Summary
Здесь мы представляем протокол для изучения виво локализации антител у мышей опухоли ксенотрансплантата моделей.
Abstract
Моноклональные антитела являются высокой сродством многофункциональных препаратов, которые работают с переменными независимыми механизмами для устранения раковых клеток. За последние несколько десятилетий наиболее перспективной областью основных и терапевтических исследований стала область конъюгированных антител антител, бисспецифических антител, химерных антигенных рецепторов (ЦАР) и иммунотерапии рака. С многочисленными успешными испытаниями на людях, направленных на иммунные рецепторы контрольно-пропускных мишеней и CAR-T клеток при лейкемии и меланоме в прорывном темпе, это очень захватывающие времена для онкологических терапевтических средств, полученных из вариаций антител инженерии. К сожалению, значительно большое количество антител и CAR основе терапии также оказались разочаровывающими в человеческих испытаний твердых раковых заболеваний из-за ограниченной доступности иммунных клеток-эффекторов в опухолевой постели. Важно отметить, что неспецифическое распределение терапевтических антител в тканях, помимо опухолей, также способствует отсутствию клинической эффективности, связанной с этим токсичности и клинической недостаточности. Поскольку верный перевод доклинических исследований в клинические тропы человека в значительной степени зависит от ксенотрансплантата мышей эффективности и безопасности исследований, здесь мы подчеркиваем метод для проверки опухоли и общего распределения тканей терапевтических антител. Это достигается путем маркировки белка-очищенные антитела с вблизи инфракрасного флуоресцентного красителя следуют живые изображения опухолевых мышей подшипника.
Introduction
FDA одобрило первый моноклональный антитела ориентации CD3 (OKT3, Muromonab) в 1986году 1,2. С тех пор в течение следующих двадцати лет, произошел быстрый взрыв в области инженерии антител из-за подавляющего успеха антител против ингибиторов иммунной контрольной точки3. Помимо косвенной активации иммунной системы, антитела в настоящее время направлены непосредственно флаг раковых клеток точно заниматься иммунных клеток эффектора, вызвать цитотоксиситу через агонист рецепторов смерти, блок выживания опухолевых клеток сигнализации, препятствовать ангиогенеза (рост кровеносных сосудов), ограничить иммунные регуляторы контрольно-пропускных псов, доставить радиоизотопы, химиотерапевтические препараты и siRNAв качестве спряженных агентов 2. Кроме того, изучение одной цепи переменных фрагментов (scFv) различных антител на поверхности пациента производных Т-клеток и НК-клеток (CAR-T и CAR-NK) является быстро растущей областью клинических исследований для клеточнойтерапии 4.
Сверхвысокое сродство препаратов на основе антител, которые обеспечивают избирательность к антигену, выражаюму опухолевые клетки, делает его привлекательным агентом. Аналогичным образом, целевая доставка и удержание опухоли терапевтического антитела (или химического препарата) является ключом к балансу эффективности над токсичностью. Таким образом, большое количество белков инженерных стратегий, которые включают, но неограничиваются бисспецифических 5 и трехспецифическихантител 6 в настоящее время используются для значительного повышения алчность оптимизированной опухоли удержания внутривенно (IV)вводили терапии 5,7. Здесь мы описываем простой метод на основе флуоресценции для решения опухоли и распределения тканей потенциально эффективных противоораком антител.
Поскольку ткани животных обладают автоматической флуоресценцией при возбуждении в видимом спектре, антитела были первоначально помечены вблизи инфракрасного красителя (например, IRDye 800CW). Для доказательства концептуальных исследований, мы использовали фолиевой рецептор альфа-1 (FOLR1) ориентации антитела называется farletuzumab и его производные называется Бисспецифический якорь Цитотоксичность активатор (BaCa)7 антитела, которые совместно цели FOLR1 и смерти рецептор-5 (DR5)8 в одном рекомбинантных антител. FOLR1 является четко определенным переэкспрессом целевого рецептора в раковых клетках яичников и TNBC, опухолевых ксенотрансплантатах и опухоляхпациентов 9. Примечательно, что Есть несколько усилий, чтобы клинически использовать FOLR1 с использованием антител на основе подходов для привлечения иммунных клеток эффектора и антител наркотиков конъюгации (ADC) для рака яичникови молочной железы 10,11.
В этой работе методов, мы клонировали, выразили и очищены клинические анти-FOLR1 (farletuzumab) наряду с другими антителами контроля с помощью системы выражения CHO. Isotype IgG1 и клиническое anti-idiotype mucin-16 антитело вызванное abagovomab12 были использованы как отрицательные управления. После очистки белка-А, указанные антитела были помечены IRDye 800CW и вводились в хвостовую вену обнаженных мышей либо подшипников опухоли яичников ксенотрансплантатов или ножом трансфицированных человека FOLR1 выражая мурин рака толстой кишки ксенотрансплантатов. Локализация антител отслеживалась живой визуализацией с использованием спектра визуализации in vivo в нескольких разных точкахвремени 7. Этот метод не требует каких-либо генетических модификаций или инъекций субстрата для обеспечения легкого излучения и значительно быстрее, рентабельнее и эффективнее. Общий протокол клонирования, экспрессии, очистки и маркировки, описанный ниже, может применяться к любым клиническим и неклиническим антителам, если имеются тяжелые и легкие цепные последовательности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с обращением с животными и исследования ксенотрансплантатами опухолей, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными (IACUC) здесь, в Университете Вирджинии, и соответствуют соответствующим нормативным стандартам
1. Выражение и очищение антител
- Обслуживание клеток CHO
- Расти CHO клетки в FreeStyle CHO Сми дополнены коммерчески доступны 1x глутамин дополнения при 37 градусов по Цельсию встряхивания при 130 об / мин с 5% CO2 с использованием delong Erlenmeyer колбы либо стекла или одноразовые.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать сбитую с толку колбу с вентилируемой крышкой для повышенной агитации и улучшить передачу газа во время встряхивания. Значительно сниженная урожайность антител была получена с помощью регулярных колб (не сбитых с толку) из-за ограниченной агитации культуры суспензии. - Поддерживайте номер ячейки между 1-5 x10 6 ячейками/мл с 95% жизнеспособностью клеток. Если количество клеток увеличивается более чем на 5 х10 6 ячеек/мл, разделите клетки. Никогда не позволяет клеткам CHO достичь ниже 0,2 х 106 ячеек/мл.
- Расти CHO клетки в FreeStyle CHO Сми дополнены коммерчески доступны 1x глутамин дополнения при 37 градусов по Цельсию встряхивания при 130 об / мин с 5% CO2 с использованием delong Erlenmeyer колбы либо стекла или одноразовые.
- Трансфекция клеток CHO
- Выращиваем клетки CHO в 200 мл мультимедиа (2 х 106 клеток/мл) в обету Эрленмейера, сбитого с толку колбами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подвеска культур, выращенных в сбит с толку колбы всегда производятся более высокие урожаи белка по сравнению с когда выращивается в не-озадаченных колбы. - В 15 мл трубки возьмите 5 мл средств массовой информации CHO FreeStyle и добавьте 50 мкг ДНК клона VH и 75 мкг ДНК клона VL. Vortex хорошо перемешать.
- Инкубировать смесь ДНК при комнатной температуре в течение 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более длинная инкубация снижает урожайность белка. - Добавьте 750 л полиэтилена (PEI) 1 мг/мл в раствор ДНК и агрессивно вихрем смеси на 30 с. Инкубировать при комнатной температуре еще 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: PEI должны быть сделаны свежими. Многократный цикл замораживания оттепели PEI значительно снижает общую урожайность. - Добавьте всю смесь ДНК и PEI на клетки, вручную встряхивая колбу. Немедленно инкубировать delong Erlenmeyer сбит с толку колбы с клетками при 37 градусов по Цельсию тряски при 130 об/мин.
- Выращиваем клетки CHO в 200 мл мультимедиа (2 х 106 клеток/мл) в обету Эрленмейера, сбитого с толку колбами.
- Выражение
ПРИМЕЧАНИЕ: Антитело имеет секреторный пептид сигнала, разработанный до его N-терминального конца, который помогает антителам быть секретированными в средствах массовой информации.- Выращиваем трансфицированные клетки при 37 градусах Цельсия, со тряской при 130 об/мин в день 1.
- На второй день добавьте 2 мл 100-кратного анти-слипания агента и 2 мл 100x антибактериально-антимикотического раствора. Сдвинуть колбу на более низкую температуру (32-34 градуса по Цельсию), со тряской при 130 об/мин.
- На каждый пятый день, добавить 10 мл триптона N1 корма, и 2 мл 100x глутамин дополнения.
- Продолжайте считать клетки каждый третий день с помощью гемоцитометра после окрашивания aliquot клеток с трипан синее пятно. Убедитесь, что жизнеспособность ячейки остается выше 80%.
- В день 10 или 11, урожай среды для очистки антител. Спин культуры на 3000 х г, 4 КК в течение 40-60 мин, а затем фильтровать четкие средства массовой информации с помощью 0,22 МКМ фильтры бутылки.
- Очистки
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка антител проводится с использованием коммерчески доступной колонки Protein-A (см. Таблицуматериалов), используя перистальтический насос.- Эквилибрировать столбец с двумя колонками объем связывающего буфера (20 мМ фосфата натрия при рН 7,4).
- Перейдите фильтрованные средства, содержащие антитела (полученные в шаге 1.3.5) через столбец со скоростью потока 1 мл/мин.
- Вымойте столбец двухколюйным объемом связывающего буфера.
- Elute антитела в 500 йл фракций с использованием 5 мл элюционного буфера (30 мМ ацетата натрия при рН 3,4).
- Нейтрализовать рН элализованного антитела, добавив 10 МКЛ буфера нейтрализации (3 М ацетата натрия при рН 9) на фракцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фракция номер 3-6 содержит большую часть антител. Целесообразно держать все фракции в случае, если антитела eluted в более поздней фракции, чем ожидалось. - Измерьте концентрацию очищенных антител с помощью спектрофотометра, выбрав протокол по умолчанию для IgG. Окончательная концентрация антитела получена в мг/мл с учетом молекулярного веса и коэффициента поглощения.
2. Флуоресцентная маркировка
ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела помечены инфракрасным красителем, который содержит nhs эстер реактивной группы, которая в паре с белками и образуют стабильный конъюгировать. Эта реакция рН чувствительна и лучше всего работает при рН 8.5. Флуоресцентные конъюгации, помеченные красителем, отображают абсорбционный максимум 774 нм и максимум выброса 789 нм. рН 8.5 является ключом к эффективному спряжению.
- Диализ 0,5 мл антитела с помощью диализной кассеты (0,1-0,5 мл) в 1 л спряженного буфера (50 мМ фосфатный буфер при рН 8,5). После 4 ч передачи диализа кассеты на свежий буфер и диализ на ночь.
- Настройка реакции спряжения, добавив 0,03 мг IRDye 800CW на 1 мг антитела в объеме реакции 500 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: IRDye 800CW растворяется в DMSO при концентрации 10 мг/мл. - Выполнить маркировки реакции на 2 ч при 20 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение времени за 2 ч не улучшает маркировку. - Очистите помеченные конъюгации обширным диализом против 1x PBS.
- Оцените степень маркировки путем измерения абсорбтности красителя на уровне 780 нм и поглощения белка на уровне 280 нм. Вклад красителя в сигнал 280 нм составляет 3%.
- Рассчитайте соотношение красителя и белка с помощью этой формулы:
где 0,03 является фактором коррекции абсорбции красителя, используемого при 280 нм (равно 3,0% его поглощения при 780 нм), εDye и εProtein являются коэффициентами вымирания молира для красителя и белка (антитела) соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: εкраситель составляет 270000 М-1 см -1 и ε Белок 203000 М-1 см -1 (для типичного IgG) в 1:1 смесь PBS: метанол. Белки, кроме IgG, могут иметь очень разные коэффициенты вымирания моляров. Использование правильного коэффициента вымирания для белка интереса имеет важное значение для точного определения соотношения D/P. - Рассчитайте окончательную концентрацию белка с помощью этой формулы:
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда подтверждайте антиген-связывающую эффективность маркированного и неоценеленного антитела с помощью ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) или цитометрии потока, прежде чем приступить к исследованиям in vivo.
3. Исследования ксенотрансплантата мыши
- Подготовка опухолевых клеток к инъекциям
- Выращиваем клетки OVCAR-3 в RPMI-1640 Medium, дополненные 10% FBS и 1x пенициллин-стрептомицин.
- За день до инъекции, субкультурные клетки в новые 100 мм культуры блюда с 10 мл полной среды / блюдо. Используйте номер ячейки 0,5-1 х 106 клеток/блюдо.
- Инкубационые культуры при температуре 37 градусов по Цельсию, влажность 95% и 5% CO2 для 20-24 ч.
- В день инъекции удалите среду роста из культурных блюд. Тщательно промыть клеточный слой с Ca2 "/Mg2" бесплатно Dulbecco фосфат-буферный солевой раствор (DPBS) для удаления мертвых клеток, клеточного мусора и все следы сыворотки, которые могут вмешиваться в действие трипсина.
- Трипсинизировать клетки, добавив 1,0-1,5 мл трипсина-EDTA решение для каждого блюда и попытаться распространить решение, наклоняя блюдо все вокруг следуют инкубации при 37 градусов по Цельсию в течение 5-10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за клетками под перевернутым микроскопом, чтобы проверить фактический статус трипсинизации. Под трипсинизацией приводит к меньшему количеству клеточного отслоения от поверхности культуры блюдо, над трипсинизацией вызывает клеточный стресс. Таким образом, надлежащая трипсинизация имеет важное значение. - Добавьте 1,0-1,5 мл полной среды роста к каждому блюду, чтобы остановить действие трипсина, после чего повторно приостанавливайте клетки, мягко трубя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нежный пипетки имеет важное значение для поддержания здоровья клеток. - Соберите подвеску клетки в коническую трубку 15 мл и вращайся при температуре 250 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Соберите гранулы клетки после удаления супернатанта и промыть клетки, повторно приостановив гранулы в 1x DPBS.
- Спин клеточной подвески на низкой скорости 250 х г в течение 5 мин.
- Добавьте 500 МКЛ DPBS и повторно приостанавливайте ячейки нежным пипетки, чтобы получить одноклеточную подвеску.
- Подсчитайте ячейки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей точности повторите подсчет три раза и возьмите в среднем. - Отрегулируйте громкость таким образом, чтобы окончательная плотность ячейки была 1 x 108 ячеек/мл.
- Подкожная инъекция клеток для разработки ксенотрансплантатов мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны быть сделаны в кабинете безопасности BSL2. Athymic Обнаженная Foxn1ню/ Foxn1мышей были использованы в текущем исследовании.- Возьмите 50 МКЛ клеточной подвески в трубку 1,5 мл и смешайте с 50 МКЛ среды матрицы мембраны подвала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подвал мембраны матрицы среды, как правило, образуют гель, как состояние при комнатной температуре, так тщательно поддерживать клетки и матрицы средней смеси на льду. Рекомендуется хранить трубки, наконечники и шприцы в холодильнике, а затем передавать на лед до инъекции животного. - Агитировать смесь, чтобы избежать каких-либо клеток слипания. Затем возьмите эти 100 МКЛ средней смеси клеточной суспензии-матрицы, которая содержит 5 х 106 клеток, в шприц 1 см.
- Аккуратно поднимите кожу животного, чтобы отделить кожу от основного мышечного слоя и медленно ввишейте под кожу клеточную суспензию (100 МКЛ) (5 х 106 клеток) с иглой 26 Г. Подождите несколько секунд, прежде чем принимать иглу, так что подвал матрицы среды может образовывать полутвердый гель, как структура вместе с клетками под кожей, предотвращая смесь выходит из места инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть проверены до инъекции для любого загрязнения, которое может нанести вред иммунодефицитных мышей. Хотя инъекционные не положить иглу слишком глубоко в кожу, как это может сформировать опухоль глубже, чем ожидалось. - Держите животное в стерильной клетке и наблюдайте около 20 минут.
- Наблюдайте за мышами в течение 2-3 недель и позвольте опухоли вырасти до 500 мм3 размера.
- Возьмите 50 МКЛ клеточной подвески в трубку 1,5 мл и смешайте с 50 МКЛ среды матрицы мембраны подвала.
4. Локализация антител с помощью системы визуализации in vivo
ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование для визуализации In vivo (см. таблицу материалов),используемое в этом эксперименте, использует набор высоков эффективности фильтров и спектральных алгоритмов не смешивания для неинвазивной визуализации и отслеживания клеточной и генетической активности в живом организме в режиме реального времени. Система обеспечивает как флуоресценцию, так и возможность мониторинга биолюминесценции.
- Ввимить 25 мкг красителя помечены антитела через хвостовую вену.
- Анестезировать опухолевых мышей с использованием 2% изофлюран. Проверьте отсутствие реакции на педаль рефлексы.
- Как только мыши перестанут двигаться, расширять боковой хвост вены, применяя червя воды.
- Ввись 25 мкг (в 100 МКЛ) помеченных антител с использованием 1 cc инсулина шприц с иглой 26 G.
- Аналогичным образом, в качестве отрицательного контроля, этикетки и вводить неспецифические IgG1 изотип антитела, которые не нацелены на раковые клетки.
- Выполните в vivo живую визуализацию после инъекций антител после 8, 24, 48 ч и т.д.
- В связанном программном обеспечении щелкните Initialize, расположенный в панели управления, и подтвердите, что температура стадии составляет 37 градусов по Цельсию.
- Включите подачу кислорода, все насосы на анестезии системы, изофлюран газоснабжение анестезии камеры и установить изофлюран испаритель клапана до 2%.
- Перенесите мышей в анестезиологическую камеру и подождите, пока мыши полностью обезболиты. Нанесите смазку глаза, чтобы избежать высыхания глаз.
- Перейти к панели управления, настроить флуоресценции изображения через опцию Imaging Wizard и выбрать возбуждение на 773 нм и выбросов на 792 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки автоматического воздействия по умолчанию обеспечивают хорошее флуоресцентное изображение. Тем не менее, предпочтения автоматического воздействия могут быть изменены в соответствии с потребностями. - Перенесите анестезированные мыши в камеру визуализации и соберите их на поле визуализации с помощью носового конуса. Этап визуализации предоставляет возможность размещения 5 мышей одновременно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иметь контроль мышей, изображенных вместе с тестовыми мышами, чтобы иметь аналогичное количество воздействия и других параметров во время анализа. - Как только все будет готово, выберите опцию Acquire на панели управления для приобретения изображения.
- С настройками Autoexposure система генерирует изображение в течение минуты. Сгенерированное изображение является наложением флуоресценции на фотографическое изображение с оптической интенсивностью флуоресценции, отображаемой в единицах графов или фотонов, или с точки зрения эффективности.
- После получения изображения, передать мышей из камеры визуализации обратно в клетку и наблюдать за их восстановления в течение 1 до 2 минут.
- Тонкая настройка изображения дальше с инструментами и функциями, предоставляемыми в программном обеспечении для анализа изображений. Инструменты анализа изображений находятся в палитре меню и инструмента.
- Под настройкойизображения, настроить яркость, контрастность или непрозрачность и выбрать цветовую шкалу.
- Используйте инструменты ROI для указать область интереса (ROI) в оптическом изображении и измерить интенсивность сигнала в пределах рентабельности инвестиций. При необходимости экспортировать количественные данные сигнала в программное обеспечение электронной таблицы и построения данных.
- Для последующих исследований проанализируйте некропсии мышей различных тканей (например, печени, легких, сердца, почек, селезенки, мозга и т.д.) бок о бок для детального неспецифического распределения флуоресцентно помеченных антител.
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть дополнительно подкреплены ткани конкретных ELISA, используя антиген (FOLR1 в этом случае) в 96 хорошо анализы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В описанной методологии, сначала мы клонировали антитела ориентации фолиевой рецептор альфа-1 (FOLR1) имени farletuzumab, и биспецифические антитела под названием BaCa, состоящий из farletuzumab и lexatumumab наряду с антителами контроля, таких как abagovomab (последовательности, представленные в дополнительном файле 1). Подробная информация о репрезентативных переменных тяжелых (VH) и переменном свете (VL) доменов в клонах ДНК (pVH, pVL) показана на рисунке 1A. Чтобы подтвердить положительные клоны, мы провели колонии ПЦР с использованием сигнала пептид вперед (SP For) и CK Rev/ CH3 Rev праймеры (последовательности, представленные в дополнительном файле 1). Репрезентативные результаты колонии ПЦР подтверждают ожидаемые размеры легких и тяжелых цепей(рисунок 1С). Положительные клоны антител были также подтверждены с помощью секвенирования Sanger. После подтвержденного клонирования ДНК pVH и pVL, трансфекции проводились с использованием культур подвески CHO, за которыми следовали очищение сродства столбца белка-А при 4 градусах по Цельсию (см. рисунок 1B и протокол для детального шага).
Репрезентативные результаты очищенного фарлетузумаба наряду с другими контрольными IgG1 (кроме антител BaCa, запускаемых на не уменьшающиеся и уменьшающие SDS PAGE показаны на рисунке 2A. Как видно, тяжелая и легкая цепь произвела 50 и 25 полос KDa после сокращения. За этим последовало обязательное подтверждение антител к родным белкам на поверхности клетки. Представитель farletuzumab связывания с человеком FOLR1 на поверхности клеток OVCAR3 показано с помощью цитометриипотока (рисунок 2B).
Следующими флуоресцентно помеченными антителами были хвостовые вены, вводимые животным, привитыми FOLR1, выражают опухоли(рисунок 3). Звери были живые изображения в нескольких точках времени с помощью IVIS. Данные подтверждают селективное обогащение антител FOLR1 и BaCa в опухоли FOLR1(рисунок 4 и рисунок 5). Важно контролировать антитела (отрицательные для опухолевых антигенов) не локализовать в опухоли.
Рисунок 1: Схема клонирования антител, экспрессии и очищения.
(A) Показывает схему деталей тяжелых (pVH) и векторов цепи света (pVL). (B) вектор pVH, несущий переменную последовательность домена тяжелой цепи IgG1 и вектора pVL, несущего переменную последовательность домена световой цепи, были смешаны вместе (1:2 соотношения) вместе с реагентами трансфекции (такими как mirus или PEI) перед добавлением к культуре подвески клеток CHO или HEK. Клетки кормили дополнительным кормом на следующий день, а культуры отслеживались в течение 10 дополнительных дней с прерывистым кормлением. В день 11, клетки были собраны через 0,2 мкм PES фильтры следуют сродства хроматографии с использованием белка-А. Затем были проанализированы очищенные антитела для % мономеров (FPLC), связывающей активности (ELISA или SPR) и связывания с целевым антигеном (FACS) на живых клетках. Антитела также могут быть проверены на анализы in vivo (например, ингибирование роста клеток, анализ жизнеспособности клеток или ингибирование сигнализации промежуточного фосфорилирования и т.д.). Антитела также могут быть спряжены с далеко-красными красителями, например, IRDye 800CW для визуализации in vivo. ± IRDye 800CW должны быть проверены на деятельность до исследования опухоли и распределения тканей. (C)Агарозы гели колонии ПЦР, подтверждающие размеры положительных тяжелых (1,4 кб) и световой цепи (0,8 кб) клонов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Гель основе сокращения анализа для подтверждения целостности антител.
(A) Четыре различных антитела IgG1 (схема показано на вершине) были добавлены ± уменьшая агент (например, BME или DTT) при 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Антитела были затем загружены на 10% SDS-PAGE гель следуют окрашивания белка и изображений. Гель изображение в левой и правой четко показывают нетронутыми антитела и два отдельных полипептидов (No 50 KDa и No 25 KDa) соответственно. Пожалуйста, также смотрите карты векторов pVH и pVL(рисунок 1)с кДН, соответствующей доменам VH/VL, CH1/CK, CH2 и CH3. (B) Поток цитометрии подтверждение неоцебленной и IRDye 800CW помечены farletuzumab связывания с родной FOLR1 на раковых клетках яичников. Не уменьшающиеся антитела работают на геле с не уменьшая красителем, Уменьшая антитела бег на геле с уменьшая красителем, HC - Тяжелая цепь, ЦЕПЬ LC - Светлая цепь, VL - Переменный домен светлой цепи, VH - Переменный домен тяжелой цепи, цепь Kappa Пожалуйста щелкните здесь для того чтобы осмотреть более большую версию этой рисунка.
Рисунок 3: Экспериментальная схема генерации опухоли и лечения антител.
6-8 недель штаммов мышей, таких как: Иммунодефицитный атимический обнаженной / NSG / Иммунокомпетентных C57BL/6 или Balb / C мышей может быть легко привиты с опухолевыми клетками через подкожные (СЗ) опухоли. Аналогичные исследования могут быть проведены с использованием молочного жира и внутриперитонеальной (IP) опухолей. 3-4 недели спустя (опухоль No 200 мм 3 ),мышейбыли введены с IRDye помечены указанные антитела, которые ± селективными против опухолевых рецепторов. За этим последовала живая визуализация vivo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Live in-vivo изображения человека OVCAR3 опухоли подшипников мышей.
Случайно выбранные от 6 до 8 недель (возраст) и 20-25 грамм (вес) лысый атимический Обнаженная Foxn1ню/Foxn1 (Envigo) были привиты с FOLR1 и опухолей яичников (OVCAR-3 клеток). После 3 недель с очевидными опухолями, мыши были хвостовой вены вводили IRDye 800CW помечены IgG1 управления, abagovomab (CA-125 анти-идиотипические антитела), farletuzumab (анти-FOLR1 антитела) и BaCa (анти-FOLR1-DR5 антитела) следуют живой визуализации в указанное время. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Live in-vivo изображения человека FOLR1 выражая мурин MC38 клеток, полученных опухолевых мышей.
(A)Случайно выбранные от 6 до 8 недель (возраст) и 20-25 г NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ или обнаженные мыши были введены с murine MC38 клетки стабилико выражая человека FOLR1. При появлении опухоли мышам вводили хвостовую вену с помощью IRDye 800CW с маркировкой IgG1 control, abagovomab (CA-125 анти-идиотиопическое антитело), фарлетузумаб (анти-FOLR1 антитела) и BaCa (анти-FOLR1-DR5 антитела), а затем живую визуализацию в указанное время. (B)После 7 дней животные были усыпаны и изолированы ключевые органы (как указано) были изображены вместе вместе с привитыми опухолями для относительного сигнала антитела (IRDye 800CW) распределения. Как и ожидалось, опухоли оставались отрицательными с сигналом IRDye 800CW в igG1 управления и CA-125 анти-идиотипные антитела, abagovomab инъекционных животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1: Последовательности всех антител и грунтовок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Селективная и опухолевая ткань специфической доставки противооопухольной терапевтического агента является ключом к измерению эффективности и безопасности данной целевойтерапии 13. Здесь мы описали быстрый и эффективный подход к исследованию детального распределения тканей и опухолей клинического, фарлетузумаба и неклинического антитела BaCa. Описанный подход применим к любым новым антителам и может быть использован наряду с клинически эффективным антителом (с желаемыми качествами) для его свойств распределения опухоли/органа. Учитывая большинство антител целевых рецепторов (таких как HER2 в рак молочной железы) очень переэкспрессированы в опухолевых клетках (ткани), в большинстве случаев их неоптимального выражения и функции также имеет решающее значение в типах клеток, кроме опухолевыхклеток 14. Например, значительная часть EGFR ориентации клинических антител у больных раком толстой кишки накапливаются и вызываюттоксичность для ткани кожи 15, нераковой ткани, рост и дифференциация которых требует EGFR сигнализации и функции. Таким образом, мы твердо верим, что такого рода предварительные исследования распределения тканей в сочетании с гепатотоксичностью и анализами гистохимии тканей в более широкой когорте животных являются ключом к всесторонней оценке безопасности и терапевтической жизнеспособности вновь генерируемого антитела. Кроме того, описанные исследования распределения тканей также были бы весьма применимы в иммунных компетентных исследованиях ксенотрансплантата мышей, если недавно сгенерированное антитело поддерживает перекрестную реактивность к антигену/рецептору murine. В сингенеических исследованиях на животных, наряду с распределением опухолей и исследованиями гистохимии тканей, подробный анализ цитокинов крови может быть использован для укрепления эффективности и безопасности данных. Привлекательной особенностью описанного подхода является то, что он позволяет почти точной количественной оценки распределения антител, если данные дополнительно поддерживается ELISA (против целевого антигена) из опухоли и других значительных ликатов тканей (таких как печень, сердце, легкие, селезенка, почки ит.д.) 7. Еще одной важной особенностью описанного метода по однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (так называемой SPECT) и позиционной эмиссионной томографии (ПЭТ)является рентабельность 16. Оба SPECT и ПЭТ являются очень дорогими и использует радиоактивные трассировщики для визуализации, что делает весь процесс громоздким, если тестирование большой когортыживотных 17. Кроме того, SPECT и ПЭТ-изображения объектов не очень стандартные в лабораториях и вивариумах для изучения малых животных моделей заболеваний, таких как мыши18.
Одним из ограничений с описанным методом для достижения почти точной количественной оценки распределения опухоли антител является зависимость от высокой сродства целевой антиген связывания. Это потому, что высокое сродство антиген-антител взаимодействия могут привести к "целевой опосредованной диспозиции наркотиков (TMDD)" путем повышения эндоцитоза и кометлинг для лизосом19. Таким образом, результаты описанного подхода будут варьироваться в зависимости от конкретного целевого рецептора в определенном типе опухоли. Таким образом, мы настоятельно рекомендуем тестирование помеченных антител/антител в большой когорте животных с опухолевыми ксенотрансплантами, генерируемыми с более чем одной линией опухолевых клеток (ы), имеющих переменную (неоднородную) экспрессию целевого антигенного рецептора. Кроме того, настоятельно рекомендуется использовать более одного флуоресцентного конъюгного красителя (ы) и штамма мышей (ы) для предлагаемых исследований.
Учитывая, что небольшие антитела размера, такие как Fabs, scFvs, BiTes, DARTs и т.д. (отсутствие спасения рециркуляции неонатальным рецептором Fc (FcRn) ясно быстрее от опухолей (с сывороткой в два раза минут до нескольких часов), следует позаботиться, чтобы сравнить данные между различными типами опухолей, имеющих весьма переменной экспрессии FcRn. Кроме того, более крупные молекулы (такие как двойные и триспецифические антитела), которые разработаны с доменом Fc для спасения рециркуляции имеют ткани / проблемы проникновения опухоли. В этих сценариях описанный подход не подходит для сравнения распределения тканей и опухолей антител, которые значительно отличаются по размерам6. С точки зрения значимости, однако, описанные опухоли и подробные исследования распределения тканей вместе с их коллегой моноспецифических антител будет служить ключевым фактором в эффективной двойной и триспецифической конструкции платформы антител. Наконец, поскольку более высокое сродство и алчность оптимизированных антител, как правило, имеют значительно однородное распределение в опухолях, целевой выбор эпитопа опухоли (отсутствие TMDD), общая близость антител и биологической активности в конкретной модели рака всегда должны быть рассмотрены, прежде чем сделать вывод о проникновении опухоли, безопасности и эффективности.
Таким образом, мы описали быстрый и простой метод мониторинга опухоли и распределения тканей внутривенно введенных антител. Описанный подход добавил потенциал для анализа антител-siRNA конъюгированных (где siRNA помечены), антитела наркотиков конъюгации (где препарат помечен) и антитела-наночастицы (где наночастицы липиды помечены флуоресцентным красителем). Аналогичным образом, уникально инженерии остатков цистеин в опухоли ориентации scFv (если флуоресцентно помечены меламид химии) химерных рецепторов антигена Т-клеток (CAR-T) и CAR-NK будет экономически эффективным подходом для анализа опухоли / ткани распределения этих клеток на основе терапии независимо от вирусной трансфекции на основе GFP / RFP сигналов стратегий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны Университету Вирджинии онкологический центр Core Imaging фонда, биомолекулярного анализа фонда, Расширенный микроскопии фонда и основной Виварий фонда для оказания помощи. J. T-S является ранней карьеры следователя Академии рака яичников (OCA-DoD). Эта работа была поддержана грантом NCI/NIH (R01CA2333752) J. T-S, Программой исследований рака молочной железы (BCRP) прорывной премии уровня-1 J. T-S (BC17097) и премией США по исследованию рака яичников (OCRP) (OCRP) J. T-S
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
