Summary
För att visa och kvantifiera de interna funktionerna i Candida albicans biofilmer, förbereder vi fasta intakta exemplar som klargörs genom brytningsindex matchning. Sedan kan optisk snittmikroskopi användas för att få tredimensionella bilddata om biofilmens fulla tjocklek.
Abstract
Den mikrobiella svampen Candida albicans kan genomgå en förändring från commensal kolonisering till virulence som är starkt korrelerad med dess förmåga att byta från jäst-form tillväxt till hyphal tillväxt. Celler som initierar denna process blir vidhäftande till ytbehandlar as well as till varje annat, med den resulterande utvecklingen av en biofilmkoloni. Detta förekommer ofta inte bara på slemhinnor vävnadsytor i jästinfektioner, men också på medicinska implantat såsom katetrar. Det är väl känt att biofilmceller är resistenta mot svampdödande läkemedel, och att celler som fälls från biofilmen kan leda till farliga systemiska infektioner. Biofilmer sträcker sig från kraftigt genomskinlig till ogenomskinlig på grund av brytningheterogenitet. Därför svamp biofilmer är svåra att studera med optisk mikroskopi. För att visualisera interna strukturella, cellulära och subcellulära funktioner, klargör vi fast intakta biofilmer genom stegvis lösningsmedel utbyte till en punkt av optimal brytning index matchning. För C. albicans biofilmer uppnås tillräckligt med metylsalicylate (n = 1,537) för att möjliggöra konfokal mikroskopi från apex till bas i 600 μm biofilmer med liten dämpning. I detta visualiseringsprotokoll beskriver vi faskontrastrefraktommetri, tillväxten av laboratoriebiofilmer, fixering, färgning, lösningsmedelsutbyte, inställningarna för konfokal fluorescensmikroskopi och representativa resultat.
Introduction
Candida albicans är en mikrobiell svamp som vanligtvis är commensal hos människor. Det är av grundläggande intresse för biologer eftersom organismen har flera morfologier. Till exempel, som svar på vissa miljösignaler eller stressfaktorer, jäst-form spirande celler kommer att byta till fintrådande tillväxt som septating kedjor av mycket långsträckta celler som kallas hyphae. Övergången är viktig som ett exempel på fenotypiska uttryck för en övergång mellan ett encelligt och flercelligt genuttrycksprogram. Likaså är C. albicans av biomedicinskt intresse eftersom organismen är en välkänd opportunistisk patogen. Det är ansvarig för mukosal jäst infektioner såsom trast (oral candidiasis), urogenitala infektioner, och en orsak till farliga invasiva eller systemiska infektioner i immunologiskt försvagade patienter.
Denna organism potential för virulens är nära kopplad till dess flera morfotyper och andra aspekter av dess genetiska mångsidighet1,2,3,4. Bakterierör förlängning, det första synliga skedet av övergången till hyphal tillväxt, sker med tillräcklig snabbhet för att uppsluka c. albicans celler att bryta sig ur fagocyter och därmed undkomma en tidig fas av cellulärimmunsvar av värd5. Dessutom föregås och åtföljs glödtråd en stor ökning av cell-till-cell- och cell-till-yt-följsamhet som beror på ett reglerat uttryck för flera klasser av cellväggsproteiner som kallas adhesins6,7,8,9. Under en mängd olika förhållanden resulterar kombinationen av följsamhet och filamentation i en dramatisk övergång från planktonisk, encellig tillväxt till ytassocierad kolonial tillväxt som bildar en biofilm. C. albicans biofilmer kan utvecklas på vanliga implanterade medicintekniska produkter såsom venösa katetrar. Spridas infektioner kan resultera när sådana biofilmer börjar knoppa av jäst-form celler och kasta dem i cirkulerande blod. Flera studier har visat att biofilmceller är mer resistenta mot svampdödande läkemedel än planktoniska celler10,11, vilket delvis kan bero på sänkt metabolism12. Dessutom kan den höga totala följsamheten av en biofilm ge den förankring som behövs för effektiv invasiv tillväxt av hypha e till värdvävnad1.
Optiskt förtydligande av C. albicans biofilms genom brytningindex matchning har haft en stor inverkan på vår förmåga att visualisera strukturen i denna mikrobiella samhället och upptäcka relationer mellan genuttryck och fenotyp. Biofilmer som odlas i laboratoriet på testytor under flytande odlingsmedium i 48 h visas som en vitaktig beläggning som är tillräckligt tät och tillräckligt tjock för att vara ogenomskinlig (figur 1). Därför är många intressanta fenotypiska funktioner i biofilmen dolda för att visa. De 24 h vilda biofilmer som odlas i YPD, RPMI-1640 eller Spider medium vid 37 °C varierar upp till 300 μm tjockt, med 48 h biofilmer når ofta 500 μm. Opaciteten beror på ljusspridning, som uppstår från brytningheterogenitet: svampcellväggen är mer brytning än det omgivande mediet, och cytoplasman något mer brytning än cellväggen. Den resulterande höga optiska densiteten hos en inbyggd biofilm skymmer alla strukturer som är mer än 30 μm djupa när de ses med ett konventionellt mikroskop eller till och med en konfokal skanner (figur 2). Emellertid, en stor grad av förtydligande kan uppnås genom att infiltrera fasta biofilmer med en hög brytning svidande index vätska som ungefär matchar brytningen hos stora cellulära beståndsdelar. Efter förtydligande, imaging på submicron upplösning kan utföras genom confocal mikroskopi genom hela tjockleken på nästan alla C. albicans biofilm13. I vilda exemplar är det lätt att se att biofilmer består av lång intrasslad hyphae, kluster av knoppade jäst-form celler eller pseudohyphal celler, tomrum, och en viss mängd extracellulär matris. Dessutom stratifieras biofilmer i allmänhet, som visar rumsligt variant morfologiska skillnader i celltyp, celldensitet och förekomsten av spirande eller förgrenande celler. Många variationer i en eller flera av dessa funktioner har observerats i biofilmer som utvecklats av mutantstammar14,15. Dessutom visar reporterstammar på plats rumsliga skillnader i genuttryck16,9,13. Den överraskande graden av förtydligande kan erhållas med denna relativt enkla och billiga tillvägagångssätt gör det också möjligt att se att många biofilmer inkluderar apikal hyphae och basal invasiva hyphae sträcker sig ut till millimeter avstånd.
I detta visualiseringsprotokoll visar vi fixering, märkning, förtydligande och avbildning av en C. albicans biofilm med hjälp av en enkel cellväggmarkör som en fläck. Ursprunget till den nuvarande versionen av protokollet är den förbättrade klarhet vi observerade när formaldehyd-fasta biofilmer infiltrerades med 97% glykol metakrylat (GMA), som sedan polymeriserades för att bädda in biofilm i en hård plast med en måttligt hög brytningsindex (n = 1,49). Vi använde sedan konventionell fas kontrastmikroskopi och en serie brytningsindex referensvätskor för att mer exakt bestämma punkten för kontrast återföring (maximal öppenhet) av biofilm (figur 3). För C. albicans biofilms detta inträffade nära n = 1,530, vilket var förvånansvärt hög med tanke på att en tät proteinstruktur såsom hår keratin är bara något mer brytning (1,54-1,55). Även om det är på den övre änden av det optimala intervallet i figur 3, antog vi metylsalicylate (olja av vintergröna, n = 1,537) i det nuvarande protokollet eftersom det länge har använts som ett klargörande medel för mikroskopi i embryologi och histologi, den har låg toxicitet och lågt ångtryck, och det gav utmärkta resultat i våra prövningar med hjälp av måttlig NA oljenedsänkning optik.
Fyra poäng bör tas upp här:
(1) Med få undantag är den idealiska situationen i mikroskopi att provexemplarets brytningsindex bör vara lika med det brytningsindex för objektivlinsnedsänkningsvätskan17,18,13. För tredimensionella (3D) bildstudier där djup fokusering är nödvändig är detta alltid viktigt.
(2) Vårt experimentella resultat för optimal clearing (n = 1,525–1,535) är något högre än vanliga nedsänkningsoljor (n = 1,515, 1,518) och bryter därför mot punkt (1), och introducerar därför en källa till sfärisk avvikelse vid användning av standardoljenedsänkningsoptik. En lösning på detta problem är användning av ett mål som utformats för ett nedsänkningsindex i det högre intervallet. På grund av ett återuppvaknande av intresse för imaging rensas exemplar, specialitet mål med den nödvändiga korrigeringen blir tillgängliga. Den andra lösningen är att justera index för det förtydligande mediet ner till 1,515 eller 1,518 genom tillsats av en liten mängd butanol (n = 1,399) för optimal oljenedsänkning prestanda, och acceptera den något försämrade klarhet.
(3) Mikroskopi av intakta biofilmer (och andra exemplar på denna skala) kräver ett betydande arbetsavstånd för att rymma provtjockleken. Detta är en viktig praktisk faktor. Ett långt arbetsavstånd begränsar optiken till en måttlig numerisk bländare (NA = 0,6–1,25), vilket begränsar upplösningen men också begränsar svårighetsgraden av sfärisk avvikelse.
(4) Det optimala brytningsindexet för förtydligande kan vara olika för andra typer av fasta provexemplar. Proverna bör testas i enlighet med faskontrasten och en serie brytningsindexreferensvätskor enligt figur 3.
Protocol
1. Biofilmkulturers tillväxt
VARNING: Candida albicans är en mänsklig patogen. På vissa institutioner kräver kultur av denna organism BSL-2 inneslutning.
- Strimma ut vald stam på en jäst extrakt-pepton-dextros (YPD) agar platta och växa 48 h vid 30 °C.
- Välj enstaka kolonier från plattan för att vaccinera 5 ml YPD-medium i 15 ml odlingsrör för nattenaerob tillväxt (karusellrotator, 52–55 rpm) vid 30 °C.
- Bestäm celltäthetmed en 40- till 50-faldig utspädning av övernattens kultur. Beräkna den utspädningsfaktor som behövs för att föra celldensiteten till 3 x 106 cell/ml för silikonsubstrat, eller 0,6–1,2 x 106 celler/ml för täckglasytor som behandlats med concanavalin-A (ConA) eller vete-germ agglutinin (WGA) (se Diskussion).
- För biofilmtillväxt i en 12 brunnsplatta (figur 1),dela ut 2,0 ml steril glödtrådningsmedium i varje brunn och värm plattan till 37 °C i en fuktad inkubator. En mängd olika medier kommer att inducera filamentation, starkare vid en förhöjd temperatur (37 °C) och med tillsatt serum. Fetalt bovint serum (FBS) rekommenderas. Rekommenderade medier är YPD, Spider-Mannitol eller RPMI-1640.
- Med sterila pincett, placera ett förberett substratum i varje brunn i den uppvärmda plattan och rubba bubblor. Lägg till inokulat från natten kultur för att nå celldensitet rekommenderas i steg 1,3 i varje brunn. En brunn utan inokulat fungerar som ett visuellt tomrum och kontroll mot kontaminering.
- Placera plattan på en 60 rpm orbital mixer i en fuktad 37 °C luftinkubator i 90 min för att ge tid för cell vidhäftningar. Efter 90 min, ta bort de medelstora och ofästa cellerna, tvätta med sterilmedium eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och placera inokulerat substrat i kulturrätter eller en annan multibrunnsplatta som innehåller förvärmt filamentationsmedium. Med multiwell plattor, är det mycket bekvämt att använda en andra platta för tvätt steg och en tredje platta med 2,0 ml förvärmt medium per brunn för att ta emot tvättade vaccinerade substrat. Sterilisera pincett före varje överföring.
- Återgå plattan till 37 °C fuktad omgivande luft inkubator och odla biofilmer upp till 48 h med 60 rpm orbital blandning för luftning. Det bör finnas lite planktontillväxt i varje kultur om inte den utvecklande biofilm sprider jäst-form celler. En biofilm som odlas på detta sätt visas i figur 1.
2. Provbehandling för avbildning
VARNING: Aldehyd fixativ är flyktiga och farliga. Förbered fixativa utspädningar i en rökhuva, inte i ett biosäkerhetsskåp. Lägg inte fixativ i inkubatorer som används för levande celler. Arbeta med utspädda fixativ i täckta rätter i rökhuva eller en väl ventilerad bänkskiva. Kassera fixeringsmedel och tvätta tvätta lösningar efter fixeringen som farligt avfall.
- Förbered färsk fixativ, 4% formaldehyd eller paraformaldehyd i PBS, eventuellt med upp till 2% glutaraldehyd. Formalin utspädd till 4% kan användas för rutinmässigt arbete.
OBS: Glutaraldehyd i synnerhet kommer att öka bredband autofluorescens och kan dämpa fluorescens en uttrycksbar taggar såsom dTomato. - Ta bort odlingsmediet från provet och byt ut med PBS för att späda bort serumproteiner, eller överför biofilmen på dess substratum till PBS i flera minuter.
- Överför exemplaret till fixativ, och ställ in den täckta skålen på en långsam orbital mixer för 20 min. Förlänga tidsperioden vid bearbetning av tjockare prover (se diskussion). Tillräcklig fixativ volym bör läggas till varje maträtt för att fördjupa all biofilm tillväxt, inklusive någon på de inre sidorna av skålen.
- Ta bort fixativ och fyll på skålen med PBS för att tvätta bort resterande fixativ. Kassera det fixativa som farligt avfall. Upprepa flera kortsiktiga tvättar, sedan längre tvättar för att ge tid för resterande fixativ att sprida ut ur biofilm eller agar block. Tvättperioden beror på vilken tid det är tillåtet för fixering (se Diskussion).
- Den nödvändiga mängden fläck beror på biofilmmassan. Ta bort all biofilm från icke-exemplar områden av kulturskålen före färgning, eller överföra den fasta exemplaret till en ny maträtt före färgning. Låt inte biofilmen rinna av eller torka. Håll den nedsänkt i PBS.
- Lägg till fläcken till skålen (se Diskussion) och ställ in den täckta skålen på en långsam orbital mixer över natten (se Diskussion). Skydda mot ljus.
- På morgonen, ta bort färgning lösningen och fylla på skålen med PBS för att späda den obundna fläcken. Ställ disken på långsam orbital mixer att avfläcka i flera timmar.
3. Förtydligande Protokoll: Biofilmer om impermeant Substrata
- Förtydligade biofilmer är svåra att urskilja visuellt. Markera därför ena sidan av varje substrat med en repa för att ange sidan för inokulering.
- Använd märkta långa Pasteur-pipetter för alla efterföljande avfalls- och lösningsmedelsöverföringar för att undvika korskontaminering av lösningsmedel.
- Med hjälp av pincett, överför den fasta biofilmen från PBS till 5 ml 50:50 PBS:metanol i en 20 mL glasflaska med biofilmen uppåt. Blanda manuellt med omloppsrörelser med 1 min intervall er i 5 min (se Diskussion).
- Ta bort lösningsmedlet till en avfallsflaska, var försiktig för att undvika kontakt mellan pipett och biofilm, eller biofilm och injektionsflaska. Fyll försiktigt på med 3 ml snygg metanol. Blanda manuellt med omloppsrörelser med 1 min intervall i 3 min.
- Ta ut lösningsmedlet till en avfallsflaska och fyll omedelbart på med 5 ml metanol. Blanda manuellt med omloppsrörelser med 1 min mellanrum i 5–10 min. Ta bort lösningsmedlet till avfallsflaskan och fyll omedelbart på med 3 ml metanol. Biofilmer ser ofta mer ogenomskinliga ut på denna punkt än deras ursprungliga utseende.
- Ta bort lösningsmedlet till avfallsflaskan och fyll omedelbart på injektionsflaskan med 5 ml på 50:50 metanol:metylsalicylate. Blanda manuellt med omloppsrörelse med 1 min intervall i 5–10 min. Biofilmen ska vara halvtransparent i detta blandade lösningsmedel.
- Ta bort lösningsmedlet till en avfallsflaska. Fyll försiktigt på injektionsflaskan med 3 ml snyggt metylsalicylat (MS). Blanda manuellt med omloppsrörelser med 1 min intervall i 3 min.
- Ta bort lösningsmedlet till avfallsflaskan och fyll omedelbart på med 5 ml snyggt MS. Blanda manuellt med omloppsrörelser med 1 min mellanrum i 5–10 min. Vid denna punkt bör biofilmen vara transparent. Ta bort lösningsmedlet till avfallsflaskan och fyll omedelbart på injektionsflaskan med 3 ml snygg MS. Den bearbetade biofilmen är stabil i detta lösningsmedel.
- För biofilmer på agar (se Diskussion) förlänga alla utbytesperioder för att möjliggöra vatten och lösningsmedel diffusion om agaren. De nödvändiga tidsperioderna kan uppskattas med hjälp av en låg effekt dissekera mikroskop med darkfield belysning för att visa lösningsmedlet förväg i agaren. Protokollet uppnår goda förtydliganden och inga större krympeffekter när 2% agar används, men den förtydligade agaren kommer att kondensera om pressas under hantering med pincett. Användning av en spatel rekommenderas.
4. Bildbehandling Setup för confocal mikroskopi
- Följande steg är för användning av ett inverterat mikroskop. Använd en lösningsmedelssäker rätt som har en täckglasbotten för att hålla det inverterade exemplaret på mikroskopstadiet (se Diskussion).
- Förbered distanser för stöd av det inverterade exemplaret. Använd små rektanglar som skurits från mikroskopdiabilder (1 000 μm tjocka), täckglas (170 μm) eller 13 mm silikonringar (330 μm, se materialtabell), som kan staplas efter behov. Presoak ringarna i metylsalicylate för 1 h för att minimera fokus drift på grund av svullnad.
- För en biofilm på en medicinsk kvalitet silikon kvadrat, vänd torget (dvs. vänd den biofilm ner) och ställa in den på en spacer i en pool av metylsalicylat i skålen (figur 2). Se till att undvika bubblor under provet.
- Montera skålen ordentligt på scenen av mikroskopet och gör olja nedsänkt kontakt med målet (se diskussion).
- Justera mängden MS i skålen så att menisken håller preparatet stadigt ner på distansen genom ytspänning. Placera en droppe MS ovanpå det inverterade fyrkantiga substratet för att minska ljusspridningen från den matta finishen och täck skålen med en glasplatta för att begränsa avdunstningen. Vänta i flera minuter på att preparatet ska bosätta sig på distanserna före avbildningen.
- Använd överfört ljus för att visuellt inspektera synfältet och lokalisera den aktuella fokuspositionen i förhållande till de apikala och basala regionerna i den inverterade biofilmen. Ställ kondensorn lysande numerisk bländare (INA) till ett minimum (stäng kondensoriris) för att öka kontrasten, annars kommer den förtydligade biofilmen att vara nästan osynlig. Stäng av den överförda ljuskällan när den är klar.
- Växla över till konfokal fluorescens och ställ in de nedre och övre gränserna för seriefokusbildstacken som behövs för att spänna över biofilmen. Uppåtfokus enhet stegning, som rekommenderas, kommer först att visa rubbas celler som har bosatt sig på täckglaset och mycket lång apikal hyphae som vilar på glaset. I den övre änden av sekvensen bör grundarna celler ses följas till substratum vid basen av biofilmen. Ange pinhole diameter, pixelavståndet i bildplanet och fokus steg ökning med hjälp av de allmänna kriterierna som beskrivs i diskussionen.
Representative Results
Biofilmer som det i figur 1 är starkt genomskinliga till ogenomskinliga, men förtydligas rutinmässigt och avvisas genom att använda protokollet ovan. Figur 2 visar den starka dämpningen av fluorescens med fokusdjup i en fast biofilm i PBS, jämfört med samma biofilm efter indexmatchning. Som visas i figur 3kan man snabbt uppskatta att använda seriellt felsnåla lösningsmedel för att öka brytningsindex. Detta förfinas av konventionell fas kontrastmikroskopi för att hitta den punkt för minsta kontrast (maximal genomskinlighet). Det är uppenbart att denna optimala inte uppnås genom homogen indexmatchning. Detta beror på att subcellulära strukturer skiljer sig något i brytningsindex. I det här fallet inträffade kontraståterföring i cellväggen vid ett något lägre lösningsmedelsindex än i cytoplasman. För Candida albicans biofilmer, det optimala inträffar nära n = 1,530. Den 48 h vilda typen och cak1 DX mutantbiofilmer i figur 4A var 500 μm i tjocklek, men jästcellerna vid basen avbildades nästan lika kraftigt som de apikala cellerna. På samma sätt, som visas i figur 4C,var dämpning av fluorescens inte starkt korrelerad med fokusdjup. Figur 5 visar invasivhyputja i agar, hundratals mikrometer under en ytbiofilm. Mogna invasiva hyphae producerar konsekvent lateralspirande jäst proximala till septa i hypohalkedjan, vilket ger upphov till subkolonier av jästliknande celler med jämna mellanrum längs en invasiv hypoha.
Figur 1: Biofilmkulturer före förtydligande. En 24 h biofilm som odlas från ett isolat av en kompletterad efg1 ∆/∆ stam av C. albicans i en 12 brunnsplatta på ett silikonkvadrat i RPMI-1640 flytande medium kompletterat med 10% FBS. Det sterila ämnet är i brunnC4. Infälld visar skär tvärsnitt av 96-timmars vild-typ biofilm odlas i en 6-brunnsplatta på en 3,75 mm agar bas i samma medium som visar invasiva hyphae. Båda panelerna är i samma skala. Skala bar = 2,0 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Förbättring av djup bildbehandling efter indexmatchning. Figuren visar sideview projektioner av konfokal bild stackar från en 48 h vild typ biofilm som var fast och färgas med ConA-Alexafluor 594. (A)Exemplaret avbildades i PBS med ett mål på 63 x 1,0 NA direkt vattennedsänkning. Dämpningen var allvarlig vid ett fokusdjup på 30 μm. (B)Efter förtydligande av protokollsteg 3.3–3.8 avbildades samma biofilm i metylsalicylate med minimal dämpning med ett 40x 0,85 NA-oljenedsänkningsmål. Efter bakgrundssubtraktion och sidovyprojektion av 3D-bildstaplarna skalades 40x-data rumsligt om så att de matchar 63x-data för jämförelse. (C)Schemaschema som visar inverterad montering av det rensade exemplaret (från MS) genom överföring till MS i en svartanodiserad aluminiumskål med en cementerad täckglasbotten (se diskussion). Skalstång = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Faskontrastrefraktomorget visar kontraståterföring av cellulära funktioner i intervallet optimal indexmatchning. Fasta biofilmer på täckglasögon byttes ut från PBS till metanol, sedan till xylen (n = 1,496). Dessa biofilmer utbyttes därefter en varje från xylen in i en uppsättning av brytningsindexhänvisar flytande (Serie E, Cargille laboratorium, ser Bordlägga av material) och visuellt undersöktside-vid-sida för att bestämma indexet spänner som ger högst transparens. (övre panelen) Fas kontrast bilder: En biofilm var seriellt utväxlas mellan xylen och en smal uppsättning referensvätskor i det intervallet. Efter varje utbyte flyttades samma fält och sågs genom ett täckglas med hjälp av en 40x 0,85 NA Ph2 oljenedsänkning fas kontrast mål och Ph2 kondensor. Alla bilder spelades in med samma lampinställning och kameraexponering för att korrekt visa ändringar. Med ökande index ses kontraståterföring först på n = 1,530 för cellväggen, följt av cytoplasma vid n = 1,535. Skalstång = 10 μm. (nedre panelen) Diagram som visar minimum i genomsnittlig biofilm ljusstyrka vid den punkt där maximal öppenhet. Stark ljusspridning inom biofilmen gör att den genomsnittliga ljusstyrkan överskrider det tomma fältet. Isolerade celler verkar mörkare än det tomma fältet, upp till kontrast återföring i intervallet 1,530–1,535. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Djup avbildning av mutant och vild typ C. albicans biofilmer. En stam av vild typ (DAY185) och en cellcykelrelaterad proteinkinas minskade uttrycksstam (cak1 DX)14 odlades vid 37 °C för 48 timmar på silikonsubstrat i flytande YPD-medium. Biofilmerna var fasta, färgade med ConA-Alexafluor 594, och förtydligades med hjälp av lösningsmedelsutbytesprotokollet till metylsalicylat. Den 3D confocal mikroskopi visade att båda biofilmer var ~ 500 μm tjock. Bilddata konverterades till 32-bitarsformat i ImageJ eller Fiji (https://imagej.nih.gov/ij/ eller http://fiji.sc), och behandlades sedan med hjälp av subtrahera bakgrundsfunktionen med en 50-pixel rullande bollradie, tröskelför att ställa in negativa pixlar till noll, reslicera och använda maximal intensitetsprojektion för att producera sidovyer. A)Axiella och sidovyprojektioner: Den vilda biofilmen av typen wild type växte till en tjocklek av 502 μm, vilket framgår av sidovyprojektionen av den 558-plana konfokalbildstacken. Skalstång = 100 μm. (vänster hand paneler) 40-plan axiella prognoser från apex (topp) till bas (botten) visar variationen i celltyper i olika skikt av biofilmen. Detta exempel visade karakteristiska vilda typ struktur: vidhäftande celler vid basen ger upphov till hyphae som stiger upp i en tät mittzon av pseudohyphal och jäst-liknande celler. Ovanför midzone, hyphae reemerged och gav upphov till kluster av spirande jäst. Den långa hyphae sett i den apikala zonen sannolikt utvidgas till odlingsmediet i levande biofilm, men vikas över på ytan av biofilm under provbearbetning. Cak1 DX biofilm växte till en tjocklek av 500 μm som ses i sidovyprojektionen av 556-plan bildstacken. Denna mutant, som är känd för att genomgå fintråden tillväxt i avsaknad av inducerande betonar14, producerade en dramatiskt annorlunda arkitektur. Som framgår av både sideview och axiella prognoser (höger paneler), många förgrening celler gav upphov till radiella utväxter. (B)Exempel på förgrening av hyphae i cak1 DX biofilm. Skalstång = 10 μm. (C)Fluorescensdämpning med djup i den förtydligade vilda typ biofilm kvantifierades genom att maskera ut bakgrundspixlar, sedan beräkna den genomsnittliga digitala signalen för alla icke-bakgrundspixlar i varje bildplan. Med undantag för apikal hyphae som är ljust taggade av lektin, det fanns ingen stark dämpning trend med fokus djup. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Invasivhyphae i agar. C. albicans hyphae i en ytbiofilm kommer att tränga in i en agar substratum till millimeter avstånd (se figur 1). Efter förtydligande, invasiva strukturer kan ses nedåt om biofilm, eller uppåt från den nedre sidan av agaren. Det senare kräver större arbetsavstånd. Alternativt, efter fixering men före färgning och lösningsmedel utbyte, kan agaren skäras vertikalt med en skalpell eller rakblad i 1-2 mm plattor som sedan kan slås på en sida och avvisas direkt i sidovy efter färgning och förtydligande. Den här proceduren rekommenderas. I denna projektion av ett kvadratiskt 213 μm-synfält användes en regnbågefärgskala för att koda axiell position över ett 75 μm-intervall: blå funktioner är nära och röda funktioner djupare in i sidans plan. Denna uppfattning visar att långa hyphae knopp av laterala jäst-form celler med halvregelbundna intervall som ger upphov till subkolonier. Skalstång = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Framsteg inom fluorescensmikroskopi i optisk snittning, upplösning, hastighet, undvikande eller kompensation för avvikelse, flerkanaligt förvärv och i datorkraft, har orsakat ett uppsving i bildframställning intakta exemplar. För fasta exemplar har både klassiska och nya förtydliganden och expansionsmetoder haft stor inverkan19,20,21,22,23,24. I det här fallet tillämpade vi en snabb och enkel lösningsmedelsbaserad indexmatchningsmetod för att studera strukturen hos svampbiofilmer som är starkt genomskinliga till ogenomskinliga.
De föregående protokollen har testats med en rad prover. I vårt laboratorium odlas candida albicans biofilmer oftast på 14 mm rutor som skärs från ett ark medicinskt silikongummi (se materialtabell). Detta substrat används eftersom tillväxt på PDMS (polydimetylsiloxan) nedsänkt i flytande odlingsmedium har fastställts som en viktig in vitro-modell för infektioner i samband med medicinska implantat, särskilt indwelling kateter. Stressade celler som initierar glödtrådfastnar snabbt på icke-polära ytor som PDMS. I praktiken, används rutor som har rengjorts och resteriliseras i en autoklav (torr cykel) ger de mest konsekventa biofilmer för någon särskild stam. Biofilmer odlas också ofta på täckglas, i cover glas botten kulturrätter, i standard bakteriologiska kvalitet polystyren rätter, och på agar. Eftersom C. albicans celler inte följer glas, bör täckglas behandlas med en lektin som kommer att binda cellvägg polysackarider. Vi applicerar 40 μL av 1 mg/mL ConA eller WGA i sterilt vatten på varje täckyta. Efter torkning behandlas täckglasögon med 40 μL av 1% glutaraldehyd i 3 minuter för att koppla proteinet till en olöslig film. De tvättas sedan med sterilt destillerat vatten för att avlägsna fixativoch lösligt lektin och lufttorkad. Vid behov omsteriliseras de behandlade täckglasen eller rätterna under en bakteriedödande UV-lampa i 10 minuter.
Provtjockleken påverkar de erforderliga inkubationsperioderna i protokollen. Fixativ diffusion i en 300 μm biofilm kräver flera minuter att jämvikta. Denna tidsperiod ökar som kvadraten av exemplarettjocklek, och bör förlängas till en timme eller mer för mycket tjocka biofilmer eller agar block exemplar som kan vara 2-3 mm tjock. Jämviktstiden för färgning beror också på provtjockleken enligt beskrivningen för fixering och washout. Men eftersom lektinerna sprids långsammare än låg-MW fixativ, särskilt inom en agar gel, färgning bör förlängas över natten. Detsamma bör göras för washout av överskott fläck.
Fläckar av olika slag kan införlivas i protokollen. Vi använder en cellvägg fläck för strukturell avbildning, oftast Calcofluor White M2R (Fluor. Ljusare #28) eller en färg-märkt lektin som ConA-Alexafluor 594 eller WGA-Alexafluor 594. Uppmärksamhet bör ägnas åt proteinets valens. ConA-tetramern kan orsaka tvärbindning av mycket flexibel hyphae i den apikala regionen i en biofilm. Detta är mindre uppenbart med WGA dimer. De kanoniska specificiteterna hos dessa markörer är Calcofluor för chitin, ConA för mannose rester och WGA för N-acetyl-D-glukosamin och sialic syra rester.
Eftersom lösningsmedelsutbytesprotokollet klassificeras från PBS eller vatten, även om metanol till metylsalicylat, måste provbehållare vara lösningsmedelsresistenta. Metylsalicylat (MS) kommer snabbt att mjuka upp polystyren plastartiklar och långsamt mjuka upp andra plaster. Protokollet steg upp till användningen av den snygga metanol kan utföras i plasticware, men vid den tidpunkten i protokollet vi i allmänhet växla över till standard 20 mL glas scintillation flaskor med lösningsmedelsresistenta skruvlock. Injektionsflaskorna är lämpliga för biofilmer på silikon kvadrat substrat, eftersom rutorna kan plockas upp och överföras med fina pincett. Dessutom kan en injektionsflaska dräneras och fyllas på med den platta torget vilar på den inre böjda ytan så att biofilmen inte kommer i kontakt med glaset. Substratet ska biofilmas när det är nedsänkt i den upprätta injektionsflaskan. Injektionsflaskorna är utmärkta för långtidsförvaring av prov.
I förtydligandeprotokollet minimerar mer graderade lösningsmedelsutbytessteg risken för provdeformation på grund av lösningsmedelsblandningseffekter. För hastighet och bekvämlighet i grundprotokollet finns det fyra steg: 1) steg 3.3, PBS till 50:50 PBS:metanol; 2) steg 3,4 och 3,5, PBS:metanol till snygg metanol, 3) steg 3,6, snygg metanol till 50:50 metanol:MS; och 4) steg 3,7 och 3,8, metanol: MS till snyggt MS. Metanol ger övergångsfelibilitet. Eftersom vatten och ms är nästan oföränderliga är det dock viktigt att allt vatten förflyttas med metanol innan någon ms införs. avdunstning av restmetanol kommer att orsaka brytningsindexvariationer i preparatet. Inom fyra steg sekvens, upprepa den andra och fjärde stegen genom att lägga till en annan förändring av snyggt lösningsmedel, eller ens en tredje förändring, är tillrådligt. För särskilt ömtåliga prover kan lösningsmedelsförändringar formuleras i mindre procents steg.
Med agarblockprover kan steg 3.4 och 3.5 (snygg metanol) orsaka uppkomsten av saltkristaller i agaren på grund av olösligheten hos resta PBS-salter i metanolen. Detta kan undvikas genom att använda destillerat vatten (DW) i det första blandade lösningsmedelssteget i stället för PBS för att späda ut salter under vatten:metanolutbytet. Den alternativa lösningsmedelsutbytessekvensen för fasta biofilmer består sedan av dessa steg: 1) steg 3.3, överför provet från PBS till 50:50 DW:metanol (ge extra tid för diffusion genom agar); 2) steg 3.4, överför exemplaret från 50:50 DW:metanol till snygg metanol (upprepa 2x med metanol som i steg 3.5); 3) steg 3.6, överför exemplaret från metanol till 50:50 metanol:metylsalicylate; och 4) steg 3.7, överför exemplaret från 50:50 metanol:MS till snyggt MS (upprepa 2x med MS som i steg 3.8).
Eftersom metylsalicylat snabbt mjukar polystyren plastartiklar, använder vi en anodiserad aluminium skål med ett lock glas botten för att hålla den förtydligade biofilm på scenen i ett inverterat mikroskop. Täckglaset hålls på plats med uv-härdande optisk cement (Norland Optical Adhesive #61, se Materialförteckning). Förutsatt att MS avlägsnas i slutet av dagen genom att tvätta skålen med isopropanol följt av tvålvatten och sköljning, kommer det cementerade täckglaset att tjäna i många månader.
Objektivt val av objektiv är av avgörande betydelse för storskalig avbildning av förtydligade exemplar på grund av vikten av att minimera sfärisk villfarelse och behovet av tillräckligt arbetsavstånd. Vi har erfarenhet av tre mål i dessa studier. I den inverterade mikroskopsetupanvänder vi en lång arbetssträcka, måttlig numerisk bländare (NA) objektiv olja nedsänkt under täckglaset med biofilmen nedsänkt i metylsalicylat i skålen ovanför täckglaset. Det mesta av vårt arbete har gjorts med ett Zeiss Universal-serie akromatiskt mål, typ 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, som används med en negativ 160 mm brännvidd adapter för nominell oändlig-konjugat (IC) kompatibilitet. Detta mål var ursprungligen avsedd för olja nedsänkt visning genom 1,5 mm mikroskop diabilder med 0,35 mm arbetsavstånd25. När arbetsavståndet används med ett standardtäckglas (0,17 mm) är det mycket större: 1,5 + 0,35–0,17 = 1,68 mm = 1 680 μm. Vi använder också ett nytt Zeiss multi-nedsänkningsmål, typ 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat med ett arbetsavstånd som överstiger 540 μm, med nedsänkningskorrigeringen inställd på den höga sidan av "olja". Detta mål är mycket korrigerat och ger en fantastisk bild. På ett upprätt mikroskopstativ har vi använt ett nytt Nikon multi-nedsänkningsmål, typ MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat med ett arbetsavstånd som överstiger 5 000 μm (5 mm), även med nedsänkningskorrigeringen inställd på den höga sidan av "olja" (n = 1,518). Även om detta mål har en lägre NA än de andra, har det fördelen av att vara direkt nedsänkning i metylsalicylate.
För att optimera datainsamling i form av hastighet och upplösning bör konfokalmikroskopinställningar helst uppfylla både tvärgående och axiella Nyquist provtagningstätheter18. Med hjälp av konventionella kriterier ställer du in konfokal håldiameter nappad mot 1 Luftenhet. I förstorade koordinater
dP (μm) = 1,22 x förstoring x (emissionsvåglängd i μm) / NA
Tvärgående sampling (pixelavstånd) får inte överstiga (1/2) x Abbes upplösningsgräns. I objektrymdskoordinater
∆x, ∆y = (emissionsvåglängd i nm) / (4 NA)
Axiell provtagning (fokusökning) bör inte överstiga den omvända axiella bandbredden,
∆z = (nedsänkningsindex) x (emissionsvåglängd i nm) / (NA2)
Det konfokala optiska systemet utökar mikroskopets bandbredd och skärper både tvärgående och axiell upplösning med minst 1/√2.
För 40x 0,85 NA-målet som vi använder oftast, se tabell 1 för resultaten av dessa formler för en 600 nm emissionsvåglängd (Alexa Fluor 594).
| Formel | x 1/√2 | set (typiskt) | |
| dP (μm) | 34,5 μm | - | 25 eller 50 μm |
| ∆x, ∆y | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
| ∆z | 1200 nm | 848 nm | 900 nm |
Tabell 1: Konfokal håldiameter, tvärgående provtagning och axiell provtagningsvärden för en utsläppsvåglängd på 600 nm.
Med hjälp av en snurrande disk konfokal skanner med dessa inställningar och en 1,392 x 1,040 pixel skanna fält, data från biofilm exemplar kan förvärvas med rimlig hastighet och upplösning. Typiska 3D-bildstaplar med en färg körs 0,35–1,55 GB.
Förtydligande media i bred användning spänner över ett betydande brytningsindex intervall. Genom darkfield belysning och visuell inspektion, fann vi att fasta C. albicans biofilmer var mest transparenta ovan n = 1,5. Detta förfinades genom fas kontrastmikroskopi till n = 1.530-1.535. Av ett antal praktiska skäl använder vi metylsalicylate (n = 1,537) som det slutliga indexet matchande lösningsmedel. Även lösningsmedel utbyte medför risk för prov deformation eller andra artefakter, celler i fasta, förtydligade exemplar har liknande cellkroppsdimensioner, hypha diameter, och interseptal längd dimensioner som levande exemplar.
Många variationer i processen för lösningsmedelsutbyte är möjliga (t.ex. med hjälp av ett annat övergångslösningsmedel eller ett annat slutligt lösningsmedel). Metanol valdes för sin höga polaritet och snabb diffusion, men etanol visade sig bättre bevara rött fluorescerande protein (RFP) quantum yield26 som ett övergångslösningsmedel. Metylsalicylat valdes för sitt index, måttlig polaritet, lågt ångtryck och kompatibilitet med många fläckar, färgämnen och fluorescerande proteiner. Ett slutligt lösningsmedel med något lägre index, eller en blandning av metylsalicylate och ett lägre indexlösningsmedel, såsom butanol, kan dock tjäna bättre.
Oväntat, förmågan att se igenom en biofilm avslöjar inte bara dess stratifierade interna funktioner, men också stöd i visning av ursprunget till utökade strukturer som lång, oentrasslad afasotisk hyphae och invasivbasal hypohae på vissa substrat. Opportunistisk virulens i C. albicans beror på dess genetiska mångsidighet (dvs. övergång till hyphal tillväxt, upregulation av cellsubstratum och cell-cell följsamhet, generering av osmolyter för cellspirande och förlängning, och användning av alternativa näringsämnen). Hyphal förlängning möjliggör breakout av enskilda C. albicans celler från fagocytiska immunceller men är också viktigt för invasion. Biofilm vidhäftning och hyphal trassel verkar ge ytan förankring som behövs för hyphae att effektivt invadera ett substratum. När detta substrat är värdvävnad kan ökad virulens uppstå.
Imaging intakt biofilmer möjliggör ett stort antal informativa experiment som använder reporter stammar för genuttryck, modell vävnad substrat, och införandet av andra organismer såsom bakterier som finns i naturliga biofilmer. Även i det enklaste fallet av rent strukturell avbildning med en cell vägg fläck, in situ fenotyper avslöjas att då kan kvantifieras och genetiskt analyseras.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes delvis av NIH-bidrag R01 AI067703, R21 AI100270 och R21 AI135178 till A.P. Mitchell. Författarna är tacksamma mot Greenfield "Kip" Slamför att ge den långa arbetsavstånd oljenedsänkning mål som används i detta arbete, och Daniel Shiwarski för konfokal mikroskopi med direkt metylsalicylate nedsänkning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator - 30 °C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator - 37 °C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5 W | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13 mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n = 1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
References
- Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
- Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144 (2017).
- Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
- Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
- Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226 (2018).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
- Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525 (2012).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
- Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
- Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487 (2016).
- Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787 (2019).
- Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
- Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, Reprinted in 9, 154-166, 1992 1601-1613 (1991).
- Lanni, F., Keller, H. E. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. Yuste, R. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-55 (2011).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
- Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , Oberkochen, West Germany. archive CZO-Mi 823, ed. 1967 48 (1971).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113 (2008).
