Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

Summary

Candida albicans biyofilmlerinin iç özelliklerini görüntülemek ve ölçmek için, kırılma indisi eşleştirmesi ile açıklığa kavuşturulan sabit bozulmamış numuneler hazırlıyoruz. Daha sonra, optik kesit mikroskopisi biyofilmin tam kalınlığı na rağmen üç boyutlu görüntü verilerini elde etmek için kullanılabilir.

Abstract

Mikrobiyal mantar Candida albicans güçlü bir şekilde hiphal büyüme için maya formu büyüme geçiş yeteneği ile ilişkili virülans commenal kolonizasyon bir değişiklik uğrayabilir. Bu süreci başlatan hücreler, bir biyofilm kolonisinin gelişmesiyle birlikte yüzeylere ve birbirlerine yapışırlar. Bu genellikle mantar enfeksiyonlarında mukozal doku yüzeylerinde değil, kateterler gibi tıbbi implantlarda da görülür. Biyofilm hücrelerinin antifungal ilaçlara dirençli olduğu ve biyofilmden dökülen hücrelerin tehlikeli sistemik enfeksiyonlara yol açabileceği bilinmektedir. Biyofilmler kırılma heterojenliğine bağlı olarak ağır yarı saydamdan opaklığa kadar değişmektedir. Bu nedenle, mantar biyofilmleri optik mikroskopi ile çalışmak zordur. İç yapısal, hücresel ve hücre altı özellikleri görselleştirmek için, sabit bozulmamış biyofilmleri adım adım çözücü değişimi ile optimum kırılma indisi eşleştirme noktasına netleştiririz. C. albicans biyofilmleri için, az zayıflama ile 600 μm biyofilmde apeksten baza konfokal mikroskopiyi sağlamak için metil salisilat (n = 1.537) ile yeterli açıklama elde edilir. Bu görselleştirme protokolünde faz kontrastrefraktometrisi, laboratuvar biyofilmlerinin büyümesi, fiksasyon, boyama, solvent değişimi, konfokal floresan mikroskopi nin kurulumu ve temsili sonuçlar sıralanmaktadır.

Introduction

Candida albicans genellikle insanlarda kommenson bir mikrobiyal mantardır. Biyologlar için temel bir ilgi alanıdır çünkü organizmanın birden fazla morfolojisi vardır. Örneğin, bazı çevresel ipuçları veya stres yanıt olarak, maya-form tomurcuklanma hücreleri hyphae olarak bilinen yüksek uzun hücrelerin septating zincirleri olarak ipliksi büyümeye geçecektir. Geçiş tek hücreli ve çok hücreli gen ekspresyonu programı arasında bir geçiş in selotipik ifade bir örnek olarak önemlidir. Aynı şekilde, C. albicans biyomedikal ilgi çünkü organizma iyi bilinen fırsatçı patojen. Pamukçuk (oral kandidiaz), genitoüriner enfeksiyonlar ve immünolojik olarak zayıflamış hastalarda tehlikeli invaziv veya sistemik enfeksiyonların bir nedeni gibi mukozal mantar enfeksiyonları sorumludur.

Bu organizmanın virülans potansiyeli yakından çoklu morfotipleri ve genetik çok yönlülük^diğeryönleri ile^{bağlantılıdır 1 ,2,3,4}. Mikrop tüpü uzantısı, hyphal büyümesine geçişin ilk görünür aşaması, yeterli hızla oluşur yuttu C. albicans hücreleri fagositler kırmak ve böylelikle konak hücresel bağışıklık yanıtının erken bir faz kaçmak sağlamak^{için 5}. Ayrıca, filamentasyon öncesinde ve hücre-hücre ve hücreden yüzeye bağlılık büyük bir artış ile birlikte olan hücre duvarı proteinleri çeşitli sınıfların düzenlenmiş ifade nedeniyle adhesins olarak bilinen^6,7,8,9. Çok çeşitli koşullar altında, bağlılık ve filamentasyon kombinasyonu planktonik dramatik bir kayma ile sonuçlanır, tek hücreli büyüme bir biyofilm oluşturan yüzey ilişkili sömürge büyüme. C. albicans biyofilmler venöz kateterler gibi yaygın implante tıbbi cihazlarda gelişebilir. Bu tür biyofilmler maya-form hücreleri kapalı tomurcuk ve dolaşan kan içine döken başladığında disemine enfeksiyonlar neden olabilir. Birden fazla çalışma biyofilm hücrelerinin planktonik hücrelerden daha antifungal ilaçlara karşı daha dirençli olduğunu göstermiştir^10,11, kısmen düşük metabolizma nedeniyle olabilir¹². Ayrıca, bir biyofilmin yüksek genel yapışma ev sahibi doku içine hyphae verimli invaziv büyüme için gerekli çapa sağlayabilir¹.

C. albicans biyofilmlerinin kırılma indisi eşleştirmesi ile optik olarak açıklanması, bu mikrobiyal topluluğun yapısını görselleştirme ve gen ekspresyonu ile fenotip arasındaki ilişkileri keşfetme yeteneğimiz üzerinde büyük bir etkiye sahiptir. Laboratuvarda 48 saat sıvı kültür ortamı altında test yüzeylerinde yetiştirilen biyofilmler, opak olacak kadar yoğun ve kalın beyazımsı bir kaplama olarak görünürler (Şekil 1). Bu nedenle, biyofilmin birçok ilginç henotik özellikleri görünümden gizlidir. YPD, RPMI-1640 veya Örümcek ortamda 37 °C'de 300°C kalınlığında yetiştirilen 24 saatlik yabani tip biyofilmler, 48 h biyofilm genellikle 500 μm'ye ulaşır. Opaklık, kırılma heterojenitesinden kaynaklanan ışık saçılımından kaynaklanmaktadır: mantar hücre duvarı çevredeki ortama göre daha kırılmaz ve sitoplazma hücre duvarından biraz daha kırılır. Yerli bir biyofilmin ortaya çıkan yüksek optik yoğunluğu, geleneksel bir mikroskop ve hatta konfokal tarayıcı ile bakıldığında 30 μm'den daha derin olan tüm yapıları gizler (Şekil 2). Ancak, yaklaşık büyük hücresel bileşenlerin kırılması eşleşen yüksek kırılma indeksli sıvı ile sabit biyofilmler sızma ile açıklama büyük ölçüde elde edilebilir. Açıklama dan sonra, submikron çözünürlüğünde görüntüleme hemen hemen her C. albicans biofilm¹³tüm kalınlığı ile konfokal mikroskopi ile yapılabilir. Yabani tip örneklerde, biyofilmlerin uzun dolaşmış hyphae, tomurcuklanmış maya-form hücreleri veya psödohyphal hücreleri kümeleri, boşluk boşluklar ve hücre dışı matris bir miktar oluşur görmek kolaydır. Ayrıca, biyofilmler genellikle tabakalaşmış, hücre tipi, hücre yoğunluğu ve tomurcuklanma veya dallanma hücrelerinin varlığı mekansal varyant morfolojik farklılıklar gösteren. Bu özelliklerin bir veya daha fazla birçok varyasyonmutant suşları tarafından geliştirilen biyofilmlerde gözlenmiştir^14,15. Ayrıca, muhabir suşları gen ekspresyonunda mekansal farklılıklar gösterir^16,9,13. Bu nispeten basit ve ucuz yaklaşım ile elde edilen açıklama şaşırtıcı derecesi de birçok biyofilm milimetre mesafelere uzanan apikal hyphae ve bazal invaziv hyphae içerdiğini görmek mümkün kılar.

Bu görselleştirme protokolünde, basit bir hücre duvarı işaretleyicisini leke olarak kullanarak C. albicans biyofilminin düzeltilmesini, etiketlendiğini, açıklamasını ve görüntülendiğini gösteriyoruz. Protokolün mevcut versiyonunun kökeni, formaldehit-sabit biyofilmlerin %97 glikol metakrilat (GMA) ile sızdığı zaman gözlemlediğimiz ve biyofilmi orta derecede yüksek kırılma indisi olan sert bir plastikle yerleştirmek için polimerize edilen geliştirilmiş netliktir (n = 1.49). Daha sonra biyofilmin kontrast tersine çevirme noktasını (maksimum saydamlık) daha doğru bir şekilde belirlemek için konvansiyonel faz kontrast mikroskobu ve bir dizi kırılma indisi referans sıvısı kullandık (Şekil 3). C. albicans biyofilmleri için bu durum n = 1.530'a yakın meydana geldi ve saç keratini gibi yoğun bir protein yapısının sadece biraz daha kırılması (1.54-1.55) olduğu düşünülürse şaşırtıcı derecede yüksekti. Şekil 3'tekioptimal aralığın üst ucunda olmasına rağmen, uzun zamandır embriyoloji ve histolojide mikroskopi için açıklayıcı bir ajan olarak kullanıldığı için mevcut protokolde metil salisilat (wintergreen yağı, n = 1.537) benimsedik, düşük toksisite ve düşük buhar basıncına sahip ve orta-NA yağı daldırma optikleri kullanarak denemelerimizde mükemmel sonuçlar verdi.

Dört puan burada yapılmalıdır:

(1) Birkaç istisna dışında, mikroskopide ideal durum, numunenin kırılma indeksi objektif lens daldırma sıvısı¹⁷,^18,13kırılma indisi eşit olmalıdır . Derin odaklamanın gerekli olduğu üç boyutlu (3D) görüntüleme çalışmaları için bu her zaman önemlidir.

(2) Optimal temizleme için deneysel sonuç (n = 1.525-1.535) standart daldırma yağları (n = 1.515, 1.518) biraz daha yüksek ve bu nedenle noktası ihlal (1) ve böylece standart yağ daldırma optik kullanırken küresel sapma kaynağı tanıttı. Bu sorunun bir çözümü, daha yüksek aralıktaki bir daldırma dizini için tasarlanmış bir hedefin kullanılmasıdır. Temizlenmiş numunelerin görüntülenmesine olan ilginin yeniden canlanması nedeniyle, gerekli düzeltmeile özel hedefler kullanıma sunulmuştur. Diğer çözüm, optimum yağ daldırma performansı için az miktarda butanol (n = 1,399) ekleyerek 1,515 veya 1,518'e kadar olan açıklığa kavuşturulan ortamın indeksini ayarlamak ve biraz bozulmuş netliği kabul etmektir.

(3) Bozulmamış biyofilmlerin (ve bu ölçekteki diğer örneklerin) mikroskopisi, numune kalınlığını karşılamak için önemli bir çalışma mesafesi gerektirir. Bu önemli bir pratik husustur. Uzun çalışma mesafesi optikleri, çözünürlüğü sınırlayan ancak küresel sapmanın şiddetini de sınırlayan ılımlı bir sayısal diyafram açıklığıyla (NA = 0.6-1.25) sınırlar.

(4) Açıklama için optimal kırılma indisi diğer sabit numune türleri için farklı olabilir. Örnekler, Şekil 3'tegösterildiği gibi faz kontrastı ve bir dizi kırılma indisi referans sıvısı kullanılarak buna göre test edilmelidir.

Protocol

1. Biyofilm Kültürlerinin Gelişimi

DİkKAT: Candida albicans bir insan patojenidir. Bazı kurumlarda, bu organizmanın kültürü BSL-2 çevreleme gerektirir.

1. Bir maya ekstresi-peptone-dekstroz (YPD) agar plaka üzerinde seçilen gerginlik dışarı çizgi ve 30 °C'de 48 h büyür.
2. 30 °C'de bir gecede aerobik büyüme (dönen rotator, 52-55 rpm) için 15 mL kültür tüpünde 5 mL YPD ortamı aşılamak için plakadan tek koloniler seçin.
3. Hücre yoğunluğunu gecelik kültürün 40 ila 50 kat seyreltilmesini kullanarak belirleyin. Hücre yoğunluğunu silikon substrat için 3 x 10⁶ hücre/mL'ye veya konkanavalin-A (ConA) veya buğday mikrobu agglutinin (WGA) ile işlenmiş kapak cam yüzeyleri için 0,6-1,2 x 10⁶ hücre/mL'ye getirmek için gereken seyreltme faktörünü hesaplayın (Bkz. Tartışma).
4. 12 kuyu plakasında(Şekil 1)biyofilm büyümesi için, her kuyuya 2,0 mL steril ipliksilasyon ortamı dağıtın ve tabağı nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'ye ısıtın. Çeşitli ortamlar, daha yüksek bir sıcaklıkta (37 °C) ve ilave serumla daha güçlü bir şekilde filamentasyona neden olur. Fetal sığır serumu (FBS) önerilir. Önerilen ortamlar YPD, Spider-Mannitol veya RPMI-1640'tir.
5. Steril cımbız ile, ısıtılmış plaka her kuyu içine hazırlanmış bir substrat yerleştirin ve kabarcıklar yerinden. Her kuyuda adım 1.3'te önerilen hücre yoğunluğuna ulaşmak için gece kültüründen inoculum ekleyin. Inoculum olmadan bir kuyu kontaminasyona karşı görsel bir boşluk ve kontrol görevi görehizmet vermektedir.
6. Hücre yapışması için zaman tanımak için 90 dakika boyunca nemlendirilmiş 37 °C hava kuvözde 60 rpm orbital mikser üzerine plaka yerleştirin. 90 dakika sonra, orta ve bekar hücreleri çıkarın, steril orta veya fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve kültür yemekleri veya önceden ısıtılmış filamentasyon orta içeren başka bir çok kuyu plaka içine aşılanmış substrat yerleştirin. Çok kuyulu plakalar ile, yıkama adımı için ikinci bir plaka ve yıkanmış aşılanmış substrat almak için kuyu başına önceden ısıtılmış orta 2.0 mL ile üçüncü bir plaka kullanmak çok uygundur. Her transferden önce cımbızları sterilize edin.
7. Plakayı 37 °C nemlendirilmiş ortam-hava kuluçka makinesine geri döndürün ve biyofilmleri havalandırma için 60 rpm orbital karıştırma ile 48 saate kadar büyütün. Gelişmekte olan biyofilm maya formu hücreleri döken sürece her kültürde çok az planktonik büyüme olmalıdır. Bu şekilde yetiştirilen bir biyofilm Şekil 1'degösterilmiştir.

2. Görüntüleme için Numune İşleme

DİkKAT: Aldehit fiksatifler uçucu ve tehlikelidir. Bir gaz kaputunda fiksatif seyreltme hazırlayın, biyogüvenlik kabininde değil. Canlı hücreler için kullanılan kuvözlere fiksatif koymayın. Bir duman başlık veya iyi havalandırılmış tezgah alanında kapalı yemekler de seyreltilmiş fiksatifler ile çalışın. Fiksatifleri ve düzeltme sonrası yıkama çözümlerini tehlikeli atık olarak atın.

1. PBS'de isteğe bağlı olarak %2'ye kadar glutaraldehit ile taze fiksatif, %4 formaldehit veya paraformaldehit hazırlayın. Formalin% 4 seyreltilmiş rutin çalışma için kullanılabilir.
   NOT: Özellikle glutaraldehit geniş bant otofloresansını artıracak ve dTomato gibi ifade edilebilir etiketlerin floresansını azaltabilir.
2. Kültür ortamını numuneden çıkarın ve serum proteinlerini seyreltmek için PBS ile değiştirin veya substratumdaki biyofilmi birkaç dakikalığına PBS'ye aktarın.
3. Numuneyi fiksatif olarak aktarın ve kapalı tabağı 20 dakika boyunca yavaş bir orbital mikser üzerine ayarlayın. Daha kalın numuneleri işlerken süreyi uzatın (Bkz. Tartışma). Yemeğin iç tarafları da dahil olmak üzere tüm biyofilm büyümesini batırmak için her çanağa yeterli fiksatif hacim eklenmelidir.
4. Fiksatif çıkarın ve artık fiksatif yıkamak için PBS ile çanak yeniden doldurun. Fiksatifi tehlikeli atık olarak atın. Birkaç kısa süreli yıkar, sonra daha uzun biyofilm veya agar blok dışarı yaymak için artık fiksatif için zaman sağlamak için yıkar. Yıkama süresi fiksasyon için izin verilen süreye bağlıdır (bkz. Tartışma).
5. Gerekli leke miktarı biyofilm kütlesine bağlıdır. Boyama dan önce kültür yemeğinin numune olmayan alanlarından tüm biyofilm çıkarın veya boyama öncesinde yeni bir çanak içine sabit örnek aktarın. Biyofilmin kurumasını veya kurumasını izin vermeyin.  PBS'e daldırın.
6. Çanak leke ekleyin (Tartışma bakınız) ve bir gecede yavaş bir yörünge karıştırıcı üzerinde kapalı çanak ayarlayın (Tartışma bakınız). Işıktan koruyun.
7. Sabahları, boyama çözeltisini çıkarın ve bağlanmamış lekeyi seyreltmek için yemeği PBS ile doldurun. Birkaç saat için destain yavaş orbital karıştırıcı üzerinde bulaşıkları ayarlayın.

3. Açıklama Protokolü: Impermeant Substrat üzerine Biyofilmler

1. Açıklığa kavuşturulmuş biyofilmleri görsel olarak ayırt etmek zordur. Bu nedenle, istenirse, aşılama için yan belirlemek için bir çizik ile her substrat bir tarafı işaretleyin.
2. Çözücülerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için sonraki tüm atık lar ve çözücü transferleri için etiketli uzun Pasteur pipetleri kullanın.
3. Cımbız kullanarak, sabit biyofilmi PBS'den 5 mL'ye 5mL 50:50 PBS:metanol 20 mL cam şişede biyofilm yukarı bakacak şekilde aktarın. 5 dk için 1 dk aralıklarla orbital hareket ile manuel olarak karıştırın (Tartışma bakınız).
4. Pipet ve biyofilm veya biyofilm ve şişe arasında temas önlemek için dikkatli olmak, bir atık şişesi için çözücü çıkarın. 3 mL temiz metanol ile yavaşça doldurun. 3 dk için 1 dk aralıklarla orbital hareket ile manuel olarak karıştırın.
5. Çözücüü bir atık şişesine çıkarın ve hemen 5 mL metanol ile doldurun. 5-10 dk. 5-10 dakika boyunca 1 dk aralıklarla orbital hareketile elle karıştırın. Biyofilmler genellikle ilk görünüm daha bu noktada daha opak görünüyorsun.
6. Çözücüü atık şişesine çıkarın ve şişeyi hemen 50:50 metanol:metil salisilat 5 mL ile doldurun. 5-10 dk için 1 dk aralıklarla orbital hareket ile manuel olarak karıştırın. Biyofilm bu karışık çözücüde yarı saydam olmalıdır.
7. Çözücüden atık şişeye çıkarın. Şişeyi 3 mL temiz metil salisilat (MS) ile yavaşça doldurun. 3 dk için 1 dk aralıklarla orbital hareket ile manuel olarak karıştırın.
8. Çözücüü atık şişesine çıkarın ve 5 mL temiz MS ile hemen doldurun. Bu noktada, biyofilm şeffaf olmalıdır. Çözücüü atık şişesine çıkarın ve şişeyi hemen 3 mL temiz MS ile doldurun. İşlenmiş biyofilm bu çözücüde stabildir.
9. Agar biyofilmler için (Tartışma bakınız) agar rağmen su ve solvent difüzyon için izin vermek için tüm değişim süreleri uzatmak. Solventin agar'a ilerlemesini görmek için karanlık alan aydınlatmalı düşük güçlü bir kesme mikroskobu kullanılarak gerekli zaman dilimleri tahmin edilebilir. Protokol iyi bir açıklama ve% 2 agar kullanıldığında hiçbir büyük büzülme etkileri elde, ancak netleştirilmiş agar cımbız ile işleme sırasında sıkılırsa yoğuşacak. Spatula kullanılması önerilir.

4. Konfokal Mikroskopi için Görüntüleme Kurulumu

1. Aşağıdaki adımlar ters mikroskop kullanımı içindir. Ters numuneyi mikroskop aşamasında tutmak için kapak cam alt olan solvent geçirmez bir çanak kullanın (Bkz. Tartışma).
2. Uzay adaylarını ters numuneyi desteklemeye hazırlayın. Mikroskop slaytlarından (1.000 μm kalınlığında), kapak gözlüklerinden (170 μm) veya 13 mm silikon halkalardan (330 μm, Malzeme Tablosunabakınız) gerektiği gibi istiflenebilir küçük dikdörtgenler kullanın. Şişme nedeniyle odak sürüklenme en aza indirmek için 1 saat için metil salisilat halkaları önceden ıslatın.
3. Bir tıbbi sınıf silikon kare üzerinde bir biyofilm için, kare ters (yani, biyofilm aşağı çevirmek) ve çanak metil salisilat bir havuzda bir boşluk üzerine ayarlayın(Şekil 2). Numunenin altında herhangi bir kabarcıklar önlemek için emin olun.
4. Tabağı mikroskop un sahnesine sıkıca monte edin ve yağın amaç ile temas kurup kurmasını sağlayabilir (bkz.
5. Çanaktaki MS miktarını, menisküsün yüzey gerilimine göre numuneyi uzay makinesinde sıkıca tutması için ayarlayın. Mat yüzeyden gelen ışık saçılımını azaltmak için ters kare substratumun üzerine bir MS damlası yerleştirin ve buharlaşmayı sınırlamak için yemeği cam bir plakayla kaplayın. Görüntülemeden önce numunenin boşluklara yerleşmesi için birkaç dakika bekleyin.
6. Görüntü alanını görsel olarak incelemek ve ters biyofilmin apikal ve bazal bölgelerine göre geçerli odak konumunu bulmak için iletilen ışığı kullanın. Kontrastı artırmak için kondansatör aydınlatıcı sayısal diyafram açıklığını (INA) minimuma (kondansatör irisini kapatın) ayarlayın, aksi takdirde açıklığa kavuşturulan biyofilm neredeyse görünmez olacaktır. Bittiğinde, iletilen ışık kaynağını kapatın.
7. Konfokal floresan'a geçin ve biyofilmi kapamak için gereken seri odaklama görüntü yığınının alt ve üst sınırlarını ayarlayın. Yukarı odak sürücü adım, hangi tavsiye edilir, ilk kapak cam ve cam üzerinde istirahat olan çok uzun apikal hyphae üzerine yerleşmiş yerinden hücreleri gösterecektir. Dizinin üst ucunda, kurucu hücreler biyofilmin tabanındaki substratuma yapıştı lar. İğne deliği çapını, görüntü düzlemindeki piksel aralığını ve Tartışma'da özetlenen genel ölçütleri kullanarak odak adım artışını ayarlayın.

Representative Results

Şekil 1'deki gibi biyofilmler ağır şekilde opak yarı saydamdır, ancak yukarıdaki protokol tarafından rutin olarak açıklığa kavuşturulur ve görüntülenir. Şekil 2, pbs sabit bir biyofilmde odak derinliği ile floresan güçlü zayıflama gösterir, indeks eşleştirme sonra aynı biyofilm ile karşılaştırıldığında. Şekil 3'tegösterildiği gibi, kırılma indeksi artan seri olarak yanlış çözücüler kullanılarak netlik olarak maksimum hızla tahmin edilebilir. Bu minimum kontrast noktası (maksimum şeffaflık) bulmak için konvansiyonel faz kontrast mikroskobu ile rafine edilir. Bu optimum homojen indeks eşleştirme ile elde olmadığı açıktır. Bunun nedeni, hücre altı yapıların kırılma indeksi olarak biraz farklılık gösterir olmasıdır. Bu durumda, kontrast ters hücre duvarında sitoplazmadan biraz daha düşük bir çözücü indeksi oluştu. Candida albicans biyofilmleri için optimum n = 1.530'a yakın gerçekleşir. Şekil 4A'daki 48 h yabani tip ve cak1 DX mutant biyofilm kalınlığı 500 μm olmasına rağmen, tabandaki maya hücreleri apikal hücreler kadar keskin bir şekilde görüntülendi. Aynı şekilde, Şekil 4C'degösterildiği gibi, floresan zayıflaması odak derinliği ile güçlü bir şekilde ilişkili değildi. Şekil 5 agar içinde invaziv hyphae gösterir, bir yüzey biyofilm altında mikrometre yüzlerce. Olgun invaziv hyphae sürekli hyphal zincirinde septa lateral tomurcuklanan maya proksimal üretmek, invaziv bir hypha boyunca düzenli aralıklarla maya benzeri hücrelerin subcolonies yol açan.

Şekil 1: Açıklama öncesi biyofilm kültürleri. RPMI-1640 sıvı ortamda 12 kuyu plakac12 kuyu plakac1 c. albicans tamamlayıcı efg1 bir izolasyon bir izole yetiştirilen bir 24 h biyofilm% 10 FBS ile desteklenmektedir. Steril boş iyi C4 olduğunu.  Inset, aynı ortamda 3,75 mm'lik agar tabanında 6 kuyulu bir plaka içinde yetiştirilen 96-hr vahşi tip biyofilmin invaziv hyphae'yi gösteren kesitini gösterir. Her iki panel de aynı ölçekte. Ölçek çubuğu = 2,0 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Derin görüntülemenin indeks eşleştirme ile iyileştirilmesi. Şekil sabit ve ConA-Alexafluor 594 ile boyanmış bir 48 h vahşi tip biyofilm konfokal görüntü yığınları yan görüş projeksiyonları gösterir. (A) Örnek PBS'de 63x 1.0 NA doğrudan su daldırma hedefi kullanılarak görüntülendi. Zayıflama 30 μm odak derinliğinde şiddetliydi. (B) Protokol adım 3.3-3.8 ile açıklığa kavuşturulduktan sonra, aynı biyofilm 40x 0.85 NA yağ daldırma hedefi kullanılarak minimal zayıflama ile metil salisilat olarak görüntülendi. 3B görüntü yığınlarının arka plan çıkarma ve yan görünüm projeksiyonundan sonra, 40x verileri karşılaştırma için 63x verileriyle eşleşecek şekilde uzamsal olarak yeniden ölçeklendirildi. (C) Çimentolanmış cam alt kısmı olan siyah anodize alüminyum bir çanak içinde MS'e aktarılarak temizlenmiş numunenin (MS'den) ters monte edildiğini gösteren şematik diyagram (Bkz. Tartışma). Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Faz kontrastrefraktometrioptimum indeks eşleştirme aralığında hücresel özellikleri kontrast ters gösterir. Kapak gözlüklü sabit biyofilmler PBS'den metanole, sonra ksilene (n = 1.496) değiştirildi. Bu biyofilmler daha sonra ksilenden birer adet kırılma indisi referans sıvısına (Seri E, Cargille Laboratuvarları, bkz. Malzeme Tablosu)dönüştürüldü ve en yüksek saydamlık sağlayan indeks aralığını belirlemek için yan yana incelendi. (üst panel) Faz kontrast görüntüleri: Bir biyofilm seri olarak ksilen ve bu aralıktaki dar bir referans sıvı kümesi arasında değiş tokuş edildi. Her değişimden sonra, aynı alan 40x 0.85 NA Ph2 yağ daldırma fazı kontrast hedefi ve Ph2 kondansatör kullanılarak bir kapak camı olsa değiştirildi ve izlendi. Tüm görüntüler, değişiklikleri doğru bir şekilde görüntülemek için aynı lamba ayarı ve kamera pozlama ile kaydedildi. Artan indeksle, kontrast tersi ilk olarak hücre duvarı için n = 1.530'da görülür, bunu n = 1.535'te sitoplazma takip eder. Ölçek çubuğu = 10 μm. (alt panel) Maksimum saydamlık noktasında ortalama biyofilm parlaklığında minimum değeri gösteren grafik. Biyofilm içinde ışığın güçlü saçılması, ortalama parlaklığın boş alanı aşmasını neden olur. Yalıtılmış hücreler boş alandan daha koyu görünür, 1.530-1.535 aralığında kontrast ters kadar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Mutant ve yabani tip C. albicans biyofilmlerinin derin görüntülemesi. Yabani tip bir suşu (DAY185) ve hücre döngüsüne bağlı protein kiazazekspresyon(cak1 DX)¹⁴ sıvı YPD ortasında silikon substrat üzerinde 48 saat için 37 °C'de yetiştirildi. Biyofilmler, ConA-Alexafluor 594 ile boyanmış ve metil salisilat içine solvent değişim protokolü kullanılarak açıklığa kavuşturuldu. 3D konfokal mikroskopi her iki biyofilmin ~500 μm kalınlığında olduğunu gösterdi. Görüntü verileri ImageJ veya Fiji'de (https://imagej.nih.gov/ij/ veya http://fiji.sc) 32 bit formatına dönüştürüldü, ardından 50 piksellik yuvarlanan top yarıçapı ile Arka Plan'ı Çıkarma işlevi kullanılarak işlendi, negatif pikselleri sıfıra ayarlamak için eşik, reslicing ve yan görünümler üretmek için maksimum yoğunluklu projeksiyon kullanılarak işlendi. (A) Eksenel ve yan görüş projeksiyonları: Yabani tip biyofilm, 558 düzlemli konfokal görüntü yığınının yan görünüm projeksiyonunda görüldüğü gibi 502 μm kalınlığa kadar büyüdü. Ölçek çubuğu = 100 μm. (sol el panelleri) apeksten (üstten tabana) 40 düzlemli eksenel projeksiyonlar biyofilmin farklı katmanlarındaki hücre tiplerinin değişimini gösterir. Bu örnek, karakteristik yabani tip yapısını gösterdi: tabandaki yapışık hücreler, psödohyphal ve maya benzeri hücrelerin yoğun bir orta bölgesine yükselen hyphae'ye yol açar. Orta bölgenin üzerinde, hyphae yeniden ortaya çıktı ve tomurcuklanan maya kümeleri yol açtı. Apikal bölgede görülen uzun hyphae muhtemelen yaşayan biyofilm kültür ortamına genişletilmiş, ancak numune işleme sırasında biyofilm yüzeyine katlanmış. Cak1 DX biyofilm, 556 düzlemli görüntü yığınının yan görüş projeksiyonunda görüldüğü gibi 500 μm kalınlığa kadar büyüdü. Bu mutant, hangi indükleyen stresler yokluğunda ipliksi büyüme geçmesi bilinmektedir¹⁴, dramatik bir şekilde farklı bir mimari üretti. Hem yan görünümde hem de eksenel projeksiyonlarda (sağ el panellerinde) görüldüğü gibi, birçok dallanma hücresi radyal çıkıntılara yol açmıştır. (B) Cak1 DX biyofilm içinde dallanma hyphae örnekleri. Ölçek çubuğu = 10 μm. (C) Açıklık vahşi tip biyofilmde derinlik ile floresan zayıflaması arka plan pikselleri maskeleyerek ölçüldü, sonra her görüntü düzlemindeki tüm arka plan dışı pikseller için ortalama dijital sinyal hesaplandı. Parlak lektin tarafından etiketlenmiş apikal hyphae dışında, odak derinliği ile güçlü zayıflama eğilimi yoktu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Agar. C. albicans hyphae bir yüzey biyofilmde invaziv hyphae milimetre mesafelerine bir agar substratu nüfuz edecek (Şekil 1bakınız). Açıklamadan sonra, invaziv yapılar biyofilm olsa aşağı doğru veya agarAlt tarafında yukarı görülebilir. İkincisi daha fazla çalışma mesafesi gerektirir. Alternatif olarak, fiksasyon dan sonra ancak boyama ve çözücü değişiminden önce, agar neşter veya jiletle dikey olarak kesilebilir ve bu levhalar 1-2 mm'lik levhalara dönüştürülebilir ve boyama ve açıklamadan sonra doğrudan yan görünümde görüntülenebilir. Bu yordam önerilir. 213 μm karelik bir görüş alanının bu projeksiyonunda, eksenel konumu 75 m aralığında kodlamak için gökkuşağı renk skalası kullanılmıştır: mavi özellikler yakındır ve kırmızı özellikler sayfanın düzleminin daha derinlerindedir. Bu görünüm, uzun hyphae tomurcuk subcolonies yol açan yarı düzenli aralıklarla lateral maya-form hücreleri kapalı gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Optik kesit, çözünürlük, hız, kaçınma veya sapma, çok kanallı edinim ve bilgi işlem gücünde floresan mikroskopideki gelişmeler, sağlam örneklerin görüntülenmesinde yeniden canlanmaya neden olmaktadır. Sabit numuneler için, hem klasik hem de yeni açıklama ve genişletme yöntemleri büyük bir etkisi olmuştur^{19,20,21,22,23,24}. Bu durumda, opak olarak aşırı yarı saydam olan mantar biyofilmlerinin yapısını incelemek için hızlı ve basit bir solvent bazlı indeks eşleştirme yaklaşımı uyguladık.

Önceki protokoller çeşitli örneklerle test edilmiştir. Laboratuvarımızda Candida albicans biyofilmler en sık tıbbi sınıf silikon kauçuk bir levha kesilmiş 14 mm kareler üzerinde yetiştirilen (Malzeme Tablosubakınız). Bu substratum, sıvı kültür ortamına batık PDMS (poli-dimethylsiloxane) büyüme tıbbi implantlar ile ilişkili enfeksiyonlar için önemli bir in vitro model olarak kurulmuştur, çünkü kullanılır, özellikle indwelling kateterler. Filamentasyonu başlatan stresli hücreler PDMS gibi polar olmayan yüzeylere hızlı bir şekilde yapışır. Uygulamada, otoklavda (kuru çevrim) temizlenmiş ve yeniden sterilize edilmiş kullanılan kareler, herhangi bir tür için en tutarlı biyofilmleri verir. Biyofilmler de yaygın kapak gözlük, kapak cam alt kültür yemekleri, standart bakteriyolojik sınıf polistiren yemekler ve agar yetiştirilir. C. albicans hücreleri cam iyi yapışmaz çünkü, kapak gözlük hücre duvarı polisakkaritler bağlayacak bir lektin ile tedavi edilmelidir. Steril suya 40 mg/mL 1 mgL ConA veya WGA uygularız. Kuruduktan sonra, kapak gözlükleri proteini çözünmez bir filme bağlamak için 3 dk boyunca %1 glutaraldehit 40 μL ile tedavi edilir. Daha sonra fiksatif ve herhangi bir çözünür lektin kaldırmak ve hava kurutulmuş steril distile su ile yıkanır. Gerekirse, tedavi kapak bardakları veya bulaşıkları 10 dakika boyunca mikrop öldürücü UV lambası altında yeniden sterilize edilir.

Numune kalınlığı protokollerde gerekli kuluçka sürelerini etkileyecektir. 300 μm biyofilm içine fiksatif difüzyon dengelemek için birkaç dakika gerektirir. Bu süre numune kalınlığının karesi olarak artar ve 2-3 mm kalınlığında olabilecek çok kalın biyofilmler veya agar blok numuneleri için bir saat veya daha fazla uzatılmalıdır. Boyama için denge süresi de sabitleme ve yıkama için açıklandığı gibi numune kalınlığına bağlıdır. Ancak, lektinler düşük MW fiksatifler daha yavaş yayılır çünkü, özellikle bir agar jel içinde, boyama bir gecede uzatılmalıdır. Aynı aşırı leke yıkama için yapılmalıdır.

Protokollere çeşitli tipte lekeler dahil edilebilir. Biz yapısal görüntüleme için bir hücre duvarı lekesi kullanın, en yaygın Calcofluor Beyaz M2R (Flor. Aydınlatıcı #28) veya ConA-Alexafluor 594 veya WGA-Alexafluor 594 gibi boya etiketli lektin. Proteinin değerine dikkat edilmelidir. ConA tetramer bir biyofilm apikal bölgede son derece esnek hyphae crosslinking neden olabilir. Bu WGA dimer ile daha az belirgindir. Bu belirteçlerin kanonik özellikleri kitin için Calcofluor, mannose artıkları için ConA ve N-asetil-D-glukozamin ve siyalik asit kalıntıları için WGA'dır.

Çözücü değişim protokolü PBS veya su metil salisilat içine metanol rağmen dereceli olduğundan, numune kapları solvent dayanıklı olmalıdır. Metil salisilat (MS) hızlı polistiren plastik ve yavaş yavaş diğer plastik yumuşatmak yumuşatır. Protokol, düzgün metanol kullanımına kadar plastik olarak yapılabilir, ancak protokoldeki bu noktada genellikle solvente dayanıklı vida kapakları ile standart 20 mL cam ışıltılı şişelere geçeriz. Kareler alınıp ince cımbızkullanılarak aktarılabildiği için şişeler silikon kare substrat üzerindeki biyofilmler için uygundur. Ayrıca, bir şişe drene edilebilir ve biyofilm cam temas etmez, böylece iç kavisli yüzey üzerinde istirahat düz kare ile doldurulur. Substratum dik şişeye daldırıldığında biyofilm-up olmalıdır. Şişeler uzun süreli numune depolamaiçin mükemmeldir.

Açıklama protokolünde, daha fazla dereceli solvent değişim adımları solvent karıştırma etkileri nedeniyle numune deformasyonu riskini en aza indirir. Temel protokolde hız ve rahatlık için dört adım vardır: 1) adım 3.3, PBS için 50:50 PBS:metanol; 2) adımlar 3.4 ve 3.5, PBS:metanol düzgün metanol, 3) adım 3.6, 50:50 metanol için düzgün metanol:MS; ve 4) adımlar 3.7 ve 3.8, metanol:MS düzgün MS. Metanol geçiş miscibility sağlar. Ancak, su ve MS neredeyse immiscible olduğundan, tüm su herhangi bir MS giriş önce metanol tarafından yerinden olması esastır. artık metanolbuharlaşması numune içinde kırılma indisi varyasyonları neden olacaktır. Dört adım sırası içinde, düzgün çözücü başka bir değişiklik, hatta üçüncü bir değişiklik ekleyerek ikinci ve dördüncü adımları tekrarlama, tavsiye edilir. Özellikle kırılgan numuneler için çözücü değişimleri daha küçük yüzde basamaklarda formüle edilebilir.

Agar blok örnekleri ile, adımlar 3.4 ve 3.5 (düzgün metanol) metanol artık PBS tuzları çözünmezlik nedeniyle agar içinde tuz kristallerinin görünümünü neden olabilir. Bu su sırasında tuzları seyreltmek için PBS yerine ilk karışık çözücü adımda distile su (DW) kullanılarak önlenebilir: metanol değişimi. Sabit biyofilmler için alternatif solvent değişim sırası sonra şu adımlardan oluşur: 1) adım 3.3, 50:50 DW:metanol içine PBS örnek transferi (agar yoluyla difüzyon için ekstra zaman sağlar); 2) adım 3.4, 50:50 DW:metanol düzgün metanol içine örnek transferi (adım 3.5 gibi metanol ile 2x tekrarlayın); 3) adım 3.6, 50:50 metanol için metanol örnek transferi:metil salisilat; ve 4) adım 3.7, 50:50 metanol:MS temiz MS (adım 3.8 gibi MS ile 2x tekrar) için örnek aktarın.

Metil salisilat hızlı bir şekilde polistiren plastik yumuşatır çünkü, ters bir mikroskop aşamasında açıklık biyofilm tutmak için bir kapak cam alt ile anodize alüminyum çanak kullanın. Kapak camı UV küroptik çimento kullanılarak yerinde tutulur (Norland Optik Yapıştırıcı #61, Malzeme Tablosu'nabakınız). MS izopropanol ile sabunlu su ve durulama ardından bulaşık yıkayarak günün sonunda kaldırılır sağlanan, çimentolu kapak cam aylarca hizmet verecek.

Küresel sapmayı en aza indirmenin önemi ve yeterli çalışma mesafesi ihtiyacı nedeniyle, açıklığa kavuşturulmuş örneklerin büyük ölçekli görüntülemesinde objektif lens seçimi kritik öneme sahiptir. Bu çalışmalarda üç hedefle tecrübemiz var. Ters mikroskop kurulumunda, kapak camı üzerindeki çanakta metil salisilata batırılmış biyofilm ile kapak camı nın altına batırılmış uzun bir çalışma mesafesi, orta sayısal diyafram (NA) nesnel yağ kullanıyoruz. Çalışmalarımızın çoğu zeiss Universal serisi akromatik hedefi, tip 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, nominal sonsuz eşlenik (IC) uyumluluğu için negatif 160 mm odak uzaklığı adaptörü ile yapılmıştır. Bu amaç başlangıçta 0,35 mm çalışma mesafesi²⁵ile 1,5 mm mikroskop slaytlar ile yağ daldırma görüntüleme için tasarlanmıştır. Standart bir kapak camı (0,17 mm) ile kullanıldığında çalışma mesafesi çok daha fazladır: 1,5 + 0,35-0,17 = 1,68 mm = 1,680 m. Ayrıca yeni bir Zeiss çoklu daldırma hedefi, tip 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat 540 μm aşan bir çalışma mesafesi ile, daldırma düzeltme 'yağ' yüksek tarafına ayarlanmış kullanın. Bu amaç son derece düzeltilmiş ve mükemmel bir görüntü üretir. Dik bir mikroskop standında, yeni bir Nikon çoklu daldırma hedefi, MRD71120 tipi, 5.000 μm (5 mm) çalışma mesafesi ile 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat, ayrıca 'yağ' (n = 1.518) yüksek tarafına daldırma düzeltme ile kullandık. Bu hedef diğerlerinden daha düşük bir NA'ya sahip olsa da, metil salisilata doğrudan daldırılmak avantajına sahiptir.

Hız ve çözünürlük açısından veri alımını optimize etmek için, konfokal mikroskop ayarları ideal hem enine hem de eksenel Nyquist örnekleme yoğunlukları¹⁸karşılanmalıdır. Konvansiyonel kriterleri kullanarak, confocal iğne deliği çapını nominal olarak 1 Havadar üniteye ayarlayın. Büyütülmüş koordinatlarda,

d_P (μm) = 1,22 x büyütme x (μm'de emisyon dalga boyu) / NA

Enine örnekleme (piksel aralığı) x Abbe'nin çözünürlük sınırını (1/2) aşmamalıdır. Nesne-uzay koordinatlarında,

(nm'de emisyon dalga boyu) / (4 NA)

Eksenel örnekleme (odak artış) ters eksenel bant genişliğini aşmamalı,

≥z = (daldırma indeksi) x (nm'de emisyon dalga boyu) / (NA²)

Konfokal optik sistem mikroskobun bant genişliğini genişletir ve hem enine hem de eksenel çözünürlüğü en az 1/√2 ile keskinleştirir.

En sık yararlandığımız 40x 0.85 NA hedefi için, 600 nm emisyon dalga boyu için bu formüllerin sonuçları için Tablo 1'e bakınız (Alexa Fluor 594).

	Formül	x 1/√2	set (tipik)
dP (μm)	34,5 μm	-	25 veya 50 m
(x), (y)	176 nm	125 nm	161 nm
≥z	1200 nm	848 nm	900 nm

Tablo 1: 600 nm emisyon dalga boyu için konfokal iğne deliği çapı, enine örnekleme ve eksenel örnekleme değerleri.

Bu ayarlara sahip bir dönen disk konfokal tarayıcı sı ve 1.392 x 1.040 piksel lik bir tbmkografi alanı kullanılarak, biyofilm örneklerinden elde edilen veriler makul hız ve çözünürlükte elde edilebilir. Tipik tek renkli 3B görüntü yığınları 0,35-1,55 GB çalıştırın.

Geniş kullanımda açıklama ortamı önemli bir kırılma indeks aralığına yayılır. Darkfield aydınlatma ve görsel inceleme ile, sabit C. albicans biyofilm n = 1.5 üzerinde en şeffaf olduğunu bulundu. Bu durum faz kontrast mikroskobu ile n = 1.530-1.535'e kadar rafine edilmiştir. Bir dizi pratik nedenden dolayı, son indeks eşleştirme çözücü olarak metil salisilat (n = 1.537) kullanıyoruz. Solvent değişimi numune deformasyonu veya diğer objeler riskini getirse de, sabit, netleştirilmiş numunelerde bulunan hücreler canlı numuneler gibi benzer hücre gövdesi boyutlarına, hypha çapına ve interseptal uzunluk boyutlarına sahiptir.

Solvent değişim sürecinde birçok varyasyon mümkündür (örneğin, farklı bir geçiş çözücü kullanarak, ya da farklı bir son çözücü). Metanol yüksek polarite ve hızlı difüzyon için seçildi, ancak etanol daha iyi kırmızı floresan protein korumak için gösterilmiştir (RFP) kuantum^{verimi 26} bir geçiş çözücü olarak. Metil salisilat indeks, orta polarite, düşük buhar basıncı ve birçok leke, boya ve floresan proteinile uyumluluk için seçilmiştir. Ancak, biraz daha düşük indeksli son bir çözücü, ya da metil salisilat karışımı ve daha düşük indeks çözücü, butanol gibi, daha iyi hizmet verebilir.

Beklenmedik bir şekilde, bir biyofilm aracılığıyla görmek yeteneği sadece tabakalaşmış iç özellikleri ortaya koymaktadır, ama aynı zamanda bazı substrat üzerinde uzun, unentangled apikal hyphae ve invaziv bazal hyphae gibi genişletilmiş yapıların kökeni görüntüleme yardımcı olur. C. albicans fırsatçı virülans genetik çok yönlülük bağlıdır (yani, hiphal büyüme geçiş, hücre substratum ve hücre-hücre bağlılığı upregulation, hücre tomurcuklanma ve uzama için osmolit üretimi, ve alternatif besin lerin kullanımı). Hipür uzantısı fagositik bağışıklık hücrelerinden bireysel C. albicans hücrelerinin koparma sağlar ama aynı zamanda invazyon için gereklidir. Biyofilm yapışma ve hiphal dolaşıklık, hyphae'nin bir substratumu verimli bir şekilde istila etmesi için gerekli yüzey demirlemesini sağlar. Bu substratum konak doku olduğunda, artan virülans neden olabilir.

Sağlam biyofilmlerin görüntülenmesi, gen ekspresyonu, model doku substratı ve doğal biyofilmlerde bulunan bakteriler gibi diğer organizmaların dahil edilmesi için muhabir suşlarını kullanan çok sayıda bilgilendirici deney yapılmasını sağlar. Hücre duvarı lekesi ile tamamen yapısal görüntüleme basit durumda bile, yerinde fenotipler daha sonra sayısal ve genetik olarak analiz edilebilir ortaya çıkar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biohazardous waste receptacle
Biosafety cabinet with germicidal UV lamp
Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol)
Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate
Distilled water			DW
Distilled water, sterile
Ethanol, absolute			EtOH
Fetal bovine serum (FBS), sterile
Fixative waste bottle in secondary containment
Formaldehyde 20% in water, ampules	Electron Microscopy Sciences
Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37%	Electron Microscopy Sciences
Fume hood
Glutaraldehyde 25% in water, ampules	Electron Microscopy Sciences
Incubator - 30 °C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes
Incubator - 37 °C, with orbital mixer for culture plates
Isopropanol 70%			iPrOH 70%
Longwave (365 nm) UV lamp, 5 W	Cole-Parmer Scientific		for curing NOA-61 cement
Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick	Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/		Non-reinforced medical grade silicone sheeting
Methanol 99.9%			MeOH
Methyl salicylate 99%			MS
Millipore Swinnex 13 mm white silicone ring gaskets	Millipore Corp.	SX0001301
Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61	Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com	NOA-61
Orbital mixer, benchtop
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile
Refractive index standard liquids, n = 1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment)	Cargille Laboratories, https://cargille.com	Series E	Cedar Grove, NJ 07009, USA
RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile
Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner	Fisher Scientific Co.	03-341-25H	for specimen processing and storage
Solvent waste bottle in secondary containment
Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol)
Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate
Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar)
YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose)