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Developmental Biology

फ्लोरोसेंट कैल्शियम इमेजिंग और उसके बाद सिटू संकरण में ज़ेनोपस लेवेइस में न्यूरोनल अग्रदूत लक्षण वर्णन के लिए

Published: February 18, 2020 doi: 10.3791/60726
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 5, 5, 2
1Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School, Harvard University, 2Department of Biology, College of William and Mary, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Department of Bioengineering, California Institute of Technology, 5Department of Computer Science, College of William and Mary

Summary

हम एक दो भाग प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट कैल्शियम इमेजिंग को जोड़ती है, जिससे प्रयोगकर्ता को एकल-कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ कैल्शियम गतिविधि के पैटर्न को सहसंबंधित करने की अनुमति मिलती है।

Abstract

सहज इंट्रासेलुलर कैल्शियम गतिविधि विभिन्न प्रकार के कोशिका प्रकारों में देखी जा सकती है और विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाने का प्रस्ताव है। विशेष रूप से, भ्रूण के दौरान कैल्शियम गतिविधि पैटर्न का उचित विनियमन कशेरुकी तंत्रिका विकास के कई पहलुओं के लिए आवश्यक है, जिसमें उचित तंत्रिका ट्यूब बंद होना, सिनैप्टोजेनेसिस और न्यूरोट्रांसमीटर फेनोटाइप विनिर्देश शामिल हैं। जबकि अवलोकन है कि कैल्शियम गतिविधि पैटर्न दोनों आवृत्ति और आयाम में अलग कर सकते है एक सम्मोहक तंत्र है जिसके द्वारा इन प्रवाह डाउनस्ट्रीम प्रभावकों को इनकोडेड संकेतसंचारित और जीन अभिव्यक्ति को विनियमित कर सकते है पता चलता है, मौजूदा जनसंख्या स्तर के दृष्टिकोण में इस संभावना का पता लगाने के लिए आवश्यक परिशुद्धता का अभाव है । इसके अलावा, ये दृष्टिकोण सेल-सेल संपर्क के अभाव में न्यूरोनल दृढ़ संकल्प की स्थिति को परखने की क्षमता को पहले से ही सेल-सेल इंटरैक्शन की भूमिका के अध्ययन को सीमित करते हैं। इसलिए, हमने एक प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह की स्थापना की है जो सिटू संकरण परख में फ्लोरोसेंस के साथ डिसोसिएट न्यूरोनल एक्सप्लांट्स के समय-चूक कैल्शियम इमेजिंग को जोड़ता है, जिससे आणविक के साथ कैल्शियम गतिविधि पैटर्न के स्पष्ट सहसंबंध की अनुमति होती है सिंगल-सेल स्तर पर फेनोटाइप। हम क्रमशः तंत्रिका कोशिकाओं और तंत्रिका जनक कोशिकाओं में अंतर से जुड़े विशिष्ट कैल्शियम गतिविधि पैटर्न को अलग करने और चित्रित करने के लिए इस दृष्टिकोण का सफलतापूर्वक उपयोग करने में सक्षम थे; इससे परे, हालांकि, इस लेख में वर्णित प्रायोगिक ढांचे को किसी भी समय-श्रृंखला गतिविधि प्रोफ़ाइल और जीन या ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति के बीच सहसंबंधों की जांच करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

मुफ्त साइटोसोलिक कैल्शियम विभिन्न प्रकार की जैविक प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें कोशिका प्रसार और प्रवास से लेकर एपोप्टोसिस और ऑटोफैगी1,2,3तक शामिल हैं। इन रास्तों के भीतर, कैल्शियम प्रोटीन गतिविधि और बातचीत को मिलाने वाले प्रवक्ता परिवर्तनों को प्रेरित करने के लिए कैल्शियम-बाध्यकारी डोमेन के साथ बातचीत करके जीन अभिव्यक्ति पर डाउनस्ट्रीम प्रभाव डाल सकता है। उदाहरण के लिए, एक न्यूरोनल कैल्शियम सेंसर जिसे डाउनस्ट्रीम रेगुलेटरी एलिमेंट विरोधी मॉड्यूलेटर (ड्रीम) के नाम से जाना जाता है, कैल्शियम से बंधे होने पर एक सामने आया मध्यवर्ती संरचना में आयोजित किया जाता है, जो इसे अपने प्रोटीन और डीएनएलक्ष्य4के साथ बातचीत करने से रोकता है। एक साधारण संकेत अणु के रूप में सेवा करने से परे, हालांकि, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम ट्रांसिएंट्स की गतिशील प्रकृति इन गतिविधि पैटर्न को अधिक जटिल आयाम-या आवृत्ति आधारितसंकेतों कोएन्कोड करने की अनुमति देती है5,6। सक्रिय टी-कोशिकाओं (NFAT) के प्रतिलेखन कारक परमाणु कारक के परमाणु स्थानांतरण उच्च आवृत्ति कैल्शियम दोलनों द्वारा बढ़ाया जाता है, लेकिन कम आवृत्ति दोलन ों से बाधित7। मजबूर, हाल के काम का सुझाव दिया है कि NFAT वास्तव में संचयी कैल्शियम एक्सपोजर8के लिए उत्तरदायी हो सकता है । कैल्सिनेरिन और सीए2 +/calmodulin-निर्भर प्रोटीन किनेज II (CaMKII) दोनों भी एक विशिष्ट आवृत्ति, अवधि, या आयाम9के कैल्शियम यात्रियों के लिए अलग प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं । नियामक जटिलता का एक अतिरिक्त स्तर जोड़ने के लिए, कम्प्यूटेशनल मॉडल का सुझाव है कि कई डाउनस्ट्रीम कैल्शियम-बाध्यकारी प्रोटीन बाध्यकारी प्रतियोगियों की उपस्थिति या अनुपस्थिति के जवाब में कम या ज्यादा आवृत्ति-निर्भर हो जाते हैं10,11।

विकासशील तंत्रिका तंत्र के भीतर, कैल्शियम गतिविधि व्यवहार के दो मुख्य वर्गों को परिभाषित किया गया है और विशिष्ट जैविक प्रक्रियाओं से जुड़ा हुआ है। कैल्शियम प्रवाह को "स्पाइक्स" के रूप में वर्गीकृत किया जाता है यदि वे व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर होते हैं, तो पांच सेकंड के भीतर बेसलाइन के ~ 400% की चोटी तीव्रता तक पहुंचते हैं, और डबल घातीय क्षय12प्रदर्शित करते हैं। इस प्रकार का संकेत मुख्य रूप से न्यूरोट्रांसमीटर फेनोटाइप स्पेसिफिकेशन13से जुड़ा हुआ है । इसके विपरीत, "तरंगों" को धीमी, कम चरम कैल्शियम यात्रियों के रूप में परिभाषित किया गया है जिसमें एक कोशिका की इंट्रासेलुलर कैल्शियम एकाग्रता तीस सेकंड या उससे अधिक की अवधि में बेसलाइन के ~ 200% तक बढ़ जाती है, फिर कई मिनट12पर क्षय हो जाती है। ये संकेत अक्सर कई पड़ोसी कोशिकाओं में प्रचारित होते हैं, और उनकी उपस्थिति न्यूराइट आउटग्रोथ और सेल प्रसार14,15से जुड़ी हुई है। हालांकि, हालांकि इन दो वर्गों को विशिष्ट गतिज प्रोफाइल के आधार पर परिभाषित किया गया है, यह स्पष्ट नहीं है कि वास्तव में इन पैटर्न की विशेषताओं का पता कोशिकाओं द्वारा लगाया जा रहा है और डाउनस्ट्रीम प्रभावकों द्वारा अनुवादित किया जा रहा है।

इंट्रासेल्युलर कैल्शियम दोलनों और जीन अभिव्यक्ति के बीच संबंधों को समझना नियामक तंत्र में से एक में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा जो तंत्रिका तंत्र के उचित विकास और पैटर्न को सुनिश्चित करता है। इस उद्देश्य के लिए, भ्रूणरी रीढ़ की हड्डी के अध्ययनों से पता चला है कि विकास के दौरान कैल्शियम स्पाइक गतिविधि में वृद्धि निरोधात्मक न्यूरॉन्स के उच्च स्तर से जुड़ी हुई है, जबकि कैल्शियम स्पाइक गतिविधि में कमी13उत्तेजक न्यूरॉन्स के उच्च स्तर से जुड़ी हुई है। हालांकि, इन जनसंख्या स्तर के परखों का उपयोग कैल्शियम गतिविधि को एकल कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के साथ संबद्ध करने के लिए नहीं किया गया है ।

एकल सेल के स्तर पर इन सवालों के पास पिछले काम पर कई अलग लाभ प्रदान करता है । एक के लिए, कई कोशिकाओं में कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने की क्षमता व्यक्तिगत रूप से एक थोक स्तर के माप द्वारा अस्पष्ट होने के बिना अलग गतिविधि पैटर्न के पूर्ण प्रदर्शनों की सूची मनाया जा करने की अनुमति देता है । इसके अतिरिक्त, एकल सेल प्राथमिक संस्कृति में इन संबंधों का अध्ययन करने का मतलब है कि कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति के बीच सेल स्वायत्त संबंधबनाए रखा जाएगा, जबकि सेल सेल संचार की आवश्यकता होती है बातचीत निरस्त किया जाएगा । इसलिए, यह दृष्टिकोण इन सेल-स्वायत्त तंत्रों को अलगाव में अध्ययन करने की अनुमति देता है। हालांकि, यह गैर-सेल-स्वायत्त कैल्शियम गतिविधि की भूमिका को स्पष्ट और पूछताछ करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को तंत्रिका प्लेट चरण में एक भ्रूण से विच्छेदित किया जा सकता है, जब तक भाई नियंत्रण तंत्रिका ट्यूब चरण तक पहुंचने तक सुसंस्कृत, और फिर उन कोशिकाओं की तुलना में जो तंत्रिका-ट्यूब-चरण भ्रूण से हौसले से विच्छेदित हो गए हैं। यह उन कोशिकाओं की सीधी तुलना की अनुमति देता है जिन्होंने सेल-सेल संचार को उन लोगों के लिए एक प्रमुख विकासात्मक अवधि में बनाए रखा था जिनमें सेल-सेल संचार को समाप्त कर दिया गया था।

पिछले प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों की सीमाओं को संबोधित करने की मांग में, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो व्यक्तिगत तंत्रिका जनक कोशिकाओं में कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति दोनों का आकलन करने में सक्षम होगा, जिससे बाद के भेदभाव कार्यक्रमों के साथ विशिष्ट गतिविधि पैटर्न के सहसंबंध को सुविधाजनक बनाया जा सकेगा। तंत्रिका ऊतक को तंत्रिका विकास के विभिन्न चरणों में ज़ेनोपस लेवेइस से विच्छेदित किया गया था, जो एकल कोशिकाओं में अलग हो गया था, और फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक की उपस्थिति में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से छवि था। लाइव सेल इमेजिंग के बाद, नमूने तय किए गए और एक जीन या ब्याज के आइसोफॉर्म की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरेसेंस के माध्यम से परख े । महत्वपूर्ण बात, व्यक्तिगत कोशिकाओं दोनों इमेजिंग प्रयोगों में ट्रैक किया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि एक सेल के कैल्शियम गतिविधि प्रोफ़ाइल और उसके जीन अभिव्यक्ति स्तर एक दूसरे के साथ जुड़ा हो सकता है(चित्रा 1)। यहां सूचित प्रोटोकॉल का उद्देश्य ज़ेनोपस लेवेइसमें भ्रूणीय तंत्रिका विकास में कैल्शियम गतिविधि पैटर्न और जीन अभिव्यक्ति के बीच संबंधों की जांच करना है । हालांकि, व्यापक प्रयोगात्मक ढांचे (एकल सेल समय पाठ्यक्रम इमेजिंग मछली और छवि सहपंजीकरण के बाद) को संशोधित किया जा सकता है और लगभग किसी भी सेल प्रकार, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और ब्याज के जीन पर लागू किया जा सकता है।

Protocol

पशुओं को शामिल करने वाले सभी काम विलियम एंड मैरी कॉलेज में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था।

1. पशु देखभाल और भ्रूण हैंडलिंग

  1. महिलाओं के लिए 600 यू और पुरुषों के लिए 400 यू की खुराक पर वयस्क ज़ेनोपस लेवेइस की पृष्ठीय लिम्फ थैली में मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन का प्रशासन करके प्राकृतिक संभोग को प्रेरित करें।
  2. इंजेक्शन के बाद, रात भर एक कमरे के तापमान होल्डिंग टैंक में कम से कम एक पुरुष और एक महिला मेंढक रखें। अंडा बिछाने आम तौर पर एचसीजी प्रशासन के बाद 9-12 घंटे शुरू होता है ।
  3. भ्रूण लीजिए। 2-4 मिन के लिए धीरे से 2% साइस्टीन (पीएच 8.0) के साथ धोने से Dejelly।
  4. 0.1x मार्क के संशोधित रिंगर के समाधान (एमएमआर) (100 एमएम एनएसीएल, 2 एमएम केसीएल, 1 एमएम एमजीएसओ4,2 एमएम सीएसीएल2,5 एमएम एचपीईएस, पीएच समायोजित 7.4-7.6) में भ्रूण 3x कुल्ला करें।
  5. भ्रूण को 100 मिमी ग्लास पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करें जिसमें 0.1 x एमएमआर और 50 μg/mL gentamycin हो। प्रति प्लेट 50-100 भ्रूण का घनत्व उपयुक्त है।
  6. 14 डिग्री सेल्सियस-22 डिग्री सेल्सियस पर व्यंजन इनक्यूबेट करें और भ्रूण को विकसित करने की अनुमति दें जब तक कि वे वांछित विकासात्मक चरण (एस) तक नहीं पहुंच जाते। समय-समय पर प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट के साथ निषेचित कोशिकाओं और परिगलित या असामान्य रूप से विकसित भ्रूण को हटा दें।
    नोट: निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए, Nieuwkoop और Faber16द्वारा परिभाषित रूपात्मक मानदंडों के अनुसार विकासात्मक मंचन किया जाता है । प्रयोगात्मक फोकस के आधार पर ब्याज के चरण अलग-अलग होंगे। उदाहरण के लिए, प्रमुख न्यूरोडेवलपमेंटल लैंडमार्क स्टेज 14 (न्यूरोयूरेशन की शुरुआत), स्टेज 18 (तंत्रिका ट्यूब बंद होने की शुरुआत), और स्टेज 22 (टेलबड विस्तार की शुरुआत) से जुड़े हुए हैं।

2. भ्रूण विच्छेदन और नमूना तैयारी

  1. समाधान की तैयारी
    1. 2 एमएम सीए2+ समाधान तैयार करें जिसमें 116 एमएम एनसीएल, 0.67 एमएम केसीएल, 2 एमएम सीएसीएल2·2एच2ओ, 1.31 एमएम एमजीएसओ4और 4.6 एमएम ट्रिस शामिल हैं। हर १०० मीटर समाधान के लिए, पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०,००० यू/एमएल पेनिसिलिन; १०,००० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन) का 1 एमएल जोड़ें । पीएच को 7.8 में समायोजित करें और फ़िल्टर-स्टरलाइज करें।
    2. 116 एमएम एनएसीएल, 0.67 एमएम केसीएल, 4.6 एम ट्राई और 0.4 एम ईटीए को मिलाकर कैल्शियम और मैग्नीशियम-फ्री (सीएमएफ) समाधान तैयार करें। पीएच को 7.8 में समायोजित करें और नसबंदी करने के लिए ऑटोक्लेव करें। हर १०० मीटर समाधान के लिए, पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०,००० यू/एमएल पेनिसिलिन; १०,००० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन) का 1 एमएल जोड़ें । पीएच को 7.8 में समायोजित करें और फ़िल्टर-स्टरलाइज करें।
  2. विच्छेदन और इमेजिंग के लिए प्लेटों की तैयारी
    1. यूवी-स्टरलाइज दो 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री व्यंजन और एक 35 मिमी सेल कल्चर डिश (सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. लैमिनार फ्लो हुड में काम करते समय, 2 एमएम सीए2 + समाधान प्रत्येक के 10 मिलील वाले दो 50 मिलील प्लास्टिक शंकुट्यूब तैयार करें।
    3. लैमिनार फ्लो हुड में काम करते रहें और एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में 2 एमएम सीए2+ समाधान के 2 mL, 2 mM Ca2+ समाधान के लिए एक 35 मिमी सेल कल्चर डिश, और एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए सीएमएफ समाधान के 2 एमएल जोड़ें।
    4. लैमिनार फ्लो हुड के बाहर, जेंटामाइसिन (50 μg/mL) के साथ 0.1 x एमएमआर के साथ दो 100 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश और 1 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश भरें। 70% इथेनॉल के साथ 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश भरें।
    5. विच्छेदन से तुरंत पहले, सीए2 + समाधान वाले 50 मिलीग्राम ट्यूबों में से एक में कोलेजेनेज़ बी के 0.01 ग्राम जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और समाधान को एक ताजा 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप की मदद से, वांछित विकासात्मक चरण के भ्रूण की पहचान करें। चरण 2.2.4 में तैयार 0.1 x एमएमआर + जेंटामाइसिन युक्त 100 मिमी प्लेटों में से एक को कम से कम छह उपयुक्त भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें। यह होल्डिंग प्लेट का काम करेगा।
  4. 0.1 x एमएमआर + gentamycin युक्त दूसरी 100 मिमी प्लेट के लिए एक भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग करें। यह विच्छेदन प्लेट के रूप में काम करेगा।
    1. यदि भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त पुराना है (लगभग चरण 23 या पुराने), यह 0.1% 3-अमीनोबेंजोइक एसिड एथिल एस्टर से युक्त एक डिश को स्थानांतरित करके विच्छेदन से पहले प्रत्येक भ्रूण को एनेस्थेटाइज करें, जिसमें gentamycin (50 μg/mL) के साथ 0.1x एमएमआर में पतला हो गया है। एक बार भ्रूण स्थिर हो जाने के बाद, इसे जेंटामाइसिन (50 μg/mL) के साथ 0.1x एमएमआर युक्त पकवान में वापस स्थानांतरित करें और विच्छेदन जारी रखें।
  5. भ्रूण को घेरने वाली विटेलिन झिल्ली को सावधानी से हटा दें। झिल्ली को समझने के लिए ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करते समय भ्रूण को स्थिर करने के लिए कुंद संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके यह सबसे आसानी से किया जा सकता है। ध्यान से ठीक संदंश के साथ खींचने के लिए vitelline झिल्ली के अलावा छील ।
  6. भ्रूण के पृष्ठीय और वेंट्रल क्षेत्रों को अलग करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें। यह पूर्वकाल-पीछे की धुरी के साथ भ्रूण को 'चुटकी' करने के लिए संदंश का उपयोग करके किया जा सकता है, इसे आधे में काट सकता है। बाँझ हस्तांतरण पिपेट के साथ, पृष्ठीय भाग को चरण 2.2.5 में तैयार कोलेजेनेज़ समाधान के साथ 60 मिमी प्लेट में स्थानांतरित करें। वेंट्रल भाग को त्यागें।
  7. कमरे के तापमान पर 1-2 न्यूनतम के लिए कोलेजेनेज़ समाधान में इनक्यूबेट करने के लिए पृष्ठीय एक्सप्लांट की अनुमति दें। धीरे-धीरे इसे विच्छेदन प्लेट में वापस स्थानांतरित करें।
  8. एक्टोडर्म के प्रकल्पित तंत्रिका ऊतक से सभी अवशिष्ट एंडोडरमल और मेसोडरमल संदूषण को सावधानीपूर्वक हटाकर विच्छेदन को पूरा करें। स्टेज 22 या उससे अधिक समय पर भ्रूण के लिए, तंत्रिका ट्यूब को भी हटा दिया जाना चाहिए और त्याग दिया जाना चाहिए।
    नोट: यदि विच्छेदन के दौरान आवश्यक हो, तो चरण 2.2.4 में तैयार 70% इथेनॉल की डिश का उपयोग संदंश को साफ करने या फिर से स्टरलाइज करने के लिए किया जा सकता है।
  9. एक बार विच्छेदन पूरा हो जाने के बाद, एक्सप्लांट को चरण 2.2.3 में तैयार सीए2 + समाधान की 35 मिमी प्लेट में धीरे से स्थानांतरित करें।
  10. तब तक चरण ों को दोहराएं 2.4-2.9 जब तक कि चार एक्सप्लांट एकत्र नहीं किए गए हैं।
  11. एक्सप्लांट्स और एयर-वॉटर इंटरफेस के बीच किसी भी संपर्क से बचने के लिए ध्यान रखते हुए, सीएमएफ समाधान वाले 35 मिमी प्लेट में सभी चार एक्सप्लांट्स को स्थानांतरित करने के लिए P1000 माइक्रोपाइपेट का उपयोग करें। धीरे-धीरे पकवान को भंवर करें ताकि प्लेट के केंद्र में सभी एक्सप्लांट क्लस्टर हो जाएं।
  12. एक्सप्लांट्स को अलग करने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे का इनक्यूबेट करें।
    नोट: विघटन में सहायता करने के लिए, 0.025%-0.01% ट्रिप्सिन को सीएमएफ समाधान में जोड़ा जा सकता है। यह पुराने भ्रूण (चरण 22 और पुराने) के कुशल विसोजन के लिए आवश्यक हो सकता है।
  13. इस बिंदु पर, कम से दो उचित मंचन भ्रूण होल्डिंग प्लेट पर रहना चाहिए । इन भ्रूणों को चरण 2.2.4 में तैयार जेंटामाइसिन के साथ 0.1 x एमएमआर से भरे एक ताजा पकवान में स्थानांतरित करें और उन्हें एक्सप्लांट डिश से मेल खाने के लिए कवर किए गए पकवान के साथ अव्यवस्थित विकसित करने की अनुमति दें। ये भ्रूण भाई नियंत्रण के रूप में काम करेंगे ।
  14. स्टेप 2.2.3 में तैयार 35 एमएम सेल कल्चर डिश के नीचे माइक्रो-रूल्ड कवरस्लिप (टेबल ऑफ मैटेरियलदेखें) संलग्न करने के लिए सुपरग्लू का उपयोग करें।
    नोट: कवरस्लिप के किनारों के चारों ओर सुपरग्लू के छोटे डब रखें, फिर इसे सेल कल्चर डिश के नीचे के खिलाफ मजबूती से दबाएं। स्थितीय चिह्न कहीं भी गोंद ग्रिड से संपर्क अस्पष्ट हो जाएगा, इसलिए कवरस्लिप के केंद्रीय ग्रिडवाले हिस्से को चिपकने वाले से मुक्त रखना महत्वपूर्ण है।
  15. एक्सप्लांट्स के 1 घंटे के लिए डिसोसिएट होने के बाद, उन्हें सेल कल्चर डिश में स्थानांतरित करने के लिए P100 माइक्रोपाइपेट का उपयोग करें। आदेश में पकवान के ग्रिड वाले हिस्से पर संभव के रूप में कई कोशिकाओं के रूप में थाली करने के लिए, पकवान की सतह के करीब एक उथले कोण पर पिपेट पकड़, अंदर की ओर का सामना करना पड़ ग्रिड के कोने में पिपेट टिप की स्थिति, और दृढ़ता से ग्रिड एआर भर में सेल निलंबन निष्कासित ईए आदर्श रूप से, कोशिकाएं एक तंग घने क्लस्टर में बस जाएंगी।
  16. कोशिकाओं को प्लेट का पालन करने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट। जब यह ऊष्मायन शुरू होता है तो भाई-बहन नियंत्रण भ्रूण के विकासके चरण को निर्धारित और रिकॉर्ड करें।
  17. 10% प्लोरोनिक एफ-127 एसिड के 2 माइक्रोन के साथ 5 माइक्रोन 1 एमएम फ्लू-4 AM (सामग्री की तालिकादेखें) को मिलाएं।
    नोट: Fluo-4 AM प्रकाश संवेदनशील है और हर समय एक प्रकाश सुरक्षित या पन्नी से ढकी ट्यूब में रखा जाना चाहिए ।
  18. ऊष्मायन पूरा होने के बाद, नमूना पकवान को डार्करूम या अन्य प्रकाश-संरक्षित स्थान पर ले जाएं। डिश के किनारे से समाधान के 100 μL को हटाने के लिए एक माइक्रोपाइपेट का उपयोग करें। फ्लू-4 AM/Pluronic एफ-१२७ एसिड के aliquot करने के लिए इस समाधान जोड़ें, ऊपर और नीचे पिपेट मिश्रण करने के लिए, और नमूना पकवान के लिए पूरी मात्रा वापस । मिश्रण करने के लिए धीरे से भंवर।
  19. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली को कवर और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने के लिए अनुमति देते हैं । जब यह ऊष्मायन शुरू होता है तो भाई-बहन नियंत्रण भ्रूण के विकासके चरण को निर्धारित और रिकॉर्ड करें।
  20. ऊष्मायन के अंत में, निम्नलिखित तरीके से तीन मीडिया वॉश करने के लिए 2 एमएम सीए2 + की शेष शंकुई ट्यूब का उपयोग करें: 1) डिश से समाधान के 1 mL को हटा दें, ताजा समाधान के 3 mL जोड़ें, 2) डिश से समाधान के 3 mL को हटा दें, ताजा समाधान के 3 mL जोड़ें, 3) डिश से समाधान के 3 mL को हटा दें, ताजा समाधान के 3 mL जोड़ें।

3. कैल्शियम इमेजिंग

नोट: कैल्शियम इमेजिंग एक उल्टे confocal माइक्रोस्कोप(सामग्री की तालिका)का उपयोग कर किया गया था ।

  1. नमूना प्लेट को माइक्रोस्कोप चरण पर रखें, इसे परिवेश प्रकाश जोखिम से बचाने के लिए ध्यान रखें। एक बार प्लेट सुरक्षित हो जाने के बाद, प्लेट के सामने के बिंदु को लेबल करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें ताकि देखने का एक ही क्षेत्र बाद इमेजिंग में पाया जा सके।
  2. माइक्रोस्कोप के तहत नमूने का पता लगाएं- पहले 10X पर और फिर 20X आवर्धन पर - और इमेजिंग के लिए देखने के एक उपयुक्त क्षेत्र का चयन करें। देखने का एक आदर्श क्षेत्र कोशिका-घना है, लेकिन इतना घना नहीं है कि कोशिकाओं को व्यक्तिगत रूप से अलग करना मुश्किल है या मुश्किल है।
  3. माइक्रोस्कोप फोकस को एडजस्ट करें ताकि ग्रिड-रूल्ड कवरस्लिप दिखाई दे। कवरस्लिप पर चिह्नित संख्या विशेष ग्रिड लोकस के लिए अद्वितीय पहचानकर्ता के रूप में काम करती है और इसका उपयोग अतिरिक्त इमेजिंग के लिए समान दृश्य क्षेत्र का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यदि मूल रूप से चयनित दृश्य का क्षेत्र किसी भी संख्या के साथ ओवरलैप नहीं होता है, तो जब तक एक पहचान योग्य संख्या फ्रेम में न हो जाए तब तक समायोजित करें।
  4. फोकस में ग्रिड-रूल्ड कवरस्लिप के साथ देखने के चयनित क्षेत्र की एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि लें।
  5. फोकस सेटिंग्स को समायोजित करें और ध्यान में कोशिकाओं के साथ देखने के चयनित क्षेत्र की एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि लें।
  6. फोकस में सेल लेयर के साथ, नमूनों को 488 एनएम लेजर से रोशन करें। एचवी और ऑफसेट मान प्रत्येक प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि फिथ चैनल पर फ्लोरेसेंस की एक गतिशील श्रृंखला का पता लगाया जाता है।
  7. दो घंटे की छवि के लिए, इमेजिंग कॉन्फ़िगरेशन को संशोधित करें 3.93 एस के स्कैन समय के साथ 901 फ्रेम रिकॉर्ड करने के लिए और छवि प्राप्त करने के लिए 8 एस रन कॉन्फ़िगरेशन के अंतराल के साथ।
  8. एक बार इमेजिंग पूरी हो जाने के बाद, प्लेट को माइक्रोस्कोप चरण से हटा दें। प्लेट से समाधान के 1 mL निकालें और इसे 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA, और 2 mM MgSO4 में 7.4% formaldehyde) के 1 mL के साथ बदलें।
  9. कमरे के तापमान पर 2 घंटे या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट इनक्यूबेट करें। जब यह ऊष्मायन शुरू होता है तो भाई-बहन नियंत्रण भ्रूण के विकासके चरण को निर्धारित और रिकॉर्ड करें।
  10. निर्धारण पूरा होने के बाद, प्लेट से सभी समाधान निकालें और इसे 1x पीबीएस के 2 मिलील से बदल ें। आगे की प्रोसेसिंग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट स्टोर करें।

4. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण: जांच संश्लेषण

  1. जैसा कि नीचे वर्णित है, सीटू संकरण में एंटीसेंस आरएनए जांच उत्पन्न करें। इसके अतिरिक्त, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए एक ही जीन के लिए एक भावना जांच उत्पन्न करते हैं ।
  2. जांच टेम्पलेट अनुक्रम युक्त प्लाज्मिड डीएनए को शुद्ध करने के लिए, टेम्पलेट प्लाज्मिड युक्त बैक्टीरियल ग्लाइसेरोल स्टॉक के साथ एलबी शोरबा के 150 मिलीग्राम का टीका लगाया जाता है। रात भर मिलाते हुए या संस्कृति टर्बिड होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. अपनी पसंद की विधि का उपयोग करके बैक्टीरियल संस्कृति से प्लाज्मिड डीएनए को शुद्ध करें।
    नोट: हम प्लाज्मिड डीएनए की उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए McNary-Nagel मिडी-तैयारी किट का उपयोग करें ।
  4. इस बात की पुष्टि करने के लिए कि प्लाज्मिड में अपेक्षित सम्मिलित होता है, एक प्रतिबंध डाइजेस्ट करते हैं और एक अगारोज जेल पर उत्पादों का विश्लेषण करते हैं। जीनोमिक डीएनए संदूषण की जांच के लिए एक अगारोज जेल पर अनकट प्लाज्मिड का विश्लेषण भी किया जा सकता है।
  5. टेम्पलेट डीएनए को रैखिक बनाने के लिए, 100 माइक्रोन प्रतिबंध डाइजेस्ट रिएक्शन स्थापित करें जिसमें 20 माइक्रोन प्लाज्मिड डीएनए, उचित प्रतिबंध एंजाइम का 2 माइक्रोन और 1x उपयुक्त बफर हो। कम से कम 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  6. एक फिनॉल/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रदर्शन करके रैखिक डीएनए निकालें जिसके बाद क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण।
  7. 100% इथेनॉल के साथ डीएनए उपजी। यह नमूने में ठंडे इथेनॉल की दो मात्रा ओं को जोड़कर और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटकरी करके जल्दी से किया जा सकता है जब तक कि यह जमन नहीं हो जाता (15-30 0 0 0)।
  8. 12,000 x जी/4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए कताई करके पैलेट डीएनए के लिए प्रशीतित अपकेंद्रित्र का उपयोग करें।
  9. अधिनायक को हटा दें और 70% इथेनॉल के 200 माइक्रोन के साथ पैलेट को धोलें। 12,000 x जी/4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए स्पिन करें।
  10. लगभग 5 मिन के लिए सुपरनेटेंट और एयर-ड्राई पैलेट को हटा दें। 1x TE के 20 माइक्रोन में रिसस्पेंड करें और आगे उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  11. एंटीसेंस आरएनए जांच को संश्लेषित और शुद्ध करने के लिए, 10 एमएम आरसीटीपी के 15 माइक्रोन, 10 एमएम आरजीटीपी के 15 माइक्रोन, 10 मीटर आरएटीपी के 15 माइक्रोन, 10 एमएम आरयूटी के 9.75 माइक्रोन और 10 एम डीग-11 यूटीपी के 5.25 माइक्रोनल के संयोजन से 2.5 एमएम आरएनटीपी मिश्रण बनाएं ।
  12. चरण 4.2-4.10 से लीनरीटेम्पलेट डीएनए के 4 μg युक्त विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया में 50 माइक्रोन स्थापित करें, चरण 4.11 से 2.5 मीटर आरएनटीपी मिश्रण का 15 माइक्रोन, 5एक्स ट्रांसक्रिप्शन बफर का 10 माइक्रोन, 0.1 एम डीटीटी का 5 माइक्रोन, आरएनएसई अवरोधक (20 U/μL) का 0.5 माइक्रोन, और उपयुक्त आरएनए पॉलीमरेज (टी 3, टी7 या एसपी6) का 1.5 माइक्रोन। इनक्यूबेट 1 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  13. प्रतिक्रिया में आरएनए पॉलीमरेज का अतिरिक्त 1.5 माइक्रोन जोड़ें और एक अतिरिक्त घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लौटें।
  14. डीएनए टेम्पलेट को नीचा दिखाने के लिए 10 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया और इनक्यूबेट के लिए RQ1 DNAse के 1 μL जोड़ें।
  15. नमूना करने के लिए 7.5 मीटर LiCl समाधान के 30 μL जोड़ें। पिपेट को कम से कम 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर मिलाना और इनक्यूबेट करना होगा।
  16. रेफ्रिजरेटेड सेंट्रलाइज का उपयोग करके, नमूना 25 किलोको 14,000 x जी/4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें।
  17. अधिनायक को हटा दें और 70% इथेनॉल के 500 माइक्रोन के साथ गोली को कुल्ला करें। 14,000 x जी/4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए स्पिन करें।
  18. लगभग 5 मिन के लिए अलौकिक और हवा सूखी गोली निकालें । न्यूलीज मुक्त पानी के 20 μL में फिर से सस्पेंड ।
  19. संकरण बफर (50% फॉर्मामाइड) में 10 एनजी/μL की एकाग्रता के लिए नमूना कमजोर करके 10x जांच स्टॉक में बनाएं, 5x एसएससी (खारा-सोडियम साइट्रेट; 750 एमएम एनसीएल, 75 एमएम सोडियम साइट्रेट, पीएच 7.0), 1 मिलीग्राम/एमएल तोरुला आरएनए, 0.1% ट्वीन-20, 1x डेनहार्ट का समाधान, 0.1% चैप्स, 10 मीटर ईटीए, और 100 μg/mL heparin)। आगे उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण: सीटू संकरण में फ्लोरेसेंस

नोट: सभी वॉश को बाँझ, व्यक्तिगत रूप से लिपटे स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके लगभग 1 मिलील समाधान के साथ किया जाना चाहिए। समाधान निकालते समय या जोड़ने के दौरान प्लेट के किनारे पर पिपेट तैनात किया जाना चाहिए, और धोता को यह सुनिश्चित करने के लिए जितना संभव हो उतना धीरे से किया जाना चाहिए कि कोशिकाओं को प्लेट की सतह से उखाड़ नहीं दिया जाता है और खो जाता है।

  1. प्लेट से 1x पीबीएस निकालें (चरण 3.10 से)। कमरे के तापमान पर ताजा 1x पीबीएस और इनक्यूबेट 5 न्यूनतम के साथ बदलें।
  2. एसिटिक एंहाइड्राइड के 62.5 माइक्रोन के साथ 0.1 मीटर ट्राइथेनॉमाइन (पीएच 8.0) के 25 मीटर को मिलाएं। अच्छी तरह मिलाएं। 10 मिन के लिए इस घोल के साथ थाली धो लें।
  3. 5 मिन के लिए 1x एसएससी के साथ थाली धोलें।
  4. कोशिकाओं को परमीबिलाइज करने के लिए 10 मिन के लिए 0.02 एम एचसीएल के साथ प्लेट को धोएं।
  5. प्रत्येक 5 मिन के लिए 1x पीबीएस के साथ 2x धोएं।
  6. समाधान निकालें और संकरण बफर के 1 mL जोड़ें (50% फॉर्मामाइड, 5x एसएससी (750 mM NaCl, 75 mM सोडियम सिट्रेट, पीएच 7.0), 1 मिलीग्राम/mL torula RNA, 0.1% ट्वीन-20, 1x डेनहार्ट का समाधान, 0.1% चैप्स, 10 एमएम ईटीए, और 100ग्राम/एमएल में वह प्लेट में शामिल हैं। कम से कम 6 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए के साथ इनक्यूबेट।
  7. संकरण बफर निकालें और 1x आरएनए प्रोब समाधान के 750 माइक्रोन के साथ बदलें (पतला रूप चरण 4.19 में बनाया गया 10x स्टॉक। सेंस आरएनए जांच का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है।
  8. 60 डिग्री सेल्सियस पर 8-14 घंटे के लिए मिलाते हुए के साथ इनक्यूबेट।
  9. जांच निकालें और 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: 1x जांच कमजोर पड़ने से पहले तीन बार तक पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  10. 0.2x एसएससी के साथ थाली कुल्ला।
  11. 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ताजा 0.2x एसएससी के साथ धोएं।
  12. प्लेटों को कमरे के तापमान पर ले जाएं और 5 न्यूनतम के लिए समान करें।
  13. 5 मिन के लिए 0.2x एसएससी के साथ थाली धोलें।
  14. 15 मिन के लिए प्लेट को 1x पीबीटी से धोलें।
  15. 1 घंटे के लिए 1x पीबीटी (0.1% ट्राइटन-एक्स-100) में 2% एच2ओ2 के साथ प्लेट धोएं।
    नोट: यह समाधान प्रकाश-संवेदनशील है, इसलिए इसे प्रत्येक प्रयोग के लिए ताजा बनाया जाना चाहिए और प्रकाश से परिरक्षित किया जाना चाहिए। इस ऊष्मायन के दौरान प्लेटों को प्रकाश से भी ढाल दिया जाना चाहिए या उन्हें नाकाम कर देना चाहिए।
  16. 15 mST के लिए प्लेट को 1x TBST (150 mM NaCl, 50 m Ts-HCl, पीएच 7.5, 0.1% ट्वीन-20) के साथ धोलें।
  17. मैलिक एसिड बफर (100 एम एम मैलिक एसिड, 150 एमएम नैल, पीएच 7.5) में 2% तक कमजोर अवरुद्ध रिएजेंट। कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे के लिए इस मिश्रण में कोशिकाओं को ब्लॉक करें।
  18. एंटी-डिगऑक्सीजनिन-पॉड एंटीबॉडी पतला 1:1,000 के साथ अवरुद्ध समाधान को बदलें 2% में मैलिक एसिड बफर में रिएजेंट को अवरुद्ध करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  19. प्लेट 3x को 1x TBST के साथ कुल्ला।
  20. लगातार कमाल के साथ कम से कम 15 मिन प्रति वॉश के लिए 1x TBST के 2mL के साथ 4x धोएं।
  21. लगातार कमाल के साथ कम से कम 10 मिन प्रति वॉश के लिए 1x पीबीटी के साथ 2x धोएं।
  22. 1x पीबीटी में पतला Cy3-conjugated टायरामाइड 1:25 । 5 मिन के लिए इस कमजोर पड़ने के 750 माइक्रोन के साथ थाली धोलें।
    नोट: यह समाधान बेहद हल्का संवेदनशील है, और संकेत गिरावट से बचने के लिए प्लेटों को विफल या प्रयोग के शेष के लिए प्रकाश से परिरक्षित रखा जाना चाहिए।
  23. इस समाधान के लिए 0.3% एच2ओ2 के 2.5 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त 40 न्यूनतम के लिए निरंतर कमाल के साथ इनक्यूबेट करें।
  24. लगातार कमाल के साथ कम से कम 15 मिन प्रति वॉश के लिए 1x TBST के साथ 4x धोएं।
  25. 1x पीबीटी के साथ कुल्ला।
  26. 1x एमईएमएफए (100 एमएम एमओपीएस, 1 एमएम ईजीटीए, और 3.7% फॉर्मलडिहाइड में 1 एमएम एमजीएसओ4) में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटिंग करके कोशिकाओं को ठीक करें।
  27. समाधान निकालें और 1x पीबीएस के साथ बदलें। प्लेटों को अगले प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक नाकाम कंटेनर में स्टोर करें।

6. इमेजिंग कोशिकाएं

नोट: इमेजिंग एक उल्टे confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर किया गया था ।

  1. नमूना प्लेट को माइक्रोस्कोप चरण पर रखें, चरण के सामने चरण 3.1 में बने निशान को संरेखित करें।
  2. छवि पर ध्यान केंद्रित करें ताकि ग्रिड-लाइन कवरस्लिप दिखाई दे और, संदर्भ के रूप में चरण 3.4 में ली गई ग्रिड छवि का उपयोग करके, कैल्शियम छवि (धारा 3) में कैप्चर किए गए दृश्य के क्षेत्र से मेल खाने के लिए दृश्य के क्षेत्र को समायोजित करें।
  3. ग्रिड और कोशिकाओं दोनों की उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां प्राप्त करें।
  4. नमूनों को 595 एनएम ट्रायटीसी लेजर से रोशन करते हैं। नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं से छवियों का उपयोग करके पृष्ठभूमि से संकेत को उचित रूप से अलग करने और अभी भी छवि प्राप्त करने के लिए लाभ मूल्यों को समायोजित करें।
    नोट: आदर्श रूप में, पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस का स्तर एक नकारात्मक नियंत्रण प्लेट के आधार पर निर्धारित किया जाता है जो गैर-लक्षित भावना आरएनए जांच के समानांतर संसाधित होता है। लाभ सेटिंग्स को समायोजित किया जाता है ताकि यह प्लेट पूरी तरह से काली दिखाई दे (पृष्ठभूमि के स्तर के अनुरूप) दिखाई दे, फिर उस प्रयोगात्मक बैच से छवि वाली अन्य प्लेटों के लिए निरंतर आयोजित की जाए।

7. डेटा प्रोसेसिंग

नोट: निकॉन एलिमेंट्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा प्रोसेसिंग की गई थी।

  1. चरण 3.7 से 2 घंटे कैल्शियम छवि खोलें। बाइनरी एंड जीटी; स्पॉट डिटेक्शन एंड जीटी; ब्राइट स्पॉट्स का चयन करके प्रत्येक व्यक्तिगत सेल के अनुरूप पिक्सेल की पहचान करें। सुनिश्चित करें कि फ़ीसीसी चैनल का चयन किया गया है।
  2. इस परत के उत्पन्न होने के बाद रंगीन सर्कल व्यक्तिगत कोशिकाओं पर दिखाई देंगे। सेल वितरण और आकार मापदंडों को समायोजित करें ताकि संभव के रूप में कई कोशिकाओं को पहचाना और एक अद्वितीय पहचानकर्ता के साथ जुड़े रहे हैं ।
  3. व्यू एंड जीटी; एनालिसिस कंट्रोल्स एंड जीटी; ट्रैकिंग ऑप्शंसको नेविगेट करके इमेज के सभी फ्रेम ्स में कोशिकाओं को ट्रैक करें । पटरियों के बीच अधिकतम अंतर के रूप में 5 फ्रेम सेट करें, 600 से कम फ्रेम से जुड़ी वस्तुओं को हटाएं, और क्लोज गैप विकल्प का चयन करें। छवि पर सेल ट्रैकिंग लागू करने के लिए ट्रैक Binaries का चयन करें।
  4. कोशिकाओं को ट्रैक किए जाने के बाद, मैन्युअल रूप से किसी भी वस्तु को हटा दें जो किसी व्यक्तिगत कोशिका के अनुरूप नहीं है (उदाहरण के लिए कोशिकाओं का झुरमुट)। हालांकि, कैल्शियम गतिविधि ट्रेस की आकृति विज्ञान के आधार पर डेटा बिंदुओं को आगे के विश्लेषण से बाहर नहीं रखा जाना चाहिए।
  5. इमेज फलक पर, देखें ओवरले का चयन करें और बाइनरी ऑब्जेक्ट आईडी दिखाएं। छवि (फ्रेम 901) के अंत तक स्क्रॉल करें और संपादित करें और देखें स्नैपशॉट (8बिट आरजीबी)और जीटी; वर्तमान फ्रेम और जीटी; ओके। यह प्रत्येक सेल की संबद्ध बाइनरी आईडी दिखाई देने के साथ छवि के अंतिम फ्रेम का एक स्नैपशॉट बनाएगा। इस छवि को बचाओ।
  6. एक्सेलमें निर्यात डेटा के बाद सभी वस्तुओं का चयन करके समय-श्रृंखला डेटा निर्यात करें। सीएसवी फ़ाइल के रूप में आउटपुट बचाएं।
  7. मछली की छवि खोलें। फ़ीसीसी चैनल के बजाय TRITC चैनल का उपयोग करके 7.1-7.2 चरणों में स्पॉट डिटेक्शन का अनुकूलन करें। किसी भी गलत तरीके से सौंपे गए बाइनरी को मैन्युअल रूप से हटा दें, फिर प्रत्येक सेल की सिग्नल तीव्रता की गणना करने के लिए स्वचालित माप परिणाम और अद्यतन माप का चयन करें। 7.5 और 7.6 चरणों को दोहराकर एक छवि स्नैपशॉट और डेटा तालिका का निर्यात करें।
  8. एक स्प्रेडशीट बनाएं जहां कॉलम ए में फिश बाइनरी आईडी लेबल किया गया हो और कॉलम बी को कैल्शियम बाइनरी आईडीका लेबल दिया गया हो । चरण 7.5 और 7.7 में निर्यात की गई छवियों को खोलें। मछली छवि (चरण 7.7) में पहचाने गए प्रत्येक ऑब्जेक्ट के लिए, कॉलम ए में बाइनरी आईडी रिकॉर्ड करें। फिर, कैल्शियम छवि (चरण 7.5) में संबंधित कोशिका का पता लगाएं और रिकॉर्ड करें कि कॉलम बी कोशिकाओं में बाइनरी आईडी जिसे दोनों छवियों में आत्मविश्वास से पहचाना नहीं जा सकता है, को स्प्रेडशीट में नहीं जोड़ा जाना चाहिए।
    नोट: दोनों छवियों को खोलने, एक अर्ध-पारदर्शी बनाने और प्रत्येक कोशिका से जुड़े दो बाइनरी आईडीएस को अधिक आसानी से पहचानने और लिंक करने के लिए इसे अपने साथी छवि पर ओवरले करने के लिए एडोब फ़ोटोशॉप या जीआईएमपी छवि संपादक जैसे फोटो संपादन कार्यक्रम का उपयोग करना उपयोगी हो सकता है।
  9. प्रत्येक पहचान की गई कोशिका के लिए, मिलान (या तो मैन्युअल रूप से या स्क्रिप्ट के साथ) इसकी समय-श्रृंखला कैल्शियम डेटा (कैल्शियम बाइनरी आईडी से जुड़ा हुआ है और चरण 7.6 में निर्यात किया गया है) और इसके जीन अभिव्यक्ति डेटा (मछली बाइनरी आईडी से जुड़े और चरण 7.7 में निर्यात किए गए)।
    नोट: डाउनस्ट्रीम डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण में इन डेटा को एक ही डेटा टेबल में मिलाना और स्पाइक काउंटिंग, फ्रैक्टल विश्लेषण और मार्कोवियन एंट्रोपी सहित विश्लेषणात्मक तकनीकों की एक सरणी लागू करना शामिल हो सकता है जो अन्वेषक को कैल्शियम गतिविधि 17,18के उपन्यास पैटर्न को समझने की अनुमति देता है।

Representative Results

कैल्शियम इमेजिंग के लिए तैयार की गई अलग - अलग कोशिकाओं का एक सफल उदाहरण चित्रा 2एमें देखा जा सकता है । कोशिकाओं घनी चढ़ाया जाता है, जानकारी की अधिकतम राशि प्रत्येक छवि से एकत्र करने की अनुमति है, लेकिन इतना घनी चढ़ाया नहीं है कि व्यक्तिगत कोशिकाओं आत्मविश्वास से एक दूसरे के रूप में प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है । 2 एच इमेजिंग अवधि में प्रत्येक परिभाषित सेल के लिए फ्लोरेसेंस का पता लगाया जाता है। एक प्रयोग में दर्ज सभी कोशिकाओं के लिए निशान युक्त एक समग्र भूखंड के दृश्य डिग्री से पता चलता है जो थोक या जनसंख्या माप स्पाइकिंग व्यवहार के अधिक सूक्ष्म पैटर्न अस्पष्ट कर सकते है(चित्रा 2बी)। जब व्यक्तिगत कोशिकाओं की रिकॉर्ड की गई प्रोफाइल अलग-थलग पड़ जाती हैं, तो तंत्रिका जनक कोशिकाओं की अनियमित स्पाइकिंग गतिविधि विशेषता के उदाहरणों की स्पष्ट रूप से पहचान की जा सकती है। परिपक्व न्यूरॉन्स के विपरीत, भ्रूण न्यूरोनल कोशिकाएं कैल्शियम गतिविधि(चित्रा 2बी)की अनियमित, अत्यधिक चर और जटिल प्रकृति प्रदर्शित करती हैं। इस जटिलता को निर्धारित करने के लिए, विभिन्न डेटा विश्लेषण विधियों के आवेदनको 17,18लागू किया गया है, जिसमें स्पाइक(चित्रा 2सी)को परिभाषित करने के लिए विविध मापदंड शामिल हैं।

एक एंटीसेंस एमआरएनए जांच के सफल डिजाइन और संश्लेषण सहित सीटू संकरण में सफल फ्लोरेसेंस का मूल्यांकन गैर-बाध्यकारी भावना आरएनए नियंत्रण(चित्रा 3ए, बी)के साथ इनक्यूबेटेड पृष्ठभूमि नियंत्रण के खिलाफ प्रयोगात्मक प्लेट की तुलना करके किया जा सकता है। एक सकारात्मक जांच नियंत्रण भी एक सेल प्रकार का पता लगाने योग्य स्तर पर लक्ष्य mRNA व्यक्त करने के लिए जाना जाता है प्रसंस्करण द्वारा किया जा सकता है ।

कैल्शियम और फिश इमेजिंग में एक ही कोशिका की पहचान के लिए आवश्यक है कि कोशिकाएं जांच संकरण और प्रसंस्करण के दौरान लगभग एक ही स्थिति बनाए रखें। यदि प्लेटों को मोटे तौर पर संभाला जाता है या वॉश भी जबरदस्ती किया जाता है, तो कोशिकाओं को प्लेट की सतह से उखाड़ दिया जा सकता है और या तो प्लेट की सतह से उखाड़ दिया जा सकता है और या तो प्लेट पर एक अलग स्थान पर समाधान को छोड़ दिया जाता है या जमा किया जाता है, जिससे उनके लिए छवियों(चित्र 4ए)में मिलान करना असंभव हो जाता है। यदि यह व्यवधान देखने के क्षेत्र में केवल कुछ कोशिकाओं को प्रभावित करता है, तो छवि के भीतर कुछ कोशिकाओं का पता लगाना और असाइन करना अभी भी संभव हो सकता है(चित्र 4बी)। हालांकि, डेटा की अधिकतम मात्रा एक प्रयोग से प्राप्त की जाती है जिसमें मछली सावधानी से की जाती है और कुछ कोशिकाओं को खो दिया जाता है या छवियों के बीच फिर से तैनात किया जाता है(चित्र 4सी)।

एक बार डेटा दोनों कैल्शियम गतिविधि और ब्याज के विकास के स्तर पर कोशिकाओं की एक उचित संख्या की जीन अभिव्यक्ति का वर्णन करने के लिए एकत्र किया गया है, आगे विश्लेषण इन दो सुविधाओं के बीच सहसंबंधों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है(चित्रा 1)। कैल्शियम गतिविधि पैटर्न की मात्रा निर्धारित करने के लिए कई मीट्रिक लगाए गए हैं, जिनमें स्पाइक काउंटिंग/फ्रीक्वेंसी, एवरेज पावर, हर्स्ट एक्सपोनेंट अनुमान और मार्कोवियन एंट्रोपी मेजरमेंट17,18शामिल हैं । जीन अभिव्यक्ति को पूर्ण फ्लोरेसेंस स्तर द्वारा मात्रात्मक रूप से परिभाषित किया जा सकता है या प्रयोगात्मक प्रश्नों के आधार पर बाइनरी (हां/नहीं) पैमाने पर वर्गीकृत किया जा सकता है ।

तंत्रिका जनक मार्कर जीन की अभिव्यक्ति के साथ कैल्शियम गतिविधि का मिलान करने वाले प्रयोगों के परिणामों से कैल्शियम गतिविधि और न्यूरोट्रांसमीटर फेनोटाइप के विशिष्ट पैटर्न के बीच कई संघों का पता चला। तंत्रिका प्लेट चरण (स्टेज 14) में, अवरोधक न्यूरॉन मार्कर को व्यक्त करने वाली गैबाएर्गिक कोशिकाएं कैल्शियम गतिविधि का प्रदर्शन करती हैं जो उन कोशिकाओं की तुलना में अधिक नियमित और उच्च आयाम है जिनमें गड1.1 अभिव्यक्ति(चित्रा 5ए)की कमी है। इसके अलावा, जबकि ये गैड1.1-व्यक्त कोशिकाएं उच्च आयाम स्पाइकिंग के उच्च स्तर से जुड़ी होती हैं, कम आयाम स्पाइकिंग उत्तेजक न्यूरॉन मार्कर slc17a7को व्यक्त करने वाली ग्लूटामिज कोशिकाओं में अधिक बार होती है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक कार्यप्रवाह की योजनाबद्ध । स्केल बार = 100 माइक्रोन। पैनलों में छवियां 3-5 Paudel एट अल (२०१९)17से लिया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कैल्शियम इमेजिंग और उदाहरण गतिविधि प्रोफाइल। (A)फ्लू4-एएम द्वारा सूचित इंट्रासेल्युलर कैल्शियम गतिविधि। प्रत्येक 2 घंटे छवि 901 फ्रेम से बना है, एक प्रतिनिधि फ्रेम के साथ यहां दिखाओ। (ख)देखने के छवि क्षेत्र के भीतर सभी कोशिकाओं में समय के साथ फ्लोरेसेंस तीव्रता का समग्र भूखंड । निशान स्पष्ट रूप से संकेतक रंग (Fluo4) ओवरटाइम की फोटोब्लीचिंग का संकेत देते हैं। शीर्ष बाईं ओर रैस्टर प्लॉट Eilers और Boelen19द्वारा विकसित एक डी-ट्रेंडिंग एल्गोरिदम के आवेदन के बाद कैल्शियम गतिविधि के प्रतिनिधि निशान दिखाता है, जहां यहां दिखाई गई कोशिकाएं स्पाइकिंग व्यवहार के विविध पैटर्न का प्रदर्शन करती हैं। (ग)एक स्पाइक (हरे और नीले तीर) को परिभाषित करने के लिए विभिन्न थ्रेसहोल्ड (150% और 200% बेसलाइन का आवेदन, जहां बेसलाइन डी-ट्रेंड्ड फ्लोरोसेंट तीव्रता का औसत है) । स्केल बार = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: मछली इमेजिंग। (A)मछली एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक गैर बाध्यकारी भावना आरएनए जांच के साथ प्रदर्शन किया । इमेजिंग सेटिंग्स को समायोजित किया गया है ताकि कोई कोशिका फ्लोरोसेंट दिखाई न दे। देखने के कुछ क्षेत्रों में कुछ फ्लोरेसेंस के साथ गैर-सेल मलबे शामिल हो सकते हैं, जैसे कि शीर्ष दाईं और नीचे दाएं कोनों (ए) में देखा जाता है; पृष्ठभूमि सेटिंग के उद्देश्य से इन्हें नजरअंदाज किया जा सकता है। (ख)एक ही इमेजिंग सेटिंग्स तो एक प्रयोगात्मक थाली (एंटीसेंस आरएनए जांच) छवि के लिए उपयोग किया जाता है । इन परिस्थितियों में फ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि के ऊपर जीन अभिव्यक्ति से मेल खाता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: छवि ओवरले और सहपंजीकरण। कैल्शियम गतिविधि के लिए छवि वाले नमूने के योजनाबद्ध अभ्यावेदन (भरे हुए हरे घेरे द्वारा प्रतिनिधित्व की गई कोशिकाएं) और मछली (छायांकित लाल घेरे द्वारा प्रतिनिधित्व कोशिकाएं)। (A)नमूना हैंडलिंग और प्रसंस्करण के दौरान महत्वपूर्ण रूप से स्थानांतरित की गई कोशिकाओं को दो छवियों में मज़बूती से पहचाना नहीं जा सकता है। (ख)कोशिका व्यवधान देखने के क्षेत्र में केवल कुछ कोशिकाओं को प्रभावित कर सकता है । कुछ कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से दोनों छवियों में पहचाना जा सकता है, जबकि दूसरों को आत्मविश्वास से मिलान नहीं किया जा सकता है। (ग)यदि नमूनों को सावधानीपूर्वक निपटाया जाता है, तो अधिकांश कोशिकाएं अबाधित रहेंगी और दोनों छवियों में पहचान की जा सकती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: इस विधि के अनुप्रयोग का एक उदाहरण, तंत्रिका प्लेट चरण ज़ेनोपस laevis में कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति (गाबा और जीन के लिए भरमार क्रमशः 1.1 और slc17a7) के बीच संघों को दिखाने वाले बॉक्सप्लॉट। चरण 14 में, gad1.1-postive कोशिकाओं (गाबा) उच्च आयाम और अधिक नियमित रूप से कैल्शियम गतिविधि के रूप में(ए)मार्कोवियन entropy18 और(बी)स्पाइक की गिनती थ्रेसहोल्ड १२५%, १५०%, २००% और ३००% की तुलना में de-trended फ्लोरोसेंट तीव्रता (बेसलाइन)17 slc17a तारे बोनफेरोनी-सही दो-नमूना कोल्मोगोरोव-स्मिरनोव टेस्ट (पी एंड एलटी; 0.05) और कोहेन के डी स्टैटिस्टिक्स फॉर इफेक्ट साइज (एन = 5 संस्कृतियों और >100 कोशिकाओं; * 0.2 = डी एंड एलटी; 0.5) दोनों के अनुसार सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर का संकेत देते हैं। यह आंकड़ा पौडेल एट अल17से प्राप्त डेटा सेट से फिर से तैयार और अनुकूलित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

कैल्शियम गतिविधि के विशिष्ट पैटर्न कोशिकाओं में देखे गए हैं जो विकासशील तंत्रिका तंत्र बनाते हैं, विशिष्ट प्रकार की गतिविधि के साथ अलग-अलग न्यूरोडेवलपमेंटल प्रक्रियाओं से जुड़े होते हैं। हालांकि, तंत्र है जिसके द्वारा इन सूचना घने गतिविधि पैटर्न प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं में अनुवाद कर रहे है की आगे की समझ कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति के बारे में जानकारी की आवश्यकता है एकल सेल संकल्प के साथ एकत्र किया जाएगा । जबकि सिस्टम है कि इस तरह के परिपक्व न्यूरॉन्स के रूप में और अधिक टकसाली कैल्शियम गतिविधि, प्रदर्शन, यथोचित एक थोक स्तर पर परे किया जा सकता है, अनियमित पैटर्न है कि भ्रूण तंत्रिका तंत्र की विशेषता आसानी से कम सटीक रिकॉर्डिंग से नकाबपोश हैं ।

इस प्रोटोकॉल में स्थापित प्रायोगिक ढांचा आसानी से विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के अनुकूल है। ऊतक जिसमें लगभग किसी भी कोशिका प्रकार या कोशिका प्रकार के संयोजन होते हैं, ब्याज के मॉडल जीव से विच्छेदित किया जा सकता है और एकल-कोशिका इमेजिंग के लिए चढ़ाया जा सकता है। सेल पहचान की अनुमति देने और सेल-स्वायत्त प्रक्रियाओं के प्रभाव को अलग करने के अलावा, एक प्राथमिक सेल संस्कृति दृष्टिकोण प्रयोगकर्ता को वांछित के रूप में मीडिया घटकों को परिभाषित करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, 2 एमएम सीए2 + समाधान में न्यूरोनल अग्रदूतों की गतिविधि की तुलना करने वाले प्रयोगों को यह जांचने के लिए किया गया है कि क्या भ्रूणरी रीढ़ की हड्डी में स्पाइक फ्रीक्वेंसी और न्यूरोट्रांसमीटर फेनोटाइप के बीच संबंधों को कोशिका-कोशिका इंटरैक्शन13,20के प्रभाव के बिना फिर से तैयार किया जा सकता है।

हालांकि यह प्रोटोकॉल इंट्रासेलर कैल्शियम गतिविधि का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट मार्कर Fluo4-AM का लाभ उठाता है, चयन मानदंडों के आधार पर, उपयोगकर्ता आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों सहित अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मार्कर21का चयन कर सकते हैं। इसी तरह, वैकल्पिक मार्कर का उपयोग ब्याज के आयन (कश्मीर+,एनए+और जेडएन2 +सहित),झिल्ली क्षमता, या सेलुलर पीएच की एकाग्रता में गतिशील परिवर्तनों की निगरानी के लिए किया जा सकता है। इमेजिंग सेटिंग्स और इमेज अवधि को आवश्यक के रूप में संशोधित किया जा सकता है।

यद्यपि हमने कैल्शियम गतिविधि और न्यूरोनल फेनोटाइप को एक विशिष्ट अनुप्रयोग के रूप में सहसंबद्ध किया है, यह विधि विभिन्न अन्य सेलुलर गुणों के लिए भी लागू होती है। उदाहरण के लिए, सीटू संकरण में फ्लोरेसेंस को ब्याज के किसी भी जीन के खिलाफ जांच के साथ किया जा सकता है, जिसमें न्यूरोनल मार्कर चाट या ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर Engrailed शामिल है, जिससे एमआरएनए प्रजातियों के अनुकूलन योग्य पैनल का संवेदनशील पता लगाया जा सकता है। इन जांचों को आइसोफॉर्म-विशिष्ट होने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है, यदि वांछित हो तो अतिरिक्त लक्ष्य विशिष्टता का समर्थन किया जा सकता है। डबल मछली कई दो अलग-अलग फ्लोरोफोरस के लिए संयुग्मित जांच का उपयोग करके किया जा सकता है, जिससे कई जीन की अभिव्यक्ति का एक साथ आकलन हो ता है। हालांकि, इस प्रकार के प्रयोग के लिए आवश्यक अतिरिक्त वॉश सेल हानि या आंदोलन की बढ़ी हुई संभावना से जुड़े होते हैं और सफलतापूर्वक किए जाने वाले अनुभव और विनम्रता की आवश्यकता होती है।

इस प्रोटोकॉल में किए गए किसी भी प्रयोग-विशिष्ट संशोधनों के बावजूद, कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है। सभी दूषित ऊतकों या कोशिका आबादी को दूर करने के लिए देखभाल के साथ विच्छेदन किया जाना चाहिए; क्योंकि जब एक्सप्लांट्स को अलग किया जाता है तो स्थानिक पैटर्नखो जाता है, पड़ोसी ऊतकों से कोई भी शेष कोशिकाएं ब्याज की कोशिकाओं से अलग और अविवेच्य हो जाएंगी। कोशिकाओं को चढ़ाया जाने के बाद, कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने से रोकने के लिए नमूनों को धीरे से संभाला जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण बात, इसका मतलब यह है कि सभी समाधान परिवर्तन धीरे और ध्यान से किया जाना चाहिए, प्लेट के किनारे पर रखा पिपेट के साथ जब समाधान हटाया जा रहा है और जोड़ा जा रहा है । यह सुनिश्चित करेगा कि कैल्शियम और मछली दोनों छवियों में कोशिकाओं की आत्मविश्वास से पहचान की जा सकती है। यदि प्रसंस्करण के दौरान कोशिकाएं बाधित होती हैं, तो दो छवियों के बीच कुछ या सभी संबंधित कोशिकाओं की पहचान करना असंभव हो सकता है। हम इन कार्यों के साथ सावधानी के पक्ष में गलती की सलाह देते हैं, जैसे कि केवल स्पष्ट रूप से संबंधित कोशिकाओं को आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है।

जैविक प्रश्न को संबोधित किए जाने के आधार पर, विभिन्न प्रकार के विश्लेषण दृष्टिकोण उपयुक्त हो सकते हैं। समय-श्रृंखला कैल्शियम गतिविधि को विभिन्न तरीकों से संसाधित और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जिसमें डी-ट्रेंडिंग पैरामीटर, विश्लेषण मीट्रिक और विश्लेषण मापदंडों को चुनने में प्रयोगकर्ता लचीलापन होता है (उदाहरण के लिए, कैल्शियम स्पाइक को परिभाषित करने के लिए उपयोग की जाने वाली आधारभूत सीमा का%)। कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति के स्तर के बीच सहसंबंध मछली छवि से निकाले गए एक निरपेक्ष या सापेक्ष फ्लोरेसेंस मूल्य के रूप में जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके तैयार किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति (उपस्थिति/अनुपस्थिति) के बीच सहसंबंध सकारात्मक जीन अभिव्यक्ति संकेत के लिए एक फ्लोरेसेंस दहलीज को परिभाषित करके और व्यक्तिगत कोशिकाओं को ' हां ' या ' नहीं ' पहचानकर्ताओं को निर्दिष्ट करके तैयार किया जा सकता है । कुल मिलाकर, यह प्रायोगिक स्कीमा सेल-मिलान जीन अभिव्यक्ति डेटा के साथ संयोजन के रूप में समय-श्रृंखला डेटा के संग्रह और प्रारंभिक विश्लेषण के लिए एक अविश्वसनीय रूप से लचीली पाइपलाइन प्रदान करता है। इस तरह के प्रयोग सेलुलर गतिशीलता और प्रतिलेखन परिवर्तनों के बीच जटिल संबंधों को बेहतर ढंग से समझने के लिए महत्वपूर्ण होंगे, जैसा कि भ्रूणीय ज़ेनोपस लेवेइसमें निरोधात्मक-वसायुक्त और उत्तेजक-fated न्यूरोनल अग्रदूतों की विशेषता कैल्शियम गतिविधि पैटर्न की पहचान से उदाहरण है।

Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं ।

Acknowledgments

हम इन प्रोटोकॉल के विकास के लिए उनके योगदान के लिए वेंडी हर्बस्ट और लिंडसे श्लीफर का शुक्रिया अदा करते हैं । इस कार्य को एमएसएस को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 और 1R15HD096415-01) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Animal Husbandry & Cell Culture
CHORULON (chorionic gonodotropin) Merck Animal Health
Gentamycin sulfate salt Millipore Sigma G1264
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm Millipore Sigma CLS3160102
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm Fisher Scientific 08-772A
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm Fisher Scientific 08-772F
Falcon Standard Tissue Culture Dishes Fisher Scientific 08-772E
Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta Fisher Scientific 12-565-90
Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL Fisher Scientific 13-711-7M
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Millipore Sigma E10521
Collagenase B Millipore Sigma 11088807001
Dumont #55 Forceps, Dumostar Fine Science Tools 11295-51
Dumont #5 Forceps, Dumostar Fine Science Tools 11295-00
Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface Nexcelom Bioscience CLS5-25D-050
For Calcium Imaging
Fluo-4, AM, cell permeant Thermo Fisher Scientific F14201
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) Thermo Fisher Scientific P6866
For RNA Probe Generation
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1222
rATP Promega P1132
rCTP Promega P1142
rGTP Promega P1152
rUTP Promega P1162
Digoxigenin-11-UTP Millipore Sigma 3359247910
Rnase Inhibitor Thermo Fisher Scientific N8080119
T3 RNA Polymerase Promega P2083
T7 RNA Polymerase Promega P2075
SP6 RNA Polymerase Promega P1085
RQ1 Rnase-Free Dnase Promega M6101
LiCl Precipitation Solution (7.5 M) Thermo Fisher Scientific AM9480
For Fluorescence In Situ Hybridization
Acetic Anhydride Thermo Fisher Scientific 320102
Blocking Reagent Millipore Sigma 11096176001
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments Millipore Sigma 11207733910
Cy3 Mono-Reactive NHS Ester Millipore Sigma GEPA13105
Solution Components
Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs Fisher Scientific AC349610
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma C3306
CHAPS hydrate Millipore Sigma C3023
Denhardt's Solution (50X) Thermo Fisher Scientific 750018
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) Promega P1171
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate Fisher Scientific S311
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Millipore Sigma E3889
Formamide (Deionized) Thermo Fisher Scientific AM9342
Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Millipore Sigma H3393
HEPES (Ultra Pure) Thermo Fisher Scientific 11344041
Hydrogen peroxide solution Millipore Sigma H1109
L-Cysteine Millipore Sigma 168149
Magnesium chloride, pure, ACROS Organics Fisher Scientific AC223211000
Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous Fisher Scientific AC413480050
Maleic Acid, 99%, ACROS Organics Fisher Scientific ACS125231000
MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP308
Potassium chloride Millipore Sigma P9541
Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX Millipore Sigma R3629
Sodium chloride Millipore Sigma S7653
Triethanolamine Millipore Sigma 90279
Tris Millipore Sigma GE17-1321-01
TWEEN 20 Millipore Sigma P9416
Equipment
Laminar Flow Hood model of choice
Dissecting Microscope model of choice
Inverted Fluorescence Microscope Nikon TE200
NIS-Elements Imaging Software Nikon
Shaking Incubator model of choice
Refrigerated Centrifuge model of choice
Miscellaneous
Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 μm pore, 500 mL bottle capacity Millipore Sigma CLS430769
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22

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References

  1. Humeau, J., et al. Calcium signaling and cell cycle: Progression or death. Cell Calcium. 70, 3-15 (2017).
  2. Kim, J. M., Lee, M., Kim, N., Heo, W. D. Optogenetic toolkit reveals the role of Ca2+ sparklets in coordinated cell migration. PNAS. 112 (21), 5951-5957 (2016).
  3. Orrenius, S., Zhivotovsky, B., Nicotera, P. Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 552-565 (2003).
  4. Pham, K., et al. Ca2+ and Mg2+ module conformational dynamics and stability of downstream regulatory element antagonist modulator. Protein Science. 24 (5), 741-751 (2015).
  5. Smedler, E., Uhlén, P. Frequency decoding of calcium oscillations. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 964-969 (2014).
  6. Moreau, M., Néant, I., Webb, S. E., Miller, A. L., Riou, J. F., Leclerc, C. Ca(2+) coding and decoding strategies for the specification of neural and renal precursor cells during development. Cell Calcium. 59 (2-3), 75-83 (2016).
  7. Tomida, T., Hirose, K., Takizawa, A., Shibasaki, F., Iino, M. NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2+ oscillation. EMBO. 22 (15), 3825-3832 (2003).
  8. Hannanta-Anan, P., Chow, B. Y. Optogenetic Control of Calcium Oscillation Waveform Defines NFAT as an Integrator of Calcium Load. Cell Systems. 2 (4), 283-288 (2016).
  9. Li, L., Stefan, M. I. Le Novère N. Calcium input frequency, duration and amplitude differentially module the relative activation of calcineurin and CaMKII. PLoS One. 7 (9), 43810 (2012).
  10. Romano, D. R., Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursem, T. L. Competitive tuning: Competition's role in setting the frequency-dependence of Ca2+-dependent proteins. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005820 (2017).
  11. Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursen, T. L. Competitive Tuning Among Ca2+/Calmodulin-Dependent Proteins: Analysis of in silico Model Robustness and Parameter Variability. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (5), 353-365 (2018).
  12. Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes during early differentiation. Journal of Neuroscience. 14 (11), 6325-6335 (1994).
  13. Borodinsky, L. N., Root, C. M., Cronin, J. A., Sann, S. B., Gu, X., Spitzer, N. C. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429 (6991), 523-530 (2004).
  14. Ciccolini, F., Collins, T. J., Sudhoelter, J., Lipp, P., Berridge, M. J., Bootman, M. D. Local and Global Spontaneous Calcium Events Regulate Neurite Outgrowth and Onset of GABAergic Phenotype during Neural Precursor Differentiation. Journal of Neuroscience. 23 (1), 103-111 (2003).
  15. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium Waves Propagate through Radial Glial Cells and Modulate Proliferation in the Developing Neocortex. Neuron. 43 (5), 647-661 (2004).
  16. Nieuewkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
  17. Paudel, S., et al. Calcium Activity Dynamics Correlate with Neuronal Phenotype at a Single Cell Level and in a Threshold-Dependent Manner. International Journal of Molecular Science. 20 (8), 1880 (2019).
  18. Marken, J. P., et al. A Markovian Entropy Measure for the Analysis of Calcium Activity Time Series. PLoS One. 11 (12), 0168342 (2016).
  19. Eilers, P. H. C., Boelens, H. F. M. Baseline Correction with Asymmetric Least Squares Smoothing. Leiden University Medical Centre Report. , (2005).
  20. Guemez-Gamboa, A., et al. Non-cell-autonomous mechanism of activity-dependent neurotransmitter switching. Neuron. 82 (5), 1004-1016 (2014).
  21. Paredes, R., Madelaine,, et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 156 Ca2+ कैल्शियम कैल्शियम इमेजिंग कैल्शियम गतिविधि तंत्रिका विकास भ्रूण विकास न्यूरोट्रांसमीटर तंत्रिका विज्ञान
फ्लोरोसेंट कैल्शियम इमेजिंग और उसके बाद सिटू संकरण में <em>ज़ेनोपस लेवेइस</em> में न्यूरोनल अग्रदूत लक्षण वर्णन के लिए
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Ablondi, E. F., Paudel, S., Sehdev,… More

Ablondi, E. F., Paudel, S., Sehdev, M., Marken, J. P., Halleran, A. D., Rahman, A., Kemper, P., Saha, M. S. Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (156), e60726, doi:10.3791/60726 (2020).

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