Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

doi: 10.3791/60727 Published: May 16, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Burada fare tümörü ksenogreft modellerinde antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir protokol sayılmaktadır.

Abstract

Monoklonal antikorlar kanser hücrelerini ortadan kaldırmak için değişken bağımsız mekanizmalar tarafından çalışan yüksek afiniteli çok fonksiyonlu ilaçlardır. Son birkaç on yıl içinde, antikor-ilaç konjugeler alanı, bispesifik antikorlar, şimerik antijen reseptörleri (CAR) ve kanser immünoterapi temel ve terapötik araştırmaların en umut verici alan olarak ortaya çıkmıştır. Bir atılım hızında lösemi ve melanom bağışıklık kontrol noktası reseptörleri ve CAR-T hücreleri hedefleyen çok sayıda başarılı insan çalışmaları ile, antikor mühendisliği varyasyonları türetilen onkolojik terapötikler için son derece heyecan verici bir kez. Ne yazık ki, antikor ve CAR bazlı terapötik önemli ölçüde çok sayıda da tümör yatağında bağışıklık efektörü hücrelerin sınırlı durumu nedeniyle katı kanserlerin insan çalışmalarda hayal kırıklığı kanıtlamıştır. Daha da önemlisi, tümörler dışındaki dokularda terapötik antikorların nonspesifik dağılımı da klinik etkinlik eksikliğine katkıda, ilişkili toksisite ve klinik yetmezlik. Preklinik çalışmaların insan klinik izlerine sadık çevirisi farelertümörü ksenogreft etkinliği ve güvenlik çalışmalarına dayandığı için, burada tümörün ve terapötik antikorların genel doku dağılımının test edilmesi için bir yöntem vurgulanmaktadır. Bu protein-A saflaştırılmış antikor yakın Kızılötesi floresan boya ile etiketlenmesi ile elde edilir tümör taşıyan farelerin canlı görüntüleme takip.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

FDA ilk monoklonal antikor hedefleyen CD3 onayladı (OKT3, Muromonab) içinde 1 ,2. O zamandan beri önümüzdeki yirmi yıl için, bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri karşı antikorların ezici başarısı nedeniyle antikor mühendisliği alanında hızlı bir patlama olmuştur3. Bağışıklık sisteminin dolaylı aktivasyonu yanında, antikorlar doğrudan bağışıklık efektörü hücreleri meşgul etmek için kanser hücrelerinin bayrak hedeflenmektedir, ölüm reseptör agonist yoluyla sitotoksisite tetiklemek, blok tümör hücre sağkalım sinyali, obstrüktif anjiyogenez (kan damarlarının büyümesi), kısıtlama bağışıklık kontrol noktası düzenleyicileri, konjuge ajanlar olarak radyoizopes, kemoterapi ilaçları ve siRNA teslim2. Buna ek olarak, hasta türetilmiş T-hücreleri ve NK hücreleri (CAR-T ve CAR-NK) yüzeyinde çeşitli antikorların tek zincir değişken parçaları (scFv) incelenmesi hücre tabanlı tedaviler için klinik araştırmaların hızlı büyüyen bir alandır4.

Tümör hücrelerini ifade eden antijene seçicilik sağlayan antikor bazlı ilaçların aşırı yüksek yakınlığı onu çekici bir ajan haline getirir. Aynı şekilde, terapötik bir antikor hedefli doğum ve tümör tutma (veya kimyasal bir ilaç) toksisite üzerinde etkinliğini dengelemek için anahtardır. Bu nedenle, içeren ancak bispesifik5 ve üç spesifik antikorlar6 ile sınırlı değildir protein mühendisliği tabanlı stratejiler çok sayıda önemli ölçüde intravenöz (IV) enjekte terapötik tümör retansiyonu optimize tümör retansiyonu geliştirmek için yararlanılmaktadır5,7. Burada, potansiyel olarak etkili anti-kanser antikorlarının tümör ve doku dağılımını ele almak için basit bir floresan tabanlı yöntemi tanımlıyoruz.

Hayvan dokuları görünür spektrumda heyecanlandığında otomatik floresana sahip olduğundan, antikorlar başlangıçta kızılötesi boyanın yakınında (örneğin, IRDye 800CW) etiketlenmiştir. Kavram araştırmaları için folat reseptör alfa-1 (FOLR1) farletuzumab denilen antikor ve onun türevi olarak adlandırılan Bispesifik çapa Sitotoksisite aktivatör (BaCa)7 antikor bu co-targets FOLR1 ve ölüm reseptör-5 (DR5)8 bir rekombinant antikor kullandık. FOLR1 yumurtalık ve TNBC kanser hücrelerinde, tümör ksenogreftlerinde ve hasta tümörlerinde iyi tanımlanmış aşırı ekspres hedef reseptördür9. Özellikle, klinik yumurtalık ve meme kanserleri için bağışıklık efektörü hücreleri ve antikor ilaç konjugeler (ADC) meşgul antikor tabanlı yaklaşımlar kullanarak FOLR1 yararlanmak için birden fazla çaba vardır10,11.

Bu yöntem de, biz klonlanmış, ifade ve klinik anti-FOLR1 (farletuzumab) cho ifade sistemi kullanarak diğer kontrol antikorları ile birlikte saflaştırılmış. IgG1 isotipi ve abagovomab12 adı verilen klinik anti-idiyotip-16 antikor negatif kontrol olarak kullanıldı. Protein-A arınmasını takiben, endike antikorlar IRDye 800CW ile etiketlendi ve yumurtalık tümörü ksenogreftleri taşıyan veya stably transfected insan FOLR1 gösteren çıplak farelerin kuyruk damarına uygulandı. Antikor lokalizasyonu canlı görüntüleme ile birden fazla farklı zaman noktalarında in vivo görüntüleme spektrumu kullanılarak izlendi7. Bu yöntem ışık emisyonsağlamak için herhangi bir genetik modifikasyon veya substrat enjeksiyon gerektirmez ve önemli ölçüde daha hızlı, maliyet etkin ve verimlidir. Aşağıda açıklanan genel klonlama, ifade, saflaştırma ve etiketleme protokolü, ağır ve hafif zincir dizileri mevcutsa herhangi bir klinik ve klinik olmayan antikora uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Virginia Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından hayvanların işlenmesi ve tümör ksenogreftleri ile ilgili tüm prosedürler gözden geçirilerek onaylanmıştır ve ilgili mevzuat standartlarına uygun

1. Antikorların ekspresyonu ve saflaştırılması

  1. CHO hücrelerinin bakımı
    1. FreeStyle CHO Media'da CHO hücrelerini büyüyün, 37 °C'de 37 °C'de 130 rpm'de %5 CO2'de cam veya tek kullanımlık delong Erlenmeyer şişeleri kullanılarak sallanarak 1x glutamin takviyesi ile desteklenir.
      NOT: Bu son derece artan ajitasyon için havalandırmalı kapaklı bir şaşkın şişe kullanılması ve titreme durumu sırasında gaz transferini artırmak için tavsiye edilir. Süspansiyon kültürünün sınırlı ajitasyonu nedeniyle düzenli şişelerle (şaşkın olmayan) önemli ölçüde azaltılmış antikor verimi elde edilmiştir.
    2. Hücre sayısını 1-5 x 106 hücre/mL arasında >%95 hücre canlılığı ile koruyun. Hücre sayısı 5 x 106 hücre/mL'nin üzerinde artarsa hücreleri bölün. CHO hücrelerinin 0,2 x 106 hücre/mL'nin altına ulaşmasına asla izin vermeyin.
  2. CHO hücrelerinin transfeksiyonu
    1. 200 mL'lik ortamda (2 x 106 hücre/mL) CHO hücrelerini uzatılmış Erlenmeyer şaşkın şişelerinde büyütün.
      NOT: Şaşkın şişelerde yetişen süspansiyon kültürleri, şaşkın olmayan şişelerde yetiştirilen lere göre her zaman daha yüksek protein verimi üretmektedir.
    2. 15 mL'lik bir tüpte, 5 mL CHO FreeStyle ortam alın ve 50 g VH klon DNA ve 75 g VL klon DNA ekleyin. Girdap iyi karıştırmak için.
    3. 5 dakika oda sıcaklığında DNA karışımı kuluçka.
      NOT: Daha uzun kuluçka protein verimini azaltır.
    4. DNA çözeltisine 750 mg/mL polietilenin (PEI) stoku ekleyin ve 30 s için karışımı agresif bir şekilde girdaplayın. Ek 5 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
      NOT: PEI taze yapılmalıdır. PEI çoklu donma çözülme döngüsü önemli ölçüde genel verimi azaltır.
    5. Şişeyi elle sallarken hücrelere DNA ve PEI karışımının tamamını ekleyin. Hemen delong Erlenmeyer şaşkın şişeleri 37 °C'de 130 rpm'de sallayarak hücrelerle kuluçkaya yatırın.
  3. Ifa -de
    NOT: Antikor, n-terminal ucuna kadar tasarlanmış salgı sinyali peptidine sahiptir ve bu da antikorların ortama salgılansın.
    1. Transfected hücreleri 37 °C'de büyütün ve 1.
    2. 2. Günde, 2 mL 100x anti-kümelenme maddesi ve 2 mL 100x anti-bakteriyel-anti-mikotik solüsyon ekleyin. Şişeyi 130 rpm'de sallayarak daha düşük sıcaklığa (32-34 °C) kaydırın.
    3. Her beşinci günde, Tryptone N1 beslemesi 10 mL ve 100x glutamin takviyesi 2 mL ekleyin.
    4. Trypan mavi sancak ile hücrelerin bir aliquot boyama sonra hemositometre kullanarak her üç günde hücreleri sayma tutun. Hücre nin canlılığının %80'in üzerinde kalmasını sağlayın.
    5. Gün 10 veya 11, antikor arıtma için orta hasat. 40-60 dakika boyunca 3000 x g, 4 °C'de kültürü döndürün ve 0,22 μM şişe filtreleri kullanarak temiz ortamı filtreleyin.
  4. Arıtma
    NOT: Antikor arınması, peristaltik pompa kullanılarak ticari olarak kullanılabilen Protein-A sütunu (bkz.
    1. Kolon, iki sütunluk bağlama tamponhacmine (pH 7.4'te 20 mM sodyum fosfat) dengeleyin.
    2. Antikor içeren filtrelenmiş ortamı (adım 1.3.5'te elde edilen) 1 mL/dk akış hızında sütundan geçirin.
    3. Sütunu iki sütunluk bağlama arabelleği ile yıkayın.
    4. 5 mL elüsyon tamponu (pH 3.4'te 30 mM sodyum asetat) kullanarak antikorları 500 μL fraksiyona dönüştürün.
    5. Fraksiyon başına 10 μL nötralizasyon tamponu (pH 9'da 3 M sodyum asetat) ekleyerek eluted antikorpH nötralize olun.
      NOT: 3-6 nolu kesir antikorların çoğunu içerir. Antikor beklenenden daha geç bir kesir içinde eluted durumda tüm fraksiyonları tutmak için tavsiye edilir.
    6. IgG için varsayılan protokolü seçerek bir spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış antikor konsantrasyonu ölçün. Antikor son konsantrasyonu mg/mL'de moleküler ağırlık ve soğurma katsayısı göz önünde bulundurularak elde edilir.

2. Floresan etiketleme

NOT: Antikorlar, proteinlerle birleşerek istikrarlı bir eşlekap oluşturan bir NHS ester reaktif grubu içeren kızılötesi boya ile etiketlenir. Bu reaksiyon pH duyarlıdır ve en iyi pH 8.5 çalışır. Boya ile etiketlenmiş floresan konjuge ler maksimum 774 nm ve emisyon maksimum 789 nm'dir. pH 8.5 etkili çekim için anahtardır.

  1. 1 L çekim tamponunda (pH 8.5'te 50 mM fosfat tamponu) diyaliz kaseti (0.1-0.5 mL) kullanarak antikordan 0,5 mL diyaliz ekolü diyalize alın. 4 saat sonra taze tampon için diyaliz kaseti aktarın ve bir gecede diyaliz.
  2. 500 μL'lik bir reaksiyon hacminde 1 mg antikor başına 0.03 mg IRDye 800CW ekleyerek bir konjugasyon reaksiyonu kurun.
    NOT: IRDye 800CW DMSO'da 10 mg/mL konsantrasyonda çözünür.
  3. 20 °C'de 2 saat etiketleme reaksiyonları uygulayın.
    NOT: Zamanı 2 saatin üzerinde artırmak etiketlemeyi geliştirmez.
  4. Etiketli konjugatları 1x PBS'ye karşı kapsamlı diyaliz ile arındırın.
  5. Boyanın emiciliğini 780 nm ve proteinin absorbesini 280 nm olarak ölçerek etiketleme derecesini tahmin edin. 280 nm sinyaline boya katkısı %3'tür.
  6. Bu formülü kullanarak boya/protein oranını hesaplayın:
    Equation 1
    0.03 280 nm (780 nm de emicilik% 3.0 eşit) kullanılan boya emiciliği için bir düzeltme faktörü olduğu, εBoya ve εProtein boya ve protein (antikor) için molar yok olma katsayıları vardır.
    NOT: εBoya 270.000 M-1 cm-1 ve εProtein 203.000 M-1 cm-1 (tipik bir IgG için) PBS 1:1 karışımı: metanol olduğunu. IgG dışındaki proteinlerçok farklı molar yok olma katsayıları olabilir. D/P oranının doğru belirlenmesi için ilgi proteini için doğru yok olma katsayısının kullanılması esastır.
  7. Bu formülü kullanarak son protein konsantrasyonu hesaplamak:
    Equation 2
    NOT: In vivo çalışmalara geçmeden önce her zaman ELISA (Enzim Bağlantılı İmmünosorbent Assay) veya akış sitometrisi kullanarak etiketlenmiş ve etiketlenmemiş antikorların antijen bağlayıcı etkinliğini onaylayın.

3. Fare ksenogreft çalışmaları

  1. Enjeksiyon için tümör hücrelerinin hazırlanması
    1. RPMI-1640 Orta OVCAR-3 hücreleri büyümek, FBS% 10 ve 1x penisilin-streptomisin ile desteklenmektedir.
    2. Enjeksiyondan bir gün önce, alt kültür hücreleri 10 mL tam orta/çanak ile yeni 100 mm kültür yemekleriiçine. 0,5-1 x 106 hücre/çanak hücre numarasını kullanın.
    3. 37 °C sıcaklıkta, %95 nem ve 20-24 saat için %5 CO2 ile kuluçkaya yatırın.
    4. Enjeksiyon gününde, kültür yemeklerinden büyüme ortamını çıkarın. Ölü hücreleri, hücresel enkazları ve serum un tüm izlerini ortadan kaldırmak için ca2+/Mg2+ serbest Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) ile hücre tabakasını iyice durulayın ve bu da tripsin eylemine engel olabilir.
    5. Her tabağa 1,0-1,5 mL Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyerek hücreleri deneyin ve 37 °C'de 5-10 dk kuluçkaya yayarak yemeği niçin her yere yatırarak çözeltiyi yaymaya çalışın.
      NOT: Gerçek trippsinizasyon durumunu kontrol etmek için ters mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin. Tripsinizasyon altında kültür çanak yüzeyinden hücre kopma daha düşük sayıda sonuçları, tripsinizasyon üzerinde hücresel strese neden olur. Yani, uygun tripsinizasyon önemlidir.
    6. Tripsin eylemini durdurmak için her çanağa 1,0-1,5 mL tam büyüme ortamı ekleyin, bundan sonra hücreleri hafifçe borulayarak yeniden askıya alın.
      NOT: Hücre sağlığını korumak için nazik pipetleme önemlidir.
    7. Hücre süspansiyonuna 15 mL konik bir tüp alın ve oda sıcaklığında 5 dk için 250 x g'da döndürün.
    8. Supernatant çıkardıktan sonra hücre pelet toplamak ve 1x DPBS pelet yeniden askıya alarak hücreleri yıkayın.
    9. Hücre süspansiyonuna düşük hızda 250 x g'yi 5 dakika döndürün.
    10. 500 μL DPBS ekleyin ve tek hücreli süspansiyon almak için nazik pipetleme ile hücreleri yeniden askıya alın.
    11. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
      NOT: Daha iyi doğruluk için, saymayı üç kez tekrarlayın ve ortalama yıkın.
    12. Son hücre yoğunluğu 1 x 108 hücre/mL olacak şekilde hacmi ayarlayın.
  2. Fare ksenogreftleri geliştirmek için hücrelerin deri altı enjeksiyonu
    NOT: Tüm işlemler Bir BSL2 güvenlik kabininde yapılmalıdır. Mevcut çalışmada Atilmik Nude Foxn1nu/Foxn1+ fareler kullanılmıştır.
    1. Hücre süspansiyonunun 50 μL'sini 1,5 mL'lik bir tüpe alın ve 50 μL'lik bazal membran matris ortamı ile karıştırın.
      NOT: Bodrum membran matris orta oda sıcaklığında devlet gibi bir jel oluşturmak eğilimindedir, bu yüzden dikkatli cesede ve buz üzerinde matris orta karışımı korumak. Tüpleri, uçları ve şırıngaları buzdolabında tutmak ve hayvan enjeksiyonundan önce buz üzerinde aktarmak tavsiye edilir.
    2. Herhangi bir hücre kümelenme önlemek için karışımı ajite. Daha sonra, 5 x 106 hücre içeren hücre süspansiyon-matris orta karışımıbu 100 μL alın, bir 1 cc şırınga içine.
    3. Yavaşça altta yatan kas tabakasından deri ayırmak için hayvanın deri sini kaldırın ve yavaş yavaş 26 G iğne ile deri (5 x 106 hücreleri) altında hücre süspansiyon (100 μL) enjekte. İğneyi çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin, böylece bodrum matris ortamı, deri altındaki hücrelerle birlikte yarı katı jel gibi bir yapı oluşturabilsin ve enjeksiyon bölgesinden çıkan karışımı önler.
      NOT: İmmün azalan farelere zarar verebilecek herhangi bir kontaminasyon için enjeksiyondan önce hücrelerin test edilmesi gerekir. Enjekte ederken bu beklenenden daha derin tümör oluşabilir gibi derin derin iğne çok derin koymayın.
    4. Steril bir kafesiçinde hayvan tutun ve yaklaşık 20 dakika gözlemlemek.
    5. Fareleri 2-3 hafta gözlemleyin ve tümörün 500 mm3 boyutuna kadar büyümesine izin verin.

4. In vivo görüntüleme sistemi kullanılarak antikor lokalizasyonu

NOT: Bu deneyde kullanılan in vivo görüntüleme ekipmanı (bkz. Malzemeler Tablosu)bir dizi yüksek verimli filtre ve spektral karıştırma algoritmaları kullanarak canlı bir organizmanın içindeki hücresel ve genetik aktivitenin gerçek zamanlı olarak noninvaziv görüntüleme ve takibi için kullanılır. Sistem hem floresan hem de biyolüminesans izleme yeteneği sağlar.

  1. Kuyruk damarı ile 25 μg boya etiketli antikor enjekte edin.
    1. % 2 isofluran kullanarak fareler taşıyan tümör anestezik. Pedal reflekslerine yanıt eksikliği olup olmadığını kontrol edin.
    2. Fareler hareket etmeyi bıraktıktan sonra, solucan suyu uygulayarak lateral kuyruk damarını gendir.
    3. 1 cc insülin şırıngası kullanarak 25 μg (100°L olarak) 26 G iğne enjekte edin.
    4. Benzer şekilde, negatif kontrol olarak, etiket ve kanser hücrelerini hedef almaz non-spesifik IgG1 İzotip antikor enjekte.
  2. 8, 24, 48 saat, vb antikor enjeksiyonları sonra in vivo canlı görüntüleme gerçekleştirin.
    1. İlişkili yazılımda, kontrol panelinde bulunan Initialize'i tıklatın ve sahne sıcaklığının 37 °C olduğunu onaylayın.
    2. Oksijen kaynağı açın, anestezi sistemindeki tüm pompalar, anestezi kodası izofluran gaz kaynağı ve izofluran buharlaştırıcı vana ayarlayın 2%.
    3. Fareleri anestezi odasına aktarın ve fareler tamamen anestezi edilene kadar bekleyin. Gözlerinin kurumasını önlemek için göz yağlayıcı merhem uygulayın.
    4. Kontrol panelinegidin, Görüntüleme Sihirbazı seçeneği ile floresan görüntüleme ayarlayın ve 773 nm ve emisyon 792 nm de uyarma seçin.
      NOT: Varsayılan otomatik pozlama ayarları iyi bir floresan görüntü sağlar. Ancak, otomatik pozlama tercihleri ihtiyaca göre değiştirilebilir.
    5. Anestezili fareleri görüntüleme odasına aktarın ve burun konisi kullanarak görüntüleme alanında birleştirin. Görüntüleme aşaması, aynı anda 5 fareyi barındırma seçeneği sunar.
      NOT: Test fareleriyle birlikte analiz sırasında benzer miktarda pozlama ve diğer ayarlara sahip olan kontrol farelerinin görüntülenin.
    6. Her şey hazır olduğunda, görüntü edinimi için kontrol panelinde Edinme seçeneğini seçin.
    7. Otomatik Pozlama ayarları ile sistem görüntüyü bir dakika içinde oluşturur. Oluşturulan görüntü, sayım lar veya foton birimleri veya verimlilik açısından görüntülenen optik floresan yoğunluğu ile fotoğrafik görüntü floresan bindirme olduğunu.
    8. Görüntüyü aldıktan sonra, fareleri görüntüleme odasından kafeslerine geri aktarın ve 1 ila 2 dakika boyunca iyileşmelerini gözlemleyin.
  3. Görüntü analizi için yazılım içinde sağlanan araçlar ve işlevler ile görüntüyü daha da hassas bir şekilde ayarlayın. Görüntü çözümleme araçları menü çubuğunda ve araç paletindedir.
    1. Görüntü'nün altında,parlaklığı, karşıtlığı veya opaklığı ayarlayın ve renk ölçeğini seçin.
    2. Optik görüntüde ilgi çekici bir bölge (YG) belirlemek ve Yatırım Getirisi içindeki sinyal yoğunluğunu ölçmek için Yatırım Getirisi Araçlarını kullanın. Gerekirse, sayısallaştırılmış sinyal verilerini bir elektronik tablo yazılımına dışa aktarın ve verileri çizin.
    3. Takip çalışmaları için, floresan olarak etiketlenmiş antikorların ayrıntılı olmayan spesifik olmayan dağılımı için çeşitli dokuların (karaciğer, akciğer, kalp, böbrek, dalak, beyin vb.) fare nekropsilerini yan yana analiz edin.
      NOT: Veriler 96'da antijen (bu durumda FOLR1) ile dokuya özgü ELISA ile daha da desteklenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Açıklanan metodolojide, ilk olarak folat reseptöralfası alfa-1 'i (FOLR1) hedefleyen antikorları ve farletuzumab ve lexatumumab'dan oluşan BaCa adı verilen bispesifik bir antikor ile abagovomab gibi kontrol antikorları (Ek Dosya 1'deverilen diziler) klonladık. DNA klonları (pVH, pVL) temsili değişken ağır (VH) ve değişken ışık (VL) etki alanlarının ayrıntıları Şekil 1A'dagösterilmiştir. Pozitif klonları doğrulamak için, sinyal peptid ileri (SP For) ve CK Rev/CH3 Rev astarları (Ek Dosya 1'deverilen diziler) kullanarak koloni PCR'yi gerçekleştirdik. Koloni PCR'nin temsili sonuçları, beklenen hafif ve ağır zincirlerin boyutlarını doğrular(Şekil 1C). Pozitif antikor klonları da Sanger dizilimi kullanılarak doğrulandı. Doğrulanmış pVH ve pVL DNA klonlamasonrasında transfeksiyonlar CHO süspansiyon kültürleri kullanılarak gerçekleştirildi ve ardından 4 °C'de antikorların protein-A sütun afinite saflaştırmaları yapıldı (bkz. Şekil 1B ve detay adımları için protokol).

Diğer kontrol IgG1 ile birlikte saflaştırılmış farletuzumab Temsilcisi sonuçları (BaCa antikor olmayan azaltma ve SDS PAGE azaltılması çalışma hariç Şekil 2Agösterilir. Görüldüğü gibi, ağır ve hafif zincir azaltma dan sonra 50 ve 25 KDa bantları üretti. Bunu hücre yüzeyindeki yerli proteinlere antikorların bağlanması izledi. OVCAR3 hücre yüzeyinde insan FOLR1'e bağlanan temsilci farletuzumab akış sitometrisi kullanılarak gösterilmiştir (Şekil 2B).

Sonraki floresan etiketli antikorlar FOLR1 ile bünyeli hayvanlara enjekte edilen kuyruk vendir(Şekil 3). Hayvanlar IVIS kullanılarak birden fazla zaman noktasında canlı görüntülendi. Veriler FOLR1 ve BaCa antikorlarının FOLR1+ tümörlere selektif zenginleştirmesini doğrulamaktadır(Şekil 4 ve Şekil 5). Önemli ölçüde kontrol antikorları (tümör antijeni için negatif) tümörlere lokalize değildi.

Figure 1
Şekil 1: Antikor klonlama, ekspresyon ve arınma şeması.
(A) Ağır (pVH) ve Hafif (pVL) zincir vektörlerinin detay şemasını gösterir. (B) bir IgG1 ağır zincirin değişken etki alanı dizilimini taşıyan pVH vektörü ve hafif bir zincirin değişken etki alanı dizisini taşıyan pVL vektörü, CHO veya HEK hücrelerinin süspansiyon kültürüne eklemeden önce transfeksiyon reaktifleri (mirus veya PEI gibi) ile birlikte (1:2 oran) karıştırıldı. Hücreler ertesi gün ek yemle beslendi ve kültürler aralıklı beslenme ile 10 gün daha izlendi. 11. günde hücreler 0.2 m PES filtreden ve ardından protein-A kullanılarak afinite kromatografisi ile hasat edildi. Daha sonra % monomer (FPLC), bağlama aktivitesi (ELISA veya SPR) ve canlı hücrelerde hedef antijene (FACS) bağlanarak saflaştırılmış antikorlar analiz edildi. Antikorlar in vivo tahlilleri (örn. hücre büyüme inhibisyonu, hücre canlılığı tahlilleri veya sinyal ara fosforilasyon inhibisyonu vb) için de kontrol edilebilir. Antikorlar, in vivo görüntüleme için IRDye 800CW gibi uzak kırmızı boyalarla da konjuge edilebilir. ± IRDye 800CW tümör ve doku dağılımı çalışmaları öncesinde ki aktiviteler için test edilmelidir. (C) Pozitif ağır (1.4 Kb) ve hafif zincir (0.8 Kb) klonların boyutlarını doğrulayan koloni PCR agarose jelleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Antikor bütünlüğünü doğrulamak için jel bazlı redüksiyon tonu.
(A) Dört farklı IgG1 antikor (üstte gösterilen şema) 10 dakika boyunca 95°C'de azaltma maddesi (BME veya DTT gibi) ± eklendi. Antikorlar daha sonra %10'luk SDS-PAGE jeline yüklendi ve ardından protein boyama ve görüntüleme yapıldı. Sol ve sağ jel görüntü açıkça bozulmamış antikor ve iki ayrı polipeptidler (~ 50 KDa ve ~ 25 KDa) sırasıyla göstermektedir. VH/VL, CH1/CK, CH2 ve CH3 etki adlarına karşılık gelen cDNA taşıyan pVH ve pVL vektör haritalarına(Şekil 1)de bakınız. (B) Yumurtalık kanseri hücrelerinde yerli FOLR1'e bağlanan farletuzumab etiketli etiketsiz ve IRDye 800CW'nin akış sitometri onayı. Non-reducing = Antibody olmayan indirgeyici boya ile jel üzerinde çalıştırmak, Azaltma = Antibody boya, HC = Ağır zincir, LC = Hafif zincir, VL = Hafif zincirin değişken etki alanı, VH = Ağır zincirin değişken etki alanı, CK = Kappa zinciri Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Tümör üretimi ve antikor tedavilerinin deneysel şeması.
6-8 haftalık fareler gibi suşlar: İmmüneksik atimik çıplak/NSG/ İmmünyatuar C57BL/6 veya Balb/C fareleri deri altı (SQ) tümörler yoluyla tümör hücreleri ile kolayca aşılanabilir. Benzer çalışmalar meme yağ yastığı ve intraperitoneal (IP) tümörler kullanılarak yapılabilir. 3-4 hafta sonra (tümör ~200 mm3),farelere tümör aşırı ekspres reseptöre karşı ± seçici olan iDrDye etiketli bir IDye enjekte edildi. Bunu canlı görüntüleme izledi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: İnsan OVCAR3 tümörü taşıyan farelerin canlı in-vivo görüntüleme.
Rastgele seçilmiş 6-8 haftalık (Yaş) ve 20-25 gram (Ağırlık) tüysüz atilik Nude Foxn1nu/Foxn1+ (Envigo) FOLR1+ yumurtalık tümörleri (OVCAR-3 hücreleri) ile aşılandı. Belirgin tümörler ile 3 hafta sonra, fareler IGG1 kontrolü etiketli IRDye 800CW ile enjekte kuyruk damarı edildi, abagovomab (CA-125 anti-idiotypic antikor), farletuzumab (anti-FOLR1 antikor) ve BaCa (anti-FOLR1-DR5 antikor) belirtilen zamanlarda canlı görüntüleme izledi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Murine MC38 hücretüretilen tümörü taşıyan fareleri ifade eden insan FOLR1 canlı in-vivo görüntüleme.
(A) Rastgele seçilmiş 6-8 hafta eski (Yaş) ve 20-25 g NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ veya çıplak fareler insan FOLR1'i ifade eden murine MC38 hücreleri ile enjekte edildi. Tümör görünümü üzerine, fareler IGG1 kontrolü etiketli IRDye 800CW ile enjekte edilen kuyruk damarı, abagovomab (CA-125 anti-idiotypic antikor), farletuzumab (anti-FOLR1 antikor) ve BaCa (anti-FOLR1-DR5 antikor) ile endike zamanlarda canlı görüntüleme izledi. (B) 7 gün sonra hayvanlar ötenazi ve izole anahtar organlar (belirtildiği gibi) göreceli antikor sinyali (IRDye 800CW) dağılımı için aşılanmış tümörler ile birlikte görüntülendi. Beklendiği gibi, tümörler IgG1 kontrolü ve CA-125 anti-idiotypic antikor, abagovomab enjekte hayvanlarda IRDye 800CW sinyali ile negatif kaldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Tüm antikorların ve astarların dizileri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Anti-kanser terapötik ajan selektif ve tümör dokusu özel teslimat belirli bir hedefli tedavinin etkinliğini ve güvenliğini ölçmek içinanahtardır 13. Burada klinik, farletuzumab ve klinik olmayan BaCa antikorlarının ayrıntılı doku ve tümör dağılımını araştırmak için hızlı ve etkili bir yaklaşım tanımladık. Açıklanan yaklaşım yeni üretilen herhangi bir antikor için geçerlidir ve tümör / organ dağılımı özellikleri için klinik olarak etkili bir antikor (istenilen niteliklere sahip) yanında kullanılabilir. Çoğu antikor hedef reseptörleri göz önüne alındığında (meme kanserinde HER2 gibi) tümör hücrelerinde yüksek ekspresye edilir (dokular), çoğu durumda onların suboptimal ekspresyon ve fonksiyon da tümör hücreleri dışındaki hücre tiplerinde önemlidir14. Örneğin, kolon kanseri hastalarında klinik antikorları hedefleyen EGFR önemli bir oranı birikir ve ciltdokusu15toksisite neden , büyüme ve farklılaşma EGFR sinyalizasyon ve fonksiyon gerektiren bir kanser dışı doku. Bu nedenle, bu tür ön doku dağılım araştırmalarının hepatotoksisite ve doku histokimyası tahlilleri ile daha büyük bir hayvan kohortunun yeni üretilen antikorların güvenlik ve terapötik canlılığını kapsamlı bir şekilde değerlendirmenin anahtarı olduğuna inanıyoruz. Ayrıca, açıklanan doku dağılımı çalışmaları da son derece immün yetkin fareler ksenogreft çalışmalarda geçerli olacaktır, Yeni oluşturulan antikor murine muadili antijen / reseptör çapraz reaktivite korur eğer. Syngeneic hayvan çalışmalarında, tümör dağılımı ve doku histokimya çalışmaları ile birlikte, ayrıntılı kan sitokin analizi etkinliğini ve güvenlik verilerini güçlendirmek için kullanılabilir. Açıklanan yaklaşımın çekici bir özelliği, veriler ayrıca tümör den ELISA (hedef antijene karşı) ve diğer önemli doku lysates (karaciğer, kalp, akciğer, dalak, böbrek vbgibi)7 ile desteklenirse antikor dağılımının yakın doğru niceleme sağlar olmasıdır 7 . Tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi (SPECT) ve pozisyon emisyon tomografisi (PET) üzerinde tanımlanan yöntemin bir diğer önemli özelliği maliyet etkinliği16. Hem SPECT ve PET çok pahalı ve görüntüleme için radyoaktif izleyiciler kullanır, hayvanların büyük bir kohort test eğer tüm süreç hantal hale17. Buna ek olarak SPECT ve PET görüntüleme tesisleri laboratuvarlarda ve canlılarda fareler gibi hastalıkların küçük hayvan modellerini incelemek için çok standart değildir18.

Antikor tümör dağılımının neredeyse doğru bir niceletini elde etmek için açıklanan yöntemle bir sınırlama, yüksek afinitite hedef antijen bağlanmasına olan bağımlılıktır. Çünkü yüksek afinite antijen-antikor etkileşimleri gelişmiş endositoz ve lizozos19shuttling tarafından "hedef aracılı ilaç disposition (TMDD)" neden olabilir. Bu nedenle, açıklanan yaklaşımın sonuçları belirli bir tümör tipinde belirli hedef reseptöre bağlı olarak değişir. Bu nedenle, hedef antijen reseptörünün değişken (heterojen) ekspresyonuna sahip birden fazla tümör hücre hattı(lar) ile oluşturulan tümör ksenogreftleri olan büyük bir hayvan kohortunda etiketli antikor/antikorların test edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca önerilen çalışmalar için birden fazla floresan eşlekap boya(lar) ve fare suş(lar) yararlanmak için büyük ölçüde tavsiye edilir.

Fabs, scFvs, BiTes, DARTs, vb gibi küçük boyutlu antikorlar (neonatal Fc reseptörü tarafından kurtarma geri dönüşüm eksikliği (FcRn) tümörlerden daha hızlı net (serum yarım kez saat dakika olmak) göz önüne alındığında, bakım son derece değişken FcRn ekspresyonu olan farklı tümör türleri arasındaki verileri karşılaştırmak için alınmalıdır. Ayrıca, kurtarma geri dönüşümü için Fc etki alanı ile tasarlanmış daha büyük moleküllerin (çift ve trispecificity antikorlar gibi) doku/ tümör penetrasyon sorunları vardır. Bu senaryolarda, açıklanan yaklaşım boyutları6önemli ölçüde farklı antikorların doku / tümör dağılımı karşılaştırmak için uygun olmayacaktır. Ancak anlamlılık açısından, tanımlanmış tümör ve ayrıntılı doku dağılımı çalışmaları ve muadili monospesifik antikorlar etkili bir çift ve trispesifikite antikor platformu tasarımında önemli bir faktör olarak hizmet edece. Son olarak, yüksek yakınlık ve avidite-optimize antikorlar genellikle tümörlerde önemli ölçüde homojen bir dağılıma sahip olduğundan, hedef tümör epitop seçimi (TMDD eksik), belirli bir kanser modelinde genel antikor afinite ve biyolojik aktivite her zaman tümör penetrasyonu sonuçvermeden önce düşünülmelidir, güvenlik ve etkinliği.

Özetle, intravenöz enjekte edilmiş antikorların tümör ve doku dağılımını izlemek için hızlı ve basit bir yöntem tanımladık. Açıklanan yaklaşım antikor-siRNA konjugates analiz potansiyeli ekledi (nerede siRNA etiketli), antikor-ilaç konjugeler (ilaç etiketli nerede) ve antikor-nano tanecikleri (nanopartikül lipidler floresan boya ile etiketlenir). Aynı şekilde, scFv hedefleyen bir tümör benzersiz mühendislik sistein kalıntısı (floresan melamide kimya ile etiketlenmiş ise) şimerik antijen reseptör T-hücreleri (CAR-T) ve CAR-NK viral transfeksiyon tabanlı GFP / RFP sinyalleri stratejileri bağımsız bu hücre tabanlı tedavilerin tümör / doku dağılımı analiz etmek için uygun maliyetli bir yaklaşım olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların rakip finansal çıkarları yoktur.

Acknowledgments

Biz Virginia Üniversitesi Kanser Merkezi Çekirdek Görüntüleme Tesisi, Biyomoleküler Analiz Tesisi, Gelişmiş Mikroskopi Tesisi ve Yardım için Core Vivarium Tesisi müteşekkiriz. J. T-S Yumurtalık Kanseri Akademisi (OCA-DoD) erken kariyer araştırmacısı. Bu çalışma NCI/NIH hibe (R01CA233752) j. T-S, ABD DoD Meme Kanseri Araştırma Programı (BCRP) atılım seviye-1 ödülü J. T-S (BC17097) ve U.S. DoD Yumurtalık Kanseri Araştırma Programı (OCRP) finansman ödülü (OC180412) J. T-S destek

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FreeStyle CHO media Gibco Life Technologies Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X) Gibco Life Technologies Cat # 15240-062
Anti-Clumping Agent Gibco Life Technologies Cat # 01-0057DG
BD Insulin Syringe BD BioSciences Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum PerkinElmer Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B Gibco Life Technologies Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Corning Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640 Corning Cat # 10-040-CV
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X) Gibco Life Technologies Cat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kit Invitrogen Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Column GE Healthcare Cat # 11-0034-93
Infusion Takara BioScience STO344
IRDye 800CW NHS Ester LI-COR Cat # 929-70020
Isoflurane, USP Covetrus Cat # 11695-6777-2
Lubricant Eye Ointment Refresh Lacri-Lube Cat #4089
Matrigel Corning Cat # 354234
PEI transfection reagent Thermo Fisher Cat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Thermo Scientific Cat # 66333
Steritop Vacuum Filters Millipore Express Cat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTA Gibco Life Technologies Cat # 15400-054
Experimental Models: Cell lines
Human: OVCAR-3 American Type Culture Collection ATCC HTB-161
Human: CHO-K cells Stable transformed in our lab ATCC CCL-61
Mouse: 4T1 Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38 Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC Authenticated by STR profiling
Mouse: MC38 hFOLR1 Generated in our laboratory (This paper)
Experimental Models: Animal
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ Envigo Multiple Orders
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson Laboratory Multiple Orders

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
  2. Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
  3. Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
  4. Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
  5. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
  6. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
  7. Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
  8. Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11, (7), 954 (2019).
  9. Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
  10. Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
  11. Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
  12. Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
  13. Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
  14. Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
  15. Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).
  16. Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
  17. van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
  18. Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
  19. Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shivange, G., Mondal, T., Lyerly, E., Gatesman, J., Tushir-Singh, J. Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (159), e60727, doi:10.3791/60727 (2020).More

Shivange, G., Mondal, T., Lyerly, E., Gatesman, J., Tushir-Singh, J. Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (159), e60727, doi:10.3791/60727 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter