Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

تحليل الورم وتوزيع الأنسجة من مستضد الهدف الأجسام المضادة العلاجية محددة

doi: 10.3791/60727 Published: May 16, 2020
* These authors contributed equally

Summary

هنا نقدم بروتوكول لدراسة في توطين الجسم الحي للأجسام المضادة في الفئران نماذج xenograft الورم.

Abstract

الأجسام المضادة أحادية النسيلة هي الأدوية متعددة الوظائف ذات الصلة العالية التي تعمل من خلال آليات مستقلة متغيرة للقضاء على الخلايا السرطانية. على مدى العقود القليلة الماضية، برز مجال conjugates المضادة للأدوية، والأجسام المضادة للبيض، مستقبلات مستضدات الشيميك (CAR) والعلاج المناعي للسرطان كمنطقة واعدة للغاية من التحقيقات الأساسية والعلاجية. مع العديد من التجارب البشرية الناجحة التي تستهدف مستقبلات نقاط التفتيش المناعية وخلايا CAR-T في سرطان الدم وسرطان الجلد بوتيرة اختراقية ، فهي أوقات مثيرة للغاية للعلاجات الأورام المستمدة من الاختلافات في هندسة الأجسام المضادة. للأسف, وقد ثبت أيضا أن أعدادا كبيرة من الأجسام المضادة والعلاجات CAR على أساس مخيبة للآمال في التجارب البشرية من السرطانات الصلبة بسبب محدودية توافر الخلايا المناعية في السرير الورم. الأهم من ذلك، التوزيع غير محدد للأجسام المضادة العلاجية في الأنسجة غير الأورام تسهم أيضا في عدم وجود فعالية سريرية، والسمية المرتبطة بها والفشل السريري. كما تعتمد الترجمة المؤمنة للدراسات قبل السريرية في مسارات السريرية البشرية للغاية على الفئران الورم xenograft فعالية ودراسات السلامة، وهنا نسلط الضوء على طريقة لاختبار الورم وتوزيع الأنسجة العامة للأجسام المضادة العلاجية. ويتحقق ذلك عن طريق وضع العلامات على الأجسام المضادة المنقاة البروتين A مع صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء بالقرب تليها التصوير الحي للفئران الحاملة للورم.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وافقت ادارة الاغذية والعقاقير أول الأجسام المضادة أحادية النسيلة تستهدف CD3 (OKT3، Muromonab) في عام 19861،2. منذ ذلك الحين على مدى السنوات العشرين القادمة ، كان هناك انفجار سريع في مجال هندسة الأجسام المضادة بسبب النجاح الساحق للأجسام المضادة ضد مثبطات نقاط التفتيشالمناعية 3. بجانب التنشيط غير المباشر للجهاز المناعي ، يتم تهدف الأجسام المضادة إلى الإبلاغ مباشرة عن الخلايا السرطانية لإشراك الخلايا المناعية على وجه التحديد ، وإثارة السمية الخلوية عن طريق ناهض مستقبلات الموت ، وعرقلة إشارات بقاء الخلايا السرطانية ، وعرقلة تولد الأوعية (نمو الأوعية الدموية) ، وتقييد منظمي نقاط التفتيش المناعية ، وتقديم النظائر المشعة ، والعقاقير العلاجية الكيميائية وsrna كعوامل مترافقة2. بالإضافة إلى ذلك ، دراسة شظايا متغير سلسلة واحدة (scFv) من الأجسام المضادة المختلفة على سطح الخلايا التائية المستمدة من المريض وخلايا NK (CAR-T و CAR-NK) هي منطقة سريعة النمو من التحقيقات السريرية للعلاجات القائمة على الخلايا4.

التقارب فائقة عالية من الأدوية القائمة على الأجسام المضادة التي توفر الانتقائية لضداد التعبير عن الخلايا السرطانية يجعلها وكيلا جذابا. وبالمثل، فإن الولادة المستهدفة واستبقاء الورم في الجسم المضاد العلاجي (أو الدواء الكيميائي) هو المفتاح لتحقيق التوازن بين الفعالية على السمية. لذلك ، يتم استغلال عدد كبير من استراتيجيات الهندسة البروتينية التي تشمل ولكن لا تقتصر على5 والأجسام المضادة ثلاثيةالمحددة 6 لتعزيز كبير في الاحتباس الأمثل للورم من خلال الوريد (IV) حقن العلاجات5،7. هنا، نحن وصف طريقة بسيطة القائمة على الفلوريس لمعالجة الورم والأنسجة توزيع الأجسام المضادة المضادة للسرطان المحتملة الفعالية.

لأن الأنسجة الحيوانية تمتلك لصناعة السيارات الفلورية عندما متحمس في الطيف المرئي، وصفت في البداية الأجسام المضادة مع صبغة الأشعة تحت الحمراء القريبة (على سبيل المثال، IRDye 800CW). للحصول على براهين من التحقيقات مفهوم, لقد حققنا استخدام مستقبلات الفولات ألفا-1 (FOLR1) التي تستهدف الأجسام المضادة تسمى farletuzumab ومشتقة لها دعا مرساة Bispecific المنشط Cytotoxicity (BaCa)7 الأجسام المضادة التي تستهدف CO-FOLR1 ومستقبلات الموت-5 (DR5)8 في جسم مضاد واحد المؤتلف. FOLR1 هو مستقبلات مستهدفة واضحة ومحددة في المبيض والخلايا السرطانية TNBC، xenografts الورم وأورام المريض9. وتجدر الإشارة إلى أن هناك جهود متعددة لاستغلال سريريا FOLR1 باستخدام النهج القائمة على الأجسام المضادة لإشراك الخلايا المناعية والمقويات المخدرات المضادة (ADC) لسرطانات المبيض والثدي10،11.

في هذه الورقة الأساليب، ونحن استنساخ، وأعرب عن وتنقية السريرية المضادة لل FOLR1 (فارلتوزوماب) جنبا إلى جنب مع غيرها من الأجسام المضادة للسيطرة باستخدام نظام التعبير CHO. تم استخدام IgG1 isotype والأجسام المضادة للحماقة السريرية mucin-16 تسمى abagovomab12 كضوابط سلبية. بعد تنقية البروتين A، وصفت الأجسام المضادة المشار إليها مع IRDye 800CW وكانت تدار في الوريد الذيل للفئران عارية إما تحمل xenografts أو Xenografts الورم المبيض أو متحولة بشكل ثابت الإنسان FOLR1 التعبير عن سرطان القولون مورين xenografts. تم تتبع توطين الأجسام المضادة عن طريق التصوير الحي باستخدام طيف التصوير الحي في نقاط زمنية مختلفة متعددة7. ولا تتطلب هذه الطريقة أي تعديل وراثي أو حقن للركيزة لتمكين انبعاث الضوء وهي أسرع بكثير، وفعالة من حيث التكلفة والكفاءة. ويمكن تطبيق بروتوكول الاستنساخ والتعبير والتنقية ووضع العلامات العامة الوارد وصفها أدناه على أي جسم مضاد سريري وغير سريري إذا توفرت تسلسلات سلسلة ثقيلة وخفيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم استعراض جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل مع الحيوانات ودراسات xenografts الورم والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية (IACUC) هنا في جامعة فرجينيا ومطابقة للمعايير التنظيمية ذات الصلة

1. التعبير وتنقية الأجسام المضادة

  1. صيانة خلايا CHO
    1. تنمو خلايا CHO في FreeStyle CHO وسائل الإعلام تكملها متاحة تجاريا 1x الجلوتامين الملحق في 37 درجة مئوية تهتز في 130 دورة في الدقيقة مع 5٪ CO2 باستخدام قارورة delong Erlenmeyer إما الزجاج أو المتاح.
      ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام قارورة حائرة مع غطاء تنفيسي لزيادة الانفعالات وتحسين نقل الغاز أثناء حالة الاهتزاز. وقد تم الحصول على انخفاض كبير في العائد من الأجسام المضادة مع القارورة العادية (غير حيرة) بسبب الانفعالات محدودة من ثقافة التعليق.
    2. الحفاظ على عدد الخلايا بين 1-5 × 106 خلايا / مل مع > 95٪ خلية قابلة للحياة. إذا زاد عدد الخلايا أكثر من 5 × 106 خلايا / مل، تقسيم الخلايا. لا تسمح أبدا لخلايا CHO بالوصول إلى أقل من 0.2 × 106 خلايا/مل.
  2. نقل خلايا CHO
    1. تنمو خلايا CHO في 200 مل من وسائل الإعلام (2 × 106 الخلايا / مل) في erlenmeyer delong حيرة القارورة.
      ملاحظة: أنتجت ثقافات التعليق التي تزرع في قارورة حائرة دائمًا غلة بروتين أعلى مقابل زراعتها في قارورة غير حائرة.
    2. في أنبوب 15 مل, اتخاذ 5 مل من وسائل الإعلام 5 فري ستايل CHO وإضافة 50 ميكروغرام من الحمض النووي استنساخ VH و 75 ميكروغرام من الحمض النووي استنساخ VL. دوامة لخلط جيدا.
    3. احتضان خليط الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: فترة حضانة أطول يقلل من غلة البروتين.
    4. أضف 750 ميكرولتر من مخزون البولي إثيلينمين 1 ملغ/مل (PEI) إلى محلول الحمض النووي ودوامة الخليط بقوة لمدة 30 s. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق إضافية.
      ملاحظة: يجب أن تكون جزيرة الأمير إدوارد طازجة. دورة ذوبان الجليد المتعددة من جزيرة الأمير إدوارد يقلل من العائد الإجمالي بشكل كبير.
    5. أضف الخليط الكامل من الحمض النووي وجزيرة الأمير إدوارد على الخلايا أثناء هز القارورة يدويًا. على الفور احتضان erlenmeyer delong حيرة قارورة مع الخلايا في 37 درجة مئوية تهتز في 130 دورة في الدقيقة.
  3. التعبير
    ملاحظة: يحتوي الجسم المضاد على ببتيد إشارة إفرازي تم تصميمه إلى نهايته N-Terminal ، مما يساعد على إفراز الأجسام المضادة في وسائل الإعلام.
    1. تنمو الخلايا المُعدّة بالعدوى عند 37 درجة مئوية، مع اهتزاز عند 130 دورة في الدقيقة في اليوم 1.
    2. في اليوم 2، إضافة 2 مل من 100x عامل مكافحة التكتل و 2 مل من 100x المضادة للبكتيريا- المضادة للبكتيريا- حل mycotic. احول القارورة إلى درجة حرارة أقل (32-34 درجة مئوية)، مع اهتزاز عند 130 دورة في الدقيقة.
    3. في كل يوم خامس، إضافة 10 مل من الأعلاف Tryptone N1، و 2 مل من 100x الجلوتامين الملحق.
    4. الحفاظ على عد الخلايا كل يوم ثالث باستخدام قياس الهيموسيت بعد تلطيخ aliquot من الخلايا مع وصمة عار زرقاء trypan. تأكد من بقاء الخلية فوق 80٪
    5. في اليوم 10 أو 11، حصاد المتوسطة لتنقية الأجسام المضادة. تدور الثقافة في 3000 س ز،4 درجة مئوية لمدة 40-60 دقيقة ومن ثم تصفية وسائل الاعلام واضحة باستخدام 0.22 μM مرشحات زجاجة.
  4. تنقيه
    ملاحظة: يتم إجراء تنقية الأجسام المضادة باستخدام عمود البروتين-A المتاح تجاريًا (انظر جدول المواد)باستخدام مضخة متعالة.
    1. اكويريبت العمود مع اثنين من حجم العمود من العازلة ملزمة (20 mM فوسفات الصوديوم في 7.4 pH).
    2. تمرير الوسائط المصفاة التي تحتوي على الأجسام المضادة (التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.5) خلال العمود بمعدل تدفق 1 مل/دقيقة.
    3. اغسل العمود بمخزن عمودين من المخزن المؤقت للربط.
    4. إلوت الجسم المضاد إلى 500 ميكرولتر باستخدام 5 مل عازلة elution (30 mM خلات الصوديوم في الأسي 3.4).
    5. تحييد الأسي للجسم المضاد المائل بإضافة 10 ميكرولتر من عازلة تحييد (3 M خلات الصوديوم في الأسي 9) لكل كسر.
      ملاحظة: يحتوي رقم الكسر 3-6 على معظم الأجسام المضادة. من المستحسن الحفاظ على جميع الكسور في حالة الجسم المضاد هو مُلَح في جزء لاحق مما كان متوقعا.
    6. قياس تركيز الأجسام المضادة النقية باستخدام مقياس الطيف الضوئي عن طريق تحديد البروتوكول الافتراضي لIgG. يتم الحصول على التركيز النهائي للجسم المضاد في ملغم / مل عن طريق النظر في الوزن الجزيئي ومعامل الامتصاص.

2. الفلورسنت وضع العلامات

ملاحظة: الأجسام المضادة هي المسمى مع صبغة الأشعة تحت الحمراء التي تحتوي على مجموعة رد الفعل استر NHS، الذي الأزواج إلى البروتينات وتشكيل اقتران مستقرة. هذا التفاعل هو درجة الحساسية درجة اله PH ويعمل بشكل أفضل في 8.5 درجة. الفلورسنت المرافقة المسمى مع عرض صبغة أقصى امتصاص 774 نانومتر، والحد الأقصى للانبعاثات من 789 نانومتر. 8.5 هو مفتاح الاقتران الفعال.

  1. Dialyze 0.5 مل من الجسم المضاد باستخدام كاسيت غسيل الكلى (0.1-0.5 مل) في 1 لتر من العازلة الاقتران (50 mM الفوسفات العازلة في الرقم الH 8.5). بعد 4 ح نقل كاسيت غسيل الكلى إلى عازلة جديدة و dialyze بين عشية وضحاها.
  2. إعداد تفاعل اقتران بإضافة 0.03 ملغ من IRDye 800CW لكل 1 ملغ من الأجسام المضادة في حجم رد فعل 500 ميكرولتر.
    ملاحظة: يتم حل IRDye 800CW في DMSO بتركيز 10 ملغ /مل.
  3. تنفيذ ردود الفعل وضع العلامات لمدة 2 ساعة في 20 درجة مئوية.
    ملاحظة: زيادة الوقت بعد 2 h لا يحسن وضع العلامات.
  4. تنقية الترافقات المسمى من قبل غسيل الكلى واسعة النطاق ضد 1X PBS.
  5. تقدير درجة وضع العلامات عن طريق قياس امتصاص الصبغة عند 780 نانومتر وامتصاص البروتين عند 280 نانومتر. مساهمة الصبغة إلى إشارة 280 نانومتر هو 3٪.
  6. حساب نسبة الصبغة/البروتين باستخدام هذه الصيغة:
    Equation 1
    حيث 0.03 هو عامل تصحيح لامتصاص الصبغة المستخدمة في 280 نانومتر (أي ما يعادل 3.0 ٪ من امتصاصها في 780 نانومتر) ، εالصبغة والبروتين ε هي معاملات انقراض الضروس للصبغة والبروتين (الأجسام المضادة) على التوالي.
    ملاحظة: εالصبغة هو 270،000 M-1 سم-1 والبروتين ε هو 203،000 M-1 سم-1 (لIgG نموذجي) في 1:1 خليط من برنامج تلفزيوني: الميثانول. قد يكون البروتينات الأخرى غير IgG معاملات الانقراض الضروس مختلفة جدا. استخدام معامل الانقراض الصحيح للبروتين من الفائدة أمر ضروري لتحديد دقيق من نسبة D / P.
  7. حساب تركيز البروتين النهائي باستخدام هذه الصيغة:
    Equation 2
    ملاحظة: تأكد دائمًا من فعالية ربط المستضد للأجسام المضادة المسماة وغير المسماة باستخدام ELISA (قياس الانزيم المناعي المرتبط) أو تدفق قياس الألياف قبل الانتقال إلى دراسات vivo.

3. ماوس xenograft الدراسات

  1. إعداد الخلايا السرطانية للحقن
    1. تنمو الخلايا OVCAR-3 في 1640-1640 متوسطة، مع تكملة 10٪ من FBS و 1x البنسلين-الستربتوميسين.
    2. في اليوم السابق للحقن، وخلايا الثقافة الفرعية في أطباق ثقافة جديدة 100 ملم مع 10 مل من كامل متوسط / طبق. استخدام عدد الخلايا من 0.5-1 × 106 الخلايا / طبق.
    3. احتضان الثقافات في درجة حرارة 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪ و 5٪ CO2 ل 20-24 h.
    4. في يوم الحقن، وإزالة متوسطة النمو من أطباق الثقافة. شطف طبقة الخلية بدقة مع Ca2+/ Mg2 + الحرة دولبيككو المالحة الفوسفات المخزنة (DPBS) لإزالة الخلايا الميتة، والحطام الخلوي وجميع آثار المصل، والتي قد تتداخل في عمل التربسين.
    5. Trypsinize الخلايا عن طريق إضافة 1.0-1.5 مل من تريبسين-EDTA حل لكل طبق ومحاولة لنشر الحل عن طريق إمالة الطبق في جميع أنحاء تليها الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
      ملاحظة: لاحظ الخلايا تحت مجهر مقلوب للتحقق من حالة التربسينية الفعلية. تحت نتائج trypsinization في عدد أقل من انفصال الخلية من سطح طبق الثقافة، أكثر من trypsinization يؤدي إلى الإجهاد الخلوي. لذا ، فإن التبسينينية المناسبة مهمة.
    6. إضافة 1.0-1.5 مل من متوسطة النمو الكامل لكل طبق لوقف عمل التربسين، بعد أن إعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف.
      ملاحظة: الخفقان اللطيف مهم للحفاظ على صحة الخلية.
    7. جمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل وتدور في 250 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. جمع بيليه الخلية بعد إزالة عظمى وغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق بيليه في 1X DPBS.
    9. تدور مع تعليق الخلية بسرعة منخفضة 250 × ز لمدة 5 دقائق.
    10. أضف 500 ميكرولتر من DPBS وإعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب لطيف للحصول على تعليق خلية واحدة.
    11. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
      ملاحظة: للحصول على دقة أفضل، كرر العد ثلاث مرات وأخذ متوسط.
    12. ضبط مستوى الصوت في مثل هذه الطريقة بحيث كثافة الخلية النهائية ستكون 1 × 108 خلايا / مل.
  2. حقن تحت الجلد من الخلايا لتطوير الماوس xenografts
    ملاحظة: يجب أن يتم إجراء كافة الإجراءات في خزانة سلامة BSL2. Athymic عارية Foxn1nu/ Foxn1+ الفئران وقد استخدمت في الدراسة الحالية.
    1. تأخذ 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب 1.5 مل ومزيج مع 50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة.
      ملاحظة: مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة يميل إلى تشكيل هلام مثل حالة في درجة حرارة الغرفة، لذلك الحفاظ على الخلايا بعناية والخليط المتوسط مصفوفة على الجليد. من المستحسن الحفاظ على الأنابيب والنصائح والمحاقن في الثلاجة ثم نقلها على الجليد قبل حقن الحيوان.
    2. تهيج الخليط لتجنب أي تكتل الخلية. ثم، تأخذ هذا 100 μL من خلية تعليق الخليط المتوسط الذي يحتوي على 5 × 106 الخلايا، في حقنة 1 سم مكعب.
    3. ارفع جلد الحيوان بلطف لفصل الجلد عن طبقة العضلات الكامنة وحقن تعليق الخلية (100 ميكرولتر) تحت الجلد (5 × 106 خلايا) ، مع إبرة 26 G. الانتظار لبضع ثوان قبل اتخاذ الإبرة، بحيث الطابق السفلي مصفوفة المتوسطة يمكن أن تشكل هلام شبه صلبة مثل هيكل جنبا إلى جنب مع الخلايا تحت الجلد، ومنع الخليط الخروج من موقع الحقن.
      ملاحظة: تحتاج الخلايا إلى اختبار قبل الحقن لأي تلوث قد يضر بالفئران المناعية. في حين حقن لا تضع الإبرة عميقا جدا في الجلد لأن هذا قد يشكل الورم أعمق مما كان متوقعا.
    4. إبقاء الحيوان في قفص معقمة ومراقبة لحوالي 20 دقيقة.
    5. مراقبة الفئران لمدة 2-3 أسابيع والسماح للورم أن ينمو ما يصل إلى 500 ملم3 حجم.

4. توطين الأجسام المضادة باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي

ملاحظة: في معدات التصوير الحي (انظر جدول المواد)المستخدمة في هذه التجربة يستخدم مجموعة من المرشحات ذات الكفاءة العالية وخوارزميات غير خلط الطيفية للتصور غير الباضع وتتبع النشاط الخلوي والوراثي داخل كائن حي في الوقت الحقيقي. النظام يوفر كلا من الفلوريسنس والأضواء الحيوية القدرة على الرصد.

  1. حقن 25 ميكروغرام من الأجسام المضادة المسمى صبغ عن طريق الوريد الذيل.
    1. تخدير الفئران التي تحمل الورم باستخدام 2٪ isoflurane. تحقق من عدم وجود استجابة لردود الفعل دواسة.
    2. بمجرد أن تتوقف الفئران عن الحركة ، توسع الوريد الجانبي من خلال تطبيق مياه الديدان.
    3. حقن 25 ميكروغرام (في 100 ميكرولتر) من الأجسام المضادة المسمى باستخدام حقنة الأنسولين 1 سم مكعب مع إبرة 26 G.
    4. وبالمثل، كتحكم سلبي، تسمية وحقن الأجسام المضادة IgG1 Isotype غير محددة التي لا تستهدف الخلايا السرطانية.
  2. أداء في التصوير الحي في الجسم الحي بعد 8, 24, 48 ح, إلخ من حقن الأجسام المضادة.
    1. في البرنامج المقترن، انقر فوق تهيئة موجودة في لوحة التحكم وتأكد من أن درجة حرارة المرحلة هي 37 درجة مئوية.
    2. بدوره على امدادات الاوكسجين، وجميع المضخات على نظام التخدير، وإمدادات غاز isoflurane إلى غرفة مخدر وتعيين صمام متبخر isoflurane إلى 2٪.
    3. نقل الفئران إلى غرفة مخدر والانتظار حتى الفئران مخدر تماما. تطبيق مرهم تزييت العين لتجنب تجفيف عيونهم.
    4. انتقل إلى لوحة التحكم، قم بإعداد التصوير المفلور من خلال خيار معالج التصوير وحدد الإثارة في 773 نانومتر والانبعاثات في 792 نانومتر.
      ملاحظة: توفر إعدادات التعريض التلقائي الافتراضية صورة فلورية جيدة. ومع ذلك، يمكن تعديل تفضيلات التعرض التلقائي وفقا للاحتياجات.
    5. نقل الفئران تخدير إلى غرفة التصوير وتجميعها على مجال التصوير باستخدام مخروط الأنف. توفر مرحلة التصوير خيارًا لاستيعاب 5 فئران في كل مرة.
      ملاحظة: يكون ماوس التحكم مع أجهزة الماوس اختبار أن يكون لها كمية مماثلة من التعرض والإعدادات الأخرى أثناء التحليل.
    6. بمجرد أن يصبح كل شيء جاهزًا، حدد خيار الحصول على لوحة التحكم للحصول على الصورة.
    7. مع إعدادات Autoexposure يقوم النظام بإنشاء الصورة في غضون دقيقة. الصورة التي تم إنشاؤها هي تراكب الفلوريسنس على الصورة الفوتوغرافية مع كثافة الفلورس البصرية المعروضة في وحدات من العد أو الفوتونات، أو من حيث الكفاءة.
    8. بعد الحصول على الصورة، نقل الفئران من غرفة التصوير مرة أخرى إلى قفصها ومراقبة لاسترداد لمدة 1 إلى 2 دقيقة.
  3. ضبط الصورة بشكل جيد مع الأدوات والوظائف المتوفرة داخل البرنامج لتحليل الصور. أدوات تحليل الصور في شريط القوائم ولوحة الأدوات.
    1. ضمن ضبط الصورة، اضبط السطوع أو التباين أو العتامة وحدد مقياس اللون.
    2. استخدم أدوات عائد الاستثمار لتحديد منطقة ذات أهمية (ROI) في صورة بصرية وقياس كثافة الإشارة داخل عائد الاستثمار. إذا لزم الأمر، قم بتصدير بيانات الإشارة الكمية إلى برنامج جدول بيانات و قم برسم البيانات.
    3. لإجراء دراسات المتابعة، تحليل الفئران necropsies من الأنسجة المختلفة (على سبيل المثال، الكبد، الرئة، القلب، الكلى، الطحال، الدماغ الخ) جنبا إلى جنب لتوزيع غير محدد مفصل من الأجسام المضادة الفلورية المسمى.
      ملاحظة: يمكن دعم البيانات كذلك مع ELISA الأنسجة محددة من خلال الاستفادة من المستضد (FOLR1 في هذه الحالة) في 96 كذلك المقايسات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في المنهجية الموصوفة، أولاً قمنا باستنساخ الأجسام المضادة التي تستهدف مستقبلات الفولات ألفا-1 (FOLR1) المسماة فارلتوزوماب، وأضداد من نوعها يسمى BaCa تتكون من فارلتوزوماب و lexatumumab جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة للسيطرة مثل abagovomab (تسلسل المقدمة في ملف التكميلية 1). وترد تفاصيل المتغير التمثيلي الثقيلة (VH) والضوء المتغير (VL) المجالات في استنساخ الحمض النووي (pVH، pVL) في الشكل 1A. لتأكيد استنساخ إيجابية، ونفذنا مستعمرة PCR باستخدام الببتيد إشارة إلى الأمام (SP for) وCK Rev/CH3 Rev التمهيديات (تسلسل المقدمة في ملف تكميلي 1). النتائج التمثيلية للمستعمرة PCR تؤكد الأحجام المتوقعة من سلاسل الضوء والثقيلة (الشكل 1C). تم تأكيد استنساخ الأجسام المضادة الإيجابية ، أيضًا ، باستخدام تسلسل Sanger. بعد تأكيد pVH وPVL DNA الاستنساخ، نفذت transfections باستخدام الثقافات تعليق CHO، تليها تنقية تقارب العمود البروتين-A من الأجسام المضادة في 4 درجة مئوية (انظر الشكل 1B والبروتوكول للخطوات التفصيلية).

تظهر النتائج التمثيلية لفارلتوزوماب المنقية جنبا إلى جنب مع التحكم الأخرى IgG1 (باستثناء باكا الأجسام المضادة تعمل على عدم خفض والحد من SDS PAGE في الشكل 2A. كما هو واضح، أنتجت سلسلة ثقيلة وخفيفة 50 و 25 شريط KDa بعد الحد. وأعقب ذلك تأكيد ملزم للأجسام المضادة للبروتينات الأصلية على سطح الخلية. ممثل فارلتوزوماب ملزمة للإنسان FOLR1 على سطح الخلايا OVCAR3 يظهر باستخدام تدفق الخلايا (الشكل 2B).

الأجسام المضادة التالية المسماة بالفلورسنت كانت ذات وريد ذيل حقنها في الحيوانات المطعمة مع FOLR1 التعبير عن الأورام (الشكل 3). تم تصوير الحيوانات حية في نقاط زمنية متعددة باستخدام IVIS. وتؤكد البيانات الإثراء الانتقائي لـ FOLR1 وBaCa الأجسام المضادة في FOLR1+ الأورام (الشكل 4 والشكل 5). الأهم من ذلك السيطرة على الأجسام المضادة (سلبية antigen الورم) لم توطين في الأورام.

Figure 1
الشكل 1: التخطيطي لاستنساخ الأجسام المضادة والتعبير والتنقية.
(A) يظهر تفاصيل التخطيط من الثقيلة (pVH) والضوء (pVL) سلسلة ناقلات. (B) pVH ناقلات تحمل تسلسل المجال المتغير من سلسلة IgG1 الثقيلة وpVL ناقلات تحمل تسلسل المجال المتغير لسلسلة الضوء كانت مختلطة معا (1:2 نسبة) جنبا إلى جنب مع الكواشف transfection (مثل mirus أو PEI) قبل إضافة إلى ثقافة تعليق من خلايا CHO أو HEK. وتم تغذية الخلايا بالأعلاف التكميلية في اليوم التالي وتم رصد الثقافات لمدة 10 أيام إضافية مع التغذية المتقطعة. في اليوم 11، تم حصاد الخلايا من خلال مرشحات PES 0.2 ميكرومتر تليها كروماتوغرافيا تقارب باستخدام البروتين-A. تم تحليل الأجسام المضادة المنقية التالية ل% مونومر (FPLC)، والنشاط الملزم (ELISA أو SPR)، وربط المستضد الهدف (FACS) على الخلايا الحية. ويمكن أيضا أن الأجسام المضادة لفحصها في مقايسات الجسم الحي (على سبيل المثال، تثبيط نمو الخلايا، مقايسات صلاحية الخلية، أو تثبيط الفوسفورة المتوسطة الإشارات الخ). ويمكن أيضا أن تكون مضادة مترافق مع الأصباغ الحمراء البعيدة على سبيل المثال، IRDye 800CW لفي التصوير في الجسم الحي. ± يجب اختبار IRDye 800CW للأنشطة قبل دراسات توزيع الأورام والأنسجة. (ج)Agarose جل من مستعمرة PCR تؤكد أحجام إيجابية الثقيلة (1.4 كيلو بايت) وسلسلة خفيفة (0.8 كيلو بايت) استنساخ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مقايسة تخفيض على أساس هلام لتأكيد سلامة الأجسام المضادة.
(أ)تمت إضافة أربعة أجسام مضادة مختلفة IgG1 (مخطط يظهر على القمة) ± وكيل تقليل (مثل BME أو DTT) عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم تحميل الأجسام المضادة التالية على هلام SDS-PAGE بنسبة 10٪ يليه تلطيخ البروتين والتصوير. صورة جل في اليسار واليمين تظهر بوضوح الأجسام المضادة سليمة واثنين من polypeptides منفصلة (~ 50 كيلو ادا و 25 كيلو) على التوالي. يرجى أيضاً الاطلاع على خرائط ناقلات pVH وpVL (الشكل 1) التي تحمل cDNA المقابلة لنطاقات VH/VL و CH1/CK و CH2 و CH3. (ب)تدفق تأكيد القياسات للخلايا من غير labeled و IRDye 800CW المسمى فارلتوزوماب ملزمة لFOLR1 الأصلي على خلايا سرطان المبيض. غير تخفيض = الأجسام المضادة تعمل على هلام مع صبغة غير متناقصة، والحد = الأجسام المضادة تعمل على هلام مع الحد من صبغ، HC = سلسلة الثقيلة، LC = سلسلة الضوء، VL = المجال المتغير من سلسلة الضوء، VH = المجال المتغير من سلسلة الثقيلة، CK = سلسلة كابا الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التخطيط التجريبي لـ التوليد الورمي وعلاجات الأجسام المضادة.
6-8 أسابيع الفئران القديمة سلالات مثل: المناعي athymic عارية / NSG / المناعية C57BL /6 أو Balb / C الفئران يمكن المطعمة بسهولة مع الخلايا السرطانية عن طريق الأورام تحت الجلد (SQ). ويمكن إجراء دراسات مماثلة باستخدام الثدي الدهون وسادة و intraperitoneal (الملكية الفكرية) الأورام. 3-4 أسابيع في وقت لاحق (الورم ~ 200 مم3)، وكانت الفئران حقن الرابع مع IRDye وأشار الأجسام المضادة التي كانت ± انتقائية ضد مستقبلات الورم overexpressed. وأعقب ذلك العيش في التصوير الحي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: يعيش في الجسم الحي التصوير من OVCAR3 ورم الإنسان تحمل الفئران.
تم اختيار عشوائيا 6 إلى 8 أسابيع من العمر (العمر) و 20-25 غرام (الوزن) عديم الشعر athymic عارية Foxn1nu/ Foxn1+ (Envigo)تم تطعيمها مع FOLR1+ أورام المبيض (OVCAR -3 الخلايا). بعد 3 أسابيع مع الأورام واضحة، كانت الفئران الذيل الوريد حقن مع IRDye 800CW المسمى السيطرة IgG1، abagovomab (CA-125 المضادة للأجسام المضادة للحماقة)، farletuzumab (المضادة FOLR1 الأجسام المضادة) وCaCa (المضادة لFOLR1-DR5 الأجسام المضادة) تليها التصوير الحي في الأوقات المشار إليها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: يعيش في vivo التصوير من FOLR1 الإنسان التعبير عن مورين MC38 الخلايا المشتقة من الفئران تحمل الورم.
(A) تم اختيارها عشوائيا 6 إلى 8 أسابيع من العمر (العمر) و 20-25 غ NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/ SzJ أو الفئران العارية تم حقن SQ مع خلايا murine MC38 بشكل ثابت تعبر عن FOLR1 الإنسان. عند ظهور الورم ، كانت الفئران حقن الوريد الذيل مع IRDye 800CW المسمى التحكم IgG1 ، abagovomab (CA-125 المضادة للألهية الأجسام المضادة) ، farletuzumab (المضادة FOLR1 الأجسام المضادة) وBaCa (المضادة لFOLR1 - DR5) تليها التصوير الحي في الأوقات المشار إليها. (B) بعد 7 أيام تم قتل الحيوانات وعزلة الأجهزة الرئيسية (كما هو مبين) تم تصويرها جنبا إلى جنب مع الأورام المطعمة لإشارة الأجسام المضادة النسبية (IRDye 800CW) توزيع. كما هو متوقع، ظلت الأورام سلبية مع IRDye 800CW إشارة في السيطرة IgG1 وCA-125 المضادة للأجسام المضادة، حقن أباغوفوماب الحيوانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: تسلسل جميع الأجسام المضادة والناية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

انتقائية وأورام تسليم محددة من العلاجية المضادة للسرطان وكيل هو المفتاح لقياس فعالية وسلامة العلاج المستهدف معين13. هنا وصفنا نهجاً سريع وفعالاً للتحقيق في توزيع الأنسجة والورم التفصيلية للجسم المضاد لـ BaCa غير السريرية. النهج الموصوف ينطبق على أي جسم مضاد تم إنشاؤه حديثًا ويمكن استخدامه جنبًا إلى جنب مع جسم مضاد فعال سريريًا (مع الصفات المطلوبة) لخصائص توزيع الورم /الجهاز. النظر في معظم مستقبلات الهدف للأجسام المضادة (مثل HER2 في سرطان الثدي) هي جداً مفرط في الخلايا السرطانية (الأنسجة), في معظم الحالات التعبير دون الأمثل ووظيفتها هو أيضاً حرجة في أنواع الخلايا الأخرى من الخلايا السرطانية14. على سبيل المثال، تتراكم نسبة كبيرة من الأجسام المضادة السريرية التي تستهدف EGFR في مرضى سرطان القولون وتسبب سمية للأنسجة الجلدية15، وهي أنسجة غير سرطانية يتطلب نموها وتمايزها إشارة EGFR ووظيفتها. لذلك، ونحن نعتقد بقوة هذه الأنواع من التحقيقات الأولية لتوزيع الأنسجة في مجموعات مع السمية الكبدية ومقايس الأنسجة في مجموعة أكبر من الحيوانات هي المفتاح لتقييم شامل سلامة وقابلية الحياة العلاجية للأجسام المضادة ولدت حديثا. وعلاوة على ذلك، فإن الدراسات المذكورة توزيع الأنسجة أيضا أن تكون قابلة للتطبيق للغاية في الدراسات xenograft الفئران المختصة المناعية، إذا كان الجسم المضاد ولدت حديثا يحافظ على التفاعل عبر إلى نظير murine antigen/ مستقبلات. في دراسات الحيوانات syngeneic, جنبا إلى جنب مع توزيع الأورام والدراسات الأنسجة هيستووكيميتري, تحليل مفصل السيتوكين الدم يمكن استخدامها لتعزيز فعالية وسلامة البيانات. ومن السمات الجذابة للنهج الموصوف أنه يسمح بكمية قريبة من الدقة لتوزيع الأجسام المضادة إذا تم دعم البيانات بالإضافة إلى ELISA (ضد المستضد المستهدف) من الورم والأنسجة الأخرى الهامة (مثل الكبد والقلب والرئة والطحال والكلى الخ)7. سمة أخرى هامة من الأسلوب الموصوفة على الانبعاثات الفوتون واحد التصوير المقطعي المحوسب (تسمى SPECT) والتصوير المقطعي للانبعاثات الموقف (PET) هو فعالية التكلفة16. كل من SPECT وPET مكلفة للغاية ويجعل من استخدام التتبعات المشعة للتصوير، مما يجعل العملية برمتها مرهقة إذا اختبار مجموعة كبيرة من الحيوانات17. وبالإضافة إلى ذلك SPECT وPET مرافق التصوير ليست قياسية جدا في المختبرات وvivriums لدراسة نماذج الحيوانات الصغيرة من الأمراض مثل الفئران18.

قيد واحد مع الأسلوب الموصوف لتحقيق كمية دقيقة تقريبا من توزيع ورم الأجسام المضادة هو الاعتماد على ربط مستضدية هدف تقارب عالية. وذلك لأن التفاعلات المضادة للأجسام المضادة تقارب عالية قد يؤدي إلى "التخلص من المخدرات بوساطة الهدف (TMDD)" عن طريق تعزيز endocytosis وssocing إلى lysosomes19. ولذلك، فإن نتائج النهج الموصوف تختلف تبعا لمستقبلات الهدف معينة في نوع معين من الورم. وهكذا، نوصي بشدة اختبار الأجسام المضادة المسمى / الأجسام المضادة في مجموعة كبيرة من الحيوانات مع xenografts الورم ولدت مع أكثر من خط خلية الورم (ق) وجود متغير (غير متجانسة) التعبير عن مستقبلات المستضد الهدف. كما يوصى بشدة باستخدام أكثر من صبغة (صبغة) فئران فلورية وسلالات (سلالات) فئران للدراسات المقترحة.

وبالنظر إلى أن الأجسام المضادة الصغيرة الحجم مثل فاب، scFvs، BiTes، DARTs، الخ (تفتقر إلى إعادة التدوير الإنقاذ من قبل مستقبلات Fc الوليدية (FcRn) واضحة بسرعة أكبر من الأورام (مع المصل نصف مرة يجري دقائق لساعات)، وينبغي توخي الحذر لمقارنة البيانات بين أنواع الأورام المختلفة وجود تعبير FcRn متغير للغاية. وعلاوة على ذلك، فإن الجزيئات الأكبر (مثل الأجسام المضادة المزدوجة والثُلِية) التي تم تصميمها مع مجال Fc لإعادة التدوير لديها مشاكل في اختراق الأنسجة/الأورام. في تلك السيناريوهات، لن يكون النهج الموصوف مناسبًا لمقارنة توزيع الأنسجة/الورم للأجسام المضادة التي تختلف بشكل كبير في أحجام6. من حيث أهمية ومع ذلك، فإن الورم الموصوف ودراسات توزيع الأنسجة مفصلة جنبا إلى جنب مع أجسامهم المضادة أحادية محددة النظيرة بمثابة عامل رئيسي في فعالية المزدوجة وثلاثة محددة تصميم منصة الأجسام المضادة. وأخيرا، منذ أعلى تقارب والأضداد الأمثل لتعطش عموما توزيع متجانسة إلى حد كبير في الأورام، واختيار epitope الورم الهدف (تفتقر TMDD)، وتقارب الأجسام المضادة الشاملة والنشاط البيولوجي في نموذج سرطان معين ينبغي دائما النظر قبل اتخاذ استنتاج من اختراق الورم والسلامة والفعالية.

باختصار ، لقد وصفنا طريقة سريعة وبسيطة لمراقبة توزيع الورم والأنسجة للأجسام المضادة عن طريق الحقن عن طريق الوريد. وقد أضاف النهج الموصوف إمكانات لتحليل conjugates الأجسام المضادة-سيرنا (حيث يتم تسمية سيرنا), المضادة للأجسام المخدرات conjugates (حيث يتم تسمية المخدرات) والأجسام المضادة نانو جسيمات (حيث يتم تسمية الدهون الجسيمات النانوية مع صبغة الفلورسنت). وبالمثل، فإن بقايا السيستين المهندسة بشكل فريد في ورم يستهدف scFv (إذا وصفت الفلورسنت مع كيمياء melamide) من الخلايا T-cell مستقبلات مستضدات الشميرية (CAR-T) و CAR-NK سيكون نهجاً فعالاً من حيث التكلفة لتحليل توزيع الورم/الأنسجة لهذه العلاجات القائمة على الخلايا مستقلة عن استراتيجيات إشارات GFP/RFP الفيروسية القائمة على فيروسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

ونحن ممتنون لمركز فرجينيا للسرطان مرفق التصوير الأساسي، مرفق التحليل الجزيئي الحيوي، مرفق المجهر المتقدم ومرفق فيفاريوم الأساسي للمساعدة. ج. تي-س هو محقق مهني مبكر في أكاديمية سرطان المبيض (OCA-DoD). وقد تم دعم هذا العمل من قبل منحة NCI / المعاهد القومية للصحة (R01CA233752) إلى J. T-S، الولايات المتحدة DoD برنامج أبحاث سرطان الثدي (BCRP) جائزة اختراق المستوى 1 إلى J. T-S (BC17097) والولايات المتحدة DOD برنامج أبحاث سرطان المبيض (OCRP) جائزة التمويل (OC180412) إلى J. T-S

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FreeStyle CHO media Gibco Life Technologies Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X) Gibco Life Technologies Cat # 15240-062
Anti-Clumping Agent Gibco Life Technologies Cat # 01-0057DG
BD Insulin Syringe BD BioSciences Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum PerkinElmer Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B Gibco Life Technologies Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Corning Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640 Corning Cat # 10-040-CV
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X) Gibco Life Technologies Cat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kit Invitrogen Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Column GE Healthcare Cat # 11-0034-93
Infusion Takara BioScience STO344
IRDye 800CW NHS Ester LI-COR Cat # 929-70020
Isoflurane, USP Covetrus Cat # 11695-6777-2
Lubricant Eye Ointment Refresh Lacri-Lube Cat #4089
Matrigel Corning Cat # 354234
PEI transfection reagent Thermo Fisher Cat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Thermo Scientific Cat # 66333
Steritop Vacuum Filters Millipore Express Cat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTA Gibco Life Technologies Cat # 15400-054
Experimental Models: Cell lines
Human: OVCAR-3 American Type Culture Collection ATCC HTB-161
Human: CHO-K cells Stable transformed in our lab ATCC CCL-61
Mouse: 4T1 Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38 Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC Authenticated by STR profiling
Mouse: MC38 hFOLR1 Generated in our laboratory (This paper)
Experimental Models: Animal
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ Envigo Multiple Orders
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson Laboratory Multiple Orders

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
  2. Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
  3. Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
  4. Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
  5. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
  6. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
  7. Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
  8. Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11, (7), 954 (2019).
  9. Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
  10. Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
  11. Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
  12. Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
  13. Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
  14. Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
  15. Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).
  16. Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
  17. van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
  18. Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
  19. Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
تحليل الورم وتوزيع الأنسجة من مستضد الهدف الأجسام المضادة العلاجية محددة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shivange, G., Mondal, T., Lyerly, E., Gatesman, J., Tushir-Singh, J. Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (159), e60727, doi:10.3791/60727 (2020).More

Shivange, G., Mondal, T., Lyerly, E., Gatesman, J., Tushir-Singh, J. Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (159), e60727, doi:10.3791/60727 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter