Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der In-vivo-Lokalisierung von Antikörpern in Mäusetumor-Xenograft-Modellen vor.
Abstract
Monoklonale Antikörper sind hochaffine multifunktionale Medikamente, die durch variable unabhängige Mechanismen arbeiten, um Krebszellen zu eliminieren. In den letzten Jahrzehnten hat sich das Feld der Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, bispezifischen Antikörper, chimären Antigenrezeptoren (CAR) und Krebsimmuntherapie als der vielversprechendste Bereich der grundlegenden und therapeutischen Untersuchungen herauskristallisiert. Mit zahlreichen erfolgreichen Studien am Menschen, die auf Immun-Checkpoint-Rezeptoren und CAR-T-Zellen bei Leukämie und Melanom in einem bahnbrechenden Tempo abzielen, sind es hochspannende Zeiten für onkologische Therapeutika, die aus Variationen der Antikörpertechnik abgeleitet sind. Bedauerlicherweise hat sich eine signifikant große Anzahl von Antikörpern und CAR-basierten Therapeutika auch in Studien am Menschen mit soliden Krebsarten als enttäuschend erwiesen, da Immuneffektorzellen im Tumorbett nur begrenzt zur Verfügung stehen. Wichtig ist, dass die unspezifische Verteilung von therapeutischen Antikörpern in anderen Geweben als Tumoren auch zum Mangel an klinischer Wirksamkeit, damit verbundener Toxizität und klinischem Versagen beiträgt. Da die getreue Übersetzung präklinischer Studien in klinische Pfade am Menschen in hohem Maße auf Dieko-Effizienz- und Sicherheitsstudien von Mäusen beruht, heben wir hier eine Methode zur Untersuchung des Tumors und der allgemeinen Gewebeverteilung von therapeutischen Antikörpern hervor. Dies wird durch die Kennzeichnung des protein-A-gereinigten Antikörpers mit einem nahen Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff erreicht, gefolgt von einer Live-Bildgebung von tumortragenden Mäusen.
Introduction
Die FDA genehmigte 1986 den ersten monoklonalen Antikörper gegen CD3 (OKT3, Muromonab)1,2. Seitdem hat es in den nächsten zwanzig Jahren eine schnelle Explosion im Bereich der Antikörpertechnik gegeben, aufgrund des überwältigenden Erfolgs von Antikörpern gegen Immun-Checkpoint-Inhibitoren3. Neben der indirekten Aktivierung des Immunsystems zielen Antikörper darauf ab, Krebszellen direkt zu kennzeichnen, um Immuneffektorzellen präzise zu aktivieren, Zytotoxizität über Todesrezeptor-Agonisten auszulösen, Tumorzellüberlebenssignale zu blockieren, Angiogenese zu behindern (Wachstum der Blutgefäße), Immun-Checkpoint-Regler einzuschränken, Radioisotope, Chemotherapie-Medikamente und siRNA als konjugierte Wirkstoffe zu liefern2. Darüber hinaus ist die Untersuchung der einkettigen variablen Fragmente (scFv) verschiedener Antikörper auf der Oberfläche von patientenabgeleiteten T-Zellen und NK-Zellen (CAR-T und CAR-NK) ein schnell wachsendes Gebiet klinischer Untersuchungen für zellbasierte Therapien4.
Die ultrahohe Affinität von Antikörper-basierten Medikamenten, die Selektivität gegenüber Antigen-exemittierenden Tumorzellen bietet, macht es zu einem attraktiven Mittel. Ebenso ist die gezielte Abgabe und Tumorretention eines therapeutischen Antikörpers (oder eines chemischen Medikaments) der Schlüssel, um die Wirksamkeit über die Toxizität auszugleichen. Daher wird eine große Anzahl von Protein-Engineering-basierten Strategien, die, aber nicht beschränkt auf bispezifische5 und tri-spezifische Antikörper6 sind, genutzt, um die Avidität optimierte Tumorretention von intravenös (IV) injizierten Therapeutika5,7zu verbessern. Hier beschreiben wir eine einfache fluoreszenzbasierte Methode zur Behandlung der Tumor- und Gewebeverteilung potenziell wirksamer Krebsantikörper.
Da tierische Gewebe eine Autofluoreszenz besitzen, wenn sie im sichtbaren Spektrum angeregt werden, wurden die Antikörper zunächst mit einem nahen Infrarotfarbstoff (z. B. IRDye 800CW) gekennzeichnet. Für Proofs von Konzeptuntersuchungen haben wir Follatrezeptor alpha-1 (FOLR1) verwendet, der auf Antikörper namens Farletuzumab und dessen Derivat Namensbispecific Anker Cytotoxizitätsaktivator (BaCa)7 Antikörper abzielt, der FOLR1 und Todesrezeptor-5 (DR5)8 in einem rekombinanten Antikörper kotargets. FOLR1 ist ein klar definierter überexprimierter Zielrezeptor in Eierstock- und TNBC-Krebszellen, Tumor-Xenografts und Patiententumoren9. Bemerkenswert ist, dass es mehrere Bemühungen gibt, FOLR1 klinisch zu nutzen, indem Antikörper-basierte Ansätze verwendet werden, um Immuneffektorzellen und Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADC) für Eierstock- und Brustkrebs zu engagieren10,11.
In diesem Methodenpapier haben wir klinische samt Anti-FOLR1 (Farletuzumab) geklont, exprimiert und gereinigt. Als Negativkontrollen wurden der IgG1-Isotyp und ein klinischer Anti-Idiotyp Mucin-16-Antikörper namens Abagovomab12 verwendet. Nach der Protein-A-Reinigung wurden die angegebenen Antikörper mit IRDye 800CW gekennzeichnet und in die Schwanzvene von Nacktmäusen verabreicht, die entweder Eierstocktumor-Xenografts trugen oder stabil transfizierte menschliche FOLR1-Exzessen murinen Darmkrebs-Xenografts. Die Antikörperlokalisierung wurde durch Live-Bildgebung mit In-vivo-Bildgebungsspektrum an mehreren verschiedenen Zeitpunkten7verfolgt. Diese Methode erfordert keine genetische Veränderung oder Injektion des Substrats, um Lichtemission zu ermöglichen und ist deutlich schneller, kostengünstig und effizient. Das unten beschriebene allgemeine Klon-, Expressions-, Reinigungs- und Etikettierungsprotokoll kann auf jeden klinischen und nichtklinischen Antikörper angewendet werden, wenn schwere und leichte Kettensequenzen verfügbar sind.
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Protocol
Alle Verfahren im Zusammenhang mit tiermundien und Tumor-Xenografts-Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) hier an der University of Virginia überprüft und genehmigt und entsprechen den einschlägigen regulatorischen Standards.
1. Expression und Reinigung von Antikörpern
- Wartung von CHO-Zellen
- Grow CHO-Zellen in FreeStyle CHO Media ergänzt mit handelsüblichen 1x Glutamin-Ergänzung bei 37 °C Schütteln bei 130 U/min mit 5%CO2 mit delong Erlenmeyer Kolben entweder Glas oder Einweg.
HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, einen verwirrten Kolben mit belüfteter Kappe für erhöhte Rührung zu verwenden und die Gasübertragung während des Schüttelzustands zu verbessern. Aufgrund der begrenzten Agitation der Suspensionskultur wurde mit regelmäßigen Kolben (nicht verwirrt) eine signifikant reduzierte Antikörperausbeute erzielt. - Bewahren Sie die Zellzahl zwischen 1-5 x 106 Zellen/ml mit >95% Zelllebensfähigkeit bei. Wenn die Zellzahl über 5 x 106 Zellen/ml ansteigt, teilen Sie die Zellen auf. Lässt CHO-Zellen niemals unter 0,2 x 106 Zellen/ml zu.
- Grow CHO-Zellen in FreeStyle CHO Media ergänzt mit handelsüblichen 1x Glutamin-Ergänzung bei 37 °C Schütteln bei 130 U/min mit 5%CO2 mit delong Erlenmeyer Kolben entweder Glas oder Einweg.
- Transfektion von CHO-Zellen
- Wachsen Sie CHO-Zellen in 200 ml Medien (2 x 106 Zellen/ml) in entlüfteten Erlenmeyer-Faffekolben.
HINWEIS: Suspensionskulturen, die in verwirrten Kolben angebaut werden, haben immer höhere Proteinerträge im Vergleich zu dem, wenn sie in nicht-baffled Enken angebaut werden. - Nehmen Sie in einem 15 ml-Rohr 5 ml CHO FreeStyle-Medien und fügen Sie 50 g VH-Klon-DNA und 75 g VL-Klon-DNA hinzu. Wirbel gut zu mischen.
- Inkubieren Sie die DNA-Mischung bei Raumtemperatur für 5 min.
HINWEIS: Eine längere Inkubation reduziert die Proteinausbeute. - Fügen Sie 750 l von 1 mg/ml Polyethyleneimin (PEI) in die DNA-Lösung und mischen Sie die Mischung aggressiv für 30 s. Bei Raumtemperatur zusätzlich 5 min inkubieren.
HINWEIS: PEI muss frisch gemacht werden. Multipler Gefriertauzyklus von PEI reduziert den Gesamtertrag erheblich. - Fügen Sie die gesamte Mischung aus DNA und PEI auf die Zellen, während manuell schütteln den Kolben. Sofort die entlüfteten Erlenmeyer-Faffemiten mit Zellen bei 37 °C bebrüten bei 130 U/min.
- Wachsen Sie CHO-Zellen in 200 ml Medien (2 x 106 Zellen/ml) in entlüfteten Erlenmeyer-Faffekolben.
- Ausdruck
HINWEIS: Der Antikörper hat sekretorezielle Signalpeptid an seinem N-Terminal-Ende entwickelt, die hilft, Antikörper in die Medien abgesondert werden.- Wachsen Sie die transfizierten Zellen bei 37 °C, mit Schütteln bei 130 Umdrehungen pro Minute am Tag 1.
- Am Tag 2 2 2 ml 100x Anti-Klumpen-Mittel und 2 ml 100x antibakterielle-antimykotische Lösung hinzufügen. Drehen Sie den Kolben auf niedrigere Temperatur (32-34 °C), mit Schütteln bei 130 U/min.
- An jedem fünften Tag, fügen Sie 10 ml Trypton N1-Feed, und 2 ml von 100x Glutamin Ergänzung.
- Zählen Sie die Zellen jeden dritten Tag mit Hämozytometer, nachdem Sie ein Aliquot von Zellen mit Trypan-Blaufleck gefärbt haben. Stellen Sie sicher, dass die Zelllebensfähigkeit über 80 % bleibt.
- Am Tag 10 oder 11 das Medium zur Antikörperreinigung ernten. Drehen Sie die Kultur bei 3000 x g, 4 °C für 40-60 min und filtern Sie dann die klaren Medien mit 0,22 M Flaschenfiltern.
- Reinigung
HINWEIS: Die Antikörperreinigung erfolgt mit einer handelsüblichen Protein-A-Säule (siehe Materialtabelle)mit einer peristaltischen Pumpe.- Die Kolonne mit zwei Spaltenvolumen bindungspuffer (20 mM Natriumphosphat bei pH 7,4) ausdemieren.
- Führen Sie die gefilterten Medien mit Antikörpern (in Schritt 1.3.5) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min durch die Säule.
- Waschen Sie die Spalte mit einem zweispaltigen Volumen des Bindungspuffers.
- Den Antikörper mit 5 ml Elutionspuffer (30 mM Natriumacetat bei pH 3,4) in 500 L-Fraktionen zu vereitpen.
- Neutralisieren Sie den pH-Wert des eluierten Antikörpers, indem Sie 10 l Neutralisationspuffer (3 M Natriumacetat bei pH 9) pro Fraktion hinzufügen.
HINWEIS: Die Bruchzahl 3-6 enthält den größten Teil des Antikörpers. Es ist ratsam, alle Fraktionen zu behalten, falls der Antikörper in einem späteren Bruchteil als erwartet eluiert wird. - Messen Sie die Konzentration von gereinigtem Antikörper mit einem Spektralphotometer, indem Sie das Standardprotokoll für IgG auswählen. Die Endkonzentration des Antikörpers wird in mg/ml unter Berücksichtigung des Molekulargewichts und des Absorptionskoeffizienten ermittelt.
2. Fluoreszierende Etikettierung
HINWEIS: Antikörper werden mit dem Infrarotfarbstoff beschriftet, der eine NHS Ester-Reaktive Gruppe enthält, die sich mit Proteinen paart und ein stabiles Konjugat bildet. Diese Reaktion ist pH-empfindlich und funktioniert am besten bei pH 8,5. Fluoreszierende Konjugate, die mit dem Farbstoff gekennzeichnet sind, zeigen ein Absorptionsmaximum von 774 nm und ein Emissionsmaximum von 789 nm. pH 8.5 ist der Schlüssel für eine effektive Konjugation.
- Dialyse 0,5 ml des Antikörpers mit einer Dialysekassette (0,1-0,5 ml) in 1 L Konjugationspuffer (50 mM Phosphatpuffer bei pH 8,5). Nach 4 h die Dialysekassette in frischen Puffer geben und über Nacht dialysieren.
- Richten Sie eine Konjugationsreaktion ein, indem Sie 0,03 mg IRDye 800CW pro 1 mg Antikörper in einem Reaktionsvolumen von 500 l hinzufügen.
HINWEIS: IRDye 800CW wird in DMSO in einer Konzentration von 10 mg/ml aufgelöst. - Durchführung von Etikettierreaktionen für 2 h bei 20 °C.
HINWEIS: Wenn die Zeit über 2 h hinaus erhöht wird, wird die Beschriftung nicht verbessert. - Reinigen Sie gekennzeichnete Konjugate durch umfangreiche Dialyse gegen 1x PBS.
- Schätzen Sie den Grad der Etikettierung, indem Sie die Absorption des Farbstoffs bei 780 nm und die Absorption des Proteins bei 280 nm messen. Der Farbstoffbeitrag zum 280 nm Signal beträgt 3%.
- Berechnen Sie das Farb-Protein-Verhältnis nach dieser Formel:
wobei 0,03 ein Korrekturfaktor für die Absorption des verwendeten Farbstoffs bei 280 nm (entspricht 3,0 % seiner Absorption bei 780 nm) ist, sind εFarbstoff und εProtein molaren Aussterbekoeffizienten für den Farbstoff bzw. das Protein (Antikörper).
HINWEIS: εFarbstoff ist 270.000 M-1 cm-1 und εProtein ist 203.000 M-1 cm-1 (für ein typisches IgG) in 1:1 Mischung von PBS: Methanol. Proteine außer IgG können sehr unterschiedliche molaren Aussterbekoeffizienten haben. Die Verwendung des korrekten Aussterbekoeffizienten für das Protein von Interesse ist für die genaue Bestimmung des D/P-Verhältnisses unerlässlich. - Berechnen Sie die endgültige Proteinkonzentration nach dieser Formel:
HINWEIS: Bestätigen Sie immer die antigenbindende Wirksamkeit von markierten und nicht beschrifteten Antikörpern mit ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) oder Durchflusszytometrie, bevor Sie mit In-vivo-Studien fortfahren.
3. Maus Xenograft Studien
- Vorbereitung von Tumorzellen zur Injektion
- Wachsen Sie OVCAR-3-Zellen in RPMI-1640 Medium, ergänzt durch 10% von FBS und 1x Penicillin-Streptomycin.
- Am Tag vor der Injektion, Subkultur-Zellen in neue 100 mm Kulturgerichte mit 10 ml komplettem Medium/Schale. Verwenden Sie die Zellnummer 0,5-1 x 106 Zellen/Schale.
- Inkubationskulturen bei 37 °C Temperatur, 95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2 für 20-24 h.
- Am Tag der Injektion, entfernen Sie das Wachstumsmedium von Kulturgerichten. Spülen Sie die Zellschicht gründlich mit Ca2+/Mg2+ frei Dulbecco Phosphat-gepufferte Saline (DPBS), um abgestorbene Zellen, zellulären Schmutz und alle Spuren von Serum zu entfernen, die in trypsin Wirkung stören können.
- Versuchen Sie die Zellen, indem Sie 1,0-1,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Schale hinzufügen und versuchen, die Lösung zu verbreiten, indem Sie die Schale rundum kippen, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 5-10 min.
HINWEIS: Beobachten Sie Zellen unter einem invertierten Mikroskop, um den tatsächlichen Trypsinisierungsstatus zu überprüfen. Unter Trypsinisierung führt zu einer geringeren Anzahl von Zellablösung von der Oberfläche der Kulturschale, über Trypsinisierung induziert zellulären Stress. Also, richtige Trypsinisierung ist wichtig. - Fügen Sie 1,0-1,5 ml komplettes Wachstumsmedium zu jeder Schale hinzu, um die Trypsin-Aktion zu stoppen, nachdem sie Zellen durch sanftes Pipettieren wieder aufhängen.
HINWEIS: Sanfte Pipettierung ist wichtig, um die Zellgesundheit zu erhalten. - Die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr einsammeln und bei 250 x g 5 min bei Raumtemperatur drehen.
- Sammeln Sie das Zellpellet nach dem Entfernen des Überstandes und waschen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 1x DPBS wieder aufhängen.
- Drehen Sie die Zellsuspension mit niedriger Geschwindigkeit 250 x g für 5 min.
- Fügen Sie 500 L DPBS hinzu und setzen Sie Zellen durch sanftePipettieren wieder auf, um eine einzellige Suspension zu erhalten.
- Zählen Sie Zellen mit Hämozytometer oder automatisiertem Zellzähler.
HINWEIS: Für eine bessere Genauigkeit, wiederholen Sie die Zählung für dreimal und nehmen Sie einen Durchschnitt. - Passen Sie das Volumen so an, dass die endgültige Zelldichte 1 x 108 Zellen/ml beträgt.
- Subkutane Injektion von Zellen zur Entwicklung von Maus-Xenografts
HINWEIS: Alle Verfahren sollten in einem BSL2-Sicherheitsschrank durchgeführt werden. Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ Mäuse wurden in der aktuellen Studie verwendet.- Nehmen Sie 50 l der Zellsuspension in ein 1,5 ml-Rohr und mischen Sie es mit 50 l Kellermatrix-Matrixmedium.
HINWEIS: Kellermembran Matrix Medium neigt dazu, ein Gel wie Zustand bei Raumtemperatur zu bilden, so sorgfältig halten Sie die Zellen und die Matrix Medium Mischung auf Eis. Es ist ratsam, Schläuche, Spitzen und Spritzen im Kühlschrank aufzubewahren und dann vor der Tierinjektion auf Eis zu übertragen. - Rühren Sie die Mischung, um Zellklumpen zu vermeiden. Nehmen Sie dann diese 100 l des Zellsuspensions-Matrix-Medium-Gemischs, das 5 x 106 Zellen enthält, in eine 1-ccm-Spritze.
- Heben Sie die Haut des Tieres vorsichtig an, um die Haut von der darunter liegenden Muskelschicht zu trennen, und injizieren Sie die Zellsuspension (100 l) langsam unter die Haut (5 x 106 Zellen), mit einer 26 G Nadel. Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel herausnehmen, so dass Das Kellermatrixmedium die halbfeste gelähnliche Struktur zusammen mit Zellen unter der Haut bilden kann, wodurch verhindert wird, dass die Mischung von der Injektionsstelle kommt.
HINWEIS: Zellen müssen vor der Injektion auf Verunreinigungen getestet werden, die immundefizienten Mäusen schaden können. Während der Injektion setzen Sie die Nadel nicht zu tief in die Haut, da dies den Tumor tiefer als erwartet bilden kann. - Halten Sie das Tier in einem sterilen Käfig und beobachten Sie für ca. 20 min.
- Beobachten Sie die Mäuse für 2-3 Wochen und lassen Sie den Tumor bis zu 500 mm3 Größe wachsen.
- Nehmen Sie 50 l der Zellsuspension in ein 1,5 ml-Rohr und mischen Sie es mit 50 l Kellermatrix-Matrixmedium.
4. Antikörperlokalisierung mit einem In-vivo-Bildgebungssystem
HINWEIS: In vivo-Bildgebungsgeräte (siehe Tabelle der Materialien),die in diesem Experiment verwendet werden, verwenden eine Reihe von hocheffizienten Filtern und spektralen Un-Mixing-Algorithmen für die nichtinvasive Visualisierung und Verfolgung zellulärer und genetischer Aktivitäten innerhalb eines lebenden Organismus in Echtzeit. Das System bietet sowohl Fluoreszenz- als auch Biolumineszenzüberwachungsfunktionen.
- Injizieren Sie 25 g Farbstoff als Antikörper über Schwanzvene.
- Anästhetisieren Sie Tumor tragende Mäuse mit 2% Isofluran. Überprüfen Sie, ob auf Pedalreflexe nicht reagiert wird.
- Sobald Mäuse aufhören, sich zu bewegen, deisieren Sie die seitliche Schwanzvene, indem Sie Wurmwasser auftragen.
- Mit einer 26 G-Nadel mit einer Insulinspritze von 1 cc injizieren.
- Ebenso etikettieren und injizieren Sie als Negativkontrolle den unspezifischen IgG1 Isotype-Antikörper, der nicht auf Krebszellen abzielt.
- Führen Sie in vivo Live-Bildgebung nach 8, 24, 48 h, etc. von Antikörper-Injektionen.
- Klicken Sie in der zugehörigen Software auf Initialisieren im Bedienfeld, und bestätigen Sie, dass die Stufentemperatur 37 °C beträgt.
- Schalten Sie die Sauerstoffversorgung, alle Pumpen auf dem Anästhesiesystem, Isofluran-Gasversorgung an die Anästhesiekammer und stellen Sie die Isoflurane Verdampferventil auf 2%.
- Übertragen Sie die Mäuse in die Anästhesiekammer und warten Sie, bis die Mäuse vollständig beästhetisiert sind. Tragen Sie die Augenschmiersalbe auf, um das Trocknen ihrer Augen zu vermeiden.
- Gehen Sie zum Bedienfeld, richten Sie die Fluoreszenzbildgebung über die Option Imaging Wizard ein und wählen Sie die Anregung bei 773 nm und die Emission bei 792 nm aus.
HINWEIS: Die standardmäßigen Einstellungen für die automatische Belichtung bieten ein gutes fluoreszierendes Bild. Die Einstellungen für die automatische Belichtung können jedoch je nach Bedarf geändert werden. - Übertragen Sie die anästhesierten Mäuse in die Bildkammer und montieren Sie sie mit Nasenkegel auf dem Bildfeld. Die Bildgebungsphase bietet die Möglichkeit, 5 Mäuse gleichzeitig aufzunehmen.
HINWEIS: Lassen Sie Kontrollmäuse zusammen mit den Testmäusen abbilden, um während der Analyse eine ähnliche Menge an Exposition und anderen Einstellungen zu haben. - Sobald alles fertig ist, wählen Sie auf dem Bedienfeld für die Bildaufnahme die Option Übernehmen aus.
- Mit Autoexposure-Einstellungen generiert das System das Bild innerhalb einer Minute. Das erzeugte Bild ist die Überlagerung der Fluoreszenz auf fotografischem Bild mit optischer Fluoreszenzintensität, die in Einheiten von Zählungen oder Photonen oder in Bezug auf die Effizienz angezeigt wird.
- Nach dem Erfassen des Bildes, übertragen Sie die Mäuse aus der Bildkammer zurück in ihren Käfig und beobachten für ihre Genesung für 1 bis 2 min.
- Optimieren Sie das Bild weiter mit den Tools und Funktionen, die in der Software für die Bildanalyse zur Verfügung gestellt werden. Bildanalysewerkzeuge befinden sich in der Menüleiste und Werkzeugpalette.
- Passen Sie unter Bildanpassendie Helligkeit, den Kontrast oder die Deckkraft an, und wählen Sie die Farbskala aus.
- Verwenden Sie die ROI-Tools, um einen Bereich von Interesse (ROI) in einem optischen Bild anzugeben und die Signalintensität innerhalb des ROI zu messen. Exportieren Sie bei Bedarf die quantifizierten Signaldaten in eine Tabellenkalkulationssoftware und zeichnen Sie die Daten.
- Für Folgestudien analysieren Sie Mäusenekropsien verschiedener Gewebe (z. B. Leber, Lunge, Herz, Niere, Milz, Gehirn usw.) Seite an Seite für eine detaillierte unspezifische Verteilung fluoreszierend markierter Antikörper.
HINWEIS: Die Daten können durch die Verwendung von Antigen (FOLR1 in diesem Fall) in 96-Well-Tests weiter mit gewebespezifischem ELISA unterstützt werden.
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Representative Results
In der beschriebenen Methodik klonten wir zunächst Antikörper, die auf den Folatrezeptor Alpha-1 (FOLR1) mit dem Namen Farletuzumab abzielten, und einen bispezifischen Antikörper namens BaCa, der aus Farletuzumab und Lexatumumab besteht, zusammen mit Kontrollantikörpern wie Abagovomab (Sequenzen in der Zusatzdatei 1). Einzelheiten zu repräsentativen variablen Schweren (VH) und variablen Licht (VL) Domänen in DNA-Klonen (pVH, pVL) sind in Abbildung 1Adargestellt. Um die positiven Klone zu bestätigen, führten wir Kolonie-PCR mit Signalpeptid vorwärts (SP For) und CK Rev/CH3 Rev Primer (Sequenzen in Supplementary File 1) durch. Repräsentative Ergebnisse der Kolonie PCR bestätigen die erwarteten Größen von leichten und schweren Ketten (Abbildung 1C). Positive Antikörperklone wurden ebenfalls mit Sanger-Sequenzierung bestätigt. Nach dem bestätigten PVH- und PVL-DNA-Klonen wurden Transfektionen mit CHO-Suspensionskulturen durchgeführt, gefolgt von Protein-A-Säulenaffinitätsreinigungen von Antikörpern bei 4 °C (siehe Abbildung 1B und Protokoll für Detailschritte).
Repräsentative Ergebnisse von gereinigtem Farletuzumab zusammen mit anderen Kontroll-IgG1 (außer BaCa-Antikörper, die auf nicht reduzierenden und reduzierenden SDS PAGE laufen, sind in Abbildung 2Adargestellt. Wie offensichtlich, produzierten schwere und leichte Ketten 50 und 25 KDa-Bänder nach der Reduktion. Es folgte eine verbindliche Bestätigung von Antikörpern gegen native Proteine auf der Zelloberfläche. Repräsentative Farletuzumab-Bindung an den menschlichen FOLR1 auf der Oberfläche der OVCAR3-Zellen wird mittels Durchflusszytometrie gezeigt (Abbildung 2B).
Als nächstes wurden fluoreszierend markierte Antikörper in Tiere injiziert, die mit FOLR1-extierten Tumoren transplantiert wurden (Abbildung 3). Tiere wurden zu mehreren Zeitpunkten mit IVIS live abgebildet. Die Daten bestätigen die selektive Anreicherung von FOLR1- und BaCa-Antikörpern in die FOLR1+ Tumoren (Abbildung 4 und Abbildung 5). Wichtig ist, dass Sichten (negativ für Tumorantigen) nicht in Tumoren lokalisiert wurden.
Abbildung 1: Schematisches Klonen, Ausdruck und Reinigung von Antikörpern.
(A) Zeigt den Detailschema von schweren (pVH) und leichten (pVL) Kettenvektoren. (B) pVH-Vektor, der eine variable Domänensequenz einer IgG1-Schwerkette und eines pVL-Vektors mit variabler Domänensequenz einer Lichtkette trägt, wurden zusammen mit Transfektionsreagenzien (wie Mirus oder PEI) vermischt, bevor die Suspensionskultur von CHO- oder HEK-Zellen hinzugefügt wurde. Die Zellen wurden am nächsten Tag mit Zusatzfutter gefüttert und die Kulturen wurden 10 weitere Tage lang mit intermittierender Fütterung überwacht. Am 11. Tag wurden die Zellen durch 0,2 m PES-Filter geerntet, gefolgt von der Affinitätschromatographie mit Protein-A. Als nächstes wurden gereinigte Antikörper auf % Monomer (FPLC), Bindungsaktivität (ELISA oder SPR) und Bindung an das Zielantigen (FACS) an lebenden Zellen analysiert. Antikörper können auch auf In-vivo-Assays (z. B. Zellwachstumshemmung, Zelllebensfähigkeitstests oder Hemmung der Signalisierung der Zwischenphosphorylierung usw.) überprüft werden. Antikörper können auch mit weitroten Farbstoffen konjugiert werden, z.B. IRDye 800CW für die In-vivo-Bildgebung. ± IRDye 800CW muss vor Tumor- und Gewebeverteilungsstudien auf Aktivitäten getestet werden. (C) Agarose Gele der Kolonie PCR bestätigen die Größen von positiven schweren (1,4 Kb) und leichten Kette (0,8 Kb) Klone. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ein gelbasierter Reduktionstest zur Bestätigung der Antikörperintegrität.
(A) Vier verschiedene IgG1-Antikörper (schematisch oben dargestellt) wurden ± Reduktionsmittel (wie BME oder DTT) bei 95°C für 10 min hinzugefügt. Die Antikörper wurden als nächstes auf ein 10% SDS-PAGE Gel geladen, gefolgt von Proteinfärbung und Bildgebung. Gelbild links und rechts zeigt deutlich den intakten Antikörper und zwei separate Polypeptide (50 KDa bzw. 25 KDa). Siehe auch pVH- und pVL-Vektorkarten (Abbildung 1) mit cDNA-Entsprechend den Domänen VH/VL, CH1/CK, CH2 und CH3. (B) Durchflusszytometrie Bestätigung von unbeschrifteten und IRDye 800CW markierten Farletuzumab Bindung an native FOLR1 auf Eierstockkrebszellen. Nicht reduzierend = Antikörper auf Gel mit nicht reduzierendem Farbstoff laufen, Reduzieren = Antikörperauflauf auf Gel mit reduzierendem Farbstoff, HC = Schwere Kette, LC = Leichte Kette, VL = Variable Domäne der Lichtkette, VH = Variable Domäne der schweren Kette, CK = Kappa Kette Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Experimentelles Schaltplan der Tumorerzeugung und Antikörperbehandlungen.
6-8 Wochen alte Mäusestämme wie: Immunodeficient athymic nude/NSG/ Immunocompetent C57BL/6 oder Balb/C Mäuse könnten leicht mit Tumorzellen über subkutane (SQ) Tumoren transplantiert werden. Ähnliche Studien könnten mit Brustfettpad und intraperitonealen (IP) Tumoren durchgeführt werden. 3-4 Wochen später (Tumor 200 mm3), wurden Mäuse IV mit einem IRDye-markierten indizierten antikörpern, die ± selektiv gegen Tumor-überexprimierten Rezeptor waren. Es folgte eine Live-In-vivo-Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Live-In-vivo-Bildgebung menschlicher OVCAR3-Tumor-tragender Mäuse.
Zufällig ausgewählte 6 bis 8 Wochen alt (Alter) und 20-25 Gramm (Gewicht) haarlose athymische Nude Foxn1nu/Foxn1+ (Envigo) wurden mit FOLR1+ Eierstocktumoren (OVCAR-3 Zellen) transplantiert. Nach 3 Wochen mit offensichtlichen Tumoren wurden Mäuse mit IRDye 800CW mit igG1-Kontrolle, Abagovomab (CA-125 anti-idiotypic antikörper), Farletuzumab (Anti-FOLR1-Antikörper) und BaCa (Anti-FOLR1-DR5 Antikörper) injiziert, gefolgt von Live-Bildgebung zu angegebenen Zeiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Live-In-vivo-Bildgebung von humanen FOLR1, die murine MC38-Zell-abgeleitete Tumor-tragende Mäuse exzessiert.
(A) Zufällig ausgewählt 6 bis 8 Wochen alt (Alter) und 20-25 g NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ oder nackten Mäusen wurden SQ mit murinen MC38-Zellen injiziert, die den menschlichen FOLR1 stabil exemittierten. Nach dem Auftreten des Tumors wurden Mäuse mit IRDye 800CW mit igG1-Kontrolle, Abagovomab (CA-125 anti-idiotypic antikörper), Farletuzumab (Anti-FOLR1-Antikörper) und BaCa (Anti-FOLR1-DR5 Antikörper) injiziert, gefolgt von Live-Bildgebung zu angegebenen Zeiten. (B) Nach 7 Tagen wurden Die Tiere eingeschläfert und isolierte Schlüsselorgane (wie angegeben) zusammen mit transplantierten Tumoren für die relative Antikörpersignal-Verteilung (IRDye 800CW) abgebildet. Wie erwartet blieben Tumore negativ mit IRDye 800CW Signal in IgG1-Kontrolle und CA-125 Anti-Idiotypic-Antikörper, Abagovomab injizierte Tiere. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei 1: Sequenzen aller Antikörper und Primer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Selektive und tumorgewebespezifische Abgabe von Anti-Krebs-Therapeutika ist der Schlüssel zur Messung der Wirksamkeit und Sicherheit einer bestimmten gezielten Therapie13. Hier haben wir einen schnellen und effizienten Ansatz beschrieben, um die detaillierte Gewebe- und Tumorverteilung von klinischem Farletuzumab und einem nichtklinischen BaCa-Antikörper zu untersuchen. Der beschriebene Ansatz ist auf jeden neu erzeugten Antikörper anwendbar und kann zusammen mit einem klinisch wirksamen Antikörper (mit gewünschten Eigenschaften) für seine Tumor-/Organverteilungseigenschaften verwendet werden. Wenn man bedenkt, dass die meisten Antikörper-Zielrezeptoren (wie HER2 bei Brustkrebs) in Tumorzellen (Geweben) stark überexprimiert sind, ist ihre suboptimale Expression und Funktion in den meisten Fällen auch bei anderen Zelltypen als Tumorzellenkritisch 14. Zum Beispiel akkumuliert ein signifikanter Anteil von EGFR, das auf klinische Antikörper bei Dickdarmkrebspatienten abzielt, und verursacht Toxizität für Dashautgewebe15, ein nicht-kanzeröses Gewebe, dessen Wachstum und Differenzierung EGFR-Signalisierung und -funktion erfordert. Daher sind wir der festen Überzeugung, dass diese Art von vorläufigen Gewebeverteilungsuntersuchungen in Kombination mit Hepatotoxizität und Gewebehistochemie-Assays in einer größeren Tierkohorte der Schlüssel zur umfassenden Bewertung der Sicherheit und der therapeutischen Lebensfähigkeit des neu erzeugten Antikörpers sind. Darüber hinaus wären beschriebene Gewebeverteilungsstudien auch in immunkompetenten Xenograft-Studien hochanwendbar, wenn der neu generierte Antikörper die Kreuzreaktivität gegenüber dem murinen Gegenwert Antigen/Rezeptor aufrechterhält. In syngenischen Tierstudien, zusammen mit Tumorverteilung und Gewebe histochemie Studien, detaillierte Blut Zytokin-Analyse kann verwendet werden, um die Wirksamkeit und Sicherheit Daten zu stärken. Ein attraktives Merkmal des beschriebenen Ansatzes ist, dass er eine nahezu genaue Quantifizierung der Antikörperverteilung ermöglicht, wenn Die Daten zusätzlich mit ELISA (gegen Zielantigen) aus dem Tumor und anderen signifikanten Gewebelysaten (wie Leber, Herz, Lunge, Milz, Niere usw.) unterstützt werden7. Ein weiteres wichtiges Merkmal der beschriebenen Methode über die Computertomographie für einzelne Photonenemissionen (SPECT) und die Positionsemissionstomographie (PET) ist die Wirtschaftlichkeit16. Sowohl SPECT als auch PET sind sehr teuer und verwenden radioaktive Tracer für die Bildgebung, was den gesamten Prozess umständlich macht, wenn eine große Kohorte von Tieren getestet wird17. Darüber hinaus sind SPECT- und PET-Bildgebungseinrichtungen in Laboratorien und Vivarien nicht sehr standard, um Kleintiermodelle von Krankheiten wie Mäusen zu untersuchen18.
Eine Einschränkung mit beschriebener Methode, um eine nahezu genaue Quantifizierung der Antikörpertumorverteilung zu erreichen, ist die Abhängigkeit von der Antigenbindung mit hoher Affinität. Es ist, weil hohe Affinität Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen können in "target-mediated Drug Disposition (TMDD)" durch verbesserte Endozytose und Schließung zu Lysosomen führen19. Daher variieren die Ergebnisse des beschriebenen Ansatzes je nach dem jeweiligen Zielrezeptor in einem bestimmten Tumortyp. Daher empfehlen wir dringend, markierte Antikörper/Antikörper in einer großen Kohorte von Tieren mit Tumor-Xenografts zu testen, die mit mehr als einer Tumorzelllinie(en) mit variabler (heterogener) Expression des Zielantigenrezeptors erzeugt werden. Es wird auch dringend empfohlen, für die vorgeschlagenen Studien mehr als einen fluoreszierenden Konjugatfarbstoff(n) und Mäusestämme zu verwenden.
Angesichts der Tatsache, dass kleine Antikörper wie Fabs, scFvs, BiTes, DARTs usw. (fehlendes Bergungsrecycling durch neonatalen Fc-Rezeptor (FcRn) schneller von Tumoren erlöschen (wobei serum halbmal Minuten zu Stunden ist), sollte darauf geachtet werden, Daten zwischen verschiedenen Tumortypen mit hochvariabler FcRn-Expression zu vergleichen. Darüber hinaus haben größere Moleküle (wie Dual- und Trispezifitätsantikörper), die mit der Fc-Domäne für das Bergungsrecycling entwickelt wurden, Gewebe-/Tumor-Penetrationsprobleme. In diesen Szenarien ist der beschriebene Ansatz nicht geeignet, die Gewebe-/Tumorverteilung von Antikörpern zu vergleichen, die sich in den Größen6erheblich unterscheiden. In Bezug auf die Bedeutung würden jedoch die beschriebenen Tumor- und detaillierten Gewebeverteilungsstudien zusammen mit ihren gegensandigen monospezifischen Antikörpern als Schlüsselfaktor für ein effektives Dual- und Trispezifitäts-Antikörperplattform-Design dienen. Da eine höhere Affinität und avidity-optimierte Antikörper in der Regel eine signifikant homogene Verteilung in Tumoren aufweisen, sollten die Zieltumor-Epitopauswahl (fehlende TMDD), die allgemeine Antikörperaffinität und die biologische Aktivität in einem bestimmten Krebsmodell immer berücksichtigt werden, bevor die Tumorpenetration, -sicherheit und -wirksamkeit abgeschlossen werden.
Zusammenfassend haben wir eine schnelle und einfache Methode zur Überwachung der Tumor- und Gewebeverteilung intravenös injizierter Antikörper beschrieben. Der beschriebene Ansatz hat das Potenzial zur Analyse von Antikörper-SiRNA-Konjugaten (wo siRNA gekennzeichnet ist), Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (wo das Medikament gekennzeichnet ist) und Antikörper-Nanopartikeln (wo Nanopartikellipide mit Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet sind) hinzugefügt. Ebenso wird ein einzigartig entwickelter Cystein-Rückstand in einem Tumor, der auf scFv abzielt (wenn fluoreszierend mit Melamidchemie gekennzeichnet) von chimären Antigenrezeptoren T-Zellen (CAR-T) und CAR-NK ein kostengünstiger Ansatz zur Analyse der Tumor-/Gewebeverteilung dieser zellbasierten Therapien unabhängig von viralen Transfektions-basierten GFP/RFP-Signalstrategien sein.
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Disclosures
Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken der University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, der Biomolecular Analysis Facility, der Advanced Microscopy Facility und der Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S ist ein früher Karriere-Ermittler der Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Diese Arbeit wurde durch das NCI/NIH-Stipendium (R01CA233752) an J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) Breakthrough Level-1 Award an J. T-S (BC17097) und U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) Funding Award (OC180412) an J. T-S (BC17097) und U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OC180412) an J. T-S (BC17097) und U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OC180412) an J. T-S (BC17097) und Den U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OC180412) an J. T-S (BC17097) und den U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OC180412) an J. T-S
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
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