Summary
여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.
Abstract
근접 라벨링(PL) 기술은 엔지니어링된 아스코르브베이트 과산화수배 (APEX) 또는 대장균 비오틴 리가제 비라(BioID로 알려짐)를 사용하여 포유류 세포에서 단백질-단백질 상호작용(PPI)을 식별하는 데 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나 APEX 기반 PL에서2독성 과산화수소(H2O2)의요구 사항, 비오틴(16-24시간)의 배양 시간 연장, BioID 기반 PL의 더 높은 인큐베이션 온도(37°C)는 식물에서의 적용을 심각하게 제한합니다. 최근에 설명된 TurboID 기반 PL은 BioID 및 APEX의 많은 한계를 해결합니다. TurboID는 실온(RT) 조건에서 단 10분 만에 단백질의 신속한 근접 라벨링을 허용합니다. TurboID의 유용성은 동물 모델에서 입증되었지만, 우리는 최근 터보 ID 기반 PL이 관심있는 단백질에 근접한 단백질의 라벨링에 대한 BioID에 비해 식물에서 더 나은 성능을 보였다. 여기에 제공된 단계별 프로토콜은 뉴클레오티드 결합 류신-리치 반복(NLR) 단백질 패밀리의 N-말단 톨/인터류키핀-1 수용체(TIR) 도메인을 이용하여 단백질 상호작용 파트너의 식별을 위한 단계별 프로토콜이다. 이 방법은 친화도 정제에 의한 생체 연단백질의 벡터 구성, 단백질 발현 구조, 비오틴 처리, 단백질 추출 및 탈염, 정량화 및 농축에 대해 설명합니다. 여기에 기술된 프로토콜은 니코티아나 및 다른 식물 종에서 관심 있는 다른 단백질을 연구하기 위해 쉽게 적응될 수 있다.
Introduction
PPI는 다양한 세포 과정의 기초입니다. PPI를 확인하기 위한 전통적인 방법은 질량 분석법 (IP-MS)와 결합된 효모 2 하이브리드 (Y2H) 검열 및 면역침전을 포함합니다 1. 그러나 둘 다 몇 가지 단점으로 고통받고 있습니다. 예를 들어, Y2H 스크리닝은 표적 식물 또는 동물 종의 Y2H 라이브러리의 가용성을 요구한다. 이 도서관의 건설은 노동 집약적이고 비싸다. 더욱이, Y2H 접근법은 더 높은 진핵 세포의 세포 상태를 나타내지 않을 수 있는 이종 단세포 진핵 생물 효모에서 수행된다.
대조적으로, IP-MS는 일시적 또는 약한 PPI를 포착하는 데 있어 낮은 효율을 나타내며, 또한 낮은 풍부하거나 높은 소수성을 가진 단백질에 적합하지 않다. 수용체 같이 키나아제 (RLKs) 또는 면역 수용체의 NLR 가족과 같은 식물 신호 통로에서 관련시킨 많은 중요한 단백질은 낮은 수준에서 표현되고 수시로 그밖 단백질과 일시적으로 상호 작용합니다. 따라서, 그것은 크게 이러한 단백질의 조절의 기본 메커니즘의 이해를 제한.
최근에는 엔지니어링된 아스코르베이트 과산화수산아제(APEX)와 돌연변이 대장균 리게틴 리가제 비라R118G(BioID로 알려짐)에 기초한 근접 라벨링(PL) 방법이 개발되어 PPIs2,3,4의,4연구에 활용되고 있다. PL의 원리는 관심있는 표적 단백질이 효소와 융합되어 비질 바이오티닐-AMP(bio-AMP)의 형성을 촉매한다는 것입니다. 이러한 자유 바이오-AMP는 PL 효소에 의해 방출되고 표적 단백질 부근으로 확산되어 10 nm5의추정 반경 내에 있는 1차 아민에서 근위 단백질의 생체측을 허용한다.
이 접근법은 과도 또는 약한 PPI를 캡처하는 기능과 같은 기존의 Y2H 및 IP-MS 접근 방식에 비해 상당한 이점이 있습니다. 더욱이, PL은 그들의 모국세포 환경에서 표적 단백질의 근위 단백질의 라벨링을 허용한다. 다른 PL 효소는 다른 시스템에 적용할 때 독특한 단점이 있습니다. 예를 들어, APEX는 BioID에 비해 더 높은 태깅 역학을 제공하고 포유류 시스템에 성공적으로 적용되지만,2이 접근법에서 독성 과산화수소(H2O2)의요구 사항은 식물의 PL 연구에 적합하지 않습니다.
대조적으로, BioID 기반 PL은 독성H2O2의사용을 피하지만 라벨링 속도가 느립니다 (생체 이식을 완료하기 위해 18-24 시간이 필요함) 따라서 과도 PPI의 캡처가 덜 효율적입니다. 더욱이, BioID에 의한 효율적인 PL에 필요한 높은 인큐베이션 온도(37°C)는 식물4와같은 일부 유기체에 외부 스트레스를 유발한다. 따라서 식물(즉, 쌀 톱니세포, 애기장대 및 N. 벤타미아나)에서 BioID 기반 PL의 제한된 배치가6,7,78,9로보고되었다.,8 최근 기술된 터보ID 효소는 APEX 및 BioID 기반 PL. TurboID의 결핍을 극복하여 RT10에서10분 이내에 PL을 성취할 수 있는 높은 활성을 보였다. TurboID 기반 PL은 포유류 세포, 파리 및 웜10에성공적으로 적용되었습니다. 최근, 당사및 기타 연구그룹은 N. 벤타미아나 및, 애기장대 식물 및 토마토 털뿌리11,12,13,,,14를포함한 다양한 식물 시스템에서 PPI를 연구하기 위한 TurboID 기반 PL의 사용을 독립적으로 최적화및 확장시켰다. 비교 분석에 따르면 TurboID는 BioID11,,14에비해 식물에서 PL에 대해 더 나은 성능을 보입니다. 또한 전통적인 방법을 사용하여 얻기 어려운 상호 작용 파트너가 일반적으로 어려운 NLR 면역 수용체11과의 새로운 상호 작용의 수를 확인함으로써 질라에서 TurboID 기반 PL의 견고성을 입증했습니다.
이 프로토콜은 N. 벤타미아나 식물에서 NLR 면역 수용체의 N-말단 TIR 도메인의 상호작용 단백질의 식별을 설명함으로써 질라에서 터보ID 기반 PL을 설명한다. 이 방법은 N. 벤타미아나에관심있는 모든 단백질로 확장 될 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 애기장대등 다른 식물 종에서 PPI를 조사에 대 한 중요 한 참조를 제공 합니다.
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Protocol
참고: 메서드의 개요는 그림 1에나와 있습니다.
1. 식물 재료 준비
- 고밀도로 젖은 토양에서 N. 벤타미아나 씨앗을 재배하고 23-25 °C에서 16 h 빛 (약 75 μmol /m2s) 및 8 h 어두운 광주기를 가진 기후 챔버에서 유지합니다.
- 약 1 주일 후, 조심스럽게 4 'x 4'냄비에 각 젊은 묘목을 전송하고 같은 챔버에 묘목을 유지.
- 약 4주 동안 챔버내식물을 유지하여 후속농윤(15)을위해 4-8의 잎 단계로 자랄 때까지 유지한다.
2. 터보 ID 융합의 건설
- 표준 분자 복제 기술을 사용하여 목표 단백질과 터보ID(아드진 플라스미드 #107177 PCR TurboID)와 의 융합을 생성합니다. 여기서, 우리는 NLR 면역 수용체의 N-말단 TIR 도메인을 관심의 표적 단백질로 사용하고 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어 하에 터보ID에 융합된 TIR을 구성하였다(p35S::TIR-TurboID).
참고: 터보ID 효소를 표적 단백질의 카르복실-종단 또는 아미노 말단에 융합하는 것은 관심 있는 단백질에 의존할 것이다. 보통, 세포질 단백질의 경우, 터보ID 융합이 표적 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 한, 두 테르미니는 모두 허용되어야 한다. 그러나, 막 국한 된 단백질의 경우, 단백질 토폴로지는 터보 ID 융합에 가장 적합한 종단을 결정하기 전에 사전에 특성화되어야합니다. - 후속 정량적 프로테오믹 분석을 위한 대조군역할을 하는 동일한 프로모터 하에서 TurboID 융합 시트린을 구성한다.
참고: 표적 단백질에 대한 프로테오메 근위를 확인하기 위한 TurboID 제어를 구성하는 것이 중요합니다. TurboID 융합 대조군은 TurboID 융합 표적 단백질의 발현 수준과 유사한 발현 수준을 나타내야 한다. 이것은 아그로인침투 동안 아그로박테리움 농도를 조절하여 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 대조군 단백질이 관심 있는 표적 단백질과 유사한 세포내 국소화 패턴을 가지는 것이 중요하다.
3. 농업 여과
- 플라스미드를 아그로박테리움으로 의한 변형
- 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101의 단계 2.1 및 2.2~50 μL로부터 생성된 플라스미드의 0.5 μg을 추가, 앞서16에기재된 바와 같이 제조하였다.
참고 : GV2260과 같은 다른 아그로 박테리움 균주도 사용할 수 있습니다. - 얼음에 30분 동안 배양합니다.
- 60s에 대한 42 °C에서 수조에서 열 충격.
- 400 μL의 LB 배지(10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물, 10 g/L NaCl; pH = 7.0)를 아그로박테리움에 넣고 90분 동안 28°C에서 배양합니다.
- LB 한천에 튜브의 전체 함량을 플레이트 플라스미드를 선택하기 위해 적절한 항생제로 보충, 뿐만 아니라 아그로 박테리움 (GV3101 : 50 mg / L gentamicin 및 50 mg / L 리팜피신).
- 개별 식민지가 보일 때까지 36-48 시간 동안 28 °C에서 플레이트를 배양하십시오.
- 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101의 단계 2.1 및 2.2~50 μL로부터 생성된 플라스미드의 0.5 μg을 추가, 앞서16에기재된 바와 같이 제조하였다.
- 항생제 (단계 3.1.5 참조)와 신선한 LB 한천 접시에 여러 개별 식민지를 선택하고 줄무늬와 28 °C에서 하룻밤 성장.
참고 : 아그로 박테리움에서특정 이진 구문의 존재를 확인하기 위해 콜로니 PCR을 수행하는 것이 더 최적입니다. 우리의 경험에서, 식민지의 95 % 이상은 도입 된 바이너리 구문이 포함되어 있습니다. - LB 배지의 3 mL플러스 적절한 항생제(단계 3.1.4 참조)를 관심의 구성을 항구하는 아그로박테리움 콜로니와 접종하고, 아그로박테리움 배양물의 OD600이 2.0에 도달할 때까지 28°C에서 밤새 흔들어 배양한다.
- 세포를 3,000 x g에서 원심분리하고 아그로인침투 완충제에서 OD600 = 1.0으로 재중단한다(10 mM MgCl2,10 mM MES [pH = 5.6], 250 μM 아세토시링곤).
참고: 아그로인침투 전에 RT에서 2시간 동안 접종을 배양하는 것이 최적이지만, GV3101 균주에 대한 우리의 경험에서, 배양 없이 표적 단백질 발현 사이에 큰 차이가 없었다. - 완전 성숙한 N. 벤타미아나 잎의 (abaxial) 표피에 접종을 침투시키기 위해 1 mL 바늘리스 주사기를 사용한다.
참고 : 세 가지 생물학적 복제에 대한 잎 재료의 충분한 양을 준비하기 위해 : 전체 잎은 일반적으로 침투, 세 잎은 식물 당 침투하고, 3 ~ 4 식물은 각 구조에 사용됩니다. 각 잎에 대 한, 1.5-2.0 재 중단 된 아그로 박테리아의 mL충분 하다. - 36시간 후 침투 후(hpi), 200 μM 비오틴(10 mM MgCl2 용액)을 TurboID 구도로 미리 침투한 잎에 침투시다.
- 섹션 4에 설명된 바와 같이 잎 조직을 수확하기 전에 추가로 3-12 시간 동안 식물을 유지하십시오.
참고: 비오틴 침윤을 위한 36 hpi를 선택하는 이유는 이전 연구11에의하면 이 시점에서 표적 단백질 발현이 최고조에 달하기 때문이다. 관심 있는 표적 단백질의 최적 발현에 필요한 시간을 결정하는 것이 좋습니다. 인큐베이션 시간 포스트 비오틴 침윤은 연구 하에 실험 설계 및 표적 단백질에 의존한다. 보통, 비오틴 치료의 3-12 시간 터보 ID 융합에 의해 표적 단백질에 근접 대부분의 단백질의 라벨을 허용.
4. 잎 샘플 수집
참고: 잎 샘플의 후속 처리를 위해 멸균 장갑을 착용하여 시료의 각질 오염을 방지하십시오. 모든 시약은 가능한 한 각질이 없어야 합니다.
- 잎자루의 기지에서 침투 된 잎을 자르고 잎 정맥을 제거 한 다음 액체 질소로 잎 조직을 플래시 동결시.
- 유봉 및 모르타르를 사용하여 잎 조직을 갈아서 잎 분말을 15 mL 또는 50 mL 매 튜브에 -80°C에서 저장하여 후속 사용을 위해 사용한다.
참고 : 다른 식물에서 세 가지 생물학적 복제의 각각에 대한 잎의 3 ~ 4 조각을 가져 가라. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 후속 단계에 앞서, 면역블롯 분석에 의해 표적 단백질의 단백질 발현 및 생체측을 평가하는 것이 좋습니다. 전형적인 웨스턴 블롯은 그림 2에나와 있습니다.
5. 잎 총 단백질 추출
- 약 0.35 g의 잎 가루를 2 mL 튜브로 옮긴다. 각 샘플에 대해 두 개의 튜브를 준비합니다.
주의: 액체 질소로 냉각된 물체를 만지면 장갑을 착용하십시오. - RIPA 용해 버퍼 (50 mM Tris-HCl [pH = 7.5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % NP40 [v /v], 0.1 % SDS [w /v], 0.5 % 나트륨 deoxycholate [w /v], 1 mM DTT, 프로테아제 억제제 칵테일 1 정) 잎 분말 0.35 g.
- 10 분 동안 튜브를 소용돌이.
- 샘플을 얼음위에 30분 그대로 둡니다.
- 튜브를 여러 번 거꾸로 뒤집어 서 4-5 분마다 내용물과 섞습니다.
6. 탈염에 의한 무료 비오틴 제거
참고: 이 섹션은 약 50분 정도 소요됩니다.
- 탈염 열을 평형화합니다.
- 탈염 컬럼 의 하단에있는 실러를 제거하고 50mL 튜브에 컬럼을 넣습니다.
- 1000 x g 및 4 °C에서 원심 분리하여 2 분 동안 저장 용액을 제거하고 뚜껑이 느슨해지도록하십시오.
- 탈염 컬럼을 50 mL 튜브에 넣습니다. RIPA 용해 완충액 5 mL로 컬럼을 3x 평형화하고, 매번 1000 x g및 4°C에서 원심분리를 2분 동안 하고 유동을 폐기한다.
- 탈염 컬럼을 새로운 50 mL 튜브로 옮기고 후속 사용을 위해 4°C에서 일시적으로 보관하십시오.
- 16,500 x g및 4 °C에서 5.4 단계에서 튜브를 10 분 동안 회전시키고 두 튜브에서 상류를 새로운 2 mL 튜브로 옮긴다.
- 1,500 μL의 단백질 추출물을 평형 탈염 컬럼의 수지 의 상부에 첨가합니다(6.1.4단계). 단백질 추출물이 수지에 들어가면 RIPA 라시스 완충액100 μL을 추가합니다.
참고: 1,400 μL의 RIPA 용해 완충액이 잎에서 단백질 추출에 사용되었지만, 단백질 추출 및 탈염 후 총 부피는 원래 의 부피에 비해 어느 정도 변함없이 증가했습니다. 따라서, 단계 5.1 및 5.4에 기재된 바와 같이 각 그룹에서 샘플의 조합은 샘플당 적어도 1,500 μL의 단백질 추출물을 초래할 수 있다. - 1000 x g 및 4 °C에서 2 분 동안 원심 분리를 하고 탈염 된 샘플을 얼음에 일시적으로 둡니다.
7. 브래드포드 분석서를 사용하여 탈염 단백질 추출물의 정량화
- 각 그라데이션 BSA 솔루션의 50 μL을 준비하십시오: 0 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.8 mg/mL, 및 1 mg/mL.
- 5 μL 샘플을 ddH2O의 45 μL과 혼합하여 탈염 단백질 추출물을 희석시켰다.
- 5x 브래드포드 리젠트(쿠마시 브릴리언트 블루 G250 100 mg, 메탄올 47mL, 85% 인산 100 mL, ddH2O 53 mL)를 희석하여 1x 브래드포드 리젠트를 준비합니다.
- 각 그라데이션 BSA 용액 50 μL과 희석된 단백질 추출물 50 μL을 1x 브래드포드 리젠트의 2.5 mL에 첨가합니다.
- RT에서 10분 동안 배양합니다.
- ELISA 플레이트의 한 웰에 각 샘플의 용액 200 μL을 추가합니다(샘플당 3개의 기술 복제).
- 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 OD595를 측정합니다.
- 그라데이션 BSA 용액의 값을 기반으로 표준 곡선을 그리고 탈염 된 단백질 샘플의 농도를 계산합니다. 보통, 잎의 0.7 g에서 얻은 총 단백질 농도 범위에서 3-6 mg/mL.
- 후속 친화성 정제를 위해 6-8 mg의 탈염 단백질 추출물을 준비하십시오.
8. 생체 질화 단백질의 농축
- 스트렙타비덴-C1-컨쥬게이징 된 자기 비드 200 μL을 2 mL 튜브에 넣습니다.
- RT에서 1 분 동안 RIPA 용해 완충액 1 mL로 스트렙 타비덴 -C1-컨쥬게이트 된 자기 구슬을 평형화하십시오.
- 세척 할 때마다 마그네틱 랙을 사용하여 구슬을 3 분 동안 흡착하고 파이펫팅으로 용액을 부드럽게 제거하십시오.
- 8.2 단계와 8.3단계를 반복합니다.
- 탈염 된 단백질 추출물을 평형 성수연-C1-컨쥬게이스 자기 구슬로 옮김.
- 튜브를 4°C에서 12시간(또는 하룻밤)에 인큐베이션하여 생체티니화 단백질을 화결화하여 화결단백질을 화결시켰다.
- 구슬이 튜브의 한쪽에서 수집 될 때까지 RT에서 4 분 동안 자기 랙에 구슬을 캡처 한 다음 부드럽게 파이펫에 의해 상급을 제거합니다.
- 튜브에 세척 버퍼 I (물에 2 % SDS)의 1.7 mL를 추가하고 8 분 동안 RT에서 회전자에 보관하십시오. 8.3 반복 단계.
- 세척 버퍼 II (50 mM HEPES : pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 % 데옥시콜산 [w /v], 1% 트리톤 X-100)를 튜브에 넣고 8 분 동안 RT에서 회전자위에 보관하십시오.
- 세척 버퍼 III 의 1.7 mL을 추가 (10 mM 트리스-HCl: pH = 7.4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% 데옥시콜산 [w/v]), 1% NP40 [v/v]) 튜브에 8 분 동안 RT에서 회전자에 유지. 8.3 반복 단계.
- 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5)의 1.7 mL를 추가하여 세제를 제거한 다음 8.3 단계를 반복합니다.
- 구슬을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 8.11 및 8.3 단계를 반복합니다.
- RT에서 50 mM 암모늄 중탄산염 완충액으로 구슬을 5 분 동안 6 x 씻어 내보소.
- 자기 구슬에 50 mM 의 암모늄 중탄산염 버퍼 1 mL을 추가하고 잘 섞습니다.
- 면역블롯 분석을 위해 100 μL의 구슬을 제거하여 생체 면역 단백질의 농축을 확인합니다. 그림 3에전형적인 웨스턴 블롯이 나와 있습니다.
- 나머지 단백질 샘플을 플래시 동결시키고 -80°C에 저장하거나 드라이 아이스에서 LC-MS/MS 분석을 위해 즉시 보냅니다.
참고: 일반적인 MS 결과는 이전 간행물에 표시됩니다(Zhang et al. 2019; 그림 2, 보충 데이터 1 및 보충 데이터 2)11. 전체 데이터 집합은 식별자를 사용하여 MassIVE(http://massive.ucsd.edu>)에서 사용할 수 있습니다: MSV000083018 및 MSV000083019.
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Representative Results
설명된 프로토콜에 기초하여 예상되는 결과를 나타내는 대표적인 데이터는 Zhang et al11에서조정된다. 그림 1은 N. 벤타미아나에서터보ID 기반 PL을 수행하기 위한 절차를 요약한 것입니다. 도 2는 침윤된 N. 벤타미아나 잎에서단백질 발현 및 생체이식화를 나타낸다. 도 3은 침윤된 잎내의 생체티니화 단백질이 후속 질량 분석 분석을 위해 효율적으로 농축되었다는 것을 보여준다. streptavidn-C1-컨쥬게이션 된 자기 구슬을 사용하여 생체 관절 단백질을 농축 한 후 다양한 크기의 다른 단백질이 포착되었으며 농축 된 단백질의 서쪽 얼룩 분석이 얼룩진 밴드를 보였다는 점에 유의해야합니다(그림 3). 유사한 관측은 몇몇 최근 간행된연구6, 7,713,,14에서이루어졌다.,
그림 1: N. 벤타미아나의TurboID 기반 PL 방법의 개요. 터보ID 융합 구조물을 품고 있는 아그로박테리움은 N. 벤타미아나 잎에 침투되었다. 36 h 침투 후, 200 μM 비오틴은 동일한 잎에 침투하여 TurboID 융합 표적 단백질과 근접한 내인성 단백질의 생체이식화를 개시한다. 침투 된 식물은 3-12 시간 동안 RT에서 배양 한 다음 잎 을 수확하고 액체 질소로 분쇄합니다. 잎 분말은 RIPA 용해 완충액에서 용해되고, 탈염 컬럼은 단백질 추출물에서 자유 비오틴을 제거하기 위해 사용된다. 생체관절화된 단백질을 스트렙타비딘-컨쥬게이스 구슬로 친화도 정제하고 질량 분석법으로 동정하였다. 이 수치는 장 외11에서보충 그림 3에서 적응된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 4.2단계에서 수득된 단백질 추출물의 면역블롯 분석. (a)HA 태그에 대한 항체를 가진 아그로인필화 잎으로부터 추출된 단백질의 서쪽 얼룩 분석. (B)스트렙타비딘-HRP를 가진 아그로인피스트잎에서 생체연화된 단백질의 서양 얼룩 분석. 이 수치는 장 외11의보충 그림 6B에서 적응된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 생체티니화 단백질의 농축을 확인하기 위해 8.15단계에서 수득된 비드의 서쪽 얼룩 분석. 각 구문에대해 세 개의 독립적인 복제(1, 2 및 3)가 있습니다. 스트렙타비딘-HRP는 상이한 샘플에서 생체티니화된 단백질의 분석에 사용되었다. 이 수치는 장 외11에서보충 그림 7에서 적응된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
터보ID 비오틴 리가제는 바이오ID10의효모 디스플레이 기반 의 방향 진화에 의해 생성된다. 그것은 다른 PL 효소에 비해 많은 장점을 갖는다. TurboID는 최적의 성장 온도가 약 25 °C10인파리와 웜을 포함한 다른 모델 시스템에 PL을 적용 할 수 있습니다. PL 접근법은 동물 시스템에서 널리 사용되어 왔지만 식물에서의 적용은 제한적입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 식물-병원체 상호 작용 연구에서 널리 사용되고 있는 모델 공장인 N. 벤타미아나에TurboID 기반 PL을 확립하기 위한 단계별 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 잎 샘플 준비, 자유 비오틴 제거, 추출된 단백질의 정량화 및 생체 티니화 단백질의 농축을 설명합니다.
동물 세포 배양 시스템에서 자유 비오틴은 PBS 완충액4로세포를 세척함으로써 크게 제거될 수 있지만, 잎 조직의 자유 비오틴은 간단한 세척으로 지울 수 없다. 최근 연구는 자유 비오틴이 생체 연화 단백질의 후속 농축에 심각하게 영향을 미칠 수 있음을 나타냈다11. 이 프로토콜에서 탈염 컬럼은 단백질 추출물에서 자유 비오틴을 성공적으로 제거하는 데 사용되어, 생체 틸화 단백질을 스트렙타비딘 비드에 효율적으로 결합할 수 있게 한다.
또한 이 프로토콜은 다른 플랜트 시스템에서 PL을 수행하기 위한 중요한 참고 자료역할을 합니다. 최근, 3 개의 보고서는 애기장대에서TurboID 기반 PL을 사용했습니다 12,,13, 14,14 및 토마토 털이 루트12, N. benthamiana 외에 여기에 설명. 동물 세포 배양 시스템과 유사하게, 무생 비오틴의 제거는 단백질 추출 전에 식물 의 프로토플라스트를 세척함으로써 달성되었다6. 그러나, 단백질에 통합되지 않은 자유 비오틴 분자의 낮은 양은 세포의 내부에 존재했으며, 이는 생체 질화된 단백질의 후속 농축의 효율성에 영향을 미쳤다. 따라서, 탈염 절차는 자유 비오틴의 완전한 제거를 위해 권장되며, 따라서 생체 티니제 단백질의 회수 효율을 증가시다.
두 종류의 열, PD-10 및 Zeba는 무료 비오틴 제거11,,12,,13,,14에사용되어 왔다. 잎 단백질 추출물에서 자유 비오틴을 제거하는 데 있어 이들 두 컬럼의 효율성을 비교하는 것이 미래에 흥미로할 수 있다. 더욱이, 이 프로토콜은 N. 벤타미아나 잎에 관심 있는 표적 단백질을 일시적으로 발현하기 위해 정식 주사기 매개 아그로인여과입 방법을 채택한다. 이어서, 비오틴 기질은 표적 단백질에 근접한 단백질을 라벨링하기 위해 잎 내로 재침투된다. 유사한 수술은 또한 다른 두 최근보고 된 연구에서 활용되었습니다12,,13. 대안적인 방법으로서, 비오틴의 진공 매개 침윤은 N. 벤타미아나 및 애기장대(14)14모두에 적용가능하다. 또한, 아그로인침투에 적합하지 않은 식물에서, 세포 배양은 표적 단백질 발현을 위해 형질전환될 수 있고, 이어서 비오틴 처리 및 근접 라벨링분석분석(12). 이러한 최근 연구는 PPI 를 연구에서 TurboID 기반 PL의 견고성을 뒷받침하고 다른 식물 종에서 TurboID 기반 PL의 향후 응용을위한 토대를 마련했습니다.
이 프로토콜에서, 잘 확립된 아그로박테리움-N. 벤타미아나에서 의 중재된 과도 발현은 관심 있는 표적 단백질의 PPI를 식별하기 위해 사용된다. 일시적인 발현은 융합 단백질의 과발현을 유도할 수 있다. 따라서, 보다 최적의 대안은 네이티브 프로모터의 제어 하에 TurboID 융합을 설계하고 아그로인침투 또는 안정적인 형질전환 라인의 생성에 의해 이를 표현하는 것이다. 게놈 편집 기술의 발달로, 관심 있는 유전자의 네이티브 게놈 성엽으로 터보ID 단편을 직접 노크하는 것도 가능합니다.
고려해야 할 또 다른 중요한 요소는 TurboID 융합이 관심 있는 표적 단백질의 기능을 변화시키지 않도록 하는 것이다. 이전 연구에서, TurboID에 융합된 NLR 면역 수용체의 기능은 담배 모자이크 바이러스 p50 이펙터11의존재 에서 방어 매개 세포 사멸을 유도하는 능력을 시험함으로써 확인되었다. TurboID는 GFP보다 상대적으로 크며(즉, 35 kDa) 표적 단백질에 대한 그의 융합은 표적 단백질의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 경우, 더 작은 miniTurboID10을 사용할 수 있다.
또한 표적 단백질의 어느 종단이 TurboID와 융합하기에 적합한지 결정하는 것이 중요합니다. 이러한 기능적 시험에 대한 일반적인 접근법은 TurboID 융합이 표적 유전자의 돌연변이 식물 라인을 보완할 것인지를 결정하는 것이다. 대안적으로, 표적 단백질의 이전에 공지된 상호작용 파트너와의 TurboID 융합의 상호작용의 분석이 사용될 수 있다. 대부분의 경우, 세포질 단백질의 경우 TurboID의 N 말단 또는 C 말단 태깅은 후속 질량 분석 분석에서 유사한 데이터 세트를 생성할 수 있습니다. 그러나 막 국부적 단백질의 경우 벡터 구성 전에 토폴로지를 결정하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 관심 있는 유전자의 코딩 서열의 터보ID 업스트림 또는 다운스트림의 융합은 완전히 상이한 결과를 생성할 것이다. 따라서, 막 국소화 단백질의 N-말단 또는 C-말단의 마주하는 측면(예를 들어, 세포질- 또는 루멘-마주)을 결정하는 것이 중요하다. 이는 표적 단백질의 예상 근위 수체가 수득될 수 있음을 보장한다.
PL은 과도 또는 약한 PPI를 감지하기 위한 기존의 IP-MS 접근 방식에 비해 몇 가지 장점이 있지만 고유한 본질적인 한계가 있습니다. 먼저, 후보 상호작용 단백질의 식별은 미끼 단백질과의 직접 적 또는 간접적 상호작용을 즉시 의미하지는 않지만근접성 2를반영한다. 따라서, 독립적인 생체 내 분석(즉, 공동 면역 침전, 이중 분자 형광 보완 [BiFC], 또는 시험관내 GST-풀다운 분석)은 PPI를 추가로 확인하기 위해 수행될 수 있다.
둘째, 거짓 부정 또는 거짓 긍정은 여러 가지 이유로 인해 PL 분석법에서 발생할 수 있습니다. 예를 들면, 거짓 음성은 접근가능한 1 차적인 아민이 결여된 단백질 때 생길 수 있습니다. 또한, 식물에서 BIN2 인터액터의 최근 연구는 두 실험(13)에서데이터 사이의 부분적인 중복을 보였다, 부적절한 MS 범위로 인해 거짓 부정적인 결과의 존재를 나타내는. 표적 단백질의 일부 인터랙터는 또한 터보ID 융합 제어에 의해 약하게 생체화될 수 있으며, 이로 인해 컷오프 임계값 이하의 접이식 농축이 발생하고 결국 일부 진정한인터액터(13,,14)의손실이 발생할 수 있다. 따라서, 적절한 제어 및 컷오프 값을 가진 충분한 생물학적 복제는 거짓 네거티브(11,11,14)의수를 최소화하도록 설정되어야 한다.
더욱이, 긴 비오틴 치료 기간은 비특이적 단백질의 생체측을 증가시킬 수 있으며, 이는 거짓양성(10)을초래한다. 따라서, 비특이적 생체측항을 감소시키기 위해 생체 라벨링 시간 윈도우를 최적화하는 것이 중요하며, 또한 분석용 생체측단백질의 생산에 영향을 미치지 않는11,,12,,13,,14. 또한, 가혹한 추출 및 엄격한 세척 조건은비드(17)에단백질의 비특이적 결합으로부터 유래된 거짓 양성을 감소시키는 것이 권장된다. 위에서 설명한 주의 사항 외에도 적절한 네거티브 컨트롤의 설계는 진정한 인터액터를 거짓 인터액터와 구별하고 진정한 인터액터11,,12,,13,14의누락을 피하는 데 중요합니다.
터보ID는 바이오ID10,,11에비해 라벨링 역학이 크게 개선된 것으로 나타났다. 그러나 이는 PL 분석 중에 더 높은 배경으로 이어질 수도 있습니다. 따라서 배경 신호를 제거하려면 적절한 컨트롤을 포함해야 합니다. 우리는 이 프로토콜11에서시트린 융합 터보ID를 사용했으며, 이전 연구18에서유사한 대조군을 활용했습니다. 특정 세포기관 막에 국소화되는 표적 단백질의 경우, 동일한 세포세포막을 표적으로 하는 신호 펩티드와 융합된 TurboID는 세포질14에서발현되는 것과 융합하는 터보ID보다 더 나은 대조군을 만든다.
더욱이, 다른 파트너와의 상호작용을 결정하는 표적 단백질내의 주요 도메인 또는 아미노산에 대한 정보가 공지된 경우, 터보ID와 주요 도메인 또는 아미노산의 돌연변이가 있는 표적 단백질을 융합하는 것이 가장 좋은 대조되어야 하며 표적 단백질에 의해 생성된 배경 신호를 최대한 감소시킬 것이다. 또한, TurboID 효소는 적절한 pH 조건뿐만 아니라 특정 온도를 필요로한다. ER, 핵 및 미토콘드리아와 같은 세포의 대부분의 세포기관의 경우, TurboID는 근위 성 단백질10을성공적으로 표지했습니다. 그러나, 몇몇 특별한 세포기관 (즉, 그의 pH가 매우낮은식물 세포에 있는 액포)는 PL 접근을 사용하여 PPI를 공부하기에 적합하지 않을 수 있다. 더욱이, 응력 반응 동안 세포 내 환경의 pH 수준 또는 산화 감소 상태의 변화는 TurboID의 라벨링 효율에 영향을 미칠 수 있다.
요약하자면, 여기서 설명된 프로토콜은 식물 생물학20의많은 양상에서 널리 사용되고 있는 모델 식물 시스템인 N. 벤타미아나에서터보ID를 사용하여 PPI를 조사하기 위한 기초를 제공한다. 최근 기재된 TurboID 기반 PL 연구를 애기장대 식물및 토마토 털이 뿌리12,,13,,14에서,이 방법은 다른 식물 종에 적용될 것으로 기대된다. TurboID 기반 PL이 식물 생물학 연구에서 PPI를 연구하는 데 중요한 역할을 할 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 사업은 국립 트랜스제닉 과학 기술 프로그램(2019ZX08010-003 ~ Y.Z.), 중국 국립 자연과학 재단(31872637 ~ Y.Z.), 중앙대학 기초연구기금(2019TC028 ~Y.Z.), NSF-IOS-1344의 보조금으로 지원되었다. NSF-IOS-1339185 및 NIH-GM132582-01~ S.P.D.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
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