Summary
여기서 우리는 마우스 종양 제노이식 모델에서 항체의 생체 내 국소화를 연구하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
단일 클론 항체는 암세포를 제거하기 위해 가변 독립적 인 메커니즘에 의해 작동하는 높은 친화성 다기능 약물이다. 지난 수십 년 동안 항체-약물 접합, 이중 특이적 항체, 키메라 항원 수용체(CAR) 및 암 면역 요법 분야는 기본 및 치료 조사의 가장 유망한 영역으로 부상했습니다. 백혈병과 흑색종에 있는 면역 체크포인트 수용체 및 CAR-T 세포를 획기적인 속도로 표적으로 하는 수많은 성공적인 인간 적인 예심으로, 항체 공학의 변이에서 파생된 종양학 치료에 대한 매우 흥미로운 시간입니다. 유감스럽게도, 상당히 많은 수의 항체와 CAR 기반 치료법은 종양 침대에서 면역 효과기 세포의 제한된 가용성으로 인해 고형 암의 인체 실험에서 실망스러운 것으로 입증되었습니다. 중요한 것은, 종양 이외의 조직에서 치료 항체의 비특이적 분포는 또한 임상 효능의 부족, 관련 독성 및 임상 실패에 기여한다. 인간 임상 적 흔적으로 전임상 연구의 충실한 번역이 마우스 종양 xenograft 효능 및 안전 연구에 크게 의존하기 때문에, 여기에서 우리는 치료 항체의 종양 및 일반 조직 분포를 테스트하는 방법을 강조한다. 이것은 종양 베어링 마우스의 살아있는 화상 진찰에 선행된 근적외선 형광염염으로 단백질-A 정제항체를 표지하여 달성됩니다.
Introduction
FDA는 1986년1,2에서CD3(OKT3, 무로모나브)를 대상으로 한 최초의 단일클론항체를승인했다. 그 이후 20년 동안 면역 체크포인트 억제제3에대한 항체의 압도적인 성공으로 인해 항체 공학 분야에서 급속한 폭발이 있었습니다. 면역 계통의 간접적인 활성화 외에, 항체는 면역 효과기 세포를 정확하게 관여하기 위하여 암세포를 직접 플래그화하고, 죽음 수용체 작용제를 통해 세포 독성을, 종양 세포 생존 신호를 막고, 혈관 신생 (혈관의 성장), 면역 체크포인트 조절을 제한하고, 방사성 동위 원소를 전달하고, 화학 요법 약물 및 siRNA를 공자에이전트로2. 또한, 환자 유래 T세포 및 NK 세포(CAR-T 및 CAR-NK)의 표면에 다양한 항체의 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 연구하는 것은 세포 기반 치료법에 대한 임상 조사의 급속한 성장 영역이다4.
종양 세포를 발현하는 항원에게 선택성을 제공하는 항체 기반 약물의 초고친화성은 매력적인 제대리인입니다. 마찬가지로, 치료 항체(또는 화학약물)의 표적 전달 및 종양 보유는 독성에 대한 효능의 균형을 맞추는 열쇠이다. 따라서, 이중특이적5 및 삼중특이항체(6)를 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 단백질 공학 기반 전략이 정맥내(IV)의 종양 보유를 크게 향상시키는 데 이용되고 있다5,7. 여기서, 우리는 잠재적으로 효과적인 항암 항체의 종양 및 조직 분포를 해결하기 위한 간단한 형광 기반 방법을 설명한다.
동물 조직은 가시 스펙트럼에서 흥분할 때 자동 형광을 가지고 있기 때문에, 항체는 처음에 근적외선 염료로 표지되었다 (예를 들어, IRDye 800CW). 개념 조사의 증거를 위해, 우리는 엽산 수용체 알파-1 (FOLR1)의 탈구 수용체 알파-1 (FOLR1) 팔레투주맙이라고 불리는 항체와 그 유도체라는 이중 특이적 앵커 Cyto독성 활성제 (BaCa)7 항체를 공동 표적으로 하는 FOLR1 및 죽음 수용체-5 (DR5)8을 하나의 재조합 항체에서 사용했습니다. FOLR1은 난소 및 TNBC 암세포, 종양 이종이이식 및 환자 종양9에서잘 정의된 과발현 표적 수용체이다. 특히, 난소 및 유방암을 위한 면역 효과제 세포 및 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 참여시키기 위한 항체 기반접근법을이용하여FOLR1을임상적으로 악용하기 위한 여러 노력이 있다.
본 방법 논문에서, 우리는 CHO 발현 시스템을 이용한 다른 제어 항체와 함께 임상 항FOLR1(farletuzumab)을 복제, 발현 및 정제하였다. IgG1 아이소타입 및 아바고보마브(12)라고 불리는 임상 항관용형 뮤신-16 항체가 음의 대조군으로 사용되었다. 단백질-A 정화에 따라, 표시된 항체는 IRDye 800CW로 표지되었고, 난소 종양 이종이이식또는 안정적으로 전염성이 있는 인간 FOLR1을 베어링 난소 종양 xenografts 또는 안정적으로 전염성이 있는 인간 FOLR1의 꼬리 정맥으로 투여되었다. 항체 국소화는 여러 개의 상이한 시간점7에서 생체 내 이미징 스펙트럼을 이용한 라이브 이미징에 의해 추적되었다. 이 방법은 빛 방출을 가능하게 하기 위하여 기판의 어떤 유전 수정 또는 주입을 요구하지 않으며 상당히 빠르고, 비용 효과적이고 효율적입니다. 아래에 설명된 일반적인 복제, 발현, 정제 및 라벨링 프로토콜은 중형 및 광 사슬 서열을 사용할 수 있는 경우 모든 임상 및 비임상 항체에 적용될 수 있다.
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Protocol
동물 취급 및 종양 xenografts 연구 와 관련된 모든 절차는 버지니아 대학에 여기에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되고 관련 규제 기준을 준수했습니다
1. 항체의 발현 및 정화
- CHO 셀의 유지 보수
- 프리스타일 초 미디어에서 CHO 세포를 성장시키면 37°C에서 130rpm에서 흔들리는 1x 글루타민 보충제로 보충되었으며, 5%CO2는 유리 또는 일회용 을 사용한다.
참고: 통풍캡이 있는 당황한 플라스크를 사용하여 교반을 늘리고 흔들리는 상태에서 가스 전달을 개선하는 것이 좋습니다. 현탁액 배양의 제한된 동요로 인해 일반 플라스크(비당황)로 항체 수율이 현저히 감소하였다. - 세포 수 1-5 x 106 셀/mL 사이의 셀 수를 >95%의 세포 생존가능성으로 유지한다. 세포 수가 5 x 106 셀/mL 이상 증가하는 경우 셀을 분할합니다. CHO 셀이 0.2 x 106 셀/mL 이하로 도달할 수 없습니다.
- 프리스타일 초 미디어에서 CHO 세포를 성장시키면 37°C에서 130rpm에서 흔들리는 1x 글루타민 보충제로 보충되었으며, 5%CO2는 유리 또는 일회용 을 사용한다.
- CHO 세포의 전환
- 200mL의 미디어(2 x 106 셀/mL)에서 CHO 세포를 길게 길게 굴절한 플라스크로 성장시다.
참고: 당황한 플라스크에서 자란 서스펜션 배양은 항상 더 높은 단백질 수확량을 생산해 왔으며, 당황하지 않는 플라스크에서 재배할 때는 항상 더 높은 단백질 수확량을 생산해 주어 있습니다. - 15mL 튜브에서 CHO FreeStyle 미디어 5mL을 복용하고 VH 클론 DNA 50 μg와 VL 클론 DNA 75 μg를 추가합니다. 소용돌이가 잘 섞입니다.
- 실온에서 DNA 혼합물을 5분 동안 배양합니다.
참고: 더 긴 배큐베이션으로 단백질 수율이 줄어듭니다. - DNA 용액에 1 mg/mL 폴리에틸렌네이민(PEI) 스톡의 750 μL을 추가하고 혼합물을 30초 동안 적극적으로 소용돌이치게 한다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
참고 : PEI는 신선하게 만들어야합니다. PEI의 여러 동결 해동 주기는 전체 수율을 크게 줄입니다. - 수동으로 플라스크를 흔들면서 세포에 DNA와 PEI의 전체 혼합물을 추가합니다. 즉시 130 rpm에서 흔들리는 37 °C에서 세포로 delong Erlenmeyer 당황 플라스크를 배양.
- 200mL의 미디어(2 x 106 셀/mL)에서 CHO 세포를 길게 길게 굴절한 플라스크로 성장시다.
- 식
참고: 항체는 항체가 매체로 분비되는 것을 돕는 N 단말 끝으로 설계된 분비 신호 펩티드를 가지고 있습니다.- 37°C에서 감염된 세포를 성장시키고, 1일째에 130rpm에서 흔들어 보입니다.
- 2일째에는 100x 항응약제 2mL, 100x 항균 항골성 용액 2mL를 추가합니다. 플라스크를 낮은 온도(32-34°C)로 이동하여 130rpm에서 흔들어 보세요.
- 5일마다 트립톤 N1 사료 10mL, 글루타민 보충제 2mL를 추가합니다.
- 트라이판 블루 얼룩으로 세포의 알리쿼트 염색 후 혈종계를 사용하여 3 일마다 세포를 계속 계산하십시오. 셀 생존 능력이 80% 이상 유지되도록 합니다.
- 10일 또는 11일에, 항체 정화를 위한 배지를 수확한다. 배양을 3000 x g,4°C에서 40-60분 동안 돌린 다음 0.22 μM 병 필터를 사용하여 투명 미디어를 필터링합니다.
- 정화
참고: 항체 정제는 연동 펌프를 사용하여 시판되는 단백질-A 컬럼(재료 표참조)을 사용하여 수행됩니다.- 결합 버퍼의 두 컬럼 부피 (pH 7.4에서 20 mMM 나트륨 인산염)으로 컬럼을 평형화합니다.
- 1 mL/min의 유량으로 컬럼을 통해 항체(1.3.5단계에서 얻어진)를 포함하는 여과된 미디어를 전달한다.
- 바인딩 버퍼의 두 열 볼륨으로 열을 세척합니다.
- 5mL 용출 버퍼(pH 3.4에서 30mM 나트륨 아세테이트)를 사용하여 항체를 500 μL 분획으로 엘테.
- 분획당 중화 버퍼(pH 9에서 3M 나트륨 아세테이트)의 10μL을 추가하여 용출된 항체의 pH를 중화한다.
참고: 분수 번호 3-6은 항체의 대부분을 포함합니다. 항체가 예상보다 나중에 분수로 용출되는 경우에 모든 분획을 유지하는 것이 좋습니다. - IgG의 기본 프로토콜을 선택하여 분광계를 사용하여 정제된 항체의 농도를 측정합니다. 항체의 최종 농도는 분자량 및 흡수 계수를 고려하여 mg/mL에서 얻어진다.
2. 형광 라벨링
참고: 항체는 단백질과 결합하고 안정된 공주를 형성하는 NHS 에스테르 반응성 단을 포함하는 적외선 염료로 표지됩니다. 이 반응은 pH 민감하고 pH 8.5에서 가장 잘 작동합니다. 염료로 표지된 형광 접합체는 최대 774nm의 흡수와 789nm의 방출을 표시한다. pH 8.5는 효과적인 연상을 위한 핵심입니다.
- 투석 카세트(0.1-0.5mL)를 이용하여 항체의 투석 0.5mL을 1L의 컨쥬게이션 버퍼(pH 8.5에서 50mMMM인산염 버퍼)로 한다. 4 시간 후 투석 카세트를 신선한 버퍼로 옮기고 하룻밤 동안 투석을 합니다.
- 500 μL의 반응 부피에 항체의 1 mg 당 IRDye 800CW의 0.03 mg을 첨가하여 인주 반응을 설정합니다.
참고: IRDye 800CW는 10 mg/mL의 농도로 DMSO에 용해된다. - 20°C에서 2h에 대한 라벨링 반응을 수행합니다.
참고: 2시간 이상의 시간이 증가해도 라벨링이 개선되지 않습니다. - 1배 PBS에 대한 광범위한 투석으로 표시된 컨쥬게이트를 정화합니다.
- 780nm에서 염료의 흡광도 및 280 nm에서 단백질의 흡수력을 측정하여 라벨링 정도를 추정한다. 280 nm 신호에 대한 염료 기여도는 3%입니다.
- 이 포뮬러를 사용하여 염료/단백질 비율을 계산합니다.
여기서 0.03은 280nm(780nm에서 흡수력의 3.0%에 해당)에 사용되는 염료의 흡수에 대한 보정 인자이며, ε염료 및 ε단백질은 각각 염료 및 단백질(항체)에 대한 어금니 소멸 계수이다.
참고: ε염료는 270,000 M-1cm -1이고 ε단백질은 PBS: 메탄올의 1:1 혼합물에서 203,000 M-1cm -1 (전형적인 IgG의 경우)이다. IgG 이외의 단백질은 매우 다른 어금니 멸종 계수를 가질 수 있습니다. 관심있는 단백질에 대한 올바른 소멸 계수의 사용은 D / P 비율의 정확한 측정을 위해 필수적입니다. - 이 포뮬러를 사용하여 최종 단백질 농도를 계산합니다.
참고: 항상 ELISA를 사용하여 표지되고 표지되지 않은 항체의 항원 결합 효능을 확인합니다(효소 연결 면역소벤트 분석기) 또는 생체 내 연구를 진행하기 전에 세포측정을 유동한다.
3. 마우스 이종이이식 연구
- 주사를 위한 종양 세포의 준비
- RPMI-1640 배지에서 OVCAR-3 세포를 성장, FBS의 10 %와 1 x 페니실린 - 연쇄 절제술.
- 주입 전날, 100mL의 완전한 중간/접시를 갖춘 새로운 100mm 배양 요리로 서브컬쳐 셀을 배양합니다. 세포 수 0.5-1 x 106 셀/접시를 사용하십시오.
- 배양문화는 37°C 온도, 습도 95%, 20-24h의 CO2 5% 에서 배양한다.
- 주사 당일, 배양 접시에서 성장 배지를 제거하십시오. Ca2+/Mg2+ 무료 DULbecco의 인산완충식 식염수(DPBS)로 세포 층을 철저히 헹구어 죽은 세포, 세포 파편 및 혈청의 모든 흔적을 제거하여 트립신 작용을 방해할 수 있습니다.
- 트립시뉴션은 각 접시에 트립신-EDTA 용액의 1.0-1.5mL을 추가하여 세포를 배설하고 5-10 분 동안 37 °C에서 37 °C에서 배양 한 후 모든 요리를 기울여 용액을 확산하려고합니다.
참고: 반전된 현미경으로 세포를 관찰하여 실제 트립시화 상태를 확인합니다. 트립시화하에서 배양 접시 표면으로부터 세포 분리의 수가 적어질수록 트립시니화가 세포 스트레스를 유발합니다. 따라서 적절한 트립시니화가 중요합니다. - 트립신 작용을 중지하려면 각 접시에 완전한 성장 매체의 1.0-1.5 mL을 추가, 그 후 부드럽게 파이펫에 의해 세포를 다시 중단.
참고: 부드러운 파이펫팅은 세포 건강을 유지하는 데 중요합니다. - 셀 서스펜션을 15mL 원상 튜브로 수집하고 실온에서 5 분 동안 250 x g에서 회전하십시오.
- 상체를 제거한 후 세포 펠릿을 수집하고 1x DPBS에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 세포를 세척한다.
- 셀 서스펜션을 저속 250 x g에서 5분 동안 회전시킵니다.
- DPBS의 500 μL을 추가하고 단일 셀 서스펜션을 얻기 위해 부드러운 파이펫팅으로 세포를 다시 일시 중단합니다.
- 혈전계 또는 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다.
참고: 더 나은 정확도를 위해 계산을 세 번 반복하고 평균을 섭취하십시오. - 최종 세포 밀도가 1 x 108 셀/mL이 되도록 부피를 조정합니다.
- 마우스 이노 이식을 개발하기 위해 세포의 피하 주입
참고: 모든 절차는 BSL2 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 아티믹 누드 Foxn1nu/Foxn1+ 마우스는 현재 연구에서 사용되었습니다.- 셀 서스펜션의 50 μL을 1.5mL 튜브로 가져 가서 지하 막 매트릭스 배지의 50 μL과 혼합하십시오.
참고: 지하 막 매트릭스 매체는 실온에서 상태와 같은 젤을 형성하는 경향이 있으므로 얼음에 세포와 매트릭스 중간 혼합물을 주의 깊게 유지합니다. 튜브, 팁 및 주사기를 냉장고에 보관한 다음 동물 주사 전에 얼음을 옮기는 것이 좋습니다. - 어떤 세포 덩어리를 피하기 위해 혼합물을 동요. 그런 다음 5 x 106 세포를 포함하는 셀 서스펜션 매트릭스 중간 혼합물의 100 μL을 1 cc 주사기로 가져 가라.
- 동물의 피부를 부드럽게 들어 올려 기본 근육 층에서 피부를 분리하고 26 G 바늘로 피부 (5 x 106 세포) 아래에 세포 현탁액 (100 μL)을 천천히 주입합니다. 바늘을 꺼내기 전에 몇 초 동안 기다렸다가 지하 매트릭스 매체가 피부 아래 세포와 함께 구조와 같은 반고체 젤을 형성하여 주입 부위에서 나오는 혼합물을 방지할 수 있습니다.
참고: 세포는 면역 결핍 마우스에 해를 끼칠 수 있는 오염에 대한 주입 전에 시험될 필요가 있습니다. 주입하는 동안이 예상보다 깊은 종양을 형성 할 수 있기 때문에 피부에 너무 깊은 바늘을 넣어하지 않습니다. - 동물을 멸균 케이지에 넣고 약 20분 동안 관찰하십시오.
- 2-3 주 동안 마우스를 관찰하고 종양이 최대 500mm3 크기까지 자랄 수 있도록하십시오.
- 셀 서스펜션의 50 μL을 1.5mL 튜브로 가져 가서 지하 막 매트릭스 배지의 50 μL과 혼합하십시오.
4. 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 항체 국소화
참고: 본 실험에서 사용되는 생체 내 이미징 장비(재료표참조)는 살아있는 유기체 내에서 비침습적 시각화 및 세포 및 유전 활성을 실시간으로 추적하기 위한 고효율 필터 및 스펙트럼 미혼합 알고리즘 세트를 사용합니다. 시스템은 형광 및 생물 발광 모니터링 기능을 모두 제공합니다.
- 꼬리 정맥을 통해 25 μg의 염료 표지 항체를 주입하십시오.
- 종양 베어링 마우스를 2% 이소플루란을 사용하여 마취합니다. 페달 반사 신경에 대한 응답의 부족을 확인합니다.
- 마우스가 움직이지 않는 후에는 벌레 물을 적용하여 측면 꼬리 정맥을 팽창시다.
- 26G 바늘로 1cc 인슐린 주사기를 사용하여 표지된 항체의 25 μg(100 μL)를 주입합니다.
- 유사하게, 부정적인 대조군으로서, 암세포를 표적으로 하지 않는 비특이적 IgG1 Isotype 항체를 라벨 및 주입한다.
- 항체 주사의 8, 24, 48 시간, 기타 후에 생체 내 라이브 이미징을 수행하십시오.
- 관련 소프트웨어에서, 제어판에 있는 초기화를 클릭하고 스테이지 온도가 37°C인지 확인한다.
- 산소 공급, 마취 시스템의 모든 펌프, 마취 챔버에 이소플루란 가스 공급을 켜고 이소플루란 기화기 밸브를 2 %로 설정합니다.
- 마우스를 마취실로 옮기고 마우스가 완전히 마취될 때까지 기다립니다. 눈의 건조를 피하기 위해 눈 윤활 연고를 적용하십시오.
- 제어패널로이동하여 이미징 마법사 옵션을 통해 형광 이미징을 설정하고 773 nm에서 발아및 792 nm에서 방출을 선택합니다.
참고: 기본 자동 노출 설정은 좋은 형광 이미지를 제공합니다. 그러나 필요에 따라 자동 노출 환경 설정을 수정할 수 있습니다. - 마취된 마우스를 이미징 챔버로 옮기고 코 콘을 사용하여 이미징 필드에 조립합니다. 이미징 단계는 한 번에 5개의 마우스를 수용할 수 있는 옵션을 제공합니다.
참고: 분석 하는 동안 노출 및 기타 설정의 유사한 금액을 가지고 테스트 마우스와 함께 이미지 제어 마우스를 가지고있다. - 모든 것이 준비되면 이미지 수집을 위해 제어판에서 획득 옵션을 선택합니다.
- 자동 노출 설정을 사용하면 시스템이 1분 이내에 이미지를 생성합니다. 생성된 이미지는 광학 형광 강도가 수 또는 광자의 단위로 표시하거나 효율성 측면에서 사진 이미지에 형광의 오버레이입니다.
- 이미지를 얻은 후 이미징 챔버에서 케이지로 마우스를 옮기고 1~2분 동안 회복을 관찰합니다.
- 이미지 분석을 위해 소프트웨어 내에서 제공되는 도구와 기능으로 이미지를 미세 조정합니다. 이미지 분석 도구는 메뉴 표시줄과 도구 팔레트에 있습니다.
- 이미지 조정에서밝기, 대비 또는 불투명도를 조정하고 색상 축척을 선택합니다.
- ROI 도구를 사용하여 광학 이미지에 관심 영역(ROI)을 지정하고 ROI 내의 신호 강도를 측정합니다. 필요한 경우 정량화된 신호 데이터를 스프레드시트 소프트웨어로 내보내고 데이터를 플롯합니다.
- 후속 연구를 위해, 다양한 조직의 쥐 부검을 분석 (예를 들어, 간, 폐, 심장, 신장, 비장, 뇌 등) 형광 으로 표시 된 항체의 상세한 비 특이적 분포를 위해 나란히 분석.
참고: 데이터는 96및 분석에서 항원(FOLR1)을 사용하여 조직 특정 ELISA를 통해 더욱 지원될 수 있다.
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Representative Results
기술된 방법론에서, 먼저 우리는 엽산 수용체 알파-1(FOLR1)이라는 이름의 엽산 수용체 알파-1(FOLR1)을 표적으로 하는 항체를 복제하고, 바백고보맙과 같은 대조군 항체와 함께 팔레투주맙과 렉사투무맙으로 구성된 BaCa라는 이중특이적 항체(보충 파일 1에서제공된 서열). DNA 클론(pVH, pVL)의 대표적인 가변 헤비(VH) 및 가변광(VL) 도메인의 세부 사항은 도 1A에도시된다. 양성 클론을 확인하기 위해, 우리는 신호 펩티드 포워드 (SP For) 및 CK Rev / CH3 Rev 프라이머 (보충 파일 1에서제공되는 서열)을 사용하여 콜로니 PCR을 수행했습니다. 콜로니 PCR의 대표적인 결과는 빛과 무거운 사슬의 예상 크기를 확인(도 1C). 양성 항체 클론은, 또한, Sanger 시퀀싱을 사용하여 확인되었다. 확인된 pVH 및 pVL DNA 복제에 이어, 초현액 배양을 이용하여 경질이 수행되었고, 그 다음으로 4°C에서 항체의 단백질-A 컬럼 친화성 정화(세부 단계에 대한 도 1B 및 프로토콜 참조).
다른 대조군 IgG1과 함께 정제된 팔레투주맙의 대표적인 결과는(BaCa 항체를 제외하여 비감소 및 감소S PAGE를 감소시키는 경우를 제외하면 도 2A에도시된다. 분명하듯이, 무거운 체인과 라이트 체인은 감소 후 50 및 25 KDa 밴드를 생산했다. 이것은 세포 표면에 네이티브 단백질에 항체의 결합 확인에 선행되었습니다. OVCAR3 세포 표면에 인간 FOLR1에 결합하는 대표적인 팔레투주맙은 유동 세포측정(도2B)을이용하여 나타난다.
다음으로 형광표지 항체는 FOLR1발성 종양으로 이식된 동물로 주입된 꼬리정맥(도3)이었다. 동물은 IVIS를 사용하여 여러 시간 지점에서 라이브 이미지되었다. 이 데이터는 FOLR1+ 종양(도4 및 도 5)으로FOLR1 및 BaCa 항체의 선택적 농축을 확인합니다. 중요한 대조항체(종양 항원에 대한 음성)는 종양으로 국소화되지 않았다.
그림 1: 항체 복제, 발현 및 정제의 회로도.
(A)무거운 (pVH) 및 빛 (pVL) 체인 벡터의 세부 회로도를 나타낸다. (B)pVH 벡터는 광사슬의 가변 도메인 서열을 운반하는 IgG1 헤비 체인 및 pVL 벡터의 가변 도메인 서열을 전달하여 조 또는 HEK 세포의 현탁액 배양을 추가하기 전에 형질 시약(미루스 또는 PEI 와 같은)과 함께 혼합하였다. 세포는 다음날 보충 사료로 공급되었고 배양은 간헐적인 수식으로 10 일 동안 모니터링되었습니다. 11일째에, 세포는 단백질-A를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 선행한 0.2 μm PES 필터를 통해 수확하였다. 정제된 항체는 다음으로 살아있는 세포에서 % 단머(FPLC), 결합 활성(ELISA 또는 SPR) 및 표적 항원(FACS)에 결합을 위해 분석되었다. 항체는 또한 생체 내 소약(예를 들어, 세포 성장 억제, 세포 생존가능성, 또는 신호 중간 인산화 등의 억제)에서 검사될 수 있다. 항체는 또한 생체 내 이미징을 위한 먼 빨간색 염료(예를 들어, IRDye 800CW)와 결합될 수 있다. ± IRDye 800CW는 종양 및 조직 분배 연구 전에 활동을 위해 시험되어야 합니다. (C)콜로니 PCR의 아가로즈 젤은 양성 중형(1.4Kb) 및 라이트 체인(0.8 Kb) 클론의 크기를 확인한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 항체 무결성을 확인하기 위한 젤 기반 환원 분석.
(A)4개의 다른 IgG1 항체(상단에 표시된 회로도)는 10분 동안 95°C에서 감소제(BME 또는 DTT와 같은)± 첨가하였다. 항체는 단백질 염색 및 화상 진찰에 선행된 10% SDS-PAGE 젤에 다음로 로드되었습니다. 좌우의 겔 이미지는 각각 그대로 항체와 2개의 분리된 폴리펩티드(~50KDa 및 ~25KDa)를 명확하게 나타낸다. 또한 VH/VL, CH1/CK, CH2 및 CH3 도메인에 대응하는 cDNA를 운반하는 pVH 및 pVL 벡터맵(그림 1)을참조하십시오. (B)난소암세포에 네이티브 FOLR1에 결합하는 폴레투주맙을 표지한 IRDye 800CW의 유동 세포측정 확인. 비 감소 = 항체는 염료를 줄이는 젤에서 실행, 감소 = 항체는 염료를 감소시키는 젤에서 실행, HC = 헤비 체인, LC = 라이트 체인, VL = 라이트 체인의 가변 도메인, VH = 무거운 체인의 가변 도메인, CK = Kappa 체인이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 종양 생성 및 항체 치료의 실험 회로도.
6-8주 된 마우스 균주는 다음과 같이: 면역절결성 자립성 자립성 누드/NSG/면역능력 C57BL/6 또는 Balb/C 마우스는 피하(SQ) 종양을 통해 종양 세포로 쉽게 이식될 수 있다. 유사한 연구는 유방 지방 패드와 복막 내 종양을 사용하여 수행 될 수있다 (IP) 종양. 3-4주 후(종양~200mm3),마우스는 종양 과발현 수용체에 대하여 ± 선택적인 IRDye 표시 항체로 주입하였다. 이것은 생체 내 화상 진찰에 있는 살아있는 뒤에 선행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 인간 OVCAR3 종양 베어링 마우스의 생체 내 이미징을 살수 있습니다.
무작위로 선택 6 받는 다(나이) 및 20-25 그램 (무게) 털이 없는 자티믹 누드 Foxn1nu/Foxn1+ (Envigo)FOLR1+ 난소 종양으로 이식되었다 (OVCAR-3 세포). 명백한 종양으로 3 주 후에, 마우스는 IRDye 800CW 표지된 IgG1 대조군, abagovomab (CA-125 반대로 바보 같은 항체), farletuzumab (반대로 FOLR1 항체) 및 BaCa (반대로 FOLR1-DR5 항체)로 주입된 꼬리 정맥이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 뮤린 MC38 세포 유래 종양 베어링 마우스를 발현하는 인간 FOLR1의 생체 내 이미징을 라이브.
(A)무작위로 선택 6 받는 다 8 주 (나이) 및 20-25 g NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ또는 누드 마우스는 인간 FOLR1을 안정적으로 표현하는 murine MC38 세포로 SQ주입하였다. 종양 출현 시, 마우스는 IRDye 800CW 표지 IgG1 대조군, 아바고포마브 (CA-125 항 바보 항체), 팔레투주맙 (안티 FOLR1 항체) 및 BaCa (안티 FOLR1-DR5 항체)로 주사된 꼬리 정맥이 때때로 표시된 라이브 이미징에 뒤따랐습니다. (B)7일 후 동물은 안락사및 고립된 키 장기(표시된 대로)를 상대항체 신호(IRDye 800CW) 분포를 위한 접목된 종양과 함께 함께 심영상하였다. 예상대로, 종양은 IgG1 대조군 및 CA-125 항 바보 항체, abagovomab 주입 동물에 IRDye 800CW 신호로 부정적인 남아 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
항암 치료제의 선택적 및 종양 조직 특이적 전달은 주어진 표적요법(13)의효능 및 안전성 을 측정하는 열쇠이다. 여기서 우리는 임상, 팔레투주맙 및 비임상 BaCa 항체의 상세한 조직 및 종양 분포를 조사하기 위하여 신속하고 능률적인 접근을 기술했습니다. 설명된 접근법은 새로 생성된 항체에 적용가능하며 종양/장기 분포 특성에 대한 임상적으로 효과적인 항체(원하는 자질)와 함께 사용될 수 있다. 대부분의 항체 표적 수용체(예: 유방암HER2)를 고려하면 종양 세포(조직)에서 높게 과발현되며, 대부분의 경우 최적이 아닌 발현 및 기능은 종양세포(14)를제외한 세포 유형에서도 중요하다. 예를 들어, 결장암 환자에서 임상 항체를 표적으로 하는 EGFR의 상당 비율이 축적되어 피부조직(15)에독성을 일으키고, 성장과 분화가 EGFR 신호 및 기능을 필요로 하는 비암 조직이다. 따라서, 우리는 강력하게 동물의 더 큰 집단에서 간독성 및 조직 조직 학적 작용과 조합에 예비 조직 분포 조사의 이러한 종류가 포괄적으로 새로 생성 된 항체의 안전성과 치료 생존을 평가하는 열쇠라고 생각합니다. 더욱이, 기술된 조직 분포 연구는 또한 면역 유능한 마우스 xenograft 연구 결과에서 높게 적용될 것이고, 새로 생성된 항체가 뮤린 대응 항원/수용체에 교차 반응성을 유지하는 경우에. 합성 동물 연구에서, 종양 분포 및 조직 조직 화학 연구와 함께, 상세한 혈액 사이토카인 분석은 효능 및 안전 데이터를 강화하는 데 사용할 수 있습니다. 설명된 접근법의 매력적인 특징은 종양 및 기타 중요한 조직 용액(간, 심장, 폐, 비장, 신장 등)으로부터 ELISA(표적 항원 반대)로 데이터가 추가적으로 지원되는 경우 항체 분포의 거의 정확한 양을 허용한다는것이다. 단일 광자 방출 컴퓨팅 단층 촬영(SPECT라고 함)과 위치 방출 단층 촬영(PET)을 통해 기술된 방법의 또 다른 중요한 특징은 비용효율(16)이다. SPECT와 PET 는 모두 매우 비싸고 이미징을 위해 방사성 추적기를 사용하여 동물의 큰 코호트를 테스트하는 경우 전체 공정을 번거롭게만듭니다(17). 또한 SPECT 및 PET 이미징 시설은생쥐(18)와같은 질병의 작은 동물 모델을 연구하기 위해 실험실 및 생체 관리에서 매우 표준적이지 않다.
항체 종양 분포의 거의 정확한 양을 달성하는 예술된 방법에 대한 하나의 제한은 높은 친화성 표적 항원 결합에 대한 의존성이다. 높은 친화항원-항체 상호작용은 강화된 내분비증및리소좀(19)에의해 "표적 매개 약물 처분(TMDD)"을 초래할 수 있기 때문이다. 따라서, 기술된 접근법의 결과는 특정 종양 유형의 특정 표적 수용체에 따라 달라질 것이다. 따라서, 표적 항원 수용체의 가변(이질) 발현을 갖는 하나 이상의 종양 세포주(s)로 생성된 종양 이종이이식을 갖는 동물의 큰 코호트에서 표지된 항체/항체를 시험하는 것이 강력히 권장됩니다. 또한 제안된 연구에 대해 하나 이상의 형광 컨쥬게이트 염료(들) 및 마우스 균주를 사용하는 것이 좋습니다.
Fabs, scFvs, BiTes, DART 등과 같은 작은 크기의 항체(신생아 Fc 수용체(FcRn)에 의한 인양 재활용이 혈청 반시간 분에서 몇 시간 까지 명확하다는 점을 고려하여, FcRn 발현이 매우 가변적인 다른 종양 유형 간의 데이터를 비교하기 위해 주의를 기울여야 한다. 더욱이, 인양 재활용을 위해 Fc 도메인으로 설계된 더 큰 분자(이중 및 삼특이성 항체와 같은)에는 조직/종양 침투 문제가 있다. 이러한 시나리오에서, 기술된 접근법은 크기6에서현저하게 다른 항체의 조직/종양 분포를 비교하기에 적합하지 않을 것이다. 그러나 유의의 측면에서, 설명된 종양 및 상세한 조직 분포 연구는 이들의 대응적인 단일특이성 항체와 함께 효과적인 이중 및 삼특이성 항체 플랫폼 설계의 핵심 요소로 작용할 것이다. 마지막으로, 상화도 및 부도 최적화 된 항체는 일반적으로 종양에서 유의한 분포를 가지고 있기 때문에, 표적 종양 에피토프 선택 (TMDD 부족), 특정 암 모델의 전반적인 항체 친화성 및 생물학적 활성은 항상 종양 침투, 안전 성 및 효능의 결론을 내리기 전에 고려해야한다.
요약하자면, 정맥 내 주입 된 항체의 종양 및 조직 분포를 모니터링하기위한 빠르고 간단한 방법을 설명했습니다. 설명된 접근법은 항체-siRNA 컨쥬게이트(siRNA가 표지된 곳), 항체-약물 컨쥬게이트(약물이 표지된 곳) 및 항체 나노입자(나노입자 지질이 형광염으로 표지되는 곳)를 분석할 수 있는 잠재력을 추가했다. 마찬가지로, 키메라 항원 수용체 T세포(CAR-T) 및 CAR-NK의 종양 표적접기 scFv(멜라미드 화학으로 형광로 표시되는 경우)와 CAR-NK에서 유일하게 설계된 시스테인 잔류물은 바이러스 성 트랜스페션 기반 GFP/RFP 신호 전략과 는 무관하게 이러한 세포 기반 치료법의 종양/조직 분포를 분석하는 비용 효율적인 접근법이 될 것이다.
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Disclosures
저자는 경쟁 적인 재정적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 버지니아 대학 암 센터 핵심 이미징 시설, 생체 분자 분석 시설, 고급 현미경 검사시설 및 핵심 Vivarium 지원에 감사드립니다. J. T-S는 난소암 아카데미 (OCA-DoD)의 초기 경력 조사자입니다. 이 작품은 J. T-S, 미국 DoD 유방암 연구 프로그램 (BCRP)에 NCI / NIH 보조금 (R01CA233752)에 의해 지원되었다 J. T-S (BC17097) 및 미국 DoD 난소암 연구 프로그램 (OCRP) 자금 지원 상 (OC180412) J-S.J.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
