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Cancer Research

लक्ष्य एंटीजन विशिष्ट चिकित्सीय एंटीबॉडी के ट्यूमर और ऊतक वितरण का विश्लेषण

doi: 10.3791/60727 Published: May 16, 2020
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम चूहों ट्यूमर xenograft मॉडल में एंटीबॉडी के वीवो स्थानीयकरण में अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं।

Abstract

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी उच्च एफ़िनिटी मल्टीफंक्शनल दवाएं हैं जो कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए चर स्वतंत्र तंत्र द्वारा काम करती हैं। पिछले कुछ दशकों में एंटीबॉडी-ड्रग कंजूगेट्स, बिस्पीफिक एंटीबॉडी, चिमरिक एंटीजन रिसेप्टर्स (सीएआर) और कैंसर इम्यूनोथेरेपी का क्षेत्र बुनियादी और चिकित्सीय जांच के सबसे आशाजनक क्षेत्र के रूप में उभरा है । एक सफलता की गति से ल्यूकेमिया और मेलानोमा में प्रतिरक्षा चेकपॉइंट रिसेप्टर्स और कार-टी कोशिकाओं को लक्षित करने वाले कई सफल मानव परीक्षणों के साथ, यह एंटीबॉडी इंजीनियरिंग की विविधताओं से प्राप्त ऑन्कोलॉजिक चिकित्सा के लिए बेहद रोमांचक समय है। अफसोस, एंटीबॉडी और कार आधारित चिकित्सा विज्ञान की एक काफी बड़ी संख्या में भी ट्यूमर बिस्तर में प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं की सीमित उपलब्धता की वजह से ठोस कैंसर के मानव परीक्षणों में निराशाजनक साबित कर दिया है । महत्वपूर्ण बात, ट्यूमर के अलावा ऊतकों में चिकित्सीय एंटीबॉडी का गैर-विशिष्ट वितरण भी नैदानिक प्रभावकारिता, संबद्ध विषाक्तता और नैदानिक विफलता की कमी में योगदान देता है। मानव नैदानिक ट्रेल्स में प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के वफादार अनुवाद के रूप में चूहों ट्यूमर ज़ेनोग्राफ़ प्रभावकारिता और सुरक्षा अध्ययनों पर अत्यधिक भरोसा किया जाता है, यहां हम चिकित्सकीय एंटीबॉडी के ट्यूमर और सामान्य ऊतक वितरण का परीक्षण करने के लिए एक विधि पर प्रकाश डालते हैं। यह प्रोटीन-एक शुद्ध एंटीबॉडी के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबलिंग द्वारा प्राप्त किया जाता है जिसके बाद ट्यूमर असर चूहों की लाइव इमेजिंग होती है।

Introduction

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एफडीए ने 19861,2में सीडी 3 (ओकेटी3, मुरोमोनाब) को लक्षित करने वाले पहले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को मंजूरी दी। तब से अगले बीस वर्षों के लिए, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधकों के खिलाफ एंटीबॉडी की भारी सफलता के कारण एंटीबॉडी इंजीनियरिंग के क्षेत्र में तेजी से विस्फोट हुआ है3। प्रतिरक्षा प्रणाली के अप्रत्यक्ष सक्रियण के अलावा, एंटीबॉडी को सीधे प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं को शामिल करने के लिए कैंसर कोशिकाओं को ध्वजांकित करने, डेथ रिसेप्टर एगोनिस्ट के माध्यम से साइटोटॉक्सिक्सिटी को ट्रिगर करने, ट्यूमर सेल सर्वाइवल सिग्नलिंग को ब्लॉक करने, एंजियोजेनेसिस (रक्त वाहिकाओं के विकास) में बाधा डालने, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट नियामकों को बाधित करने, रेडियोआइसोटोप, कीमोथेरेपी दवाओं और सिआरएनए को एक समझौताएजेंटों केरूप में वितरित करने का लक्ष्य रखा जा रहा है। इसके अलावा, रोगी व्युत्पन्न टी-कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं (कार-टी और कार-एनके) की सतह पर विभिन्न एंटीबॉडी के एकल श्रृंखला चर टुकड़ों (एससीएफवी) का अध्ययन करना सेल-आधारित उपचार4के लिए नैदानिक जांच का एक तेजी से बढ़ता क्षेत्र है।

एंटीबॉडी आधारित दवाओं की अल्ट्रा-हाई एफ़िनिटी जो एंटीजन को ट्यूमर कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए चयनशीलता प्रदान करती है, यह एक आकर्षक एजेंट बनाती है। इसी तरह, लक्षित वितरण और एक चिकित्सीय एंटीबॉडी (या एक रासायनिक दवा) के ट्यूमर प्रतिधारण विषाक्तता पर प्रभावकारिता संतुलन की कुंजी है । इसलिए, बड़ी संख्या में प्रोटीन इंजीनियरिंग आधारित रणनीतियां शामिल हैं, जिनमें बिस्पिफिक5 और त्रि-विशिष्ट एंटीबॉडी6 तक सीमित नहीं हैं, नसों के अनुकूलित ट्यूमर प्रतिधारण को बढ़ाने के लिए शोषण किया जा रहा है (IV) इंजेक्शन थे चिकित्सीय5,7। यहां, हम संभावित प्रभावी कैंसर विरोधी एंटीबॉडी के ट्यूमर और ऊतक वितरण को संबोधित करने के लिए एक साधारण फ्लोरेसेंस-आधारित विधि का वर्णन करते हैं।

क्योंकि पशु ऊतकों के पास ऑटो-फ्लोरेसेंस होता है जब दृश्यमान स्पेक्ट्रम में उत्साहित होता है, एंटीबॉडी को शुरू में निकट इन्फ्रारेड डाई (जैसे, IRDye 800CW) के साथ लेबल किया गया था। अवधारणा जांच के सबूत के लिए, हम फोलेट रिसेप्टर अल्फा-1 (FOLR1) का उपयोग किया है fletuzumab कहा जाता है औरइसके व्युत्पन्न बिस्पेशिक एंकर Cytotoxicity सक्रियक (BaCa) 7 एंटीबॉडी कहा जाता है कि सह लक्ष्य FOLR1 और मौत रिसेप्टर-5 (DR5)8 एक recombinant एंटीबॉडी में । FOLR1 ओवेरियन और टीएनबीसी कैंसर कोशिकाओं, ट्यूमर xenografts और रोगी ट्यूमर 9 में एक अच्छीतरहसे परिभाषित अतिव्यक्त लक्ष्य रिसेप्टर है । विशेष रूप से, ओवेरियन और स्तन कैंसर10,11के लिए प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं और एंटीबॉडी दवा conjugates (एडीसी) को शामिल करने के लिए एंटीबॉडी आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके FOLR1 का चिकित्सकीय रूप से दोहन करने के लिए कई प्रयासहैं।

इस तरीके के कागज में, हमने चो अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके अन्य नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ नैदानिक एंटी-एफओएलआर1 (फारलेजुमाब) का क्लोन, व्यक्त और शुद्ध किया। IgG1 आइसोटाइप और एक नैदानिक विरोधी मूर्खता मसिन-16 एंटीबॉडी abagovomab12 कहा जाता है नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । प्रोटीन-ए शुद्धिकरण के बाद, संकेत दिया कि एंटीबॉडी को IRDye 800CW के साथ लेबल किया गया था और नग्न चूहों की पूंछ नस में प्रशासित किया गया था या तो ओवेरियन ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट्स असर या छुरा संक्रमित मानव FOLR1 murine पेट के कैंसर xenografts व्यक्त करते हैं । एंटीबॉडी लोकलाइजेशन को लाइव इमेजिंग द्वारा वीवो इमेजिंग स्पेक्ट्रम में कई अलग - अलग समयबिंदुओं पर उपयोगकरके ट्रैक किया गया था। इस विधि को प्रकाश उत्सर्जन को सक्षम करने के लिए सब्सट्रेट के किसी आनुवंशिक संशोधन या इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं होती है और यह काफी तेज, लागत प्रभावी और कुशल है। नीचे वर्णित सामान्य क्लोनिंग, अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और लेबलिंग प्रोटोकॉल को किसी भी नैदानिक और गैर-नैदानिक एंटीबॉडी पर लागू किया जा सकता है यदि भारी और प्रकाश श्रृंखला दृश्य उपलब्ध हैं।

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Protocol

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जानवरों से निपटने और ट्यूमर xenografts अध्ययन से जुड़े सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा की और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा यहां वर्जीनिया विश्वविद्यालय में मंजूरी दे दी और प्रासंगिक नियामक मानकों के अनुरूप थे

1. एंटीबॉडी की अभिव्यक्ति और शुद्धि

  1. चो कोशिकाओं का रखरखाव
    1. फ्रीस्टाइल सीई मीडिया में चो कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 130 आरपीएम पर मिलाते हुए 130 आरपीएम पर मिलाते हुए 5% सीओ2 के साथ पूरक चो कोशिकाओं को उगाएं या तो ग्लास या डिस्पोजेबल का उपयोग करें।
      नोट: यह अत्यधिक वृद्धि की स्थिति के लिए निकाल टोपी के साथ एक चकित फ्लास्क का उपयोग करने के लिए और मिलाते हुए हालत के दौरान गैस हस्तांतरण में सुधार करने की सिफारिश की है । निलंबन संस्कृति के सीमित आंदोलन के कारण नियमित फ्लास्क (गैर-चकित) के साथ महत्वपूर्ण रूप से कम एंटीबॉडी उपज प्राप्त की गई है।
    2. 1-5 x 106 कोशिकाओं/एमएल के बीच और अधिक से अधिक सेल व्यवहार्यता के बीच सेल संख्या बनाए रखें। यदि कोशिका संख्या 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल से अधिक बढ़ जाती है, तो कोशिकाओं को विभाजित करें । कभी भी चो कोशिकाओं को 0.2 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल सेनीचे पहुंचने की अनुमति न दें।
  2. चो कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन
    1. मीडिया के 200 एमएल में चो कोशिकाओं को उगाएं (2 x10 6 कोशिकाएं/एमएल) डेलॉन्ग एर्लेनमेयर चकित फ्लास्क में।
      नोट: चकित फ्लास्क में उगाई जाने वाली निलंबन संस्कृतियों ने हमेशा उच्च प्रोटीन पैदावार का उत्पादन किया है बनाम जब गैर-चकित फ्लास्क में उगाया जाता है।
    2. एक 15 एमएल ट्यूब में, चो फ्रीस्टाइल मीडिया के 5 एमएल लें और वीएच क्लोन डीएनए के 50 माइक्रोन और वीएल क्लोन डीएनए के 75 माइक्रोन जोड़ें। भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए।
    3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएनए मिश्रण इनक्यूबेट।
      नोट: अब इनक्यूबेशन प्रोटीन की पैदावार को कम कर देता है ।
    4. डीएनए समाधान में 1 मिलीग्राम/एमएल पॉलीथीलीनीमाइन (पीईआई) स्टॉक के 750 माइक्रोन जोड़ें और 30 एस के लिए मिश्रण को आक्रामक रूप से भंवर में डालें। अतिरिक्त 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
      नोट: पी ताजा किया जाना चाहिए । पी के कई फ्रीज गल चक्र समग्र उपज काफी कम कर देता है ।
    5. कोशिकाओं पर डीएनए और पी का पूरा मिश्रण जोड़ें, जबकि मैन्युअल रूप से फ्लास्क मिलाते हुए। तुरंत 130 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस मिलाते हुए कोशिकाओं के साथ delong Erlenmeyer चकित फ्लास्क इनक्यूबेट।
  3. अभिव्यक्ति
    नोट: एंटीबॉडी गुप्त संकेत पेप्टाइड अपने एन टर्मिनल अंत है, जो एंटीबॉडी मीडिया में बाहर स्रावित होने में मदद करता है इंजीनियर है ।
    1. 1 दिन 130 आरपीएम पर मिलाते हुए, 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    2. दूसरे दिन, 100x एंटी-क्लम्पिंग एजेंट के 2 एमएल और 100x एंटी-बैक्टीरियल-एंटी-माइकॉटिक समाधान के 2 एमएल जोड़ें। फ्लास्क को कम तापमान (32-34 डिग्री सेल्सियस) में शिफ्ट करें, 130 आरपीएम पर मिलाते हुए।
    3. हर पांचवें दिन, ट्राइप्टोन एन 1 फ़ीड के 10 एमएल और 100x ग्लूटामीन पूरक के 2 एमएल जोड़ें।
    4. ट्राइपैन नीले दाग के साथ कोशिकाओं के एक aliquot धुंधला के बाद हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर हर तीसरे दिन कोशिकाओं की गिनती रखें । सुनिश्चित करें कि सेल व्यवहार्यता 80% से ऊपर रहें।
    5. दिन 10 या 11 पर, एंटीबॉडी शुद्धि के लिए माध्यम फसल। 3000 x ग्रामपर संस्कृति को स्पिन करें, 40-60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और फिर 0.22 माइक्रोन बोतल फिल्टर का उपयोग करके स्पष्ट मीडिया को फ़िल्टर करें।
  4. शोधन
    नोट: एंटीबॉडी शुद्धिकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन-ए कॉलम (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके किया जाता है, एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके।
    1. बाध्यकारी बफर (पीएच 7.4 पर 20 mm सोडियम फॉस्फेट) के दो कॉलम वॉल्यूम के साथ कॉलम को इक्विलिब्रेट करें।
    2. 1 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर कॉलम के माध्यम से एंटीबॉडी युक्त फ़िल्टर किए गए मीडिया (चरण 1.3.5 में प्राप्त) पास करें।
    3. बाध्यकारी बफर के दो कॉलम वॉल्यूम के साथ कॉलम धोएं।
    4. 5 एमएल एल्यूशन बफर (पीएच 3.4 पर 30 मिलियन सोडियम एसीटेट) का उपयोग करके एंटीबॉडी को 500 माइक्रोन अंशों में एल्यूट करें।
    5. प्रति अंश 10 माइक्रोन बेअसर बफर (पीएच 9 पर 3 एम सोडियम एसीटेट) जोड़कर एल्यूटेड एंटीबॉडी के पीएच को बेअसर करें।
      नोट: अंश संख्या 3-6 एंटीबॉडी के अधिकांश शामिल हैं । यदि एंटीबॉडी को उम्मीद से बाद के अंश में रखा जाता है तो सभी अंशों को रखने की सलाह दी जाती है।
    6. आईजीजी के लिए डिफ़ॉल्ट प्रोटोकॉल का चयन करके स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके शुद्ध एंटीबॉडी की एकाग्रता को मापें। एंटीबॉडी की अंतिम एकाग्रता आणविक वजन और अवशोषण गुणांक पर विचार करके मिलीग्राम/एमएल में प्राप्त की जाती है।

2. फ्लोरोसेंट लेबलिंग

नोट: एंटीबॉडी अवरक्त डाई है कि एक एनएचएस एस्टर प्रतिक्रियाशील समूह है, जो प्रोटीन के लिए जोड़ों और एक स्थिर conjugate फार्म शामिल है के साथ लेबल कर रहे हैं । यह प्रतिक्रिया पीएच संवेदनशील है और पीएच 8.5 पर सबसे अच्छा काम करता है। फ्लोरोसेंट कंजूगेट्स को डाई डिस्प्ले के साथ अधिकतम 774 एनएम और उत्सर्जन अधिकतम 789 एनएम प्रदर्शित किया गया है। पीएच 8.5 प्रभावी संयोजण के लिए महत्वपूर्ण है।

  1. डायलिसिस कैसेट (0.1-0.5 एमएल) का उपयोग करके एंटीबॉडी का डायलाइज़ 0.5 एमएल 1 एल में संयुग्मन बफर (पीएच 8.5 पर 50 m m फॉस्फेट बफर)। 4 घंटे के बाद डायलिसिस कैसेट ताजा बफर और रात भर डायलाइज करने के लिए स्थानांतरित करें।
  2. सेटअप 500 माइक्रोन की प्रतिक्रिया की मात्रा में प्रति 1 मिलीग्राम एंटीबॉडी के 0.03 मिलीग्राम IRDye 800CW जोड़कर एक संयुग्म प्रतिक्रिया।
    नोट: IRDye 800CW 10 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर DMSO में भंग कर दिया है ।
  3. 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए लेबलिंग प्रतिक्रियाओं को पूरा करें।
    नोट: 2 घंटे से परे समय बढ़ाने से लेबलिंग में सुधार नहीं होता है।
  4. 1x पीबीएस के खिलाफ व्यापक डायलिसिस द्वारा लेबल conjugates शुद्ध।
  5. 780 एनएम पर डाई के अवशोषण और 280 एनएम पर प्रोटीन के अवशोषण को मापने के द्वारा लेबलिंग की डिग्री का अनुमान लगाएं। 280 एनएम सिग्नल में डाई का योगदान 3% है।
  6. इस सूत्र का उपयोग कर डाई/प्रोटीन अनुपात की गणना करें:
    Equation 1
    जहां 0.03 280 एनएम (780 एनएम पर अपने अवशोषण के 3.0% के बराबर) पर उपयोग किए जाने वाले डाई के अवशोषण के लिए एक सुधार कारक है,ε डाई और εप्रोटीन क्रमशः डाई और प्रोटीन (एंटीबॉडी) के लिए मोलर विलुप्त होने वाले गुणांक हैं।
    नोट: εडाई पीबीएसके 1:1 मिश्रण में 270,000 मीटर-1 सेमी -1 और εप्रोटीन 203,000 एम-1 सेमी-1 (एक ठेठ आईजीजी के लिए) है: मेथनॉल। आईजीजी के अलावा अन्य प्रोटीन में बहुत अलग मोलर विलुप्त होने वाले गुणांक हो सकते हैं। डी/पी अनुपात के सटीक निर्धारण के लिए ब्याज के प्रोटीन के लिए सही विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग आवश्यक है ।
  7. इस सूत्र का उपयोग कर अंतिम प्रोटीन एकाग्रता की गणना करें:
    Equation 2
    नोट: हमेशा वीवो अध्ययन में आगे बढ़ने से पहले एलिसा (एंजाइम लिंक्ड इम्यूनोसोर्बेंट परख) या प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके लेबल और अवेलेबल एंटीबॉडी की एंटीजन-बाध्यकारी प्रभावकारिता की पुष्टि करें।

3. माउस ज़ेनोबेड़ा अध्ययन

  1. इंजेक्शन के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी
    1. आरपीएमआई-1640 मीडियम में ओवीएआर-3 कोशिकाएं उगाएं, एफबीएस के 10% और 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक।
    2. इंजेक्शन से पहले दिन, उपसंस्कृति कोशिकाओं को नए १०० मिमी संस्कृति व्यंजनों में पूरा माध्यम/पकवान के 10 एमएल के साथ । 0.5-1 x 106 कोशिकाओं/डिश के सेल नंबर का उपयोग करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस तापमान पर इनक्यूबेट संस्कृतियों, 95% आर्द्रता और20-24 घंटे के लिए 5% सीओ 2।
    4. इंजेक्शन के दिन, संस्कृति व्यंजनों से विकास माध्यम को हटा दें। मृत कोशिकाओं, सेलुलर मलबे और सीरम के सभी निशानों को हटाने के लिए सीए2 + // एमजी2 + फ्री डल्बेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीपीबीएस) के साथ सेल लेयर को अच्छी तरह से कुल्ला करें, जो ट्राइप्सिन कार्रवाई में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
    5. प्रत्येक डिश में ट्राइपसिन-ईडीटीए समाधान के 1.0-1.5 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें और डिश को चारों ओर झुकाकर समाधान फैलाने की कोशिश करें और इसके बाद 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन करें।
      नोट: वास्तविक ट्राइप्सिनाइजेशन स्थिति की जांच करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें। ट्रिपसिनाइजेशन के परिणामस्वरूप संस्कृति पकवान की सतह से सेल टुकड़ी की कम संख्या होती है, ट्राइपसिनाइजेशन सेलुलर तनाव को प्रेरित करता है। इसलिए, उचित ट्राइपसिनाइजेशन महत्वपूर्ण है।
    6. ट्राइप्सिन कार्रवाई को रोकने के लिए प्रत्येक डिश में पूर्ण विकास माध्यम के 1.0-1.5 एमएल जोड़ें, इसके बाद धीरे-धीरे पाइपिंग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      नोट: कोमल पिपटिंग सेल स्वास्थ्य बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
    7. सेल निलंबन को 15 एमएल शंकु नली में ले जाएं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर स्पिन करें।
    8. सुपरनेट को हटाने के बाद सेल पेलेट को इकट्ठा करें और 1x डीपीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करके कोशिकाओं को धोएं।
    9. 5 मिनट के लिए कम गति 250 x ग्राम पर सेल निलंबन स्पिन।
    10. डीपीबीएस के 500 माइक्रोन जोड़ें और एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कोमल पिपटिंग द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    11. हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: बेहतर सटीकता के लिए, तीन बार के लिए गिनती दोहराने और एक औसत ले लो ।
    12. वॉल्यूम को इस तरह से एडजस्ट करें ताकि फाइनल सेल डेंसिटी 1 x 108 सेल/एमएल हो जाए ।
  2. माउस ज़ेनोग्राफ्ट विकसित करने के लिए कोशिकाओं के चमड़े के नीचे इंजेक्शन
    नोट: सभी प्रक्रियाओं को एक BSL2 सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए । मौजूदा अध्ययन में एथेमिक न्यूड फॉक्स1नू/फॉक्सएन1+ चूहों का इस्तेमाल किया गया है ।
    1. सेल सस्पेंशन के 50 माइक्रोन को 1.5 एमएल ट्यूब में लें और बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम के 50 माइक्रोन के साथ मिलाएं।
      नोट: बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम कमरे के तापमान पर राज्य की तरह एक जेल बनाने के लिए जाता है, तो ध्यान से बर्फ पर कोशिकाओं और मैट्रिक्स मध्यम मिश्रण बनाए रखने । फ्रिज में ट्यूब, टिप्स और सीरिंज रखने और फिर जानवरों के इंजेक्शन से पहले बर्फ पर स्थानांतरित करने की सलाह दी जाती है।
    2. किसी भी सेल झुरमुट से बचने के लिए मिश्रण को उत्तेजित करें। इसके बाद इस 100 माइक्रोन सेल सस्पेंशन-मैट्रिक्स मीडियम मिक्सचर को लें जिसमें 5 x 106 सेल होता है, 1 सीसी सिरिंज में।
    3. धीरे-धीरे जानवर की त्वचा को अंतर्निहित मांसपेशियों की परत से त्वचा को अलग करने के लिए उठाएं और धीरे-धीरे त्वचा के नीचे कोशिका निलंबन (100 माइक्रोन) (5 x 106 कोशिकाओं) को 26 जी सुई के साथ इंजेक्ट करें। सुई को बाहर निकालने से पहले कुछ सेकंड तक प्रतीक्षा करें, ताकि बेसमेंट मैट्रिक्स माध्यम त्वचा के नीचे कोशिकाओं के साथ अर्ध-ठोस जेल जैसी संरचना बना सके, इंजेक्शन की साइट से बाहर आने वाले मिश्रण को रोक सके।
      नोट: कोशिकाओं को किसी भी संदूषण के लिए इंजेक्शन से पहले परीक्षण की जरूरत है जो इम्यूनोडिफिशिएंसी चूहों को नुकसान पहुंचा सकता है । इंजेक्शन देते समय सुई को त्वचा में बहुत गहरा न डालें क्योंकि यह ट्यूमर को उम्मीद से अधिक गहरा बना सकता है।
    4. जानवर को बाँझ पिंजरे में रखें और लगभग 20 मिनट तक निरीक्षण करें।
    5. 2-3 सप्ताह के लिए चूहों का निरीक्षण करें और ट्यूमर को 500 मिमी3 आकार तक बढ़ने दें।

4. वीवो इमेजिंग सिस्टम में एक का उपयोग कर एंटीबॉडी स्थानीयकरण

नोट: इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले वीवो इमेजिंग उपकरण (सामग्री की तालिकादेखें) में वास्तविक समय में जीवित जीव के भीतर सेलुलर और आनुवंशिक गतिविधि के गैर-वाज़र्वसिव विज़ुअलाइज़ेशन और ट्रैकिंग के लिए उच्च दक्षता फिल्टर और स्पेक्ट्रल अन-मिक्सिंग एल्गोरिदम का एक सेट का उपयोग करता है। सिस्टम फ्लोरेसेंस और बायोल्यूमिनेसेंस मॉनिटरिंग क्षमता दोनों प्रदान करता है।

  1. पूंछ नस के माध्यम से एंटीबॉडी लेबल डाई के 25 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
    1. 2% आइसोफ्लुन का उपयोग करके चूहों को असर करने वाले ट्यूमर को एनेस्थेटाइज करें। पेडल सजगता के लिए प्रतिक्रिया की कमी के लिए जांच करें ।
    2. एक बार चूहों को आगे बढ़ना बंद कर दें, तो कीड़ा पानी लगाकर पार्श्व पूंछ की नस को फैलाएं।
    3. 26 जी सुई के साथ 1 सीसी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके लेबल एंटीबॉडी के 25 माइक्रोग्राम (100 माइक्रोन में) इंजेक्ट करें।
    4. इसी तरह, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, लेबल और गैर विशिष्ट IgG1 आइसोटाइप एंटीबॉडी जो कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित नहीं करता है सुई ।
  2. एंटीबॉडी इंजेक्शन के 8, 24, 48 घंटे आदि के बाद वीवो लाइव इमेजिंग में प्रदर्शन करें।
    1. संबंधित सॉफ्टवेयर में, नियंत्रण कक्ष में स्थित प्रारंभिक पर क्लिक करें और पुष्टि करें कि चरण का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस है।
    2. ऑक्सीजन की आपूर्ति चालू करें, संज्ञाहरण प्रणाली पर सभी पंप, एनेस्थेटिक चैंबर में आइसोफ्लुरेन गैस की आपूर्ति करें और आइसोफ्लुएरेन वाष्पीकरण वाल्व को 2% तक सेट करें।
    3. चूहों को एनेस्थेटिक कक्ष में स्थानांतरित करें और चूहों को पूरी तरह से संवेदनाहारी होने तक इंतजार करें। आंखों के सूखने से बचने के लिए आंखों का चिकनाई मरहम लगाएं।
    4. नियंत्रण कक्षमें जाएं, इमेजिंग जादूगर विकल्प के माध्यम से फ्लोरेसेंस इमेजिंग की स्थापना करें और 773 एनएम पर उत्तेजना और 792 एनएम पर उत्सर्जन का चयन करें।
      नोट: डिफ़ॉल्ट ऑटो एक्सपोजर सेटिंग्स एक अच्छी फ्लोरोसेंट छवि प्रदान करती हैं। हालांकि, ऑटो एक्सपोजर वरीयताओं को जरूरत के अनुसार संशोधित किया जा सकता है।
    5. एनेस्थेटाइज्ड चूहों को इमेजिंग चैंबर में स्थानांतरित करें और नाक शंकु का उपयोग करके इमेजिंग क्षेत्र पर इकट्ठा करें। इमेजिंग चरण एक समय में 5 चूहों को समायोजित करने का विकल्प प्रदान करता है।
      नोट: परीक्षण चूहों के साथ छवि चूहों को नियंत्रित करें विश्लेषण करते समय एक्सपोजर और अन्य सेटिंग्स की एक समान मात्रा में।
    6. एक बार सब कुछ तैयार हो जाने के बाद, छवि अधिग्रहण के लिए नियंत्रण कक्ष पर अधिग्रहण विकल्प चुनें।
    7. ऑटोएक्सपोजर सेटिंग्स के साथ सिस्टम एक मिनट के भीतर छवि उत्पन्न करता है। उत्पन्न छवि गिनती या फोटॉनों की इकाइयों में प्रदर्शित ऑप्टिकल फ्लोरेसेंस तीव्रता के साथ फोटोग्राफिक छवि पर फ्लोरेसेंस का ओवरले है, या दक्षता के मामले में।
    8. छवि प्राप्त करने के बाद, इमेजिंग कक्ष से चूहों को उनके पिंजरे में वापस स्थानांतरित करें और 1 से 2 मिनट के लिए उनकी वसूली के लिए निरीक्षण करें।
  3. छवि विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर के भीतर प्रदान किए गए उपकरणों और कार्यों के साथ छवि को आगे ठीक ट्यून करें। छवि विश्लेषण उपकरण मेनू बार और उपकरण पैलेट में हैं।
    1. इमेज एडजस्ट केतहत, ब्राइटनेस, कंट्रास्ट या अस्पष्टता को एडजस्ट करें और कलर स्केल का चयन करें।
    2. एक ऑप्टिकल छवि में ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र को निर्दिष्ट करने और आरओआई के भीतर सिग्नल तीव्रता को मापने के लिए आरओआई टूल्स का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो क्वांटिफाइड सिग्नल डेटा को स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में निर्यात करें और डेटा को प्लॉट करें।
    3. अनुवर्ती अध्ययनों के लिए, विभिन्न ऊतकों (जैसे, यकृत, फेफड़े, हृदय, गुर्दे, तिल्ली, मस्तिष्क आदि) के चूहों नेक्रोपियों का विश्लेषण करें, फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी के विस्तृत गैर-विशिष्ट वितरण के लिए साथ-साथ।
      नोट: डेटा को 96 अच्छी तरह से परख में एंटीजन (इस मामले में FOLR1) का उपयोग करके ऊतक विशिष्ट एलिसा के साथ आगे समर्थित किया जा सकता है।

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Representative Results

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वर्णित पद्धति में, पहले हमने फोलेट रिसेप्टर अल्फा-1 (FOLR1) को लक्षित करते हुए एंटीबॉडी का क्लोन बनाया, जिसका नाम फर्लेतुज़ुमाब है, और एक बिस्पीफिक एंटीबॉडी जिसे बायगुजुम्ब और लेक्सातुम्ब शामिल है, साथ ही नियंत्रण एंटीबॉडी जैसे अबागोगोमाब (अनुपूरक फ़ाइल 1में प्रदान किए गए दृश्य)। डीएनए क्लोन (पीवीएच, पीवीएल) में प्रतिनिधि चर भारी (वीएच) और चर प्रकाश (वीएल) डोमेन का विवरण चित्र 1 एमें दिखाया गया है। सकारात्मक क्लोन की पुष्टि करने के लिए, हमने सिग्नल पेप्टाइड फॉरवर्ड (एसपी फॉर) और सीके रेव/सीएच3 रेव प्राइमर (अनुपूरक फाइल 1में प्रदान किए गए दृश्यों) का उपयोग करके कॉलोनी पीसीआर को बाहर किया। कॉलोनी पीसीआर के प्रतिनिधि परिणाम प्रकाश और भारी श्रृंखला(चित्रा 1C)के अपेक्षित आकारों की पुष्टि करते हैं। सकारात्मक एंटीबॉडी क्लोन भी, Sanger अनुक्रमण का उपयोग कर की पुष्टि की थी । पुष्टि की PVH और pVL डीएनए क्लोनिंग के बाद, ट्रांसफेक्शन चो निलंबन संस्कृतियों का उपयोग कर बाहर किया गया, प्रोटीन के बाद-4 डिग्री सेल्सियस पर एंटीबॉडी के एक स्तंभ आत्मीयता शुद्धि (चित्रा 1B और विस्तार कदम के लिए प्रोटोकॉल देखें) ।

अन्य नियंत्रण IgG1 के साथ शुद्ध फरलेदुम्ब के प्रतिनिधि परिणाम (बाका एंटीबॉडी को छोड़कर गैर-कम करने और एसडीएस पेज को कम करने पर रन चित्रा 2 एमें दिखाए गए हैं। जैसा कि स्पष्ट है, भारी और प्रकाश श्रृंखला में कमी के बाद 50 और 25 केडीए बैंड का उत्पादन किया। इसके बाद कोशिका की सतह पर देशी प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी की बाध्यकारी पुष्टि की गई । OVCAR3 कोशिकाओं की सतह पर मानव FOLR1 के लिए बाध्यकारी प्रतिनिधि farletuzumab प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 2B)का उपयोग कर दिखाया गया है ।

अगले फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी पूंछ नस FOLR1 ट्यूमर व्यक्त(चित्रा 3)के साथ कलम जानवरों में इंजेक्शन थे । आईवीआईएस का उपयोग करके जानवरों को कई समय बिंदुओं पर लाइव इमेज किया गया था। डेटा FOLR1 +ट्यूमर (चित्रा 4 और चित्रा 5)में FOLR1 और BaCa एंटीबॉडी के चयनात्मक संवर्धन की पुष्टि करता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि एंटीबॉडी (ट्यूमर एंटीजन के लिए नकारात्मक) को नियंत्रित करें ट्यूमर में स्थानीयकरण नहीं किया।

Figure 1
चित्रा 1: एंटीबॉडी क्लोनिंग, अभिव्यक्ति और शुद्धि की योजनाबद्ध।
(A)भारी (पीवीएच) और लाइट (पीवीएल) चेन वैक्टर की डिटेल स्कीमेटिक दिखाती है । (ख)पीवीएच वेक्टर एक IgG1 भारी श्रृंखला के चर डोमेन अनुक्रम और पीवीएल वेक्टर एक प्रकाश श्रृंखला के चर डोमेन अनुक्रम ले जाने के साथ (1:2 अनुपात) ट्रांसफैक्शन अभिकर्दक (जैसे मिरस या पीई) को चो या एचईके कोशिकाओं की निलंबन संस्कृति में जोड़ने से पहले एक साथ मिलाया गया था । कोशिकाओं को अगले दिन पूरक फ़ीड के साथ खिलाया गया था और संस्कृतियों आंतरायिक भोजन के साथ 10 अतिरिक्त दिनों के लिए निगरानी की गई । 11 दिन में, कोशिकाओं को 0.2 माइक्रोन पीईएस फिल्टर के माध्यम से काटा गया था और इसके बाद प्रोटीन-ए का उपयोग करके आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी की गई थी। शुद्ध एंटीबॉडी अगले % मोनोमर (FPLC), बाध्यकारी गतिविधि (एलिसा या एसपीआर) के लिए विश्लेषण किया गया, और लाइव कोशिकाओं पर लक्ष्य एंटीजन (FACS) के लिए बाध्यकारी । एंटीबॉडी को वीवो परखों (उदाहरण के लिए, सेल विकास अवरोध, सेल व्यवहार्यता परख, या मध्यवर्ती फॉस्फोरिलेशन आदि के संकेत का अवरोध) में भी जांचा जा सकता है। एंटीबॉडी को दूर-लाल रंगों के साथ भी संयोजित किया जा सकता है जैसे, वीवो इमेजिंग में आईआरडीवाई 800CW। ± IRDye 800CW ट्यूमर और ऊतक वितरण अध्ययन से पहले गतिविधियों के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए । (ग)कॉलोनी पीसीआर के एगरजिंग जैल सकारात्मक भारी (1.4 केबी) और लाइट चेन (0.8 केबी) क्लोन के आकार की पुष्टि करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एंटीबॉडी अखंडता की पुष्टि करने के लिए एक जेल आधारित कमी परख।
(ए)10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एजेंट (जैसे बीएमई या डीटीटी) को कम करने के ± चार अलग-अलग आईजीजी1 एंटीबॉडी (शीर्ष पर दिखाई गई योजनाबद्ध) जोड़े गए थे। एंटीबॉडी अगले 10% SDS-पेज जेल पर लोड किए गए थे जिसके बाद प्रोटीन धुंधला और इमेजिंग होती थी। बाएं और दाएं में जेल छवि स्पष्ट रूप से बरकरार एंटीबॉडी और दो अलग-अलग पॉलीपेप्टाइड्स (~ 50 केडीए और ~ 25 केडीए) को क्रमशः दिखाती है। कृपया पीवीएच और पीवीएल वेक्टर मैप्स(चित्रा 1)को वीएच/वीएल, सीएच 1/सीके, CH2 और CH3 डोमेन के अनुरूप सीडीएनए ले जाते हुए भी देखें । (ख)अवेलेबल और आईआरडीवाई 800CW की फ्लो साइटोमेट्री पुष्टि ओवेरियन कैंसर कोशिकाओं पर देशी FOLR1 के लिए दूर-दूर तक बाध्यकारी लेबल । नॉन कमिंग = एंटीबॉडी नॉन कमिंग डाई के साथ जेल पर चलती है, कम करने = एंटीबॉडी को कम करने डाई के साथ जेल पर चलाएं, एचसी = हैवी चेन, एलसी = लाइट चेन, वीएल = वेरिएबल डोमेन ऑफ लाइट चेन, वीएच = वेबल डोमेन ऑफ हैवी चेन, सीके = कापा चेन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ट्यूमर पीढ़ी और एंटीबॉडी उपचार के प्रयोगात्मक योजनाबद्ध।
6-8 सप्ताह पुराने चूहों जैसे उपभेदों: इम्यूनोडिफिशल एथिमिक न्यूड/एनएसजी/इम्यूनोकंपेस्टेंट C57BL/6 या बाल्ब/सी चूहों को आसानी से चमड़े के नीचे (एसक्यू) ट्यूमर के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं के साथ कलम किया जा सकता है । इसी तरह के अध्ययन स्तन वसा पैड और इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) ट्यूमर का उपयोग कर किया जा सकता है । 3-4 सप्ताह बाद (ट्यूमर ~ 200मिमी 3),चूहों को आईआरडीवाई लेबल वाले आईआरडीवाई लेबल के साथ इंजेक्शन दिया गया था जो ट्यूमर-ओवरएक्सप्रेस्ड रिसेप्टर के खिलाफ ± चयनात्मक थे। इसके बाद लिव इन वीवो इमेजिंग की गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: मानव OVCAR3 ट्यूमर असर चूहों के लाइव इन-वीवो इमेजिंग।
बेतरतीब ढंग से चयनित 6 से 8 सप्ताह पुराना (आयु) और 20-25 ग्राम (वजन) गंजे एथिमिक न्यूड फॉक्सएन1 nu/Foxn1+ (Envigo)FOLR1+ अंडाशय ट्यूमर (OVCAR-3 कोशिकाओं) के साथ कलम किया गया । स्पष्ट ट्यूमर के साथ 3 सप्ताह के बाद, चूहों को आईआरडीवाई 800CW लेबल के साथ इंजेक्ट की गई पूंछ नस थी, जो आईजीजी1 नियंत्रण, अबागोवॉब (सीए-125 एंटी-इडियपिक एंटीबॉडी), फार्लेतुज़ुमाब (एंटी-एफओएलआर1 एंटीबॉडी) और बाका (एंटी-फोलआर1-DR5 एंटीबॉडी) के साथ संकेतित समय पर लाइव इमेजिंग द्वारा पीछा किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: मानव FOLR1 के लाइव इन-वीवो इमेजिंग मुरीन MC38 सेल व्युत्पन्न ट्यूमर असर चूहों व्यक्त करते हैं ।
(A)बेतरतीब ढंग से चयनित 6 से 8 सप्ताह पुराना (आयु) और 20-25 ग्राम मंजूरी । सीजी पीआरडीसीscid Il2rgtm1Wjl/SzJया नग्न चूहों sq इंजेक्शन मुरीन MC38 कोशिकाओं के साथ स्थिर मानव FOLR1 व्यक्त किया गया । ट्यूमर उपस्थिति पर, चूहों को आईआरडीवाई 800CW लेबल IgG1 नियंत्रण, abagovomab (CA-125 एंटी-इडियपिक एंटीबॉडी), फर्लेतुज़ुमाब (एंटी-एफओएलआर1 एंटीबॉडी) और बाका (एंटी-एफओएलआर1-DR5 एंटीबॉडी) के साथ इंजेक्ट की गई पूंछ नस थी, जिसके बाद लाइव इमेजिंग का संकेत मिलता है। (ख)7 दिनों के बाद जानवरों को इच्छामृत्यु दी गई और अलग-थलग प्रमुख अंगों (जैसा कि संकेत दिया गया है) को रिश्तेदार एंटीबॉडी सिग्नल (IRDye 800CW) वितरण के लिए ग्राफ्ट ट्यूमर के साथ एक साथ चित्रित किया गया था। जैसा कि उम्मीद थी, ट्यूमर IgG1 नियंत्रण और सीए-१२५ विरोधी मूर्खतापूर्ण एंटीबॉडी, abagovomab इंजेक्शन जानवरों में IRDye 800CW संकेत के साथ नकारात्मक बने रहे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल 1: सभी एंटीबॉडी और प्राइमर के दृश्य। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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कैंसर रोधी चिकित्सीय एजेंट की चयनात्मक और ट्यूमर ऊतक विशिष्ट डिलीवरी किसी दिए गए लक्षित चिकित्सा13की प्रभावकारिता और सुरक्षा को मापने की कुंजी है । यहां हमने नैदानिक, फर्लेदुम्ब और एक गैर-नैदानिक BaCa एंटीबॉडी के विस्तृत ऊतक और ट्यूमर वितरण की जांच करने के लिए एक त्वरित और कुशल दृष्टिकोण का वर्णन किया है। वर्णित दृष्टिकोण किसी भी नए उत्पन्न एंटीबॉडी पर लागू होता है और इसका उपयोग इसके ट्यूमर/अंग वितरण गुणों के लिए चिकित्सकीय रूप से प्रभावी एंटीबॉडी (वांछित गुणों के साथ) के साथ किया जा सकता है । अधिकांश एंटीबॉडी लक्ष्य रिसेप्टर्स (जैसे स्तन कैंसर में HER2) को ध्यान में रखते हुए ट्यूमर कोशिकाओं (ऊतकों) में अत्यधिक अधिक अभिव्यक्ति की जाती है, ज्यादातर मामलों में उनकी उप-विशिष्ट अभिव्यक्ति और कार्य ट्यूमर कोशिकाओं के अलावा अन्य कोशिका प्रकारों में भी महत्वपूर्ण है14। उदाहरण के लिए, पेट के कैंसर के रोगियों में नैदानिक एंटीबॉडी को लक्षित करने वाले ईजीएफआर का एक महत्वपूर्ण अनुपात जमा होता है और त्वचा ऊतक15को विषाक्तता पैदा करता है, एक गैर-कैंसर ऊतक जिसके विकास और भेदभाव के लिए ईजीएफआर सिग्नलिंग और कार्य की आवश्यकता होती है। इसलिए, हम दृढ़ता से विश्वास करते हैं कि जानवरों की एक बड़ी पलटन में हेपेटोटॉक्सिकिटी और ऊतक हिस्टोकेमिस्ट्री के साथ संयोजनों में प्रारंभिक ऊतक वितरण जांच के इन प्रकार के नए उत्पन्न एंटीबॉडी की सुरक्षा और चिकित्सीय व्यवहार्यता का व्यापक आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, वर्णित ऊतक वितरण अध्ययन भी प्रतिरक्षा सक्षम चूहों xenograft अध्ययन में अत्यधिक लागू होगा, अगर नए उत्पन्न एंटीबॉडी murine समकक्ष एंटीजन/रिसेप्टर के लिए पार प्रतिक्रियाशीलता रखता है । सिंजेनिक पशु अध्ययन में, ट्यूमर वितरण और ऊतक हिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययन के साथ, विस्तृत रक्त साइटोकिन विश्लेषण प्रभावकारिता और सुरक्षा डेटा को मजबूत करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। वर्णित दृष्टिकोण की एक आकर्षक विशेषता यह है कि यह एंटीबॉडी वितरण के सटीक मात्रा के पास की अनुमति देता है यदि डेटा अतिरिक्त रूप से ट्यूमर और अन्य महत्वपूर्ण ऊतकों (जैसे जिगर, हृदय, फेफड़े, तिल्ली, गुर्देआदि)से एलिसा (लक्ष्य एंटीजन के खिलाफ) के साथ समर्थित है। एकल फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (SPECT कहा जाता है) और स्थिति उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) पर वर्णित विधि की एक और महत्वपूर्ण विशेषता लागत प्रभावशीलता16है । स्पेक्ट और पीईटी दोनों बहुत महंगे हैं और इमेजिंग के लिए रेडियोधर्मी ट्रेसर का उपयोग करते हैं, जिससे पूरी प्रक्रिया बोझिल हो जाती है यदि जानवरों की एक बड़ी पलटन का परीक्षण17। इसके अलावा स्पेक्ट और पीईटी इमेजिंग सुविधाएं प्रयोगशालाओं और वाइवरियम में चूहों18जैसे रोगों के छोटे पशु मॉडलों का अध्ययन करने के लिए बहुत मानक नहीं हैं ।

एंटीबॉडी ट्यूमर वितरण के निकट सटीक मात्रा को प्राप्त करने के लिए वर्णित विधि के साथ एक सीमा उच्च आत्मीयता लक्ष्य एंटीजन बाध्यकारी पर निर्भरता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि उच्च आत्मीयता एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन के परिणामस्वरूप "लक्षित-मध्यस्थता दवा स्वभाव (टीएमडीडी)" हो सकता है" उन्नत एंडोसाइटोसिस और लाइसोसोम्स19को शटल करके। इसलिए, वर्णित दृष्टिकोण के परिणाम एक विशेष ट्यूमर प्रकार में विशेष लक्ष्य रिसेप्टर के आधार पर भिन्न होंगे। इस प्रकार, हम दृढ़ता से एक से अधिक ट्यूमर सेल लाइन (एस) लक्ष्य एंटीजन रिसेप्टर की चर (विषम) अभिव्यक्ति वाले ट्यूमर xenografts के साथ जानवरों की एक बड़ी पलटन में एंटीबॉडी/एंटीबॉडी लेबल परीक्षण की सलाह देते हैं । प्रस्तावित अध्ययनों के लिए एक से अधिक फ्लोरोसेंट कंजूगेट डाई (एस) और चूहों तनाव (ओं) का उपयोग करने की भी सिफारिश की जाती है।

यह देखते हुए कि छोटे आकार के एंटीबॉडी जैसे फैब्स, एससीएफवी, बीटीई, डार्ट्स, आदि (नवजात एफसी रिसेप्टर (एफसीआरएन) द्वारा उबार रीसाइक्लिंग की कमी ट्यूमर से अधिक तेजी से स्पष्ट होती है (सीरम के साथ आधा गुना मिनट से घंटे तक जा रहा है), विभिन्न ट्यूमर के बीच डेटा की तुलना करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए जिसमें अत्यधिक चर एफसीआरएन अभिव्यक्ति होती है। इसके अलावा, बड़े अणुओं (जैसे दोहरी और त्रिप्रजाति एंटीबॉडी) है कि उबार रीसाइक्लिंग के लिए एफसी डोमेन के साथ इंजीनियर कर रहे है ऊतक/ उन परिदृश्यों में, वर्णित दृष्टिकोण एंटीबॉडी के ऊतक/ट्यूमर वितरण की तुलना करने के लिए उपयुक्त नहीं होगा जो आकार6में काफी भिन्न है । महत्व के संदर्भ में हालांकि, वर्णित ट्यूमर और विस्तृत ऊतक वितरण अध्ययन उनके समकक्ष मोनोस्पेसिफिक एंटीबॉडी के साथ एक प्रभावी दोहरी और त्रिप्रसिकता एंटीबॉडी प्लेटफॉर्म डिजाइन में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में काम करेंगे। अंत में, चूंकि उच्च आत्मीयता और उत्साह-अनुकूलित एंटीबॉडी में आम तौर पर ट्यूमर में काफी समरूप वितरण होता है, लक्ष्य ट्यूमर एपिटोप चयन (टीएमडीडी की कमी), एक विशेष कैंसर मॉडल में समग्र एंटीबॉडी आत्मीयता और जैविक गतिविधि को हमेशा ट्यूमर प्रवेश, सुरक्षा और प्रभावकारिता का निष्कर्ष बनाने से पहले विचार किया जाना चाहिए।

संक्षेप में, हम नसों में इंजेक्शन एंटीबॉडी के ट्यूमर और ऊतक वितरण की निगरानी के लिए एक त्वरित और सरल विधि का वर्णन किया है । वर्णित दृष्टिकोण एंटीबॉडी-सिरना conjugates (जहां सिराना लेबल है), एंटीबॉडी दवा conjugates (जहां दवा लेबल है) और एंटीबॉडी-नैनोकणों (जहां नैनोकण लिपिड फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल कर रहे है) का विश्लेषण करने की क्षमता जोड़ा गया है । इसी तरह, एक ट्यूमर में एक विशिष्ट इंजीनियर सिस्टीन अवशेषों को लक्षित करने वाले एससीएफवी (यदि फ्लोरोसेंट रूप से मेल्माइड रसायन शास्त्र के साथ लेबल) चिमिक एंटीजन रिसेप्टर टी-सेल (कार-टी) और कार-एनके वायरल ट्रांसफेक्शन आधारित जीएफपी/आरएफपी संकेतों से स्वतंत्र इन सेल आधारित उपचारों के ट्यूमर/ऊतक वितरण का विश्लेषण करने के लिए एक लागत प्रभावी दृष्टिकोण होगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है ।

Acknowledgments

हम वर्जीनिया कैंसर सेंटर कोर इमेजिंग सुविधा, बायोमॉलिक्यूलर विश्लेषण सुविधा, उन्नत माइक्रोस्कोपी सुविधा और सहायता के लिए कोर विवरियम सुविधा विश्वविद्यालय के आभारी हैं। जे टी-एस ओवेरियन कैंसर अकादमी (ओसीए-डीओडी) के शुरुआती करियर अन्वेषक हैं । इस काम को एनसीआई/एनआईएच ग्रांट (R01CA233752) ने जे टी-एस, यूएस डीओडी ब्रेस्ट कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (बीसीआरपी) सफलता स्तर-1 पुरस्कार जे टी-एस (BC17097) और अमेरिकी डीओडी ओवेरियन कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (OCRP) फंडिंग अवार्ड (OC180412) को जे-एस को समर्थन दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FreeStyle CHO media Gibco Life Technologies Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X) Gibco Life Technologies Cat # 15240-062
Anti-Clumping Agent Gibco Life Technologies Cat # 01-0057DG
BD Insulin Syringe BD BioSciences Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum PerkinElmer Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B Gibco Life Technologies Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Corning Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640 Corning Cat # 10-040-CV
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X) Gibco Life Technologies Cat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kit Invitrogen Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Column GE Healthcare Cat # 11-0034-93
Infusion Takara BioScience STO344
IRDye 800CW NHS Ester LI-COR Cat # 929-70020
Isoflurane, USP Covetrus Cat # 11695-6777-2
Lubricant Eye Ointment Refresh Lacri-Lube Cat #4089
Matrigel Corning Cat # 354234
PEI transfection reagent Thermo Fisher Cat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Thermo Scientific Cat # 66333
Steritop Vacuum Filters Millipore Express Cat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTA Gibco Life Technologies Cat # 15400-054
Experimental Models: Cell lines
Human: OVCAR-3 American Type Culture Collection ATCC HTB-161
Human: CHO-K cells Stable transformed in our lab ATCC CCL-61
Mouse: 4T1 Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38 Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC Authenticated by STR profiling
Mouse: MC38 hFOLR1 Generated in our laboratory (This paper)
Experimental Models: Animal
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ Envigo Multiple Orders
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson Laboratory Multiple Orders

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References

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Shivange, G., Mondal, T., Lyerly, E., Gatesman, J., Tushir-Singh, J. Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (159), e60727, doi:10.3791/60727 (2020).More

Shivange, G., Mondal, T., Lyerly, E., Gatesman, J., Tushir-Singh, J. Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (159), e60727, doi:10.3791/60727 (2020).

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