Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att studera in vivo lokalisering av antikroppar i möss tumör xenograft modeller.
Abstract
Monoklonala antikroppar är hög affinitet multifunktionella läkemedel som verkar genom variabel oberoende mekanismer för att eliminera cancerceller. Under de senaste decennierna har området antikropp-läkemedel konjugater, bispecifika antikroppar, chimära antigenreceptorer (CAR) och cancer immunterapi framträtt som det mest lovande området för grundläggande och terapeutiska undersökningar. Med många framgångsrika mänskliga försök riktade immun checkpoint receptorer och CAR-T-celler i leukemi och melanom i en genombrottstakt, är det mycket spännande tider för onkologiska therapeutics härrör från variationer av antikroppar engineering. Tyvärr har ett betydligt stort antal antikroppar och CAR-baserade therapeutics också visat sig vara en besvikelse i mänskliga prövningar av fasta cancerformer på grund av den begränsade tillgången på immuneffektorceller i tumörbädden. Viktigt, ospecifik fördelning av terapeutiska antikroppar i andra vävnader än tumörer bidrar också till bristen på klinisk effekt, associerad toxicitet och klinisk misslyckande. Som trogen översättning av prekliniska studier i mänskliga kliniska spår är starkt förlitat sig på möss tumör xenograft effekt och säkerhet studier, här vi belysa en metod för att testa tumör och allmänna vävnad distribution av terapeutiska antikroppar. Detta uppnås genom att märka proteinet-A renad antikropp med nära IR fluorescerande färgämne följt av levande avbildning av tumörbärande möss.
Introduction
FDA godkände den första monoklonala antikroppen inriktning CD3 (OKT3, Muromonab) i 19861,2. Sedan dess under de kommande tjugo åren har det skett en snabb explosion inom området för antikroppsteknik på grund av den överväldigande framgången för antikroppar mot immun kontrollpunktshämmare3. Bredvid indirekt aktivering av immunsystemet, antikroppar syftar till att direkt flagga cancerceller att exakt engagera immun effektorceller, utlösa cytotoxicitet via död receptogonist, blockera tumör cell överlevnad signalering, hindra angiogenes (tillväxt av blodkärl), begränsa immun checkpoint regulatorer, leverera radioisotoper, kemoterapi läkemedel och siRNA som en konjugerad agenter2. Dessutom är studera den enda kedjan variabel fragment (scFv) av olika antikroppar på ytan av patienten härrör T-celler och NK celler (CAR-T och CAR-NK) ett snabbt växande område av kliniska undersökningar för cell-baserade terapier4.
Den ultrahöga affiniteten av antikroppsbaserade läkemedel som ger selektivitet mot antigen som uttrycker tumörceller gör det till ett attraktivt medel. Likaså är riktad leverans och tumör lagring av en terapeutisk antikropp (eller ett kemiskt läkemedel) nyckeln till balans effekt över toxicitet. Därför är ett stort antal protein engineering baserade strategier som inkluderar men inte är begränsade till bispecifika5 och tri-specifika antikroppar6 utnyttjas för att avsevärt förstärka avidity optimerad tumörretention av intravenöst (IV) injicerade therapeutics5,7. Här beskriver vi en enkel fluorescens-baserad metod för att ta itu med tumör och vävnad distribution av potentiellt effektiva anti-cancer antikroppar.
Eftersom djurvävnader besitter auto-fluorescens när upphetsad i synligt spektrum, var antikropparna ursprungligen märkta med nära IR-färgämne (t.ex., IRDye 800CW). För proofs of concept investigations har vi utnyttjat folatreceptorn alpha-1 (FOLR1) med inriktning på antikropp som kallas farletuzumab och dess derivat som kallas Bispecific anchor Cytotoxicity activator (BaCa)7 antibody that co-targets FOLR1 and death receptor-5 (DR5)8 in one recombinant antibody. FOLR1 är en väldefinierad överuttryckt målreceptor i äggstocks- och TNBC-cancerceller, tumörxenografts och patienttumörer9. Noterbart är att det finns flera försök att kliniskt utnyttja FOLR1 med hjälp av antikroppsbaserade metoder för att engagera immuneffektorceller och antikroppar läkemedel konjugater (ADC) för äggstockscancer och bröstcancer10,11.
I detta metoder papper, vi klonade, uttryckt och renade kliniska anti-FOLR1 (farletuzumab) tillsammans med andra kontroll antikroppar med hjälp av CHO uttryck system. IgG1 isotype och en klinisk anti-idiotype mucin-16 antikroppar kallas abagovomab12 användes som negativa kontroller. Efter protein-A rening, indikerade antikroppar var märkt med IRDye 800CW och administrerades i svansen ven av nakna möss antingen med äggstockscancer tumör xenografts eller stably transfected mänskliga FOLR1 uttrycker murine kolon cancer xenografts. Antikroppslokalisationen spårades av live avbildning med hjälp av in vivo imaging spektrum vid flera olika tidpunkter7. Denna metod kräver inte någon genetisk modifiering eller injektion av substratet för att möjliggöra ljusemission och är betydligt snabbare, kostnadseffektiv och effektiv. Det allmänna klonings-, uttrycks-, renings- och märkningsprotokollet som beskrivs nedan kan tillämpas på vilken klinisk och icke-klinisk antikropp som helst om tung- och lätta kedjesekvenser finns tillgängliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar djurhantering och tumör xenografts studier granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) här vid University of Virginia och överensstämmer med de relevanta lagstadgade normerna
1. Uttryck och rening av antikroppar
- Underhåll av CHO-celler
- Odla CHO-celler i FreeStyle CHO Media kompletteras med kommersiellt tillgängliga 1x glutamin tillägg vid 37 °C skakning vid 130 rpm med 5% CO2 med hjälp av avlånga Erlenmeyer kolvar antingen glas eller engångs.
OBS: Det rekommenderas starkt att använda en förbryllad kolv med avluftat lock för ökad agitation och för att förbättra gasöverföringen vid skakningar. Signifikant minskat antikroppsutbyte har erhållits med vanliga kolvar (ej förbryllade) på grund av begränsad agitation av suspensionskulturen. - Behåll cellnumret mellan 1–5 x 106 celler/mL med >95 % cellens livskraft. Om cellnumret ökar över 5 x 106 celler/mL, dela upp cellerna. Tillåter aldrig ATTK-celler att nå under 0,2 x 106 celler/mL.
- Odla CHO-celler i FreeStyle CHO Media kompletteras med kommersiellt tillgängliga 1x glutamin tillägg vid 37 °C skakning vid 130 rpm med 5% CO2 med hjälp av avlånga Erlenmeyer kolvar antingen glas eller engångs.
- Transfektion av CHO-celler
- Odla CHO-celler i 200 mL media (2 x 106 celler/mL) i avlånga Erlenmeyer förbryllade kolvar.
OBS: Suspensionskulturer som odlas i förbryllade kolvar har alltid gett högre proteinavkastning jämfört med när de odlas i icke-förbryllade kolvar. - I ett 15 mL-rör, ta 5 mL CHO FreeStyle media och tillsätt 50 μg VH klon-DNA och 75 μg VL-klon-DNA. Vortex att blanda väl.
- Inkubera DNA-blandningen i rumstemperatur i 5 min.
OBS: Längre inkubation minskar proteinavkastningen. - Tillsätt 750 μL av 1 mg/mL polyetylenimin (PEI) lager till DNA-lösningen och aggressivt vortexa blandningen för 30 s. Inkubera i rumstemperatur i ytterligare 5 min.
OBS: PEI måste göras färska. Flera frysa tö cykel av PEI minskar totala avkastningen avsevärt. - Tillsätt hela blandningen av DNA och PEI på cellerna samtidigt som du skakar kolven manuellt. Omedelbart inkubera delong Erlenmeyer förbryllade kolvar med celler vid 37 °C skakning vid 130 rpm.
- Odla CHO-celler i 200 mL media (2 x 106 celler/mL) i avlånga Erlenmeyer förbryllade kolvar.
- Uttryck
OBS: Antikroppen har sekretorisk signal peptid konstruerad till sin N-terminal, som hjälper antikroppar att utsöndras ut i media.- Odla de transfekterade cellerna vid 37 °C, med skakningar vid 130 rpm på Dag 1.
- På Dag 2, tillsätt 2 mL av 100x anti-klumpmedel och 2 mL av 100x anti-bakteriell-anti-mykotisk lösning. Förskjut kolven till lägre temperatur (32-34 °C), med skakningar vid 130 varv/min.
- På var femte dag, tillsätt 10 mL tryptone N1 foder, och 2 mL av 100x glutamin tillägg.
- Fortsätt räkna cellerna var tredje dag med hemocytometer efter färgning en alikvot av celler med trypan blå fläck. Se till att cellens livskraft håller sig över 80 %.
- På dag 10 eller 11, skörda mediet för antikroppsrening. Snurra kulturen i 3000 x g, 4 °C i 40-60 min och filtrera sedan det klara mediet med hjälp av 0,22 μM-flaskfilter.
- Rening
OBS: Antikroppsrening utförs med hjälp av kommersiellt tillgänglig Protein-A-kolonn (se Table of Materials), med hjälp av en peristaltisk pump.- Jämviktskolonnen med två pelarvolym av bindningsbuffert (20 mM natriumfosfat vid pH 7.4).
- För det filtrerade media som innehåller antikropp (erhållet i steg 1.3.5) genom kolonnen vid flödet av 1 mL/min.
- Tvätta kolonnen med tvåpelarvolym av bindningsbuffert.
- Elutera antikroppen till 500 μL-fraktioner med hjälp av 5 mL elueringsbuffert (30 mM natriumacetat vid pH 3,4).
- Neutralisera pH-värdet för den eluterade antikroppen genom att tillsätta 10 μL neutraliseringsbuffert (3 M natriumacetat vid pH 9) per fraktion.
OBS: Bråknummer 3-6 innehåller det mesta av antikroppen. Det är lämpligt att hålla alla fraktioner i fall antikroppen eluteras i en senare fraktion än väntat. - Mät koncentrationen av renad antikropp med hjälp av en spektrofotometer genom att välja standardprotokoll för IgG. Den slutliga koncentrationen av antikroppen erhålls i mg/mL genom att beakta molekylvikten och absorptionskoefficienten.
2. Lysrörsmärkning
OBS: Antikroppar är märkta med det infraröda färgämnet som innehåller en NHS esterreaktiva grupp, som par till proteiner och bildar en stabil konjugat. Denna reaktion är pH-känslig och fungerar bäst på pH 8.5. Fluorescerande konjuger märkta med färgämnet display en absorption högst 774 nm, och ett utsläpp högst 789 nm. pH 8.5 är nyckeln för effektiv konjugering.
- Dialyze 0,5 mL av antikroppen med hjälp av en dialyskassett (0,1-0,5 mL) i 1 L av konjugeringsbuffert (50 mM fosfatbuffert vid pH 8,5). Efter 4 h överför dialyskassetten till färsk buffert och dialys över natten.
- Setup en konjugation reaktion genom att lägga till 0,03 mg IRDye 800CW per 1 mg av antikropp i en reaktionsvolym på 500 μL.
OBS: IRDye 800CW löses i DMSO vid en koncentration av 10 mg/mL. - Utför etiketteringsreaktioner i 2 h vid 20 °C.
OBS: Att öka tiden längre än 2 h förbättrar inte märkningen. - Rena märkta konjuger genom omfattande dialys mot 1x PBS.
- Uppskatta märkningsgraden genom att mäta färgämnets absorbans vid 780 nm och absorbans av proteinet vid 280 nm. Färgämnet bidrag till 280 nm signalen är 3%.
- Beräkna färgämnet/proteinförhållandet med hjälp av denna formel:
där 0,03 är en korrektionsfaktor för absorbansen hos det färgämne som används vid 280 nm (lika med 3,0 % av dess absorbans vid 780 nm), εDye och εProtein är molarutdöendekoefficienter för färgämnet respektive proteinet (antikroppen).
OBS: εDye är 270.000 M-1 cm-1 och εProtein är 203.000 M-1 cm-1 (för en typisk IgG) i 1:1 blandning av PBS: metanol. Proteiner än IgG kan ha mycket olika molar utrotningskoefficienter. Användning av korrekt utrotningskoefficient för det protein av intresse är avgörande för korrekt bestämning av D/P-förhållande. - Beräkna den slutliga proteinkoncentrationen med hjälp av denna formel:
OBS: Bekräfta alltid den antigenbindande effekten av märkt och omärkt antikropp med hjälp av ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) eller flödescytometri innan du fortsätter till in vivo-studier.
3. Studier av mouse xenograft
- Beredning av tumörceller för injektion
- Odla OVCAR-3 celler i RPMI-1640 Medium, kompletterat med 10% av FBS och 1x penicillin-streptomycin.
- Dagen före injektionen, subkultur celler i nya 100 mm kultur rätter med 10 mL av komplett medium / skålen. Använd cellnummer på 0,5-1 x 106 celler/maträtt.
- Inkubera kulturer vid 37 °C-temperatur, 95 % luftfuktighet och 5 % CO2 för 20-24 h.
- På injektionsdagen, ta bort tillväxtmediet från odlingsrätter. Skölj noga cellskiktet med Ca2+/Mg2+ gratis Dulbeccos fosfatbuffrade koksaltlösning (DPBS) för att avlägsna döda celler, cellavfall och alla spår av serum, som kan störa trypsin-verkan.
- Trypsinize cellerna genom att lägga till 1,0-1,5 mL Trypsin-EDTA lösning till varje maträtt och försöka sprida lösningen genom att luta skålen runt följt av inkubation vid 37 °C i 5-10 min.
OBS: Observera celler under ett inverterat mikroskop för att kontrollera den faktiska trypsinization status. Under trypsinization resulterar i lägre antal cellavlossning från ytan av kultur skålen, över trypsinization inducerar cellulär stress. Så, ordentlig trypsinization är viktigt. - Lägg till 1,0-1,5 mL av komplett tillväxtmedium till varje maträtt för att stoppa trypsin-åtgärden, efter att åter upphäva celler genom pipettering försiktigt.
OBS: Skonsam pipetting är viktigt för att bibehålla cellhälsan. - Samla in cellupphängningen i ett koniskt rör på 15 mL och snurra i 250 x g i 5 min i rumstemperatur.
- Samla cellpelletsen efter att du tagit bort supernatanten och tvätta cellerna genom att åter upphäva pelleten i 1x DPBS.
- Snurra cellupphängningen med låg hastighet 250 x g i 5 min.
- Tillsätt 500 μL DPBS och åter suspendera celler genom skonsam pipettering för att få encellsupphängning.
- Räkna celler med hjälp av hemocytometer eller automatiserad cellräknare.
OBS: För bättre noggrannhet, upprepa räkna för tre gånger och ta ett medelvärde. - Justera volymen på ett sådant sätt så att den slutliga celltätheten blir 1 x 108 celler/mL.
- Subkutan injektion av celler för att utveckla mus xenografts
OBS: Alla procedurer ska göras i ett BSL2-säkerhetsskåp. Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ möss har använts i den aktuella studien.- Ta 50 μL av cellupphängningen till ett 1,5 mL-rör och blanda med 50 μL av källarmembranmatrismediet.
OBS: Basement membran matrismedium tenderar att bilda en gel som tillstånd vid rumstemperatur, så noggrant behålla cellerna och matrismediet blandningen på is. Det är lämpligt att förvara rör, spetsar och sprutor i kylen och sedan överföra på is före djurinjektionen. - Agitera blandningen för att undvika cellklumpning. Ta sedan denna 100 μL av cellupphängningen-matrismediet blandningen som innehåller 5 x 106 celler, i en 1 cc spruta.
- Lyft försiktigt djurets hud för att separera huden från det underliggande muskellagret och långsamt injicera cellfjädringen (100 μL) under huden (5 x 106 celler), med en 26 G-nål. Vänta i några sekunder innan du tar nålen ut, så att källaren matris medium kan bilda halvfast gel som struktur tillsammans med celler under huden, vilket förhindrar blandningen kommer ut från injektionsstället.
OBS: Celler måste testas före injektion för någon kontamination som kan skada immundeficienta möss. Medan injicera inte sätta nålen för djupt in i huden eftersom detta kan bilda tumören djupare än väntat. - Håll djuret i en steril bur och observera i cirka 20 min.
- Observera mössen i 2-3 veckor och låt tumören växa upp till 500 mm3-storlek.
- Ta 50 μL av cellupphängningen till ett 1,5 mL-rör och blanda med 50 μL av källarmembranmatrismediet.
4. Antikroppslokalisering med hjälp av ett in vivo-bildsystem
OBS: In vivo bildåtergivning utrustning (se Tabell över material) används i detta experiment använder en uppsättning av hög effektivitet filter och spektrala UN-blandning algoritmer för noninvasive visualisering och spårning av cellulär och genetisk aktivitet inom en levande organism i realtid. System ger både fluorescens och bioluminescens övervakning förmåga.
- Injicera 25 μg färgämne märkt antikropp via svans ven.
- Anesthetize tumör bärande möss med hjälp av 2% isofluran. Kontrollera om det saknas svar på pedalreflexer.
- När möss slutar röra sig, vidga den laterala svansvenen genom att applicera maskvatten.
- Injicera 25 μg (i 100 μL) av märkt antikropp med 1 cc insulinspruta med en 26 G-nål.
- Likavis, som en negativ kontroll, märka och injicera den icke-specifika IgG1 Isotype antikropp som inte riktar cancerceller.
- Utför in vivo live imaging efter 8, 24, 48 h, etc. av antikroppsinjektioner.
- I den tillhörande programvaran klickar du på Initialisera som finns på kontrollpanelen och bekräftar att scenens temperatur är 37 °C.
- Slå på syretillförseln, alla pumpar på anestesisystemet, isoflurangasförsörjning till anestesikammaren och ställ in isoflurane VAPORIZER-ventilen till 2%.
- Överför mössen till bedövningskammaren och vänta tills mössen är helt sövda. Applicera ögat smörja salva för att undvika torkning av deras ögon.
- Gå till kontrollpanelen, ställ in avbildningen fluorescens genom Imaging Wizard-alternativet och välj excitationen vid 773 nm och emission vid 792 nm.
OBS: Standardinställningarna för automatisk exponering ger en bra fluorescerande bild. Men, den automatiska exponeringen preferenser kan ändras enligt behoven. - Överför de sövda mössen till bildkammaren och montera den på bildfältet med hjälp av noskon. Bildfasen ger möjlighet att rymma 5 möss åt gången.
OBS: Har kontroll möss avbildas tillsammans med testet möss att ha en liknande mängd exponering och andra inställningar medan analys. - När allt är klart, välj Förvärva alternativet på kontrollpanelen för bild förvärvet.
- Med Autoexponeringsinställningar genererar systemet bilden inom en minut. Den genererade bilden är överlagring av fluorescens på fotografisk bild med optisk fluorescensintensitet som visas i enheter av antal eller fotoner, eller i fråga om effektivitet.
- Efter att ha förvärvat bilden, överför mössen från bildbehandlingskammaren tillbaka till sin bur och observera för deras återhämtning i 1 till 2 min.
- Finjustera bilden ytterligare med de verktyg och funktioner som tillhandahålls inom programvaran för bildanalys. Bildanalysverktyg finns i menyraden och verktygspaletten.
- Justera ljusstyrka,kontrast eller opacitet under Bildjustera och välj färgskala.
- Använd roi-verktygen för att ange en region av intresse (ROI) i en optisk bild och mäta signalintensiteten inom avkastningen på investeringen. Om det behövs, exportera kvantifierade signaldata till ett kalkylblad programvara och rita data.
- För uppföljande studier analysera möss obduktioner av olika vävnader (t.ex. lever, lunga, hjärta, njure, mjälte, hjärnan etc.) sida vid sida för en detaljerad icke-specifik fördelning av fluorescently märkt antikropp.
OBS: Data kan ytterligare stödjas med vävnadsspecifika ELISA genom att använda sig av antigen (FOLR1 i detta fall) i 96 well-analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den beskrivna metodiken klonade vi först antikroppar riktade mot folatreceptorn alpha-1 (FOLR1) med namnet farletuzumab, och en bispecific antikropp som kallas BaCa som består av farletuzumab och lexatumumab tillsammans med kontrollantikroppar som abagovomab (sekvenser som tillhandahålls i Supplementary File 1). Uppgifter om representativa variabel tunga (VH) och variable light (VL) domäner i DNA-kloner (pVH, pVL) visas i figur 1A. För att bekräfta de positiva klonerna genomförde vi koloni PCR med hjälp av signalpeptid framåt (SP For) och CK Rev/CH3 Rev-primers (sekvenser som tillhandahålls i Supplementary File 1). Representativa resultat av koloni PCR bekräfta de förväntade storlekarna av lätta och tunga kedjor (Figur 1C). Positiva antikroppar kloner var, också, bekräftas med hjälp av Sanger sekvensering. Efter bekräftad pVH och pVL DNA-kloning utfördes transfections med CHO suspension kulturer, följt av protein-A kolumn affinitet rening av antikroppar vid 4 °C (se figur 1B och protokoll för detalj steg).
Representativa resultat av renat farletuzumab tillsammans med annan kontroll IgG1 (utom BaCa-antikropp som körs på icke-reducerande och reducerande SDS PAGE visas i figur 2A. Som uppenbart, tunga och lätta kedjan produceras 50 och 25 KDa band efter minskning. Detta följdes av bindande bekräftelse av antikroppar mot inhemska proteiner på cellytan. Representativ farletuzumab bindning till human FOLR1 på OVCAR3 celler yta visas med hjälp av flödescytometri (Figur 2B).
Nästa fluorescerande märkt antikroppar var svans ven injiceras i djur ympade med FOLR1 uttrycker tumörer (Figur 3). Djur var levande avbildas vid flera tidpunkter med hjälp av IVIS. Uppgifterna bekräftar selektiv anrikning av FOLR1- och BaCa-antikroppar i FOLR1+ tumörerna (figur 4 och figur 5). Viktigt kontroll antikroppar (negativt för tumör antigen) inte lokalisera till tumörer.
Figur 1: Schematisk för antikroppskloning, uttryck och rening.
(A) Visar detalj schematisk av tunga (pVH) och lätta (pVL) kedjevektorer. (B) pVH-vektor bär variabel domän sekvens av en IgG1 tung kedja och pVL vektor bär variabel domän sekvens av en ljuskedja blandades ihop (1:2 ratio) tillsammans med transfection reagenser (såsom mirus eller PEI) innan du lägger till suspensionen kultur av CHO eller HEK celler. Celler matades med kompletterande foder nästa dag och kulturer övervakades för 10 ytterligare dagar med intermittent utfodring. Vid dag 11, celler skördades genom 0,2 μm PES filter följt av affinitet kromatografi med hjälp av protein-A. Renat antikroppar analyserades nästa för % monomer (FPLC), bindningsaktivitet (ELISA eller SPR), och bindning till målantigenen (FACS) på levande celler. Antikroppar kan också kontrolleras för in vivo-analyser (t.ex., celltillväxthämning, cellens viabilitetsanalyser, eller hämning av signalering av mellanliggande fosforylering etc). Antikroppar kan också konjugeras med långt röda färgämnen t.ex., IRDye 800CW för in vivo-avbildning. ± IRDye 800CW måste testas för aktiviteter före studier av tumör- och vävnadsfördelning. (C) Agarose geler av koloni PCR bekräftar storlekarna av positiva tunga (1.4 Kb) och ljus kedja (0.8 Kb) kloner. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: En gelbaserad reduktionsanalys för att bekräfta antikroppens integritet.
(A) Fyra olika IgG1-antikroppar (schematiska visas ovanpå) lades ± reduktionsmedel (såsom BME eller DTT) vid 95° C i 10 min. Antikroppar var nästa lastas på en 10% SDS-PAGE gel följt av protein färgning och bildbehandling. Gelbild i vänster och höger visar tydligt den intakta antikroppen och två separata polypeptider (~50 KDa respektive ~25 KDa). Se även pVH- och pVL-vektorkartor (figur 1) som bär på cDNA motsvarande VH/VL-, CH1/CK-, CH2- och CH3-domäner. (B) Flödescytometri bekräftelse av omärkta och IRDye 800CW märkt farletuzumab bindning till inhemska FOLR1 på äggstockscancer celler. Icke-reducerande = Antikroppskörning på gel med icke-reducerande färgämne, Reducera = Antikropp som körs på gel med reducerande färgämne, HC = Tung kedja, LC = Ljuskedja, VL = Variabel domän av ljuskedja, VH = Variabel domän av tung kedja, CK = Kappa kedja Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Experimentellt schematiskt för tumörgenererings- och antikroppsbehandlingar.
6- 8 veckor gamla mössstammar som: Immunodeficient athymic nude/NSG/ Immunocompetent C57BL/6 eller Balb/C möss kunde lätt ympas med tumörceller via subkutana (SQ) tumörer. Liknande studier skulle kunna utföras med hjälp av bröst fett-pad och intraperitoneal (IP) tumörer. 3-4 veckor senare (tumör ~ 200 mm3), möss var IV injiceras med en IRDye märkt anges antikroppar som var ± selektiv mot tumör-overexpressed receptor. Detta följdes av live in vivo imaging. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Live in-vivo imaging av mänskliga OVCAR3 tumör bärande möss.
Slumpmässigt utvalda 6 till 8 veckor gamla (Ålder) och 20-25 gram (Vikt) hårlös athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ (Envigo) var ympade med FOLR1+ äggstockscancer tumörer (OVCAR-3 celler). Efter 3 veckor med uppenbara tumörer, möss var svans ven injiceras med IRDye 800CW märkt IgG1 kontroll, abagovomab (CA-125 anti-idiotypic antikroppar), farletuzumab (anti-FOLR1 antikropp) och BaCa (anti-FOLR1-DR5 antikropp) följt av levande bildframställning vid indikerade gånger. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Live in-vivo imaging av mänskliga FOLR1 uttrycker murine MC38 cell härledda tumör bärande möss.
(A) Slumpmässigt utvalda 6 till 8 veckor gamla (Ålder) och 20-25 g NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ eller naken möss var SQ injiceras med murine MC38 celler stably uttrycker mänskliga FOLR1. Vid tumör utseende, möss var svans ven injiceras med IRDye 800CW märkt IgG1 kontroll, abagovomab (CA-125 anti-idiotypic antikroppar), farletuzumab (anti-FOLR1 antikroppar) och BaCa (anti-FOLR1-DR5 antikropp) följt av levande bildframställning vid indikerade tidpunkter. (B) Efter 7 dagar djur avlivades och isolerade nyckel organ (som anges) var avbildad tillsammans med ympade tumörer för relativ antikropp signal (IRDye 800CW) fördelning. Som väntat förblev tumörer negativ med IRDye 800CW signal i IgG1 kontroll och CA-125 anti-idiotypic antikroppar, abagovomab injiceras djur. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Sekvenser av alla antikroppar och grund- och primrar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selektiv och tumörvävnad specifik leverans av anti-cancer terapeutiska agent är nyckeln till att mäta effekt och säkerhet av en viss riktad terapi13. Här har vi beskrivit ett snabbt och effektivt tillvägagångssätt för att undersöka den detaljerade vävnads- och tumörfördelningen av klinisk, farletuzumab och en nonklinisk BaCa-antikropp. Det beskrivna tillvägagångssättet är tillämpligt på någon nygenererad antikropp och kan användas tillsammans med en kliniskt effektiv antikropp (med önskade kvaliteter) för dess tumör-/organfördelningsegenskaper. Med tanke på de flesta antikroppsmålreceptorer (såsom HER2 i bröstcancer) är mycket överuttryckta i tumörceller (vävnader), i de flesta fall deras suboptimala uttryck och funktion är också kritisk i celltyper än tumörceller14. Till exempel, en betydande andel av EGFR inriktning kliniska antikroppar i tjocktarmscancer patienter ackumuleras och orsaka toxicitet för hudvävnad15, en noncancerous vävnad vars tillväxt och differentiering kräver EGFR signalering och funktion. Därför tror vi starkt på att dessa typer av preliminära vävnadsdistributionsutredningar i kombinationer med hepattotoxicitet och vävnads histochemistry-analyser i en större kohort av djur är nyckeln till att på ett heltäckande sätt bedöma säkerhet och terapeutisk livskraft hos den nyligen genererade antikroppen. Dessutom skulle beskrivna vävnadsfördelningsstudier också vara mycket tillämpliga i immun kompetenta möss xenograft studier, om den nygenererade antikroppen upprätthåller korsreaktivitet till murine motsvarighet antigen/receptor. I syngeneiska djurstudier, tillsammans med tumörfördelning och vävnadshitokemistudier, kan detaljerad blodcytkinanalys användas för att stärka effekt- och säkerhetsdata. Ett attraktivt inslag i den beskrivna metoden är att det tillåter nära korrekt kvantisering av antikroppsfördelning om data dessutom stöds med ELISA (mot målantgen) från tumören och andra betydande vävnadstlysen (såsom lever, hjärta, lunga, mjälte, njure etc)7. En annan viktig egenskap hos beskriven metod över enfotonutsläppsdatortomografi (kallad SPECT) och positionsemissionstomografi (PET) ärkostnadseffektiviteten 16. Både SPECT och PET är mycket dyra och använder sig av radioaktiva spårämnen för avbildning, vilket gör hela processen besvärlig om man testar en stor kohort av djur17. Dessutom SPECT och PET bildbehandling anläggningar är inte särskilt standard i laboratorier och vivarium att studera små djur modeller av sjukdomar som möss18.
En begränsning med beskrivs metod för att uppnå en nära noggrann kvantifiering av antikroppar tumör distribution är beroendet av hög affinitet mål antigen bindande. Det beror på hög affinitet antigen-antikropp interaktioner kan resultera i "mål-medierad läkemedel disposition (TMDD)" av förbättrad endocytos och shuttling till lysosomer19. Därför kommer resultaten av den beskrivna metoden att variera beroende på den särskilda målreceptorn i en viss tumörtyp. Vi rekommenderar således starkt testning märkt antikroppar/antikroppar i en stor kohort av djur med tumör xenografts genereras med mer än en tumör cellinje (s) med variabel (heterogena) uttryck för mål antigen receptor. Det är också mycket rekommenderas att använda sig av mer än en fluorescerande konjugat färgämne (s) och möss stam (s) för de föreslagna studierna.
Med tanke på att små storlek antikroppar såsom Fabs, scFvs, BiTes, DARTs, etc. (saknar bärgning återvinning av neonatal Fc receptor (FcRn) klar snabbare från tumörer (med serum halv gånger är minuter till timmar), bör man se till att jämföra data mellan olika tumörtyper har mycket varierande FcRn uttryck. Vidare större molekyler (såsom dubbla och trispecificity antikroppar) som är konstruerade med Fc domän för bärgning återvinning har vävnad / tumör penetration frågor. I dessa scenarier kommer det beskrivna tillvägagångssättet inte att vara lämpligt att jämföra vävnads-/tumörfördelning av antikroppar som skiljer sig avsevärt istorlekarna 6. När det gäller betydelse dock, den beskrivna tumör och detaljerade vävnad distribution studier tillsammans med deras motsvarighet monospecific antikroppar skulle fungera som en nyckelfaktor i en effektiv dubbla och trispecificity antikroppar plattform design. Slutligen, eftersom högre affinitet och aviditet-optimerade antikroppar har i allmänhet en betydligt homogen fördelning i tumörer, målet tumör epitope urval (saknas TMDD), övergripande antikropp affinitet och biologisk aktivitet i en viss cancer modell bör alltid övervägas innan ingående av tumörpenetration, säkerhet och effekt.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit en snabb och enkel metod för övervakning av tumör och vävnad distribution av intravenöst injicerade antikroppar. Det beskrivna tillvägagångssättet har lagt till potential att analysera antikropps-siRNA konjugater (där siRNA är märkt), antikropp-läkemedel konjugater (där läkemedlet är märkt) och antikropp-nanopartiklar (där nanopartikellipider är märkta med fluorescerande färgämne). Likaså en unikt konstruerad cystein rester i en tumör inriktning scFv (om fluorescently märkt med melamid kemi) av chimeric antigen receptorn T-celler (CAR-T) och CAR-NK kommer att vara ett kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att analysera tumör/vävnad distribution av dessa cell baserade terapier oberoende av viral transfection baserade GFP/RFP signaler strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Upphovsmännen har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomolecular Analysis Facility, Advanced Microscopy Facility och Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S är en tidig karriär utredare av äggstockscancer Academy (OCA-DoD). Detta arbete stöddes av NCI / NIH bidrag (R01CA233752) till J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) genombrott nivå-1 tilldelning till J. T-S (BC17097) och US DoD Äggstockscancer Research Program (OCRP) finansiering tilldelning (OC180412) till J. T-S
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
