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Medicine

외과 클립을 사용하여 마우스에 소매 위절제술

doi: 10.3791/60719 Published: November 14, 2020

Summary

당뇨병과 비만의 보급은 전 세계적으로 지속적으로 증가하고 있습니다. 당뇨병, 비만 및 그들의 관련된 사망 및 공동 병위 사이 기계장치는 추가 조사될 필요가 있습니다. 여기서, 우리는 비만 수술의 단순한 전임상 모델로 동물에 있는 소매 위절제술 (SG)를 위한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

과체중과 비만인 사람들의 수는 성인과 사춘기 인구 모두에서 지속적으로 증가하고 있습니다. 이것은 타입-2 당뇨병 (T2D) 및 그밖 신진 대사 문제의 증가한 보편적인 현상과 일치합니다. SG와 같은 Bariatric 수술은 현재 비만과 T2D를 위한 가장 효과적이고 일반적으로 사용되는 장기 치료 중 하나이지만, 그(것)들 사이 협회는 아직 완전히 탐구되지 않습니다. 인간에 있는 bariatric 수술 후에 보인 결과의 근본적인 기계장치는 전임상 동물 연구 결과에 근거를 두어 조사될 수 있습니다. SG는 체중, 포도당 수준 및 많은 대사 매개 변수를 감소시키며 합병증발생률이 낮기 때문에 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 작업의 목표는 간단한 방법과 연구원을위한 동물에 있는 bariatric 수술의 단순한 전임상 모형을 제공하는 것입니다.

Introduction

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비만의 보급은 1975년부터 전 세계적으로 거의 3배 증가했습니다. 2016년에는 18세 이상 성인 19억 명 이상이 과체중이었으며 6억 5천만 명 이상의 성인이 비만이었습니다. 성인 인구에서 T2D의 보급은 또한 1980년과 2014년 사이 1억 2,200만 명의 성인으로 증가한 숫자로 4.7%에서 8.5%로 두 배로증가했습니다. 대부분의 비만 수술은 상당한 체중 감소, 체지방의 감소, 포도당 내성, 인슐린 저항 성 및 당뇨병 조절2의개선으로 이어집니다. T2D의 체중 감소 및 면제 외에도, bariatric 수술은 고혈압 조절과 같은 추가적인 건강 이점을 생성하고 특정 유형의 비만 관련 암 개발 및 진행3의부각을 낮춥니다. Bariatric 수술은 또한 튼튼한 완전한 유도합니다, T2D의 부분적인 면제, 10 년 주요 관상 동맥 심장병의 리스크를 감소시습니다 (CHD) 및 뇌혈관 리스크의 어느 정도. 그러나 기본 메커니즘은4를완전히 이해하지 는 않습니다.

bariatric/신진 대사 수술을 위한 몇몇 절차가 있습니다. 제한및 위장 우회 수술 모두 신진대사5에긍정적인 영향을 미칩니다. bariatric 수술 모델 중, SG 및 변형 된 Roux-en-Y 위 우회는 더 높은 성공과 낮은 사망률을 가지고 있으며 마우스6에서신뢰할 수있는 제한적 및 위장 우회 수술 모델을 입증한다. 위장 우회 수술은 장기적으로 제한적인 절차보다 더 많은 체중 감량과 포도당 내성 및 간 steatosis의 상당한 개선을 제공하지만, SG는 여전히 체중과 포도당 수준의 좋은6제어를 생산하고 합병증6의 낮은 발생률로 수행하기 쉽습니다. SG의 비율은 30%에서 54%로 증가하고 Roux-en-Y 위 우회 수술은 2008년부터 2014년까지 52%에서 32%로감소했습니다. 현재 복강경 SG는 미국의 학술 센터 내에서 국가 수준에서 가장 일반적으로 수행되는 bariatric절차8. bariatric 수술, 당뇨병 및 비만 사이 병리 생리 과정에 관하여 많은 간행된 보고가 있더라도, 우리는 더 알려지지 않은 기계장치를 탐구하기 위하여 더 많은 동물 실험이 필요합니다.

이 프로토콜은 인간에 있는 bariatric 수술 후에 보인 결과의 근본적인 기계장치를 조사하는 동물 방법을 생성하는 것을 작합니다. 현재 번역 연구는 SG에서 비만 및 T2D 처리의 기계장치에 통찰력을 제공할 수 있습니다.

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Protocol

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동물 사용에 대한 모든 절차는 국립 양명대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었으며 "실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드"를 준수했습니다. 8판, 2011". 마취 절차는 국립 양명대학, ICAUC-016, 2015,1st edition의 실험동물에 대한 통증 조절, 마취, 수술 전 및 수술 후 치료에 대한 지침에 따라 수행되었다.

1. 동물 준비

  1. 16-18 그램의 무게국립 실험실 동물 센터 (NLAC)에서 20 8 주 된 야생 유형 C57BL/6 수컷 마우스를 가져옵니다. 무작위로 SG 또는 10 마우스각각의 가짜 수술 그룹에 이러한 마우스를 할당합니다.
  2. bariatric 또는 sham 수술9전에 차우 또는 고지방 식단 (보충 파일참조)에 마우스를 시작합니다. HFD의 적어도 2 수술 전 주를 가진 규정식 유도한 비만을 생성합니다.
  3. 국립 양명대학 실험실 동물 센터에 12:12의 밝은 어두운 주기 아래 12:12에 빛이 발병하고 .M.
  4. 모든 동물을 음식에서 제한하지만 수술 전날 밤에 무료로 물을 이용할 수 있습니다.

2. 일반 수술 전 준비

  1. 수술 전에 적어도 6 시간 동안 마우스를 빨리. 5% 이소플루란과 산소(3-4 L/min)로 유도 챔버에서 마취를 유도합니다.
    1. 마취의 깊이를 확인하여 뒷발, 앞포 및 귀의 핀치 자극 (무딘 곡선 의 부드러운 미세 집게)이 모터 반사를 일으키지 않도록합니다. 항생제를 관리 (25 mg/kg cefazolin) 수술 전에 피하 주사를 통해.
  2. 외과 적 절차에 대한 특정 작업 영역을 할당합니다. 수술 부위를 청소하고 수술 전에 75 %의 알코올 용액으로 수술 테이블을 분사하십시오.
  3. 마우스를 코 콘에 놓고 마취를 2% 이소플루란(2L/분)과 산소(4L/분)로 유지합니다.
  4. 슬리브 위절제술과 샴장 작동의 경우 발가락 자극에 의한 마취의 적절한 깊이를 확인한 후, 안구건조증을 방지하기 위해 마우스의 눈에 0.2% 카보머 아이 젤을 바르십시오.
  5. 전기 면도기를 사용하여 복부에서 흉골까지 머리카락을 면도합니다. 남은 모발을 탈모 크림으로 제거하고 청소합니다. 수술 대에 마우스를 놓고 고정시 면에 놓습니다.
  6. 3개의 응용을 위해 75%의 알콜로 번갈아 가며 povidone 요오드 용액으로 마우스의 복부 벽을 소독하십시오.

3. 슬리브 위절제술과 가짜 절차

  1. 중앙 분리근
    1. 마이크로 가위를 사용하여 상부 복부에서 1-1.5cm 길이의 중간 선 절개를 합니다.
  2. 위장 및 장 외부화
    1. 예측할 수 없는 출혈과 저혈당 충격을 방지하기 위해 필요에 따라 돋보기 해부 현미경 또는 돋보기의 도움으로 SG 절차를 수행하십시오.
    2. 두 개의 곡선된 부드러운 톱니 모양의 마이크로 포스프를 사용하여 위장을 부드럽게 움직이고 외부화하십시오.
    3. 필요에 따라 면기울 프로브와 전기 카우터리를 사용하여 왼쪽 위를 비장으로 연결하는 위장 인대를 조심스럽게 나누어 주변 비장 및 기타 내부 장기에서 위 기금을 해부합니다.

4. 위장 격리 및 클립

참고: 마우스용 SG는 이전에 게시된10과같은 새로운 클립 어플리케이션 기술을 사용하여 수행되었다.

  1. 위금욕과 유동을 집게로 부드럽게 그리고 옆으로 스트레칭하고, 중간선(도1도 2)을식별하고, 위내측의 중간쪽의 절반에 외과 클립을 열등하게 대열시키고 하부 극을 우월하게 적용한다. 위장의 약 75-80%를 클램프 및 배제하여 위장의 전체 측면 슬리브(도1도 2)를생성한다.
  2. 장의 피부를 옆의 맨손으로 옮기고 따뜻한 살린 촉촉한 거즈로 덮고 탈수와 저체온증을 방지하기 위해 필요에 따라 복통 수분을 섭취하십시오.
  3. 측면 잘린 위장을 절제하고, 미세 시저로 위장의 제외 된 소매를 제거 한 다음 povidone-요오드 용액으로 위장의 절단 가장자리를 살균하십시오.
  4. 클립 라인을 5-0 모노필라멘트 비흡수성 봉합사로 오버세우하여 누출이 없도록 합니다. 봉합사의 끝을 매듭짓고 양쪽 끝에 있는 클립에 고정합니다.
  5. 복부와 내장을 복강내의 적절한 위치로 되돌리고 복부를 5-0 모노필라멘트 무흡수성 연속 및 불연속 봉합사로 닫습니다.
  6. 케토프로펜(2-5 mg/kg)과 세파졸린(25 mg/kg)을 투여한 항생제를 전체 시술 후 인과간으로 투여한다.

5. SG의 샴 절차

  1. 앞서 설명한 바와 유사한 절차를 미드라인 복강경 절제술과 함께 수행하고, 37°C 젖은 따뜻한 식염수 거즈 커버리지를 사용하여 장과 위를 5분 동안 외부화한다.
  2. 이 내부 장기의 적절한 사이트에 위와 내장을 반환합니다.
  3. 이전에 설명된 바와 같이 복부 벽을 세심하게 닫는 것은 느리거나 흡수성이 없는 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 근막과 피부에 연속적이고 불연속적인 폐쇄2층으로 설명되어 있습니다. 케토프로펜(2-5 mg/kg)과 세파졸린(25 mg/kg)을 투여한 항생제를 전체 시술 후 인과간으로 투여한다.

6. 일반 수술 후 치료

  1. 이소플루란을 멈추고 마우스가 완전히 깨어날 때까지 3-5 L/min의 실내 공기 흐름을 계속합니다.
  2. 그것은 이동성을 회복하고 케이지 주위를 걷기 시작하는 동안 마우스를 계속보고.
  3. 마우스를 30°C 독립 인큐베이터에 5일 동안 배치합니다. 마우스가 서로 부상하지 않도록 케이지당 마우스가 하나만 있는지 확인하십시오.
  4. 수술 후 3일 간 젤 다이어트 식품(고지방 젤 다이어트: 라드 10%, 액상 설탕 10%, 물 57%)에 무료로 접속하고 수술 후 3일 간 이전 식단을 다시 도입합니다.
  5. 피하 또는 복천성 케토프로펜 (2-5 mg/kg), 및 cefazolin (25 mg/kg) 수술 후 1 일 동안 주입.
  6. 전체 연구 기간을 통해 매주 마우스 체중을 평가합니다. 케토프로펜(2-5 mg/kg)을 필요에 따라 매일 한 번 통증 조절을 위한 관복막 주사를 제공하여 수술 후 동물이 곤란하다.
    참고: 여기서 SG의 생존율은 학습 기간 이후 90%였습니다.

7. 대사 매개 변수 평가

  1. 6h에 대한 빠른 마우스, 기준선 혈액 샘플을 (0 분). 자유롭게 움직이는마우스(11),12의꼬리 정맥 끝에서 모든 혈액 샘플을 얻을 수 있다.
  2. 포도당 내성 검사를 위한 복막 주사로 50% 덱스트로오스1 mg/g를 전달합니다.
  3. 글루코미터 및 테스트 스트립을 사용하여 중복 시료에 대한 포도당 투여 후 0, 5, 15, 30, 60 및 120분에서 자유롭게 움직이는 마우스의 꼬리 정맥 끝에서 혈당을 측정합니다.
  4. 30 분 동안 응고와 실온에서 전체 혈액 샘플 (n = 10)을 유지합니다.
  5. 4°C에서 10분 동안 3,000 x g의 혈액 샘플을 원심분리합니다.
  6. 혈전을 방해하지 않고 별도의 튜브로 플라즈마를 옮기고 -80 °C에 보관하십시오.
  7. 헤모글로빈 A1c (HBA1c), 포도당, 콜레스테롤 및 인슐린 수치를 위한 상용 마우스 ELISA 키트를 사용하여 연구 결과의 끝에 플라즈마 견본을 공부하십시오.

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Representative Results

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작업의 결과는 도 3도 4에표시됩니다. 연구 결과의 생존율은 90%이었습니다. 한 마우스는 약점 때문에 sham 그룹에서 사망하고 다른 마우스는 알 수없는 이유로 수술 후 3 일에 SG 그룹에서 사망했다. HFD 공급 마우스에 대한 체중감량(도 3A)에대한 결과(3주차)는 인간에서 관찰된 것과 매우 유사하며, 최종 체중 감소는 약 15~20%13. 연구 결과는 또한 HFD 먹이 마우스에 있는 SG 수술 후에 콜레스테롤 수준(도 3B)가현저하게 감소했다는 것을 보여주었습니다.

더 나은 인슐린 감도 및 포도 당 내성은 복막 내 포도 당 내성 테스트에 의해 수술 직후 관찰 되었다 (IPGTT). 현재 연구에서는, 우리는 HFD 유도비만이 야생형 C57BL/6 마우스에서 인슐린 저항성 및 포도당 편협을 불러내고 SG에 의해 교정될 수 있음을 입증하였다. SG 후, 인슐린 저항, 포도 당, 그리고 지질 수준 모두이 연구에서 향상.

Figure 1
그림 1: SG의 외과 적 절차.
(A)이 실험 모델에 사용되는 5mm 수술 클립. (B)핀치 자극으로 마취의 깊이를 확인합니다. (C,D) 위내측의 중간쪽 절반에 위식도 접합을 열등하고 하부 극에서 우월하게 적용합니다. (E)누설을 보장하기 위해 위장의 절단 가장자리를 살균하고 봉합합니다. (F-H) 따뜻한 식염수로 마우스를 수분시키고, 복강내의 적절한 부위로 위와 내장을 되돌려 보냅니다. 복강을 조심스럽게 닫습니다. 유도 챔버에서 마취 상태에서 회복하고 상태가 완전히 회복되고 안정화되었을 때 케이지로 돌아갑니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 위장에 수술 클립 사용 의 사이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: (A) 주간 체중 변화와 (B) 콜레스테롤 수치에 대한 SG의 효과.
데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. * P< 0.05; **P< 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 연구 끝에 (A) IPGTT (B) Hba1c 및 (C) HOMA-IR에 대한 SG의 효과.
(n = 5 VSG; n = 7 가짜); 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. * P< 0.05; **P< 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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예비 코호트 연구의 대부분은 체질량 지수를 증가시키는 것이 사망률 증가와 관련이 있음을 확인했습니다. 비만은 당뇨병의 고위험, 심혈관 질환 (CVD), 그리고 남녀 모두에서 사망과 관련이 있습니다. 특정 병리학 적 과정은 당뇨병, 비만 및 사망률14사이의 연결을 확립했다. 체계적인 검토는 심실 비대 회귀 및 향상된 확장기 기능에 대한 증거와 CVD에 대한 위험 요소를 감소에 bariatric 수술의 장점을 나타냅니다15. 비만/대사 수술은 비만 당뇨병 환자의 전통적인 CVD 위험 요소를 향상시킬 수 있으며, 10년 CHD 및 치명적인 CHD 위험은 T2D4를가진 비만 환자에서 다양한 bariatric/metabolic 수술 후 최대 50%까지 감소되는 것으로 나타났습니다.

Bariatric 수술은 비만을 위한 가장 효과적인 장기 치료 전략입니다. 지질 프로파일, 염증성 바이오마커, 혈압 및 심부전과 같은 비만 수술에서 대사 파라미터의 현저한 개선은 특히 예기치 않은 유형 2 당뇨병 조절에서 주목된다. SG는 지방 조직 염증 및 발달을 감소시키고 수정했으며 죽상 동맥 경화증 위험을 감소시켰습니다.

위장 호르몬의 변화는 장기 체중 조절에 역할을 할 수 있습니다16,,17. SG는 또한 칼로리 섭취량을 줄이고 혈당조절(18)을정상화했다. 위 우회 수술 관련 혈당 내성 효과는 현재이론(19)으로부터근위장좌를 우회하여 발생한 전경 호르몬 효과와 관련이 있다. 그러나, SG는 유사한 항당뇨 효과를 입증하여 글루카곤과 같은 펩타이드 1수용체16,20의효과를 넘어서도 추가비 우회 관련 알 수 없는 메커니즘을 시사한다. Lopez 외. SG체중 감소를 촉진, 콜레스테롤 및 포도 당 프로필을 향상, 렙틴 무감각, 그리고 인슐린 저항을 감소, 비만 주커 쥐에 ghrelin 수준 변화와 는 무관한 (21). 이 모든 위의 문제는 당뇨병, 비만 및 질병과의 연결을 명확히하기 위해 추가 동물 연구가 필요합니다. SG는 장 우회를 포함하지 않는 bariatric 절차입니다, 이는 미국에서 최근 수십 년 동안 점점 더 인기를 끌고있다 전 세계적으로 낮은 장기 합병증으로 인해22.

bariatric 외과 절차는 높은 외과 사망률 및 장기 합병증으로 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸리며 작은 동물 실험을위한 주요 중요한 단계입니다. SG는 현재 높은 효과, 낮은 동시 병, 낮은 사망률을 가진 간단한 절차 이기 때문에 미국에서 체중 감소를 위한 가장 많이 사용되는 수술입니다. 이 프로토콜은 인간에서 일상적으로 실행 되는 체중 감소 및 신진 대사 수술을 모방 비슷한 장점이 있다. 일반적으로, 외과 기술은 작은 바디 크기 때문에 마우스에서 아주 어렵고, 해부 현미경은 수시로 높은 외과 사망을 필요로 합니다.

Schlager 등은 위장용 핸드 바느질 클로저 대신 수술 용 클립 응용 프로그램을 갖춘 SG의 마우스 모델을 개발했습니다. 이 동물 모델은 체중 감소 및 포도당 조절의 유사한 효과를 입증했지만 중요한 췌장 축전 세포증식(10)을밝히지 못했다. 이 마우스 모형에서 물질 대사에 이 효력은 아주 낮은 수술 사망률을 가진 인간 bariatric/신진 대사 수술과 유사합니다.

이 현재 연구는 향상된 당화 헤모글로빈, IPGTT, HOMA-IR (인슐린 저항을 위한 동종성 모델 평가) 및 콜레스테롤 수준을 가진 HFD 공급 마우스에 있는 SG 후에 일정한 중량 감소를 보여줍니다. 이 외과 적 절차는 마우스에서 안전하고 쉽게 수행 할 수 있습니다.

우리의 실험실에 있는 이 프로토콜의 외과 생존율은 학습 기간 후에 약 90%이고, 절차는 15 분 미만이 걸립니다. 이 프로토콜은 수술 타당성, 안전, 재현성 및 임상 관련성을 가진 미래의 작은 설치류 연구에서 상당한 가치를 제공할 수 있습니다. 이 방법은 또한 인간에 있는 bariatric 수술 후에 관찰된 생리적인 변경을 강조하기 위하여 이용될 수 있습니다. SG 수술의 어려움은 동물 연구의 성공에 중요한 요인을 재생합니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고, 일반적으로 다른 동물 및 인간 연구에서 실행되는 SG를 모방.

이 동물 모형은 슬리브 위절제술을 가진 간단한 외과 절차를 사용하여 당뇨병과 비만의 임상 관련성을 조사할 수 있습니다. 이러한 절차는 수술 시간을 단축하고 수술 생존율을 향상시킬 수 있습니다. 이 연구의 주요 장점은 간단한 수술 모델을 사용하여 인간 환자에서 bariatric 수술의 임상 결과를 모방하는 것입니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

영어 내레이션에 대한 미스 이사벨 루에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% normal saline China Chemical & Pharmaceutical Co., Ltd.
5-0 monofilament suture Shineteh Inc. Taiwan Ethicon
Alm Shineteh Inc. Taiwan ST-A072PK UNIK
Animal Anesthesia Step Technology 0712VAP11076 Matrx
Barraqer-Troutman forceps Shineteh Inc. Taiwan ST-N309(H-4410) UNIK
cefazolin Taiwan veteran pharmacy company
Chow diet Research Diets
Glucose strips and glucometer BeneCheck BKM13-1 BeneCheck
HbA1c kit Level OKEH00661
Hematology system Fuji FUJI DRI-CHEM 4000i Europe
High Fat diet Research Diets 1810724 LabDiet
Iris Forceps Shineteh Inc. Taiwan ST-1210 UNIK
Iris Scissors Shineteh Inc. Taiwan ST-S011 UNIK
Isoflurane Panion & BF biotech INC 8547 Panion & BF
Ketoprofen Sigma 22071154 Sigma-Aldrich
Stereo microscope MicroTech SZ-5T MicroTech
Surgical clip (M) Echicon Inc., Somerville, NJ Size M, 5mm
Vidisic gel Dr. Gerhard Mann Chem.-pharm. Fabrik GmbH

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References

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Wei, J. H., Yeh, C. H., Lee, W. J., Lin, S. J., Huang, P. H. Sleeve Gastrectomy in Mice using Surgical Clips. J. Vis. Exp. (165), e60719, doi:10.3791/60719 (2020).More

Wei, J. H., Yeh, C. H., Lee, W. J., Lin, S. J., Huang, P. H. Sleeve Gastrectomy in Mice using Surgical Clips. J. Vis. Exp. (165), e60719, doi:10.3791/60719 (2020).

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