은 또한 많은 생물막이 밀리미터 거리로 확장되는 정점 하이파 및 기저 침습 적 하이픈을 포함한다는 것을 볼 수 있게 합니다.
이 시각화 프로토콜에서, 우리는 얼룩으로 간단한 세포벽 마커를 사용하여 C. albicans 생물막의 고정, 표지, 설명 및 이미징을 입증합니다. 프로토콜의 본 버전의 기원은 포름알데히드 고정 생물막이 97% 글리콜 메타크릴레이트(GMA)로 침투되었을 때 관찰된 향상된 선명도이며, 그 후 중합되어 중합되어 중합되어 중등도의 굴절률이 높은 경질 플라스틱에 포함시켰다(n = 1.49). 그런 다음 기존의 상 대비 현미경 검사법과 일련의 굴절률 기준 액체를 사용하여 생물막의 대조 반전 점(최대 투명도)을 보다 정확하게 결정했습니다(그림3). C. albicans 생물막의 경우 이것은 n = 1.530에 가깝게 발생했으며, 이는 모발 각질과 같은 조밀한 단백질 구조가 약간 더 굴절된다는 것을 감안할 때 놀랍게도 높았다 (1.54-1.55). 도 3에서최적 범위의 상단에 있지만, 우리는 배아학 및 조직학에서 현미경 검사법검사용 정제제로서 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 현재 프로토콜에서 메틸 살리실산염(wintergreen, n = 1.537)을 채택했으며, 독성이 낮고 증기압이 낮으며, 적당한 NA 오일 침수를 이용한 임상시험에서 우수한 결과를 얻었습니다.
여기서 4가지 사항을 선택해야 합니다.
(1) 몇 가지 예외를 제외하고, 현미경 검사법의 이상적인 상황은 시편의 굴절률이 객관적인 렌즈 침지 액의 굴절률17,18,13과같아야 한다는 것이다. 깊은 초점 조정이 필요한 3차원(3D) 이미징 연구의 경우 항상 중요합니다.
(2) 최적의 청산을 위한 당사의 실험 결과(n = 1.525-1.535)는 표준 침지 오일(n = 1.515, 1.518)보다 약간 높으며 따라서 포인트(1)를 위반하므로 표준 오일 침지 광학을 사용할 때 구면 수차의 원천을 소개합니다. 이 문제에 대한 한 가지 해결책은 더 높은 범위의 침수 인덱스를 위해 설계된 목표를 사용하는 것입니다. 이미징 클리어 표본에 대한 관심의 부활로 인해 필요한 교정을 갖춘 특수 목표가 제공되고 있습니다. 다른 해결책은 최적의 오일 침지 성능을 위해 소량의 부탄올(n=1.399)을 첨가하여 명확히 배지의 지수를 1.515 또는 1.518로 조정하고, 약간 저하된 선명도를 받아들이는 것이다.
(3) 손상되지 않은 생물막 (및 이 규모의 다른 표본)의 현미경 검사법은 시편 두께를 수용하기 위해 상당한 작업 거리가 필요합니다. 이것은 중요한 실질적인 고려 사항입니다. 긴 작동 거리는 광학을 적당한 수치 개구부(NA = 0.6-1.25)로 제한하여 해상도를 제한하지만 구면 수차의 심각도도 제한합니다.
(4) 설명을 위한 최적 굴절률은 다른 유형의 고정 시편에 대해 다를 수 있습니다. 시편은 그림 3에나타난 바와 같이 위상 대비 및 일련의 굴절률 참조 액체를 사용하여 그에 따라 테스트되어야 합니다.
Protocol
1. 생물막 문화의 성장
주의: 칸디다 알비칸스는 인간 병원균입니다. 일부 기관에서는이 유기체의 문화가 BSL-2 봉쇄가 필요합니다.
- 효모 추출물-펩톤-덱스트로스(YPD) 한천 플레이트에 선택된 균주를 내고 30°C에서 48시간 성장한다.
- 30°C에서 밤새 호기성 성장(회전목마, 52-55 rpm)을 위해 15 mL 배양 튜브에서 YPD 배지의 5 mL을 접종하기 위해 플레이트에서 단일 콜로니를 선택합니다.
- 밤새 배양된 40-50배 희석을 이용하여 세포 밀도를 결정한다. 실리콘 지층의 경우 세포 밀도를 3 x 106 셀/mL로 가져오는 데 필요한 희석 계수를 계산하거나, 콘카나발린-A(ConA) 또는 밀-세균 아그글루티닌(WGA)으로 처리된 커버 유리 표면에 대해 0.6-1.2 x 106 셀/mL을 계산합니다(토론 참조).
- 12웰 플레이트에서 생물막 성장을위해(도 1),멸균 필라멘트 배지의 2.0 mL을 각각 잘 분배하고, 가습된 인큐베이터에서 플레이트를 37°C로 따뜻하게 한다. 다양한 매체는 고온(37°C)에서 더 강하게 필라멘트를 유도하고 혈청을 첨가한다. 태아 소 혈청 (FBS)을 권장합니다. 권장 매체는 YPD, 스파이더-마니톨 또는 RPMI-1640입니다.
- 멸균 핀셋으로 준비된 지층을 따뜻하게 데운 접시에 잘 넣고 거품을 빼내립니다. 각 우물에서 1.3단계에서 권장되는 세포 밀도에 도달하기 위해 밤새 배양으로부터 접종을 추가한다. 접종이없는 우물은 시각적 인 빈 및 오염에 대한 제어 역할을합니다.
- 플레이트를 60 rpm 궤도 믹서에 가습 된 37 °C 공기 인큐베이터에 90 분 동안 놓고 세포 접착 시간을 허용합니다. 90분 후, 배지 및 부착되지 않은 세포를 제거하고, 멸균 배지 또는 인산완충식염수(PBS)로 세척하고, 접종된 지층을 배양 접시 또는 미리 온난화된 필라멘트 배지를 함유하는 다른 멀티웰 플레이트에 넣습니다. 멀티웰 플레이트의 경우, 세척 단계및 제3 플레이트에 2.0 mL의 미리 따뜻해진 배지를 사용하여 세척된 접종된 지층을 수신하는 것이 매우 편리하다. 각 이송 전에 핀셋을 소독하십시오.
- 플레이트를 37°C 가습 된 주변 공기 인큐베이터로 되돌리고 폭기를 위해 60 rpm 궤도 혼합으로 최대 48 시간까지 바이오 필름을 성장시다. 개발 생물 막 효 모 형성 세포를 흘리지 않는 한 각 배양에 작은 플랑크토닉 성장 이어야 한다. 이런 식으로 자란 생물막은 그림 1에나와 있다.
2. 이미징용 시편 처리
주의 사항: 알데히드 고정제는 휘발성 및 위험합니다. 바이오 세이프티 캐비닛이 아닌 연기 후드에 고정 희석을 준비하십시오. 살아있는 세포에 사용되는 인큐베이터에 고정제를 넣지 마십시오. 연기 후드 또는 통풍이 잘되는 벤치탑 공간에서 덮인 접시에 희석된 고정제를 사용합니다. 고정제 및 사후 세척 솔루션을 유해 폐기물로 폐기하십시오.
- PBS에서 신선한 고정제, 4% 포름알데히드 또는 파라포름알데히드를 준비시고, 선택적으로 최대 2%의 글루타랄데히드를 준비합니다. 4%로 희석된 포르말린은 일상적인 작업에 사용될 수 있다.
참고: 글루타랄데히드는 특히 광대역 자가형광을 증가시키고 dTomato와 같은 발현성 태그의 형광을 감쇠시킬 수 있다. - 시편에서 배양 배지를 제거하고 PBS로 대체하여 혈청 단백질을 희석하거나 지층의 생물막을 PBS로 몇 분 동안 옮니다.
- 시편을 고정제로 옮기고, 덮인 접시를 20분 동안 느린 궤도 믹서위에 놓습니다. 두꺼운 시편을 처리할 때 의 기간을 연장합니다(토론 참조). 접시의 안쪽면을 포함하여 모든 생물막 성장을 담그기 위해 각 접시에 충분한 고정 량을 첨가해야합니다.
- 고정제를 제거하고 PBS로 접시를 리필하여 잔류 고정제를 씻어 내도록 합니다. 고착제를 유해 폐기물로 폐기하십시오. 몇 가지 단기 세안을 반복한 다음 잔류 고정제가 생물막 또는 한천 블록에서 확산되는 데 시간이 걸리도록 더 오래 세차합니다. 세척 기간은 고정이 허용되는 시간에 따라 다릅니다(토론참조).
- 필요한 양의 얼룩은 생물막 질량에 따라 달라집니다. 염색 전에 배양 접시의 비 표본 영역에서 모든 생물막을 제거하거나 고정 된 시편을 염색 전에 새 접시로 옮김하십시오. 생물막이 물기를 빼내거나 건조되지 않도록 하십시오. PBS에 몰입 유지.
- 접시에 얼룩을 추가하고(토론 참조) 덮인 접시를 밤새 느린 궤도 믹서에 놓습니다(토론 참조). 빛으로부터 보호하십시오.
- 아침에, 염색 용액을 제거하고 무한 얼룩을 희석PBS로 접시를 리필. 몇 시간 동안 스테인을 느린 궤도 믹서에 접시를 설정합니다.
3. 설명 프로토콜: 임페라시 수반에 생물막
- 명확한 생물막은 시각적으로 분별하기 어렵다. 따라서 원하는 경우 각 지층의 한쪽면을 스크래치로 표시하여 접종을 위해 측면을 지정합니다.
- 모든 후속 폐기물 및 용매 전달에 라벨이 부착된 긴 파스퇴르 파이펫을 사용하여 용매의 교차 오염을 방지합니다.
- 핀셋을 사용하여 고정 생물막을 PBS에서 5mL의 5mL로 50:50 PBS:메탄올을 20 mL 유리 바이알에 전달하고 생물막을 위로 향하게 합니다. 5분 간격으로 궤도 운동과 수동으로 혼합합니다(토론 참조).
- 파이펫과 바이오필름, 또는 바이오필름과 바이알 사이의 접촉을 피하기 위해 조심스럽게 폐병에 용매를 제거하십시오. 깔끔한 메탄올 3mL로 부드럽게 리필합니다. 1분 간격으로 3분 간격으로 궤도 운동과 수동으로 혼합합니다.
- 폐병에 용매를 제거하고 즉시 메탄올 5 mL로 리필하십시오. 5-10 분 동안 1 분 간격으로 궤도 운동과 수동으로 혼합하십시오. 바이오필름은 종종 초기 외관보다 이 시점에서 더 불투명해 보입니다.
- 폐병에 용매를 제거하고 즉시 50:50 메탄올:메틸 살리실산염의 5 mL로 바이알을 리필합니다. 5-10분 동안 1분 간격으로 궤도 운동과 수동으로 혼합합니다. 생물막은 이 혼합 용매에서 반투명해야 한다.
- 폐병에 용매를 제거합니다. 깔끔한 메틸 살리실산염(MS)의 3 mL로 바이알을 부드럽게 리필합니다. 1분 간격으로 3분 간격으로 궤도 운동과 수동으로 혼합합니다.
- 폐병에 용매를 제거하고 5 mL의 깔끔한 MS. 수동으로 5-10 분 동안 1 분 간격으로 궤도 운동과 혼합하여 즉시 리필하십시오. 이 시점에서 생물막은 투명해야 합니다. 폐병에 용매를 제거하고, 즉시 깔끔한 MS의 3 mL로 유리병을 리필. 가공된 생물막은 이 용매에서 안정적이다.
- 한천의 생물막의 경우(토론 참조) 한천에 물과 용매 확산을 허용하도록 모든 교환 기간을 연장합니다. 필요한 기간은 한천으로 용매 사전을 보기 위해 다크 필드 조명과 저전력 해부 현미경을 사용하여 추정 될 수있다. 이 프로토콜은 2% 한천을 사용할 때 양호한 설명과 주요 수축 효과를 얻지 만 핀셋으로 처리하는 동안 압착하면 명확한 한천이 응축됩니다. 주걱을 사용하는 것이 좋습니다.
4. 공초점 현미경 검사법에 대한 이미징 설정
- 다음 단계는 반전된 현미경을 사용하기 위한 것입니다. 표지 유리 바닥이 있는 용매 방지 접시를 사용하여 현미경 단계에서 반전된 시편을 고정합니다(토론 참조).
- 반전된 시편을 지지하기 위해 스페이서를 준비합니다. 현미경 슬라이드 (1,000 μm 두께), 커버 안경 (170 μm) 또는 13mm 실리콘 링 (330 μm, 재료 표참조)에서 잘라낸 작은 사각형을 사용하여 필요에 따라 쌓을 수 있습니다. 부종으로 인한 초점 드리프트를 최소화하기 위해 메틸 살리실산염에 링을 1시간 동안 미리 담그십시오.
- 의료용 실리콘 정사각형의 생물막의 경우, 정사각형을 반전시키고(즉, 바이오필름을 내려놓음) 접시에 메틸 살리실산의 풀에 있는 스페이서위에 놓습니다(그림2). 시편 아래에 거품이 발생하지 않도록 하십시오.
- 현미경의 무대에 단단히 접시를 장착하고 목적과 기름침 접촉을합니다 (토론 참조).
- 반월 상 연골표면 장력에 의해 스페이서에 단단히 아래로 시편을 보유할 수 있도록 접시에 MS의 양을 조정합니다. 무광택 마감으로 인한 광산이 적혀 있는 것을 줄이기 위해 역사각형 지층 위에 MS 방울을 놓고 접시를 유리 판으로 덮어 증발을 제한합니다. 이미징 전에 표본이 스페이서에 정착할 때까지 몇 분 간 기다립니다.
- 투과된 빛을 사용하여 시야를 시각적으로 검사하고 반전된 생물막의 정점 및 기저 영역을 기준으로 현재 초점 위치를 찾습니다. 콘덴서 조명 수치 조리개(INA)를 최소(응축기 아이리스 닫기)로 설정하여 콘트라스트를 증가시키고, 그렇지 않으면 명확한 생물막이 거의 보이지 않게 됩니다. 완료되면 전송된 광원을 끕지.
- 공초점 형광으로 전환하고 생물막을 포괄하는 데 필요한 직렬 포커스 이미지 스택의 하한및 상한을 설정합니다. 상향 초점 드라이브 스테핑, 권장, 먼저 커버 유리에 정착 한 빠진 세포와 유리에 휴식되는 매우 긴 상피 hyphae을 보여줍니다. 서열의 상부에서, 설립자 세포는 생물막의 기저부에 있는 지층에 부착된 것을 보아야 한다. 토론설명에 설명된 일반 기준을 사용하여 핀홀 지름, 이미지 평면의 픽셀 간격 및 초점 단계 증분을 설정합니다.
Representative Results
도 1과 같은 생물막은 불투명에 크게 반투명하지만, 상기 프로토콜을 채택하여 일상적으로 명확히 하고 이미지화한다. 도 2는 PBS에서 고정된 생물막에 초점 깊이를 가진 형광의 강한 감쇠를 나타내며, 지수 매칭 후 동일한 생물막과 비교하였다. 도 3에도시된 바와 같이, 굴절률 증가의 직렬적으로 혼화성 용매를 사용하여 선명도의 최대치를 신속하게 추정할 수 있다. 이것은 최소 대비 (최대 투명도)의 점을 찾기 위해 기존의 위상 대비 현미경 검사법에 의해 정제된다. 이 최적 인덱스 일치에 의해 달성 되지 않습니다 분명 하다. 이는 세포내 구조가 굴절률에서 약간 다르기 때문입니다. 이 경우, 대조 반전은 세포질보다 약간 낮은 용매 지수에서 세포벽에서 발생하였다. 칸디다 알비칸스 바이오필름의 경우, 최적은 n = 1.530에 가깝게 발생합니다. 도 4A에 있는 48h 야생 형 및 cak1 DX 돌연변이 생물막은 두께가 500 μm이었으며, 그러나 염기의 효모 세포는 정점 세포만큼 급격히 이미지화되었다. 마찬가지로 그림 4C에나타난 바와 같이 형광감쇠는 초점 깊이와 강하게 상관되지 않았습니다. 도 5는 한천에서 침습적 하이픈을 나타내며, 표면 생물막 아래 수백 마이크로미터를 나타낸다. 성숙한 침략적 hyphae는 지속적으로 침략적인 hypha를 따라 정규 간격으로 효모 같이 세포의 subcolonies를 초래하는, hyphal 사슬에 있는 패시에 측방 신진 효모 근위를 일으킵니다.
그림 1: 설명 하기 전에 생물 막 배양. RPMI-1640 액상 배지에 12개의 웰 플레이트에 있는 C. 알비칸스의 보완된 efg1 °/... 균주를 분리하여 재배한 24시간 바이오필름을 10% FBS로 보충하였다. 멸균 빈은 C4에 잘 있습니다. 인세트는 동일한 배지에서 3.75 mm 한천 염기상 6웰 플레이트에서 자란 96시간 야생형 생물막의 절단 단면을 동일한 배지에서 수축하여 침습적 하이픈을 나타낸다. 두 패널모두 배율이 동일합니다. 배율 표시줄 = 2.0mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 인덱스 일치에 의한 딥 이미징 개선. 이 그림은 ConA-Alexafluor 594로 고정되고 염색된 48시간 야생 형 생물막으로부터 의 공초점 이미지 스택의 측면 투영을 보여줍니다. (a)시편은 63x 1.0 NA 직접 침지 조준을 사용하여 PBS에서 영상화하였다. 감쇠는 30 μm의 초점 깊이에서 심각했다. (B)프로토콜 단계 3.3-3.8에 의한 해명 후, 동일한 생물막을 40x 0.85 NA 오일 침지 목표를 사용하여 최소한의 감쇠로 메틸 살리실산염으로 화하였다. 3D 이미지 스택의 배경 빼기 및 사이드뷰 프로젝션 후 40x 데이터를 비교를 위해 63x 데이터와 일치하도록 공간적으로 재조정되었습니다. (C)시멘트 커버 글래스 바닥이 있는 검정 양극 산화 알루미늄 접시에 MS로 이송함으로써 클리어된 시편(MS로부터)의 역장착을 보여주는 도식다이어그램(토론 참조). 배율 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 위상 대비 굴절량은 최적의 인덱스 일치 범위에서 셀룰러 피처의 대비 반전을 보여줍니다. 고정 된 바이오 필름 커버 안경은 PBS에서 메탄올로 교환 한 다음 자일렌 (n = 1.496)으로 교환되었습니다. 이 생물막은 자일렌에서 굴절률 기준 액체 세트(시리즈 E, 카길 연구소, 재료 표참조)로 각각 교환하고 시각적으로 나란히 검사하여 가장 높은 투명성을 제공하는 지수 범위를 결정했습니다. (상단 패널) 위상 대비 이미지: 한 바이오필름이 자일렌과 그 범위의 좁은 기준 액체 세트 사이에서 연속적으로 교환되었습니다. 각 교환 후, 동일한 필드를 재배치하고 40x 0.85 NA Ph2 오일 침지 상 콘트라스트 대물및 Ph2 콘덴서를 사용하여 커버 글래스를 통해 보았다. 모든 이미지는 동일한 램프 설정과 카메라 노출로 기록되어 변경 사항을 정확하게 표시합니다. 증가 인덱스와 함께, 대조 반전은 먼저 n = 1.530 세포 벽에 대 한, n = 1.535에서 세포질 다음에서 볼 수 있습니다. 배율 막대 = 10 μm. (아래쪽 패널) 최대 투명도 지점에서 평균 생물막 밝기의 최소값을 보여주는 그래프. 생물막 내에서 빛이 강하게 산란하면 평균 밝기가 빈 필드를 초과합니다. 격리된 셀은 1.530-1.535 범위에서 대비 반전까지 빈 필드보다 어둡게 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 돌연변이 체및 야생형 C. 알비칸스 생물막의 깊은 이미징. 야생형 균주(DAY185) 및 세포주기 관련 단백질 키나아제 감소 발현균주(cak1 DX)14는 액체 YPD 배지에서 실리콘 지층에서 48시간 동안 37°C에서 성장하였다. 생물막은 코나-알렉사플루오르 594로 염색하고, 용매 교환 프로토콜을 메틸 살리실산염으로 사용하여 정제되었다. 3D 공초점 현미경 검사법은 두 생물막이 ~500 μm 두께임을 보여주었습니다. 이미지 데이터는 ImageJ 또는 Fiji(https://imagej.nih.gov/ij/ 또는 http://fiji.sc)에서 32비트 형식으로 변환된 다음 50픽셀 롤링 볼 반경이 있는 빼기 배경 함수를 사용하여 음수 픽셀을 0으로 설정하는 임계값을 설정하고, 리딩하고, 최대 강도 투영을 사용하여 측면 뷰를 생성합니다. (a)축 및 측면 도면 투영: 558평면 공초점 이미지 스택의 측면 뷰 투영에서 볼 수 있듯이 야생형 생물막은 502 μm의 두께로 성장하였다. 배율 막대 = 100 μm. (왼손 패널) 40평면 축 투영은 정점(위)에서 염기(아래)까지의 바이오필름의 상이한 지층에서 세포 유형의 변화를 보여준다. 본 예는 특징적인 야생형 구조를 보였다: 기지에 부착된 세포는 가성및 효모 유사 세포의 조밀한 중간 영역으로 올라가는 하이픈을 초래한다. 중구 위, 하이파가 다시 등장하여 신진 효모의 무리를 일으켰습니다. 상체 영역에서 보이는 긴 하이파는 살아있는 생물막에서 배양 배지로 확장될 가능성이 높지만, 시편 처리 동안 생물막의 표면상으로 접혀 있다. cak1 DX 바이오필름은 556평면 이미지 스택의 측면 투영에서 볼 수 있듯이 500 μm의 두께로 성장했습니다. 이 돌연변이체는 유도 응력14의부재에서 필라멘트 성장을 겪는 것으로 알려져 있으며, 극적으로 다른 아키텍처를 생성했다. 사이드 뷰와 축 투영 (오른손 패널)에서 볼 수 있듯이 많은 분기 세포는 방사형 파생을 일으켰습니다. (B) cak1 DX 바이오필름 내의 하면을 분기하는 예. 배율 막대 = 10 μm. (C)광형 생물막의 깊이를 가진 형광 감쇠는 배경 픽셀을 마스킹한 다음 각 이미지 평면의 모든 비배경 픽셀에 대한 평균 디지털 신호를 계산하여 정량화하였다. 렉틴에 의해 밝게 태그된 정점 하이픈을 제외하고는 초점 깊이가 있는 강한 감쇠 추세는 없었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 한천에서침습적 하이픈을 표면 생물막에서 알비칸스 하이파는 한천 지층을 밀리미터 거리로 관통한다(도 1참조). 해명 후, 침습성 구조는 생물막에 의해 아래쪽으로, 또는 한천의 아래쪽에서 위쪽으로 볼 수 있다. 후자는 더 큰 작업 거리를 요구합니다. 대안적으로, 고정 후 염색 및 용매 교환 전에, 한천은 메스 또는 면도날로 수직으로 절단될 수 있으며, 그 후 옆으로 켜지고 염색 및 해명 후 측면 도면에서 직접 이미지화될 수 있다. 이 절차를 권장합니다. 213 μm 정사각형 시야의 이 투영에서는 75μm 범위에서 축 위치를 인코딩하는 데 무지개 색 눈금이 사용되었습니다. 이 견해는 긴 하이픈이 반규칙간격으로 측면 효모 형태 세포에서 떨어져 서브콜로니를 초래한다는 것을 보여줍니다. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
광학 단면화, 해상도, 속도, 회피 또는 수차, 다채널 획득 및 컴퓨팅 파워의 형광 현미경 검사법의 발전은 이미징 그대로 표본의 부활을 일으켰습니다. 고정 된 표본의 경우, 고전및 신규한 해명 및 팽창 방법 모두19,20,21,22,23,24에큰 영향을 미쳤다. 이 경우, 우리는 불투명에 크게 반투명 곰팡이 생물막의 구조를 연구하기 위해 빠르고 간단한 용매 기반 인덱스 매칭 접근 방식을 적용했습니다.
선행 프로토콜은 다양한 시편으로 테스트되었습니다. 우리의 실험실에서 칸디다 알비칸스 생물 막은 가장 자주 의료 등급 실리콘 고무의 시트에서 잘라 14mm 사각형에 성장 (재료의 표참조). 이러한 지층은 액체 배양 배지에 침수된 PDMS(폴리-디메틸실록산)에 대한 성장이 의료용 임플란트, 특히 카테터와 관련된 감염에 대한 중요한 시험관내 모델로 확립되었기 때문에 사용된다. 필라멘트를 개시하는 응력 세포는 PDMS와 같은 비극성 표면에 빨리 부착됩니다. 실제로, 오토클레이브(드라이 사이클)에서 세척 및 재살균된 사용된 사각형은 특정 균주에 대해 가장 일관된 생물막을 제공합니다. 생물막은 또한 커버 안경, 커버 유리 바닥 문화 접시, 표준 세균 학년 폴리스티렌 접시 및 한천에서 일반적으로 재배됩니다. C. albicans 세포는 유리에 잘 부착되지 않기 때문에, 커버 안경은 세포벽 다당류를 묶는 렉틴으로 취급되어야 합니다. 멸균수에 1 mg/mL ConA 또는 WGA 40 μL을 각 커버슬립 표면에 적용합니다. 건조 후, 커버 안경은 단백질을 불용성 필름으로 크로스링크하기 위해 3분 동안 40 μL의 1% 글루타랄데히드로 처리됩니다. 그런 다음 멸균 증류수로 세척하여 고정제 및 수용성 렉틴을 제거하고 공기 건조합니다. 필요한 경우, 처리된 커버 안경 또는 접시를 10분 동안 살균UV 램프 하에서 재살균한다.
시편 두께는 프로토콜에서 필요한 잠복기에 영향을 미칩니다. 300 μm 의 생물막으로 의고정 확산은 평형을 위해 몇 분이 필요합니다. 이 기간은 시편 두께의 제곱으로 증가하고, 2-3 mm 두께일 수 있는 매우 두꺼운 생물막 또는 한천 블록 표본에 대해 1시간 이상으로 연장되어야 한다. 염색을 위한 평형 기간은 또한 고정 및 세척을 위해 기술된 바와 같이 견본 두께에 달려 있습니다. 그러나, 렉틴은 낮은 MW 고착제보다 더 느리게 확산되기 때문에, 특히 한천 젤 내에서, 염색은 하룻밤 연장되어야한다. 과잉 얼룩의 세척에 대해동일한 수행해야합니다.
다양한 유형의 얼룩이 프로토콜내로 통합될 수 있다. 우리는 구조 화상 진찰을 위해 세포벽 얼룩을, 가장 일반적으로 Calcofluor 백색 M2R (Fluor) 이용합니다. 브라이트너 #28) 또는 코나-알렉사플루르 594 또는 WGA-알렉사플루르 594와 같은 염료 태그렉틴. 주의는 단백질의 발아성에 지불해야합니다. ConA 테트라머는 생물막의 정점 영역에서 매우 유연한 하이파의 가교를 일으킬 수 있다. 이것은 WGA 디머와 덜 분명하다. 이 마커의 정식 특이성은 치틴을 위한 Calcofluor, mannose 잔류물을 위한 ConA, 및 N-아세틸-D-글루코사민 및 시알산 잔류물을 위한 WGA입니다.
용매 교환 프로토콜은 메탄올을 메틸 살리실레이트에 넣은 채 PBS 또는 물에서 등급이 매겨지므로 시편 용기는 용매에 강해야 합니다. 메틸 살리실산염 (MS)은 폴리스티렌 플라스틱 제품을 빠르게 부드럽게하고 다른 플라스틱을 천천히 부드럽게합니다. 깔끔한 메탄올의 사용까지 프로토콜 단계는 플라스틱 웨어에서 수행 될 수 있지만, 프로토콜의 그 시점에서 우리는 일반적으로 용매 저항 나사 캡표준 20 mL 유리 섬광 바이알로 전환합니다. 바이알은 미세 핀셋을 사용하여 사각형을 집어 들고 옮길 수 있기 때문에 실리콘 사각형 지하층의 생물막에 편리합니다. 또한 바이알은 유리막이 유리에 닿지 않도록 내부 곡면에 놓인 평평한 사각형으로 배수및 리필될 수 있습니다. 지층은 직립 바이알에 침지될 때 생물막업이어야 한다. 바이알은 장기 시편 보관에 탁월합니다.
해명 프로토콜에서 더 많은 등급의 용매 교환 단계는 용매 혼합 효과로 인한 시편 변형의 위험을 최소화합니다. 기본 프로토콜의 속도와 편의를 위해, 네 단계가 있다: 1) 단계 3.3, PBS 에 50:50 PBS:메탄올; 2) 단계 3.4 및 3.5, PBS:메탄올을 깔끔하게 하는 메탄올, 3) 단계 3.6, 깔끔한 메탄올 50:50 메탄올:MS; 및 4) 단계 3.7 및 3.8, 메탄올:MS를 깔끔하게 MS. 메탄올은 과도기적 난교성을 제공한다. 그러나 물과 MS는 거의 불순하기 때문에, 모든 물은 임의의 MS의 소개 이전에 메탄올에 의해 변위되는 것이 필수적이다. 잔류 메탄올의 증발은 시편 내에서 굴절률 변동을 일으킬 것입니다. 4단계 서열 내에서, 깔끔한 용매또는 세 번째 변경의 또 다른 변화를 추가하여 두 번째 및 네 번째 단계를 반복하는 것이 바람직하다. 특히 깨지기 쉬운 시편의 경우, 용매 변화는 더 작은 퍼센트 단계로 공식화될 수 있습니다.
한천 블록 시편을 사용하면 3.4 단계 와 3.5 단계 (깔끔한 메탄올)는 메탄올 내의 잔류 PBS 염의 불용성으로 인해 한천 내에서 소금 결정의 출현을 일으킬 수 있습니다. 이는 PBS 대신에 제1 혼합 용매 단계에서 증류수(DW)를 사용하여 물 교환 동안 염을 희석함으로써 피할 수 있다. 고정 된 생물 막에 대한 대체 용매 교환 서열은 다음 단계로 구성 : 1) 단계 3.3, 50 : 50 DW : 메탄올로 PBS에서 시편을 전송 (한천을 통해 확산을위한 여분의 시간을 허용); 2) 단계 3.4, 50:50 DW:메탄올에서 검정된 메탄올을 깔끔한 메탄올로 옮기다(3.5단계에서와 같이 메탄올로 2회 반복); 3) 단계 3.6, 메탄올로부터 50:50 메탄올:메틸 살리실산염으로 시편을 옮기고; 및 4) 단계 3.7, 50:50 메탄올:MS에서 깔끔한 MS로 시편을 전송한다(3.8단계에서와 같이 MS로 2x 반복).
메틸 살리실산염은 폴리스티렌 플라스틱 제품을 빠르게 부드럽게 하기 때문에 커버 글래스 바닥이 있는 양극 산화 처리된 알루미늄 접시를 사용하여 반전된 현미경의 단계에서 정제된 생물막을 고정합니다. 커버 유리는 UV 경화 광학 시멘트를 사용하여 제자리에 개최됩니다 (Norland 광학 접착제 #61, 재료 표참조). MS가 이소프로판올로 세척한 다음 비눗물과 헹구어서 하루가 끝날 때 제거되면 시멘트 커버 유리는 수개월 동안 제공됩니다.
객관적인 렌즈 선택은 구면 수차를 최소화하는 것의 중요성과 충분한 작업 거리의 필요성 때문에 명확한 시편의 대규모 이미징에서 매우 중요합니다. 우리는 이 연구 결과에 있는 3개의 목표를 가진 경험이 있습니다. 반전된 현미경 설정에서, 우리는 커버 유리 위에 있는 접시에 메틸 살리실산염에 침지된 생물막과 함께 커버 유리 아래에 침지된 긴 작업 거리, 적당한 수치 조리개(NA) 객관적인 오일을 사용합니다. 우리의 작업의 대부분은 자이스 유니버설 시리즈 무채색 목표, 유형 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, 명목 무한 컨쥬게이트 (IC) 호환성을 위한 음수 160mm 초점 거리 어댑터와 함께 사용되었습니다. 이 목표는 원래 0.35 mm 작동 거리25와1.5 mm 현미경 슬라이드를 통해 오일 침지 보기를 위해 설계되었습니다. 표준 커버 글래스(0.17 mm)와 함께 사용하면 작동 거리가 훨씬 더 큽: 1.5 + 0.35-0.17 = 1.68 mm = 1,680 μm. 또한 새로운 Zeiss 멀티 몰입 목표인 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat를 사용하여 작동 거리가 540 μm를 초과하며 침수 보정이 '오일'의 높은 쪽으로 설정되어 있습니다. 이 목표는 고도로 수정되고 뛰어난 이미지를 생성합니다. 직립 현미경 스탠드에서, 우리는 새로운 니콘 멀티 침지 목표, 유형 MRD71120, 10x 0.5NA CFI 계획 -apochromat 를 사용하여 5,000 μm (5mm)를 초과하는 작업 거리, 또한 '오일'(n = 1.518)의 높은 면에 설정 된 침수 보정. 이 목적은 다른 목표보다 낮은 NA를 가지고 있지만, 메틸 살리실산염에 직접 몰입되는 장점이 있다.
속도와 해상도 면에서 데이터 수집을 최적화하기 위해 공초점 현미경 설정은 가로 및 축 나이퀴스트 샘플링 밀도18을모두 충족해야 합니다. 기존의 기준을 사용하여 공초점 핀홀 지름을 공초점 지름을 1 Airy 단위로 지정합니다. 확대 된 좌표로,
dP (μm) = 1.22 x 배율 x (μm의 방출 파장) / NA
가로 샘플링(픽셀 간격)은 (1/2) x Abbe의 해상도 제한을 초과해서는 안 됩니다. 오브젝트 공간 좌표에서
□x, □y = (nm의 방출 파장) / (4 NA)
축 샘플링(초점 증분)은 역축 대역폭을 초과해서는 안 됩니다.
□z = (침수 지수) x (nm의 방출 파장) / (NA2)
공초점 광학 시스템은 현미경의 대역폭을 확장하고 횡방향 및 축 분해능을 최소 1/√2로 선명하게 합니다.
우리가 가장 자주 사용하는 40x 0.85 NA 목표에 대해서는 600 nm 방출 파장에 대한 이러한 수식의 결과에 대한 표 1을 참조하십시오(Alexa Fluor 594).
| 수식 | x 1/√2 | 집합(일반) | |
| d P(μm) | 34.5 μm | - | 25 또는 50 μm |
| □x, □y | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
| □z | 1200 nm | 848 nm | 900 nm |
표 1: 600 nm 방출 파장에 대한 공초점 핀홀 지름, 횡 샘플링 및 축 샘플링 값.
이러한 설정과 1,392 x 1,040 픽셀 스캔 필드를 갖춘 회전 디스크 공초점 스캐너를 사용하여 생물막 표본의 데이터를 합리적인 속도와 해상도로 수집할 수 있습니다. 일반적인 단일 색상 3D 이미지 스택은 0.35~1.55GB를 실행합니다.
광범위한 사용에서 설명 매체는 상당한 굴절률 범위에 걸쳐 있습니다. 다크 필드 조명 및 육안 검사에 의해, 우리는 고정 C. albicans 생물 막은 n = 1.5 위의 가장 투명한 것을 발견했다. 이것은 n = 1.530-1.535에 위상 대조 현미경 검사법에 의해 정제되었다. 여러 가지 실용적인 이유로, 우리는 메틸 살리실산염 (n = 1.537)을 최종 인덱스 매칭 용매로 사용합니다. 용매 교환은 표본 변형 또는 기타 유물의 위험을 가져오지만 고정되고 명확한 표본의 세포는 살아있는 표본과 유사한 세포 체 치수, 하이파 직경 및 중간 세면 길이 치수를 가지고 있습니다.
용매 교환 공정에서 많은 변형이 가능합니다(예를 들어, 상이한 과도 용매, 또는 상이한 최종 용매를 사용). 메탄올은 높은 극성과 급속한 확산을 위해 선택되었지만, 에탄올은 과도용 매로서 적색 형광 단백질(RFP) 양자수율(26)을 더 잘 보존하는 것으로 나타났다. 메틸 살리실산염은 지수, 적당한 극성, 낮은 증기압 및 많은 얼룩, 염료 및 형광 단백질과의 호환성으로 선택되었습니다. 그러나, 약간 낮은 지수를 가진 최종 용매, 또는 메틸 살리실산염과 부탄올과 같은 하부 인덱스 용매의 혼합물은 더 나은 역할을 할 수 있다.
예기치 않게, 생물막을 통해 볼 수있는 능력은 계층화 된 내부 특징뿐만 아니라 특정 지층에서 길고 얽히지 않은 상피 하이픈 및 침략적 인 기저 하이픈과 같은 확장 된 구조의 기원을 보는 데 도움이됩니다. C. albicans에 있는 기회 독성은 그것의 유전 다양성에 달려 있습니다 (즉, 잠수 성장으로 전환, 세포 지층 및 세포 순응도의 upregulation, 세포 신진 및 신장을 위한 osmolytes의 생성 및 대체 영양소의 사용). 하이팔 확장은 식세포 면역 세포에서 개별 C. 알비칸스 세포의 브레이크 아웃을 가능하게하지만 또한 침략에 필수적이다. 생물막 접착 및 하이프 얽힘은 지층을 효율적으로 침범하기 위해 하이픈에 필요한 표면 앵커링을 제공하는 것으로 보인다. 그 지층이 호스트 조직일 때, 증가한 독성은 귀착될 수 있습니다.
이미징 그대로 생물막은 유전자 발현, 모델 조직 지층 및 천연 생물막에서 발견되는 박테리아와 같은 다른 유기체의 포함을 위한 리포터 균주를 활용하는 수많은 유익한 실험을 가능하게 합니다. 세포벽 얼룩을 가진 순전히 구조화상 진찰의 가장 간단한 경우에조차, 그 때 정량화되고 유전으로 분석될 수 있다는 것을 그 때 현상형에서 드러난다.
Disclosures
저자는 공개 할 경쟁 이익이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금 R01 AI067703, R21 AI100270, A.P. 미첼에 R21 AI135178에 의해 부분적으로 지원되었다. 저자는 이 작품에 사용된 장거리 오일 침지 목표를 제공한 그린필드 '킵' 슬러거와 직접 메틸 살리실산 침지로 공초점 현미경 을 제공하는 다니엘 시와르스키에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator - 30 °C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator - 37 °C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5 W | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13 mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n = 1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
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