Summary
Aqui apresentamos um protocolo para estudar a localização in vivo de anticorpos em modelos de xenoenxerto de tumores de camundongos.
Abstract
Anticorpos monoclonais são drogas multifuncionais de alta afinidade que trabalham por mecanismos independentes variáveis para eliminar células cancerígenas. Ao longo das últimas décadas, o campo de conjugados anticorpos, anticorpos bisespecíficos, receptores de antígeno quimérico (CAR) e imunoterapia contra o câncer emergiu como a área mais promissora de investigações básicas e terapêuticas. Com numerosos testes em humanos bem-sucedidos visando receptores de ponto de verificação imunológicos e células CAR-T em leucemia e melanoma em um ritmo inovador, são tempos altamente emocionantes para terapêuticas oncológicas derivadas de variações da engenharia de anticorpos. Lamentavelmente, um número significativamente grande de anticorpos e terapêutica baseada em CAR também se mostrou decepcionante em testes em humanos de cânceres sólidos devido à limitada disponibilidade de células de efeito imunológico no leito tumoral. É importante ressaltar que a distribuição inespecífica de anticorpos terapêuticos em tecidos diferentes dos tumores também contribui para a falta de eficácia clínica, toxicidade associada e falha clínica. Como a tradução fiel de estudos pré-clínicos em trilhas clínicas humanas são altamente confiadas na eficácia e estudos de segurança do xenoenxerto de tumores de camundongos, aqui destacamos um método para testar o tumor e a distribuição geral de tecidos de anticorpos terapêuticos. Isso é conseguido rotulando o anticorpo purificado proteína-A com corante fluorescente infravermelho próximo seguido de imagem viva de camundongos portadores de tumores.
Introduction
A FDA aprovou o primeiro anticorpo monoclonal direcionado ao CD3 (OKT3, Muromonab) em 19861,2. Desde então, nos próximos vinte anos, houve uma rápida explosão no campo da engenharia de anticorpos devido ao sucesso esmagador de anticorpos contra inibidores de ponto de verificação imunológico3. Além da ativação indireta do sistema imunológico, os anticorpos estão sendo destinados a sinalizar diretamente as células cancerígenas para engajar precisamente as células efeitológicas, desencadear a citotoxicidade através do agonista do receptor da morte, bloquear a sinalização de sobrevivência das células tumorais, obstruir a angiogênese (crescimento dos vasos sanguíneos), restringir os reguladores imunológicos, fornecer radioisótopos, drogas de quimioterapia e siRNA como agentes conjugados2. Além disso, estudar os fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) de vários anticorpos na superfície das células T derivadas do paciente e células NK (CAR-T e CAR-NK) é uma área de rápido crescimento das investigações clínicas para terapias baseadas em células4.
A afinidade ultra-alta de drogas à base de anticorpos que fornecem seletividade para células tumorais expressas de antígeno torna-o um agente atraente. Da mesma forma, a entrega direcionada e a retenção tumoral de um anticorpo terapêutico (ou uma droga química) é a chave para equilibrar a eficácia sobre a toxicidade. Portanto, um grande número de estratégias baseadas em engenharia de proteínas que incluem, mas não se limitam a anticorpos bisespecíficos5 e tri-específicos6 estão sendo explorados para melhorar significativamente a retenção otimizada de tumores de intravenosamente (IV) injetável terapêutica5,7. Aqui, descrevemos um método simples baseado em fluorescência para abordar a distribuição de tumores e tecidos de anticorpos anticâncicos potencialmente eficazes.
Como os tecidos animais possuem auto-fluorescência quando excitados em espectro visível, os anticorpos foram inicialmente rotulados com corante infravermelho próximo (por exemplo, IRDye 800CW). Para provas de investigações conceituais, fizemos uso do receptor de folato alfa-1 (FOLR1) visando anticorpos chamados farletuzumab e seu derivado chamado ativador de citotoxicidade de âncora bispecífica (BaCa)7 anticorpo que co-visa FOLR1 e receptor de morte-5 (DR5)8 em um anticorpo recombinante. FOLR1 é um receptor-alvo superexpresso bem definido em células cancerígenas ovarianas e TNBC, xenoenxertos tumorais e tumores de pacientes9. Notavelmente, existem múltiplos esforços para explorar clinicamente folr1 usando abordagens baseadas em anticorpos para engajar células de efeito imunológico e conjugados de anticorpos (ADC) para cânceres de ovário e mama10,11.
Neste artigo de métodos, clonamos, expressamos e purificamos o anti-FOLR1 clínico (farletuzumab) juntamente com outros anticorpos de controle usando o sistema de expressão CHO. O isótipo IgG1 e um anticorpo clínico anti-idiotype mucin-16 chamado abagovomab12 foram usados como controles negativos. Após a purificação da proteína A, os anticorpos indicados foram rotulados com IRDye 800CW e foram administrados na veia traseira de camundongos nus, com xenoenxertos de tumor ovariano ou FOLR1 humanos transfectados com facadas expressando xenoenxertos de câncer de cólon murino. A localização de anticorpos foi rastreada por imagens ao vivo usando espectro de imagem in vivo em vários pontos de tempo diferentes7. Este método não requer qualquer modificação genética ou injeção do substrato para permitir a emissão de luz e é significativamente mais rápido, econômico e eficiente. O protocolo geral de clonagem, expressão, purificação e rotulagem descrito abaixo pode ser aplicado a qualquer anticorpo clínico e não clínico se as sequências de cadeia pesada e leve estiverem disponíveis.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo o manejo de animais e os estudos de xenoenxertos tumorais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) aqui na Universidade da Virgínia e de acordo com as normas regulamentares pertinentes
1. Expressão e purificação de anticorpos
- Manutenção de células CHO
- Cultivar células CHO em FreeStyle CHO Media complementada com suplemento de 1x glutamina disponível comercialmente a 37 °C tremendo a 130 rpm com 5% de CO2 usando frascos de Erlenmeyer longos, vidro ou descartáveis.
NOTA: É altamente recomendável usar um frasco perplexo com tampa ventilada para maior agitação e para melhorar a transferência de gás durante a condição de agitação. O rendimento de anticorpos significativamente reduzido foi obtido com frascos regulares (não perplexos) devido à agitação limitada da cultura de suspensão. - Mantenha o número de celular entre 1-5 x 106 células/mL com viabilidade celular >95%. Se o número de células aumentar acima de 5 x 106 células/mL, divida as células. Nunca permite que as células CHO alcancem abaixo de 0,2 x 106 células/mL.
- Cultivar células CHO em FreeStyle CHO Media complementada com suplemento de 1x glutamina disponível comercialmente a 37 °C tremendo a 130 rpm com 5% de CO2 usando frascos de Erlenmeyer longos, vidro ou descartáveis.
- Transfecção de células CHO
- Cultivar células CHO em 200 mL de mídia (2 x 106 células/mL) em frascos de longos Erlenmeyer perplexos.
NOTA: Culturas de suspensão cultivadas em frascos perplexos sempre produziram maiores rendimentos proteicos versus quando cultivadas em frascos não perplexos. - Em um tubo de 15 mL, pegue 5 mL de mídia CHO FreeStyle e adicione 50 μg de DNA de clone VH e 75 μg de DNA clone VL. Vórtice para misturar bem.
- Incubar a mistura de DNA à temperatura ambiente por 5 minutos.
NOTA: A incubação mais longa reduz a produção de proteínas. - Adicione 750 μL de 1 mg/mL de polietileneimina (PEI) à solução de DNA e vórtice agressivamente a mistura para 30 s. Incubar em temperatura ambiente por mais 5 minutos.
NOTA: PEI deve ser feito fresco. O ciclo de degelo múltiplo do PEI reduz significativamente o rendimento global. - Adicione toda a mistura de DNA e PEI nas células enquanto agita manualmente o frasco. Incubar imediatamente os frascos de longo Erlenmeyer perplexos com células a 37 °C tremendo a 130 rpm.
- Cultivar células CHO em 200 mL de mídia (2 x 106 células/mL) em frascos de longos Erlenmeyer perplexos.
- Expressão
NOTA: O anticorpo tem peptídeo de sinal secreto projetado para o final do terminal N, que ajuda anticorpos a serem secretados na mídia.- Cresça as células transfeinadas a 37 °C, com tremor a 130 rpm no dia 1.
- No dia 2, adicione 2 mL de 100x de agente anti-aglomerado e 2 mL de solução antibacteriana-anti-micótica de 100x. Mude o frasco para temperatura mais baixa (32-34 °C), com agitação a 130 rpm.
- Em cada quinto dia, adicione 10 mL de ração Tryptone N1, e 2 mL de suplemento de glutamina de 100x.
- Continue contando as células todos os três dias usando hemótmetro depois de colorindo uma alíquota de células com mancha azul trypan. Certifique-se de que a viabilidade celular fique acima de 80%.
- No dia 10 ou 11, colhe o meio para purificação de anticorpos. Gire a cultura a 3000 x g, 4 °C por 40-60 min e depois filtre a mídia clara usando filtros de garrafa de 0,22 μM.
- Purificação
NOTA: A purificação de anticorpos é realizada utilizando-se uma coluna Protein-A comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais),utilizando uma bomba peristáltica.- Equilibre a coluna com dois volumes de coluna de tampão de ligação (fosfato de sódio de 20 mM no pH 7.4).
- Passe a mídia filtrada contendo anticorpos (obtidos na etapa 1.3.5) através da coluna na taxa de fluxo de 1 mL/min.
- Lave a coluna com volume de duas colunas de tampão de ligação.
- Elute o anticorpo em frações de 500 μL usando tampão de elução de 5 mL (acetato de sódio de 30 mM em pH 3.4).
- Neutralize o pH do anticorpo elucido adicionando 10 μL de tampão de neutralização (acetato de sódio de 3 M a pH 9) por fração.
NOTA: A fração número 3-6 contém a maior parte do anticorpo. É aconselhável manter todas as frações caso o anticorpo seja elucido em uma fração posterior do que o esperado. - Meça a concentração de anticorpos purificados usando um espectotômetro selecionando o protocolo padrão para IgG. A concentração final do anticorpo é obtida em mg/mL considerando o peso molecular e o coeficiente de absorção.
2. Rotulagem fluorescente
NOTA: Os anticorpos são rotulados com o corante infravermelho que contém um grupo reativo de éster NHS, que acoplam às proteínas e formam um conjugado estável. Esta reação é sensível ao pH e funciona melhor em pH 8.5. Conjugados fluorescentes rotulados com o corante exibem um máximo de absorção de 774 nm, e um máximo de emissão de 789 nm. pH 8.5 é fundamental para uma conjugação eficaz.
- Dialyze 0,5 mL do anticorpo usando um de diálise (0,1-0,5 mL) em 1 L de tampão de conjugação (tampão fosfato de 50 mM no pH 8.5). Depois de 4h transfira o de diálise para tampão fresco e diálise durante a noite.
- Configure uma reação conjugal adicionando 0,03 mg de IRDye 800CW por 1 mg de anticorpo em um volume de reação de 500 μL.
NOTA: IRDye 800CW é dissolvido em DMSO a uma concentração de 10 mg/mL. - Realizar reações de rotulagem por 2h a 20 °C.
NOTA: Aumentar o tempo além de 2h não melhora a rotulagem. - Purificar conjugados rotulados por diálise extensiva contra 1x PBS.
- Estime o grau de rotulagem medindo a absorção do corante a 780 nm e a absorção da proteína a 280 nm. A contribuição de corante para o sinal de 280 nm é de 3%.
- Calcule a razão corante/proteína usando esta fórmula:
onde 0,03 é fator de correção para a absorção do corante utilizado a 280 nm (igual a 3,0 % de sua absorvância a 780 nm), εCorante e proteína εsão coeficientes de extinção molar para o corante e a proteína (anticorpo) respectivamente.
NOTA: εCorante é 270.000 M-1 cm-1 e εProteína é 203.000 M-1 cm-1 (para um IgG típico) em 1:1 mistura de PBS: metanol. Proteínas diferentes do IgG podem ter coeficientes de extinção molar muito diferentes. O uso do coeficiente de extinção correto para a proteína de interesse é essencial para a determinação precisa da razão D/P. - Calcule a concentração final de proteína usando esta fórmula:
NOTA: Confirme sempre a eficácia de ligação de antígeno de anticorpo rotulado e sem rótulo usando ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ou citometria de fluxo antes de prosseguir para estudos in vivo.
3. Estudos de xenoenxerto de rato
- Preparação de células tumorais para injeção
- Cultivar células OVCAR-3 em RPMI-1640 Medium, suplementada com 10% de FBS e 1x penicilina-estreptomicina.
- Um dia antes da injeção, células de subcultura em novos pratos de cultura de 100 mm com 10 mL de meio/prato completo. Use o número celular de 0,5-1 x 106 células/prato.
- Incubar culturas a temperatura de 37 °C, 95% umidade e 5% DE CO2 para 20-24 h.
- No dia da injeção, remova o meio de crescimento dos pratos de cultura. Enxágue completamente a camada celular com ca2+/Mg2+ livre A solução salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco para remover células mortas, detritos celulares e todos os vestígios de soro, que podem interferir na ação de trypsin.
- Experimente as células adicionando 1,0-1,5 mL de solução Trypsin-EDTA para cada prato e tente espalhar a solução inclinando o prato ao redor seguido de incubação a 37 °C por 5-10 min.
NOTA: Observe células sob um microscópio invertido para verificar o estado real de trypsinização. Sob a tentação resulta em menor número de descolamento celular da superfície do prato de cultura, sobre a trippsinização induz o estresse celular. Então, a experimentação adequada é importante. - Adicione 1,0-1,5 mL de meio de crescimento completo a cada prato para parar a ação de trypsin, depois que re-suspender as células por pipetação suavemente.
NOTA: A tubulação suave é importante para manter a saúde celular. - Colete a suspensão da célula em um tubo cônico de 15 mL e gire a 250 x g por 5 min a temperatura ambiente.
- Colete a pelota celular depois de remover o supernasce e lave as células suspendendo a pelota em 1x DPBS.
- Gire a suspensão da célula em baixa velocidade 250 x g por 5 min.
- Adicione 500 μL de DPBS e suspenda as células por tubulação suave para obter suspensão de célula única.
- Conte células usando hemótmetro ou contador automatizado de células.
NOTA: Para melhor precisão, repita a contagem por três vezes e tome uma média. - Ajuste o volume de tal forma para que a densidade final da célula seja de 1 x 108 células/mL.
- Injeção subcutânea de células para desenvolver xenergrafos de camundongos
NOTA: Todos os procedimentos devem ser feitos em um gabinete de segurança BSL2. Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ ratos têm sido usados no presente estudo.- Leve 50 μL da suspensão celular em um tubo de 1,5 mL e misture com 50 μL de matriz de membrana de porão.
NOTA: O meio da matriz da membrana do porão tende a formar um estado de gel como o estado à temperatura ambiente, por isso mantenha cuidadosamente as células e a mistura média da matriz no gelo. É aconselhável manter tubos, pontas e seringas na geladeira e, em seguida, transferir gelo antes da injeção animal. - Agitar a mistura para evitar qualquer aglomeração celular. Em seguida, leve este 100 μL da mistura meio de suspensão da célula que contém 5 x 106 células, em uma seringa de 1 cc.
- Levante suavemente a pele do animal para separar a pele da camada muscular subjacente e injete lentamente a suspensão celular (100 μL) sob a pele (5 x 106 células), com uma agulha de 26 G. Aguarde alguns segundos antes de tirar a agulha, para que o meio de matriz do porão possa formar o gel semissólido como estrutura junto com células sob a pele, impedindo que a mistura saia do local da injeção.
NOTA: As células precisam ser testadas antes da injeção para qualquer contaminação que possa prejudicar camundongos imunodeficientes. Enquanto a injeção não coloca a agulha muito profunda na pele, pois isso pode formar o tumor mais profundo do que o esperado. - Mantenha o animal em uma gaiola estéril e observe por cerca de 20 minutos.
- Observe os camundongos por 2-3 semanas e permita que o tumor cresça até 500 mm3 tamanho.
- Leve 50 μL da suspensão celular em um tubo de 1,5 mL e misture com 50 μL de matriz de membrana de porão.
4. Localização de anticorpos usando um sistema de imagem in vivo
NOTA: O equipamento de imagem in vivo (ver Tabela de Materiais) usado neste experimento utiliza um conjunto de filtros de alta eficiência e algoritmos espectrais de não misturação para visualização não invasiva e rastreamento da atividade celular e genética dentro de um organismo vivo em tempo real. O sistema fornece capacidade de monitoramento de fluorescência e bioluminescência.
- Injete 25 μg de anticorpo rotulado de corante através da veia da cauda.
- Anestesina tumores com camundongos usando 2% de isoflurane. Verifique a falta de resposta aos reflexos do pedal.
- Uma vez que os ratos parem de se mover, dilatar a veia traseira lateral aplicando água de verme.
- Injete 25 μg (em 100 μL) de anticorpo rotulado usando 1 cc de seringa de insulina com uma agulha de 26 G.
- Da mesma forma, como um controle negativo, rotule e injete o anticorpo isótipo IgG1 não específico que não tenha como alvo as células cancerígenas.
- Realize imagens ao vivo in vivo após 8, 24, 48 h, etc. de injeções de anticorpos.
- No software associado, clique em Inicializar localizado no painel de controle e confirme que a temperatura do palco é de 37 °C.
- Ligue o suprimento de oxigênio, todas as bombas do sistema de anestesia, o fornecimento de gás isoflurane para câmara anestésico e ajuste a válvula vaporizadora isoflurane para 2%.
- Transfira os ratos para câmara anestésico e espere até que os ratos sejam completamente anestesiados. Aplique a pomada lubrificante dos olhos para evitar a secagem dos olhos.
- Vá para o painel Controle,configure a imagem de fluorescência através da opção Assistente de Imagem e selecione a excitação em 773 nm e emissão a 792 nm.
NOTA: As configurações padrão de exposição automática fornecem uma boa imagem fluorescente. No entanto, as preferências de exposição automática podem ser modificadas de acordo com as necessidades. - Transfira os camundongos anestesiados para a câmara de imagem e monte-o no campo de imagem usando cone de nariz. O estágio de imagem oferece a opção de acomodar 5 ratos por vez.
NOTA: Tenha os ratos de controle com imagens, juntamente com os ratos de teste, tenham uma quantidade semelhante de exposição e outras configurações durante a análise. - Uma vez que tudo esteja pronto, selecione Adquirir opção no painel de controle para a aquisição de imagem.
- Com as configurações de autoexposição, o sistema gera a imagem em um minuto. A imagem gerada é a sobreposição de fluorescência na imagem fotográfica com intensidade de fluorescência óptica exibida em unidades de contagens ou fótons, ou em termos de eficiência.
- Após adquirir a imagem, transfira os ratos da câmara de imagem de volta para sua gaiola e observe para sua recuperação por 1 a 2 min.
- Ajuste ainda mais a imagem com as ferramentas e funções fornecidas dentro do software para análise de imagens. As ferramentas de análise de imagem estão na barra de menu e na paleta de ferramentas.
- Em Ajuste de imagem,ajuste o brilho, contraste ou opacidade e selecione a escala de cores.
- Use as ferramentas do ROI para especificar uma região de interesse (ROI) em uma imagem óptica e medir a intensidade do sinal dentro do ROI. Se necessário, exporte os dados de sinal quantificados para um software de planilha e plote os dados.
- Para estudos de acompanhamento, analise necropsias de camundongos de vários tecidos (por exemplo, fígado, pulmão, coração, rim, baço, cérebro etc.) lado a lado para uma distribuição detalhada não específica de anticorpos fluorescentes rotulados.
NOTA: Os dados podem ser suportados com ELISA específico do tecido, fazendo uso de antígeno (FOLR1 neste caso) em 96 ensaios.
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Representative Results
Na metodologia descrita, primeiro clonamos anticorpos voltados para o receptor de folato alfa-1 (FOLR1) chamado farletuzumab, e um anticorpo bispecífico chamado BaCa consistindo de farletuzumabe e lexatumumab, juntamente com anticorpos de controle como abagovomab (sequências fornecidas no Arquivo Suplementar 1). Detalhes dos domínios de variável pesada (VH) e luz variável (VL) em clones de DNA (pVH, pVL) são mostrados na Figura 1A. Para confirmar os clones positivos, realizamos o PCR colônia utilizando peptídeos de sinal para a frente (SP For) e primers CK Rev/CH3 Rev (sequências fornecidas no Arquivo Suplementar 1). Resultados representativos da COLÔNIA PCR confirmam os tamanhos esperados de cadeias leves e pesadas(Figura 1C). Clones de anticorpos positivos foram confirmados, também, usando sequenciamento Sanger. Após a confirmação da clonagem de DNA pVH e pVL, as transfesões foram realizadas utilizando culturas de suspensão cho, seguidas de purificações de afinidade de coluna proteica-A de anticorpos a 4 °C (ver Figura 1B e protocolo para etapas detalhadas).
Os resultados representativos do farletuzumab purificado juntamente com outros controles IgG1 (exceto o anticorpo BaCa executado na PÁGINA SDS não redutor e redutor são mostrados na Figura 2A. Como evidente, a cadeia pesada e leve produziu bandas de 50 e 25 KDa após a redução. Isso foi seguido pela confirmação vinculante de anticorpos às proteínas nativas na superfície celular. A ligação representativa farletuzumabe ao FOLR1 humano na superfície das células OVCAR3 é mostrada usando citometria de fluxo(Figura 2B).
Os próximos anticorpos fluorescentes rotulados foram a veia da cauda injetada em animais enxertados com tumores expressos FOLR1(Figura 3). Os animais foram imagens ao vivo em vários pontos de tempo usando o IVIS. Os dados confirmam o enriquecimento seletivo dos anticorpos FOLR1 e BaCa nos tumores FOLR1+ (Figura 4 e Figura 5). É importante ressaltar que os anticorpos de controle (negativos para antígeno tumoral) não se localizaram em tumores.
Figura 1: Esquema de clonagem, expressão e purificação de anticorpos.
(A) Mostra o esquema de detalhes dos vetores de corrente pesado (pVH) e light (pVL). (B) vetor pVH carregando sequência de domínio variável de uma cadeia pesada IgG1 e vetor pVL carregando sequência de domínio variável de uma cadeia leve foram misturados (proporção 1:2) juntamente com reagentes de transfecção (como mirus ou PEI) antes de adicionar à cultura de suspensão de células CHO ou HEK. As células foram alimentadas com alimentação suplementar no dia seguinte e as culturas foram monitoradas por mais 10 dias com alimentação intermitente. No dia 11, as células foram colhidas através de filtros pes de 0,2 μm seguidos por cromatografia de afinidade utilizando proteína-A. Os anticorpos purificados foram analisados em seguida para % monômero (FPLC), atividade de ligação (ELISA ou SPR) e vinculação ao antígeno alvo (FACS) em células vivas. Os anticorpos também podem ser verificados para ensaios in vivo (por exemplo, inibição de crescimento celular, ensaios de viabilidade celular ou inibição de sinalização de fosforilação intermediária etc. Anticorpos também podem ser conjugados com corantes vermelhos, por exemplo, IRDye 800CW para imagens in vivo. ± IRDye 800CW deve ser testado para atividades anteriores a estudos de distribuição de tumores e tecidos. (C) Géis agarose da colônia PCR confirmando os tamanhos de clones positivos pesados (1,4 Kb) e cadeia leve (0,8 Kb). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Um ensaio de redução à base de gel para confirmar a integridade do anticorpo.
(A) Quatro anticorpos diferentes do IgG1 (esquemático mostrado no topo) foram adicionados ± agente redutor (como BME ou DTT) a 95°C por 10 minutos. Os anticorpos foram carregados em um gel de 10% SDS-PAGE seguido de coloração de proteínas e imagens. A imagem em gel à esquerda e à direita mostra claramente o anticorpo intacto e dois polipeptídeos separados (~50 KDa e ~25 KDa), respectivamente. Consulte também mapas vetoriais pVH e pVL(Figura 1)que carregam cDNA correspondente aos domínios VH/VL, CH1/CK, CH2 e CH3. (B) Confirmação da citometria de fluxo de unlabeled e IRDye 800CW rotulado farletuzumab vinculação para FOLR1 nativo em células cancerosas ovarianas. Não redução = Anticorpo executado em gel com corante não redutor, Reduzindo = Anticorpo executado em gel com corante redutor, HC = Cadeia pesada, cadeia LC = Cadeia leve, VL = Domínio variável da cadeia leve, VH = Domínio variável da cadeia pesada, cadeia CK = Kappa Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esquema experimental de geração de tumores e tratamentos de anticorpos.
Camundongos de 6 a 8 semanas de idade como: Imunodeficient atímica nude/NSG/ Imunocompetent C57BL/6 ou Camundongos Balb/C poderiam ser facilmente enxertados com células tumorais através de tumores subcutâneos (SQ). Estudos semelhantes poderiam ser realizados usando tumores de gordura mamária e tumores intraperitoneais (IP). 3-4 semanas depois (tumor ~200 mm3), os camundongos foram injetados com um IRDye rotulado anticorpos indicados que foram ± seletivo contra receptor superexpresso tumor. Isso foi seguido por imagens ao vivo in vivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem in vivo de camundongos portadores de tumor ovcar3 humanos.
Selecionados aleatoriamente de 6 a 8 semanas de idade (Idade) e 20-25 gramas (Peso) sem cabelo nude nu Foxn1nu/Foxn1+ (Envigo) foram enxertados com FOLR1+ tumores ovarianos (células OVCAR-3). Após 3 semanas com tumores evidentes, os camundongos foram injetados na veia traseira com controle IgG1 identificado como IRDye 800CW, abagovomab (anticorpo anti-idiota CA-125), farletuzumab (anticorpo anti-FOLR1) e BaCa (anticorpo anti-FOLR1-DR5) seguido de imagens ao vivo nos horários indicados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagem in vivo ao vivo do FOLR1 humano expressando tumor derivado de células murinas MC38 com camundongos.
(A) Selecionado aleatoriamente 6 a 8 semanas de idade (Idade) e 20-25 g NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ ou ratos nus foram SQ injetados com células murine MC38 expressando stably AVES HUMANAS. Após a aparência do tumor, os camundongos foram injetados na veia traseira com controle IgG1 identificado como IRDye 800CW, abagovomab (anticorpo anti-idiota CA-125), farletuzumabe (anticorpo anti-FOLR1) e BaCa (anticorpo anti-FOLR1-DR5) seguido de imagem ao vivo nos momentos indicados. (B) Após 7 dias, os animais foram eutanizados e os órgãos-chave isolados (como indicado) foram visualizados juntamente com tumores enxertados para distribuição de sinal de anticorpos relativos (IRDye 800CW). Como esperado, os tumores permaneceram negativos com o sinal IRDye 800CW no controle do IgG1 e o anticorpo anti-idiota CA-125, animais injetados por abagovomab. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Sequências de todos os anticorpos e primers. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A entrega específica do tecido seletivo e tumoral de agente terapêutico anticâncer é a chave para medir a eficácia e a segurança de uma determinada terapia-alvo13. Aqui descrevemos uma abordagem rápida e eficiente para investigar a distribuição detalhada de tecidos e tumores de anticorpos clínicos, farletuzumabe e um anticorpo BaCa não clínico. A abordagem descrita é aplicável a qualquer anticorpo recém-gerado e pode ser usada juntamente com um anticorpo clinicamente eficaz (com qualidades desejadas) para suas propriedades de distribuição de tumores/órgãos. Considerando que a maioria dos receptores-alvo de anticorpos (como o HER2 no câncer de mama) são altamente expressos em células tumorais (tecidos), na maioria dos casos sua expressão e função subótimas também é crítica em tipos celulares diferentes das células tumorais14. Por exemplo, uma proporção significativa de EGFR direcionado a anticorpos clínicos em pacientes com câncer de cólon se acumulam e causam toxicidade ao tecido da pele15, um tecido nãoncanceroso cujo crescimento e diferenciação requer sinalização e função EGFR. Portanto, acreditamos fortemente que esse tipo de investigações preliminares de distribuição de tecidos em combinações com hepatotoxicidade e ensaios histoquímicos teciduais em uma coorte maior de animais são fundamentais para avaliar de forma abrangente a segurança e a viabilidade terapêutica do anticorpo recém-gerado. Além disso, estudos de distribuição de tecidos descritos também seriam altamente aplicáveis em estudos de xenoenxerto de camundongos imunes competentes, se o anticorpo recém-gerado mantiver a reatividade cruzada ao antígeno/receptor murina. Em estudos em animais síngênicos, juntamente com a distribuição de tumores e estudos histoquímicos de tecido, a análise detalhada da citocina sanguínea pode ser usada para fortalecer os dados de eficácia e segurança. Uma característica atraente da abordagem descrita é que permite a quantitação quase precisa da distribuição de anticorpos se os dados forem adicionalmente suportados com ELISA (contra o antígeno alvo) do tumor e outros tecidos significativos (como fígado, coração, pulmão, baço, rim etc)7. Outra característica importante do método descrito sobre a tomografia computadorizada de emissão de fótons único (chamada SPECT) e tomografia de emissão de posição (PET) é o custo-efetividade16. Tanto o SPECT quanto o PET são muito caros e fazem uso de rastreadores radioativos para imagem, tornando todo o processo complicado se testar uma grande coorte de animais17. Além disso, as instalações de imagem SPECT e PET não são muito padrão em laboratórios e vivariums para estudar pequenos modelos animais de doenças como camundongos18.
Uma limitação com o método descrito para alcançar uma quantitação quase precisa da distribuição de tumores de anticorpos é a dependência da ligação de antígeno alvo de alta afinidade. É porque interações de antígeno-anticorpos de alta afinidade podem resultar em "disposição medicamentosa mediada por alvo (TMDD)" por endocitose aprimorada e shuttling para lysososomes19. Portanto, os resultados da abordagem descrita variam dependendo do receptor alvo específico em um determinado tipo de tumor. Assim, recomendamos fortemente testar anticorpos/anticorpos rotulados em uma grande coorte de animais com xenoenxertos tumorais gerados com mais de uma linha de células tumorais com expressão variável (heterogênea) do receptor de antígeno alvo. Também é muito recomendado fazer uso de mais de um corante conjugado fluorescente e cepas de camundongos para os estudos propostos.
Considerando que anticorpos de pequeno porte como Fabs, scFvs, BiTes, DARTs, etc. (falta de reciclagem de salvamento pelo receptor fc neonatal (FcRn) mais rapidamente dos tumores (com o soro meio tempo sendo minutos a horas), deve-se tomar cuidado para comparar dados entre diferentes tipos de tumores com expressão fcrn altamente variável. Além disso, moléculas maiores (como anticorpos de dupla e triespecífica) que são projetadas com domínio de Fc para reciclagem de salvamento têm problemas de penetração de tecidos/tumores. Nesses cenários, a abordagem descrita não será adequada para comparar a distribuição tecidual/tumor de anticorpos que diferem significativamente nos tamanhos6. Em termos de significância, no entanto, os estudos de distribuição de tumores descritos e detalhados, juntamente com seus anticorpos monoespecíficos contrapartes, serviriam como um fator-chave em um design eficaz de plataforma de anticorpos duplo e triespecífico. Finalmente, uma vez que os anticorpos otimizados para maior afinidade e avidagem geralmente têm uma distribuição significativamente homogênea nos tumores, a seleção de epitope tumoral alvo (sem DTM), afinidade global de anticorpos e atividade biológica em um determinado modelo de câncer devem ser sempre considerados antes de concluir a penetração do tumor, segurança e eficácia.
Em resumo, descrevemos um método rápido e simples para monitorar a distribuição de tumores e tecidos de anticorpos injetados por via intravenosa. A abordagem descrita adicionou potencial para analisar conjugados anticorpos-siRNA (onde o siRNA é rotulado), conjugados anticorpos -drogas (onde a droga é rotulada) e nanopartículas de anticorpos (onde os lipídios nanopartículas são rotulados com corante fluorescente). Da mesma forma, um resíduo de cisteína exclusivamente projetado em um tumor direcionado scFv (se fluorescentemente rotulado com química de melamida) de células T-receptor de antígeno quimérico (CAR-T) e CAR-NK será uma abordagem econômica para analisar a distribuição tumoral/tecido dessas terapias baseadas em células independente das estratégias de sinais de sinais GFP/RFP baseados em transfecção viral.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Somos gratos ao Centro de Câncer da Universidade da Virgínia, ao Centro de Análise Biomolecular, ao Centro Avançado de Microscopia e ao Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S é um investigador de carreira em início de carreira da Academia de Câncer de Ovário (OCA-DoD). Este trabalho foi apoiado pela subvenção do NCI/NIH (R01CA233752) para J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) prêmio de financiamento nível-1 para J. T-S (BC17097) e prêmio de financiamento do Programa de Pesquisa do Câncer de Ovário (OCRP) dos EUA (OC180412) para J. T-S
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
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