Summary
A prevalência de diabetes e obesidade está aumentando continuamente em todo o mundo. Os mecanismos entre diabetes, obesidade e sua mortalidade associada e co-morbidades precisam ser mais aprofundados. Aqui, apresentamos um protocolo para gastrectomia de manga (SG) em animais como um modelo pré-clínico descomplicado da cirurgia bariátrica.
Abstract
O número de pessoas com sobrepeso e obesidade está aumentando continuamente tanto nas populações adultas quanto adolescentes. Isso coincide com o aumento do fenômeno universal do diabetes tipo 2 (T2D) e outros problemas metabólicos. A cirurgia bariátrica, como a SG, é atualmente um dos tratamentos de longo prazo mais eficazes e comumente utilizados para obesidade e T2D, mas a associação entre eles ainda não é completamente explorada. Os mecanismos subjacentes aos desfechos observados após a cirurgia bariátrica em humanos podem ser investigados com base em estudos pré-clínicos em animais. O SG reduz o peso corporal, os níveis de glicose e muitos parâmetros metabólicos, e é fácil de realizar com uma baixa incidência de complicações. O objetivo deste trabalho é fornecer um método simples e um modelo pré-clínico descomplicado de cirurgia bariátrica em animais para pesquisadores.
Introduction
A prevalência de obesidade aumentou quase três vezes em todo o mundo desde 1975. Em 2016, mais de 1,9 bilhão de adultos com mais de 18 anos estavam acima do peso e mais de 650 milhões de adultos eram obesos. A prevalência de T2D na população adulta também dobrou de 4,7% para 8,5%, com o número subindo de 108 milhões para 422 milhões de adultos entre 1980 e 2014 globalmente1. A maioria das cirurgias bariátricas resulta em perda significativa de peso, redução da gordura corporal e melhora na tolerância à glicose, resistência à insulina e controle do diabetes2. Além da perda de peso e remissão do T2D, a cirurgia bariátrica produz ainda mais vantagens para a saúde, como o controle da hipertensão arterial e a menor incidência de certos tipos de obesidade relacionada ao desenvolvimento e progressão do câncer3. A cirurgia bariátrica também induz a remissão total e parcial durável do T2D, e diminui o risco de doença cardíaca coronariana grave (ACS) de dez anos e algum grau de risco cefalorraquidcular. No entanto, os mecanismos subjacentes não são completamente compreendidos4.
Existem vários procedimentos para cirurgia bariátrica/metabólica. Cirurgias restritivas e gastrointestinais de bypass fornecem efeitos positivos no metabolismo5. Dos modelos cirúrgicos bariátricos, SG e bypass gástrico Roux-en-Y modificados têm maior sucesso e menores taxas de mortalidade e demonstram modelos de cirurgia de bypass restritivos e gastrointestinais confiáveis em camundongos6. Embora a cirurgia de bypass gastrointestinal proporcione mais perda de peso e uma melhora significativa da tolerância à glicose e da esteatose hepática do que o procedimento restritivo a longo prazo, o SG ainda produz um bom controle dos níveis de peso corporal e glicose e é fácil de realizar com baixa incidência de complicações6. A proporção de SG aumentou de 30% para 54% e a cirurgia de bypass gástrico Roux-en-Y diminuiu de 52% para 32% de 2008 a 20147. Atualmente, o SG laparoscópico é o procedimento bariátrico mais comumente realizado em nível nacional dentro de centros acadêmicos nos Estados Unidos8. Embora tenha havido muitos relatos publicados sobre os processos fisiodicosiológicos entre cirurgia bariátrica, diabetes e obesidade, precisamos de mais experimentos em animais para explorar ainda mais mecanismos desconhecidos.
Este protocolo visa produzir um método animal para investigar os mecanismos subjacentes aos desfechos vistos após a cirurgia bariátrica em humanos. O presente estudo translacional pode fornecer insights sobre o mecanismo da obesidade e do tratamento T2D do SG.
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Protocol
Todos os procedimentos para uso de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Yang-Ming e cumpriram o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 8ª edição, 2011". O procedimento anestésico foi realizado de acordo com a diretriz para o controle da dor, anestesia, pré-operatório e pós-operatório para os animais experimentais da Universidade Nacional Yang Ming, ICAUC-016, 2015,1ª edição.
1. Preparação animal
- Obtenha 20 camundongos machos C57BL/6 machos de 8 semanas de idade do National Laboratory Animal Center (NLAC) que pesam em torno de 16-18 gramas. Atribua aleatoriamente esses ratos ao SG ou ao grupo de operação falso com 10 ratos cada.
- Inicie os camundongos em chow ou uma dieta rica em gordura (ver Arquivo Suplementar) antes das cirurgias bariátricas ou falsas9. Produzir obesidade induzida por dieta com pelo menos 2 semanas pré-operatórias do HFD.
- Abriga os ratos no National Yang-Ming University Laboratory Animal Center sob um ciclo claro-escuro de 12:12 com início claro às 07:00 A.M. e permite a alimentação gratuita para a comida e água de roedores padrão.
- Restringir todos os animais da comida, mas permitir acesso gratuito à água na noite anterior à cirurgia.
2. Preparação pré-operatória geral
- Acelere os ratos por pelo menos 6 horas antes da cirurgia. Induzir anestesia em uma câmara de indução com 5% de isoflurano e oxigênio (ambos 3-4 L/min).
- Verifique a profundidade da anestesia garantindo que a estimulação da pitada (micro-fórceps lisos serrilhados sem cortes) da pata traseira, da pata dianteira e do ouvido não evoca nenhum reflexo motor. Administre antibióticos (25 mg/kg cefazolin) através de injeções subcutâneas antes da operação.
- Atribua uma determinada zona de trabalho para procedimentos cirúrgicos. Limpe a área cirúrgica e pulverize a mesa cirúrgica com 75% de solução alcoólica antes de uma operação.
- Coloque o rato no cone do nariz e mantenha a anestesia com 2% de isoflurano (2 L/min) e oxigênio (4 L/min).
- Para gastrectomia de manga e operação falsa, depois de confirmar a profundidade adequada da anestesia por estimulação do dedo do pé, aplique o gel de olho carbomer de 0,2% nos olhos do rato para evitar olhos secos.
- Use uma navalha elétrica para raspar o cabelo do abdômen para o esterno. Retire e limpe o cabelo restante com um creme depilatório. Coloque e fixe o mouse sobre a mesa cirúrgica em uma posição supina.
- Desinfete a parede abdominal do camundongo com soluções de povidona-iodo alternando com 75% de álcool para 3 aplicações.
3. Gastrectomia de manga e procedimentos falsos
- Laparotomia mediana
- Use uma micro-tesoura para fazer uma incisão midline de 1-1,5 cm de comprimento no abdômen superior.
- Externalização do estômago e intestino
- Realize o procedimento SG com o auxílio de um microscópio ou lupa de dissecação de ampliação, conforme necessário para evitar o sangramento imprevisível e o choque hipovolêmico.
- Use dois micro-fórceps serrilhados lisos curvos para mover suavemente o estômago e externalizá-lo completamente.
- Divida cuidadosamente o ligamento gastrosplenico que liga o estômago esquerdo ao baço usando uma sonda de ponta de algodão e eletrocauteria conforme necessário, dissecando assim o fundo gástrico do baço circundante e outros órgãos internos.
4. Isolamento estomacais e clipe
NOTA: O SG para ratos foi realizado utilizando a nova técnica de aplicador de clipes como publicado anteriormente10.
- Estique o fundus e o pilão do estômago suavemente e lateralmente com fórceps, identifique a linha média (Figura 1 e Figura 2), e aplique cuidadosamente clipes cirúrgicos em metade do lado medial da linha média do estômago a partir da junção gastroesofágica inferiormente e o polo inferior superiormente. Grampo e exclua cerca de 75-80% do estômago, criando assim toda a manga lateral do estômago(Figura 1 e Figura 2).
- Mova o intestino para a pele nua ao lado e cubra-o com uma gaze salina-salina e realize a hidratação intraperitoneal conforme necessário para evitar desidratação e hipotermia.
- Ressele o estômago cortado lateralmente, remova a manga excluída do estômago com microscisores e, em seguida, esterilize a borda cortada do estômago com solução povidone-iodo.
- Sobreaia a linha de clipe com uma sutura nãoabsorbável de monofilamento 5-0 para garantir que não haja vazamento. Nó as extremidades da sutura e ancorar nos clipes em cada extremidade.
- Devolva o estômago e o intestino para a posição adequada na cavidade abdominal e feche o abdômen com uma sutura contínua e descontínua contínua e descontínua de 5-0 para a fáscia e parede abdominal.
- Administre analgésicos com cetoprofeno (2-5 mg/kg) e antibióticos com cefazolina (25 mg/kg) intraperitoneally após todo o procedimento.
5. Procedimento falso de SG
- Realize um procedimento semelhante ao descrito anteriormente com uma laparotomia de linha média, e externalize o intestino e o estômago usando cobertura de gaze salina quente molhada de 37 °C por 5 minutos.
- Devolva o estômago e o intestino aos locais apropriados desses órgãos internos.
- Feche a parede abdominal cuidadosamente como descrito anteriormente com 2 camadas de fechamento contínuo e descontínuo para a fáscia e pele usando suturas de monofilamento lentas ou não absorvíveis. Administre analgésicos com cetoprofeno (2-5 mg/kg) e antibióticos com cefazolina (25 mg/kg) intraperitoneally após todo o procedimento.
6. Atendimento geral pós-operatório
- Pare isoflurane e continue com um fluxo de ar de 3-5 L/min até que o mouse esteja totalmente acordado.
- Continue observando o rato enquanto ele recupera a mobilidade e começa a andar ao redor da gaiola.
- Coloque o mouse em uma incubadora independente de 30 °C por 5 dias. Certifique-se de que há apenas um rato por gaiola para evitar que os ratos se feram.
- Retorne ao acesso gratuito a um alimento diet gel (dieta de gel de alta gordura: 10% banha, 10% açúcar líquido, 57% água) por 3 dias após a cirurgia e reintroduza a dieta anterior atribuída 3 dias após a cirurgia.
- Injete subcutâneamente ou intraperitonealmente cetoprofeno (2-5 mg/kg) e cefazolina (25 mg/kg) por 1 dia após a operação.
- Avalie o peso corporal do camundongo semanalmente durante todo o período de estudo. Forneça cetoprofeno (2-5 mg/kg) por injeção intraperitoneal para controle da dor uma vez por dia, conforme necessário, se o animal estiver em perigo após a operação.
NOTA: Aqui, a taxa de sobrevivência do SG foi de 90% após o período de aprendizagem.
7. Avaliação do parâmetro metabólico
- Camundongos rápidos por 6h, e pegue amostras de sangue de linha de base (0 min). Obtenha todas as amostras de sangue da ponta da veia da cauda de camundongos em movimento livre11,12.
- Entregar 1 mg/g de 50% dextrose por injeção intraperitoneal para o teste de tolerância à glicose.
- Meça a glicemia das pontas das veias traseiras de camundongos em movimento livre em 0, 5, 15, 30, 60 e 120 min após a administração da glicose em amostras duplicadas usando glucometers e tiras de teste.
- Mantenha toda a amostra de sangue (n = 10 para cada grupo) em temperatura ambiente com coagulação por 30 minutos.
- Centrifugar a amostra de sangue a 3.000 x g durante 10 minutos a 4 °C.
- Transfira o plasma para tubos separados sem perturbar coágulos sanguíneos e armazene a -80 °C.
- Estude as amostras de plasma no final do estudo usando kits de ELISA de camundongos comerciais para hemoglobina A1c (HBA1c), glicose, colesterol e insulina de acordo com as diretrizes do fabricante.
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Representative Results
Os resultados da operação são mostrados na Figura 3 e Figura 4. A taxa de sobrevivência do estudo foi de 90%. Um rato morreu no grupo falso por causa da fraqueza e outro rato morreu no grupo SG no terceiro dia após a operação por razões desconhecidas. Os resultados obtidos na perda de peso (Figura 3A) após a operação (na semana 3) em camundongos alimentados com HFD foram bastante semelhantes aos observados em humanos, com uma perda final de peso corporal de cerca de 15-20%13. O estudo também demonstrou que o nível de colesterol (Figura 3B) diminuiu significativamente após a cirurgia de SG no HFD alimentado por camundongos.
Melhor sensibilidade à insulina e tolerância à glicose foram observadas logo após a cirurgia por um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT). No presente estudo, demonstramos que a obesidade induzida pelo HFD evocava resistência à insulina e intolerância à glicose em camundongos do tipo selvagem C57BL/6 e pode ser corrigida por SG. Após a SG, a resistência à insulina, glicose e lipídios melhoraram neste estudo.
Figura 1: Procedimentos cirúrgicos de SG.
(A) O clipe cirúrgico de 5 mm utilizado neste modelo experimental. (B) Verifique a profundidade da anestesia com estimulação de beliscar. (C,D) Aplique o clipe na metade do lado medial da linha média do estômago a partir da junção gastroesofágica inferior e inferior do polo superiormente. (E) Esterilize e suture a borda cortada do estômago para garantir que não haja vazamento. (F-H) Hidrate os camundongos com soro fisiológico quente, devolva o estômago e o intestino de volta ao local adequado na cavidade abdominal. Feche a cavidade abdominal cuidadosamente. Recupere-se do estado de anestesia na câmara de indução e retorne à gaiola quando a condição estiver totalmente recuperada e estabilizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Locais de uso de clipe cirúrgico no estômago. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O efeito do SG sobre (A) semanalmente o peso corporal muda e (B) nível de colesterol.
Os dados são representados como média ± SD. *P < 0,05; **P < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeito de SG sobre (A) IPGTT (B) Hba1c e (C) HOMA-IR no final do estudo.
(n = 5 VSG; n = 7 sham); Os dados são representados como média ± SD. *P < 0,05; **P < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A maioria dos estudos prospectivos de coorte confirmaram que o aumento do índice de massa corporal está relacionado ao aumento da mortalidade. A obesidade está associada a maior risco de diabetes, doenças cardiovasculares (DCV) e morte em ambos os sexos. Os processos patológicos específicos estabeleceram uma ligação entre diabetes, obesidade e mortalidade14. As revisões sistemáticas indicam os benefícios da cirurgia bariátrica na redução de fatores de risco para DCV com evidência de regressão de hipertrofia ventricular e melhora da função diastólica, bem como15. A cirurgia bariátrica/metabólica pode melhorar os fatores tradicionais de risco de DCV em pacientes diabéticos obesos, e o estresse de 10 anos e o risco fatal de CHD mostraram-se reduzidos em até 50% após vários procedimentos cirúrgicos bariátricos/metabólicos em pacientes obesos com T2D4.
A cirurgia bariátrica é a estratégia terapêutica de longo prazo mais eficaz para a obesidade. As melhorias significativas dos parâmetros metabólicos da cirurgia bariátrica, como perfil lipídicos, biomarcadores inflamatórios, pressão arterial e insuficiência cardíaca também são notadas especialmente no controle diabético tipo 2 inesperado. A SG reduziu e modificou a inflamação e desenvolvimento do tecido adiposo e possivelmente reduziu o risco de aterosclerose.
Alterações de hormônios gastro-intestinais podem desempenhar um papel no controle de peso a longo prazo16,17. O SG também reduziu a ingestão calórica e normalizou o controle glicêmico18. Os efeitos de tolerância glicêmico relacionados à cirurgia de bypass gástrico estão relacionados aos efeitos hormonais foregut evocados contornando o intestino proximal das teorias atuais19. No entanto, o SG demonstrou o efeito antidiabético comparável, sugerindo outros mecanismos desconhecidos não contornando, mesmo além do efeito do peptídeo 11 1 16,,20. Lopez et al. mostraram que a SG promove a perda de peso, melhora o perfil de colesterol e glicose, a insensibilidade da leptina e diminui a resistência à insulina, que é independente das mudanças no nível de grelina nos ratos zucker obesos21. Todas essas questões acima precisam de estudos em animais para esclarecer a conexão com diabetes, obesidade e doenças. SG é um procedimento bariátrico que não envolve bypass intestinal, que se tornou cada vez mais popular nas últimas décadas nos EUA e globalmente devido a complicações de longo prazobaixas 22.
O procedimento cirúrgico bariátrico é tecnicamente difícil e demorado com alta mortalidade cirúrgica e complicação a longo prazo e é o principal passo crítico para pequenos experimentos em animais. O SG é atualmente a cirurgia mais utilizada para redução de peso nos EUA porque é um procedimento simples com alta eficácia, baixa co-morbidade e baixa mortalidade. Este protocolo tem vantagens semelhantes imitando a redução de peso e cirurgias metabólicas praticadas rotineiramente em humanos. Em geral, as técnicas cirúrgicas são bastante difíceis em camundongos devido ao pequeno tamanho do corpo, e um microscópio dissecando é frequentemente necessário com alta mortalidade cirúrgica.
Schlager et al. desenvolveram um modelo de mouse de SG com uma aplicação de clipe cirúrgico em vez de um fechamento costurado à mão para o estômago. Este modelo animal demonstrou efeitos semelhantes da redução do peso corporal e do controle da glicose, mas não revelou uma proliferação significativa de células de ilhotas pancreáticas10. Este efeito no metabolismo deste modelo de camundongos é semelhante à cirurgia bariátrica/metabólica humana com uma mortalidade operatória muito baixa.
Este estudo atual demonstra a redução constante de peso após o SG no HFD alimentar camundongos com hemoglobina glicada melhorada, IPGTT, HOMA-IR (avaliação do modelo homeostático para resistência à insulina) e nível de colesterol. Este procedimento cirúrgico é seguro e fácil de realizar em camundongos.
A taxa de sobrevivência cirúrgica deste protocolo em nosso laboratório é de cerca de 90% após um período de aprendizagem, e o procedimento leva menos de 15 minutos. Este protocolo pode fornecer valor significativo em futuros estudos de pequenos roedores com viabilidade cirúrgica, segurança, reprodutibilidade e relevância clínica. Este método também pode ser usado para destacar alterações fisiológicas observadas após cirurgia bariátrica em humanos. A dificuldade da cirurgia de SG desempenha um fator importante no sucesso dos estudos em animais. Este protocolo é fácil de executar, e imita o SG como comumente praticado em outros estudos animais e humanos.
Este modelo animal pode investigar a relevância clínica do diabetes e da obesidade usando um breve procedimento cirúrgico com gastrectomia de manga. Esses procedimentos podem encurtar o tempo de operação e melhorar a taxa de sobrevivência cirúrgica. A principal vantagem deste estudo é imitar os desfechos clínicos da cirurgia bariátrica em pacientes humanos utilizando um modelo cirúrgico simples.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos à Srta. Isabelle Lu pela narração inglesa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% normal saline | China Chemical & Pharmaceutical Co., Ltd. | ||
| 5-0 monofilament suture | Shineteh Inc. Taiwan | Ethicon | |
| Alm | Shineteh Inc. Taiwan | ST-A072PK | UNIK |
| Animal Anesthesia | Step Technology | 0712VAP11076 | Matrx |
| Barraqer-Troutman forceps | Shineteh Inc. Taiwan | ST-N309(H-4410) | UNIK |
| cefazolin | Taiwan veteran pharmacy company | ||
| Chow diet | Research Diets | ||
| Glucose strips and glucometer | BeneCheck | BKM13-1 | BeneCheck |
| HbA1c kit | Level | OKEH00661 | |
| Hematology system | Fuji | FUJI DRI-CHEM 4000i | Europe |
| High Fat diet | Research Diets | 1810724 | LabDiet |
| Iris Forceps | Shineteh Inc. Taiwan | ST-1210 | UNIK |
| Iris Scissors | Shineteh Inc. Taiwan | ST-S011 | UNIK |
| Isoflurane | Panion & BF biotech INC | 8547 | Panion & BF |
| Ketoprofen | Sigma | 22071154 | Sigma-Aldrich |
| Stereo microscope | MicroTech | SZ-5T | MicroTech |
| Surgical clip (M) | Echicon Inc., Somerville, NJ | Size M, 5mm | |
| Vidisic gel | Dr. Gerhard Mann Chem.-pharm. Fabrik GmbH |
References
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