Summary
Descritto qui è un metodo di etichettatura di prossimità per l'identificazione dei partner di interazione del dominio TIR del recettore immunitario NLR nel tessuto fogliare di Nicotiana benthamiana. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l'identificazione delle interazioni tra altre proteine di interesse utilizzando questa tecnica nella Nicotiana e in altre specie vegetali.
Abstract
Le tecniche di etichettatura di prossimità (PL) che utilizzano l'aossidasi ascorbate (APEX) ingegnerizzata o l'Escherichia coli biotini ligase ligase BirA (noto come BioID) sono state utilizzate con successo per l'identificazione delle interazioni proteina-proteina (IPP) nelle cellule dei mammiferi. Tuttavia, i requisiti di perossido di idrogeno tossico (H2O2) in PL basato su APEX, tempi di incubazione più lunghi con biotina (16-24 h) e una temperatura di incubazione più elevata (37 gradi centigradi) nel PL basato sul bioID limitano gravemente le loro applicazioni nelle piante. Il PL basato su TurboID recentemente descritto affronta molte limitazioni di BioID e APEX. TurboID consente una rapida etichettatura di prossimità delle proteine in soli 10 min in condizioni di temperatura ambiente (RT). Anche se l'utilità di TurboID è stata dimostrata in modelli animali, abbiamo recentemente dimostrato che PL a base di TurboID offre prestazioni migliori nelle piante rispetto al BioID per l'etichettatura delle proteine che sono propimali a una proteina di interesse. A questo proposito è fornito un protocollo passo-passo per l'identificazione dei partner di interazione proteica utilizzando il dominio del recettore N-terminale Toll/interleukin-1 (TIR) della famiglia di proteine leucina-ricca (NLR) legante-legame nucleotide come modello. Il metodo descrive la costruzione vettoriale, l'agroinfiltrazione dei costrutti di espressione proteica, il trattamento della biotina, l'estrazione e la dissalazione delle proteine, la quantificazione e l'arricchimento delle proteine biotinylate per purificazione dell'affinità. Il protocollo qui descritto può essere facilmente adattato per studiare altre proteine di interesse per Nicotiana e altre specie vegetali.
Introduction
Gli IPP sono alla base di vari processi cellulari. I metodi tradizionali per identificare gli IPP includono lo screening del lievito-due-ibrido (Y2H) e l'immunoprecipitazioni accoppiati con la spettrometria di massa (IP-MS)1. Tuttavia, entrambi soffrono di alcuni svantaggi. Ad esempio, lo screening Y2H richiede la disponibilità della libreria Y2H delle specie vegetali o animali bersaglio. La costruzione di queste biblioteche è laboriosa e costosa. Inoltre, l'approccio Y2H viene eseguito nel lievito eterologo dell'organismo eucatotico unidestro, che potrebbe non rappresentare lo stato cellulare delle cellule eucariotiche superiori.
Al contrario, IP-MS mostra una bassa efficienza nell'acquisizione di IPP transitori o deboli, ed è anche inadatto per quelle proteine con bassa abbondanza o alta idrofobicità. Molte importanti proteine coinvolte nei percorsi di segnalazione delle piante, come le chinasi recettoriali (RLK) o la famiglia NLR di recettori immunitari, sono espresse a bassi livelli e spesso interagiscono con altre proteine in modo transitorio. Pertanto, limita notevolmente la comprensione dei meccanismi alla base della regolazione di queste proteine.
Recentemente, sono stati sviluppati e utilizzati per lo studio degli Escherichia coli biotin ligase Ligase R118G (noto come BioID) metodi basati su ascorbate perossidasi ingegnerizzati (APEX) e un mutante Escherichia coli biotinli ligaseBirA R118G (noto come BioID) e utilizzati per lo studio degli IPP2,,3,4. Il principio di PL è che una proteina bersaglio di interesse è fusa con un enzima, che catalizza la formazione di labile biotinyl-AMP (bio-AMP). Questi bio-AMP gratuiti vengono rilasciati dagli enzimi PL e si diffondono in prossimità della proteina bersaglio, permettendo la biotinyalazione delle proteine prossimali nelle ammine primarie entro un raggio stimato di 10 nm5.
Questo approccio presenta vantaggi significativi rispetto agli approcci tradizionali Y2H e IP-MS, ad esempio la capacità di acquisire IPP temporanei o deboli. Inoltre, PL consente l'etichettatura delle proteine prossimali della proteina bersaglio nei loro ambienti cellulari nativi. Diversi enzimi PL hanno svantaggi unici quando li applicano a sistemi diversi. Ad esempio, sebbene APEX offra una cinetica di tagging più elevata rispetto al BioID e venga applicato con successo nei sistemi di mammiferi, il fabbisogno di perossido di idrogeno tossico (H2O2) in questo approccio lo rende inadatto per gli studi PL negli impianti.
Al contrario, PL basato su BioID evita l'uso del tossico H2O2, ma il tasso di etichettatura è lento (che richiede 18-24 h per completare la biotinylation), rendendo così meno efficiente la cattura di PpI transitori. Inoltre, la temperatura di incubazione più elevata (37 gradi centigradi) necessaria per un PL efficiente da parte di BioID introduce lo stress esterno ad alcuni organismi, come le piante4. Pertanto, è stato segnalatoun,7,8,9impiego limitato di PL a base di BioID in impianti (ad esempio protoplasti di riso, Arabidopsis e N. benthamiana) . L'enzima TurboID recentemente descritto supera le carenze di APEX e PL.10 PL basato su turboidi è stato applicato con successo nelle cellule dei mammiferi, mosche e vermi10. Recentemente, noi e altri gruppi di ricerca indipendenteottimizzato ed esteso l'uso di TurboID-based PL per studiare IPP in diversi sistemi vegetali, tra cui N. benthamiana e arabidopsis piante e pomodoro radici pelose11,12,13,14. Analisi comparative hanno indicato che TurboID offre prestazioni migliori per PL nelle piante rispetto al BioID11,14. Ha anche dimostrato la robustezza di PL a base di TurboID in planta identificando una serie di nuove interazioni con un recettore immunitario NLR11, una proteina i cui partner di interazione sono solitamente difficili da ottenere utilizzando metodi tradizionali.
Questo protocollo illustra il PL basato su TurboID in planta descrivendo l'identificazione delle proteine di interazione del dominio TIR N-terminale del recettore immunitario NLR nelle piante Di N. benthamiana. Il metodo può essere esteso a qualsiasi proteina di interesse in N. benthamiana. Ancora più importante, fornisce un importante riferimento per lo studio degli IPP in altre specie vegetali come l'Arabidopsis,il pomodoro e altri.
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Protocol
NOTA: una panoramica del metodo è illustrata nella Figura 1.
1. Preparazione del materiale vegetale
- Coltiva i semi di N. benthamiana in terreno umido ad alta densità e mantenerli in una camera climatica con una luce di 16 h (circa 75 mol/m2s) e un fotoperiodo scuro di 8 h a 23–25 gradi centigradi.
- Circa 1 settimana dopo, trasferire attentamente ogni giovane piantine a pentole da 4' x 4' e tenere le piantine nella stessa camera.
- Mantenere le piante nella camera per circa 4 settimane fino a quando crescono ad uno stadio foglia di 4-8 per la successiva agroinfiltrazione15.
2. Costruzione di fusioni TurboID
- Utilizzare la tecnica di clonazione molecolare standard per generare la fusione della proteina bersaglio con TurboID (PCR TurboID di Addgene plasmid #107177). Qui, abbiamo usato il dominio TIR N-terminale del recettore immunitario NLR come proteina bersaglio di interesse e costruito TIR fuso a TurboID sotto il controllo del virus del mosaico di Cavolfiore 35S promotore (p35S::TIR-TurboID).
NOTA: La fusione dell'enzima TurboID al carboxyl-terminus o all'ammino-terminus della proteina bersaglio dipenderà dalla proteina di interesse. Di solito, per una proteina citoplasmatica, entrambi i termini dovrebbero essere accettabili, purché la fusione TurboID non influisca sulla funzione della proteina bersaglio. Tuttavia, per una proteina localizzata in membrana, la topologia proteica deve essere caratterizzata in anticipo prima di determinare quale capolinea è meglio per la fusione TurboID. - Costruisci un citrino fuso turboide sotto lo stesso promotore per fungere da controllo per la successiva analisi proteomica quantitativa.
NOTA: è importante costruire un controllo TurboID per identificare il proteoma proximal alla proteina bersaglio. Il controllo di fusione TurboID dovrebbe mostrare un livello di espressione simile a quello della proteina bersaglio fusa turboID. Questo può essere determinato empiricamente regolando la concentrazione di Agrobacterium durante l'agroinfiltrazione. Inoltre, è importante che la proteina di controllo abbia un modello di localizzazione subcellulare simile a quello della proteina bersaglio di interesse.
3. Agroinfiltrazione
- Trasformazione dei plasmidi in agrobatterio
- Aggiungete 0,5 g di plasmidi generati dai passi 2.1 e da 2,2 a 50 -L di Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101 cellule competenti, preparate come descritto in precedenza16.
NOTA: Possono essere utilizzati anche altri ceppi di Agrobacterium, come GV2260. - Incubare sul ghiaccio per 30 min.
- Scossa di calore in un bagno d'acqua a 42 gradi centigradi per 60 s.
- Aggiungete all'Agrobacterium 400 l di LB medio (10 g/L di tryptone, 5 g/L di lievito e 10 g/L NaCl; pH 7,0) e incubate a 28 gradi centigradi per 90 min.
- Piastrare l'intero contenuto nel tubo su LB agar integrato con antibiotici appropriati per selezionare il plasmide, così come per l'Agrobacterium (per GV3101: 50 mg/L gentamicin e 50 mg/L rifampicina).
- Incubare le piastre a 28 gradi centigradi per 36-48 h fino a quando le singole colonie non sono visibili.
- Aggiungete 0,5 g di plasmidi generati dai passi 2.1 e da 2,2 a 50 -L di Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101 cellule competenti, preparate come descritto in precedenza16.
- Raccogliere e strisciare diverse colonie individuali su un piatto fresco di agar LB con antibiotici (vedi passo 3.1.5) e crescere a 28 gradi durante la notte.
NOTA: È più ottimale eseguire la colonia PCR per confermare la presenza del costrutto binario specifico nell'Agrobacterium. Nella nostra esperienza, oltre il 95% delle colonie contiene i costrutti binari introdotti. - Inoculare 3 mL di LB medio più antibiotici appropriati (vedi passo 3.1.4) con colonia di Agrobacterium che ospita il costrutto di interesse, e incubare agitando durante la notte a 28 s fino a quando l'OD600 della coltura Agrobacterium raggiunge 2.0.
- Centrifugare le cellule a 3.000 x g e risospendere a OD600 x 1,0 nel buffer di agroinfiltrazione (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH - 5,6], 250 s acetosyringone).
NOTA: Anche se è ottimale incubare l'inoculum per 2 h a RT prima dell'agroinfiltrazione, nella nostra esperienza con il ceppo GV3101, non c'è stata una grande differenza tra l'espressione proteica bersaglio con vs senza incubazione. - Utilizzare una siringa senza ago da 1 mL per infiltrarsi nell'inoculo nell'epidermide (abassiale) delle foglie di N. benthamiana completamente mature.
NOTA: Per preparare una quantità sufficiente di materiali foglia per tre repliche biologiche: di solito un'intera foglia viene infiltrata, tre foglie vengono infiltrate per pianta e per ogni costrutto vengono utilizzate da tre a quattro piante. Per ogni foglia è sufficiente 1,5-2,0 mL di agrobatteri risospesi. - Dopo 36 h post-infiltrazione (hpi), infiltrati con biotina da 200 m (in 10 m soluzione MgCl2) nelle foglie preinfiltrate con i costrutti TurboID.
- Mantenere la pianta per ulteriori 3-12 h prima di raccogliere il tessuto fogliare come descritto nella sezione 4.
NOTA: La ragione per la scelta del 36 hpi per l'infiltrazione di biotina è che l'espressione proteica bersaglio raggiunge il picco in questo punto temporale secondo studi precedenti11. Si consiglia di determinare il tempo necessario per l'espressione ottimale della proteina bersaglio di interesse. Il tempo di incubazione post-biotina dipende dalla progettazione sperimentale e dalla proteina bersaglio in esame. Di solito, 3-12 h di trattamento della biotina consente l'etichettatura della maggior parte delle proteine prossimati alla proteina bersaglio da parte delle fusioni TurboID.
4. Raccolta di campioni di foglie
NOTA: Per la successiva elaborazione dei campioni di foglie, indossare guanti sterili per evitare la contaminazione da cheratina dei campioni. Tutti i reagenti dovrebbero anche essere il più possibile privi di cheratina.
- Tagliare le foglie infiltrate alla base del picciolo, rimuovere la vena foglia, quindi congelare il tessuto fogliare in azoto liquido.
- Macinare il tessuto fogliare utilizzando un pestello e malta e conservare la polvere di foglia in 15 mL o 50 mL tubi falco a -80 gradi centigradi per un uso successivo.
NOTA: Prendere tre o quattro pezzi di foglie per ciascuno dei tre replica biologici da piante diverse. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Prima delle fasi successive, si raccomanda di valutare l'espressione proteica e la biotinylazione della proteina bersaglio mediante analisi immunoblot. Le tipiche macchie occidentali sono mostrate nella Figura 2.
5. Estrazione della proteina totale delle foglie
- Trasferire circa 0,35 g di polvere di foglia in un tubo da 2 mL. Preparare due tubi per ogni campione.
PROCEDIMENTO: Indossare guanti quando si tocca qualsiasi oggetto raffreddato da azoto liquido. - Aggiungere 700 l di buffer di lisi RIPA (50 mMM Tris-HCl [pH - 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0.5% deoxycholate di sodio [w/v], 1 mM DTT, 1 compressa di cocktail inibitore proteasi) a 0,35 g di polvere di foglia.
- Vorticare i tubi per 10 min.
- Lasciare i campioni sul ghiaccio per 30 min.
- Mescolare il contenuto ogni 4-5 min capovolgendo i tubi più volte.
6. Rimozione della biotina gratuita mediante dissalatura
NOTA: questa sezione richiede circa 50 min.
- Equilibrate la colonna di salvie.
- Rimuovere il sigillante nella parte inferiore della colonna di salsalazione e mettere la colonna in un tubo da 50 mL.
- Rimuovere la soluzione di stoccaggio con centrifugazione a 1000 x g e 4 gradi centigradi per 2 min e assicurarsi che il tappo sia allentato.
- Mettere la colonna di salvieo in un tubo da 50 mL. Equilibrate la colonna 3x con 5 mL di buffer di lisi RIPA, ogni volta centrifugando a 1000 x g e 4 gradi centigradi per 2 min e scartando il flusso.
- Trasferire la colonna di dissalamento in un nuovo tubo da 50 mL e conservarla temporaneamente a 4 gradi centigradi per un uso successivo.
- Girare i tubi da passo 5.4 a 16.500 x g e 4 s per 10 min e trasferire il supernatante dai due tubi in un nuovo tubo 2 mL.
- Aggiungere 1.500 l di estratto proteico nella parte superiore della colonna di dissalazione equilibrata (dal punto 6.1.4). Quando l'estratto di proteina entra nella resina, aggiungere altri 100 l di lis tampone RIPA.
NOTA: Anche se per l'estrazione di proteine dalle foglie è stato utilizzato un buffer di lisi RIPA di 1.400 gradi, il volume totale dopo l'estrazione e la dealning delle proteine è stato invariabilmente aumentato in misura rispetto al volume originale. Pertanto, una combinazione dei campioni di ogni gruppo, come descritto nei passaggi 5.1 e 5.4, può comportare almeno 1.500 l di estratto di proteine per campione. - Centrifuga a 1000 x g e 4 gradi centigradi per 2 min e lasciare temporaneamente i campioni dissalati sul ghiaccio.
7. Quantificazione degli estratti di proteine dissalati utilizzando un saggio Bradford
- Preparare 50 l di ogni soluzione sfumata BSA: 0 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL e 1 mg/mL.
- Diluire l'estratto di proteine dissalate mescolando un campione di 5 ll con 45 -L di ddH2O.
- Preparare 1 x Bradford reggente diluindo il 5x Bradford reggent (100 mg di Coomassie brillante blu G250, 47 mL di metanolo, 100 mL di 85% acido fosforico, 53 mL di ddH2O).
- Aggiungete 50 l di ogni soluzione bstale BSA e 50 ll di estratto di proteine diluite ai 2,5 mL di 1 x regent Bradford.
- Incubare a RT per 10 min.
- Aggiungere 200 l di soluzione di ogni campione a un pozzo di una piastra ELISA (tre repliche tecniche per campione).
- Misurare l'OD595 utilizzando un lettore di microplacio.
- Disegnare la curva standard in base al valore della soluzione BSA sfumata e calcolare la concentrazione dei campioni di proteine dissalate. Di solito, la concentrazione proteica totale ottenuta da 0,7 g di foglie varia da 3 a 6 mg/mL.
- Preparare 6-8 mg di estratto di proteine dissalate per la successiva purificazione dell'affinità.
8. Arricchimento delle proteine biomutate
- Prendere 200 l di perline magnetiche coniugate streptavidn-C1 in un tubo da 2 mL.
- E le perline magnetiche coniugate streptavidn-C1 con 1 mL di tampone di lisi RIPA per 1 min a RT.
- Dopo ogni lavaggio, utilizzare il rack magnetico per adsornerare le perline per 3 min e rimuovere delicatamente la soluzione pipetting.
- Ripetere i passaggi 8.2 e 8.3.
- Trasferire l'estratto di proteine dissalate nelle perle magnetiche coniugate streptavidn-C1 bilanciate.
- Incubare il tubo a 4 gradi centigradi per 12 h (o durante la notte) su un rotatore per purificare l'affinità delle proteine biotinylate.
- Catturare le perline su un rack magnetico per 4 minuti a RT fino a quando le perline raccolgono su un lato del tubo, quindi rimuovere delicatamente il supernatant da pipetta.
- Aggiungere 1,7 mL di tampone di lavaggio I (2% SDS in acqua) al tubo e tenerlo sul rotatore a RT per 8 min. Ripetere il passaggio 8.3.
- Aggiungere 1,7 mL di buffer di lavaggio II (50 mHe: pH - 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% acido deossilicico [w/v], 1% Triton X-100) al tubo e tenerlo sul rotatore a RT per 8 min. Step Repeat 8.3.
- Aggiungere 1,7 mL di buffer di lavaggio III (10 mM Tris-HCl: pH : 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% acido deoxycholic [w/v], 1% NP40 [v/v]) al tubo e tenerlo sul rotatore a RT per 8 min.
- Aggiungere 1,7 mL di 50 mM Tris-HCl (pH - 7,5) per rimuovere il detergente, quindi ripetere il passaggio 8.3.
- Trasferire le perline in un nuovo tubo da 1,5 mL e ripetere i passaggi 8.11 e 8.3.
- Lavare le perline 6x per 5 min ciascuna con 50 mM di tampone di bicarbonato di ammonio a RT.
- Aggiungere 1 mL di 50 mm di batampo di bicarbonato di ammonio alle perline magnetiche e mescolare bene.
- Rimuovere 100 l di perline per l'analisi dell'immunoblot per confermare l'arricchimento delle proteine biotinylate. Una tipica macchia occidentale è mostrata figura 3.
- Congelano in flash il resto dei campioni di proteine e conservati a -80 gradi o li inviano immediatamente per l'analisi LC-MS/MS sul ghiaccio secco.
NOTA: I risultati tipici degli Stati membri sono visualizzati in una pubblicazione precedente (shang et al. Figura 2, Dati supplementari 1 e Dati supplementari 2)11. Gli interi set di dati sono disponibili in MassIVE (disponibile all'indirizzo
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Representative Results
I dati rappresentativi, che illustrano i risultati attesi in base al protocollo descritto, sono adattati da .hang et al11. Figura 1 riepiloga le procedure per l'esecuzione di TurboID-based PL in N. benthamiana. La figura 2 mostra l'espressione proteica e la biotinylazione nelle foglie di N. benthamiana infiltrate. La figura 3 mostra che le proteine biotinylate nelle foglie infiltrate sono state arricchite in modo efficiente per la successiva analisi della spettrometria di massa. Va notato che dopo l'arricchimento delle proteine biotinylalate utilizzando streptavidn-C1 coniugato perline magnetiche, sono state catturate diverse proteine con varie dimensioni, e l'analisi occidentale delle macchie occidentali delle proteine arricchite ha mostrato bande spalmate (Figura 3). Osservazioni simili sono state fatte in diversi studi pubblicati di recente6,7,13,14.
Figura 1: Panoramica del metodo PL basato su TurboID in N. benthamiana. L'agrobatteriterio che ospitava i costrutti turboid-fusione sono stati infiltrati nelle foglie di N. benthamiana. 36 h dopo l'infiltrazione, la biotina di 200 M viene infiltrata nelle stesse foglie per avviare la biotinyalazione delle proteine endogene che sono propimali alla proteina bersaglio fusa dal TurboID. Le piante infiltrate vengono poi incubate alla RT per 3-12 h, seguite dalla raccolta delle foglie e dalla macinazione in azoto liquido. La polvere di foglia viene lised nel buffer di lisi RIPA e viene impiegata una colonna di disalazione per rimuovere la biotina libera nell'estratto di proteina. Le proteine biotinylate sono state poi purificate per affinità con perline coniugate a streptavidin e identificate dalla spettrometria di massa. Questa cifra è adattata dalla Figura 3 supplementare di .hang et al11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi immunoblot degli estratti proteici ottenuti al punto 4.2. (A) Analisi occidentale delle proteine estratte dalle foglie agroinfiltrate con anticorpi contro il tag HA. (B) Analisi occidentale delle proteine biotinylate nelle foglie agroinfiltrate con streptavidina-HRP. Questa cifra è adattata dalla figura supplementare 6B di shang et al11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi occidentale delle perline ottenute al punto 8.15 per confermare l'arricchimento delle proteine biotinylate. Per ogni costrutto, ci sono tre repliche indipendenti (1, 2 e 3). Streptavidin-HRP è stato utilizzato per l'analisi di proteine biotinylate in diversi campioni. Questa cifra è adattata dalla Figura 7 supplementare di .hang et al11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il turboID biotina lega è generato dall'evoluzione diretta del BioID10basato sul display di lievito. Ha molti vantaggi rispetto ad altri enzimi PL. TurboID consente l'applicazione di PL ad altri sistemi di modello, tra cui mosche e vermi, la cui temperatura di crescita ottimale è di circa 25 c10. Anche se l'approccio PL è stato ampiamente utilizzato nei sistemi animali, la sua applicazione nelle piante è limitata. Il protocollo qui descritto fornisce una procedura passo-passo per stabilire il PL basato su TurboID in N. benthamiana, una pianta modello che è stata ampiamente utilizzata negli studi di interazione pianta-agente-patogeno. Questo protocollo delinea la preparazione del campione di foglia, la rimozione della biotina gratuita, la quantificazione delle proteine estratte e l'arricchimento delle proteine biotinylate.
Anche se la biotina gratuita nei sistemi di coltura delle cellule animali può essere in gran parte rimossa lavando le cellule con il buffer PBS4, la biotina gratuita nel tessuto fogliare non può essere cancellata con un semplice lavaggio. Uno studio recente ha indicato che la biotina libera può avere un grave impatto sull'arricchimento successivo delle proteine biotinylate11. In questo protocollo, una colonna di dealfiore viene utilizzata per rimuovere con successo la biotina gratuita negli estratti proteici, consentendo il legame efficiente delle proteine biotinylalate alle perline di streptavidina.
Inoltre, questo protocollo funge da importante riferimento per la conduzione di PL in altri sistemi di impianti. Recentemente, tre rapporti hanno utilizzato PL turboid in Arabidopsis12,13,14 e radice pelosa di pomodoro12, oltre alla N. benthamiana descritto qui. Simile ai sistemi di coltura delle cellule animali, la rimozione della biotina gratuita è stata ottenuta lavando i protoplasts vegetali prima dell'estrazione delle proteine6. Tuttavia, una minore quantità di molecole di biotina libera che non erano integrate nella proteina esisteva all'interno della cellula, il che ha influenzato l'efficienza del successivo arricchimento delle proteine biotinylate. Pertanto, una procedura di dissalamento è raccomandata per la rimozione completa della biotina gratuita, aumentando così l'efficienza di recupero delle proteine biotinylate.
Due tipi di colonne, PD-10 e zeba, sono stati utilizzati per la rimozione gratuita di biotina11,12,13,14. Potrebbe essere interessante per il futuro confrontare l'efficienza di queste due colonne nella rimozione della biotina libera negli estratti di proteine foglie. Inoltre, questo protocollo utilizza un metodo di agroinfiltrazione canonico mediato dalla siringa per esprimere transitoriamente la proteina bersaglio di interesse per le foglie di N. benthamiana. Quindi, il substrato di biotina viene reinfiltrato nelle foglie per etichettare le proteine che sono prossimali alla proteina bersaglio. Operazioni simili sono state utilizzate anche in altri due studi recentemente riportati12,13. Come metodo alternativo, l'infiltrazione mediata sottovuoto di biotina è applicabile sia per N. benthamiana che per l'Arabidopsis14. Inoltre, nelle piante che non sono adatte per l'agroinfiltrazione, le colture cellulari possono essere trasformate per l'espressione proteica bersaglio, seguita dal trattamento della biotina e dal test di etichettatura di prossimità12. Questi studi recenti hanno sostenuto la robustezza del PL basato su TurboID nello studio degli IPP e hanno gettato le basi per future applicazioni di PL basate su TurboID in diverse specie vegetali.
In questo protocollo, ben consolidata espressione transitoria mediata da Agrobacteriumin N. benthamiana viene impiegata per identificare gli IPP della proteina bersaglio di interesse. L'espressione transitoria può portare a una sovraespressione delle proteine di fusione. Pertanto, un'alternativa più ottimale è quella di progettare la fusione TurboID sotto il controllo di un promotore nativo ed esprimerla con agroinfiltrazione o generazione di linee transgeniche stabili. Con lo sviluppo della tecnologia di editing del genoma, è anche possibile inserire il frammento TurboID direttamente nei loci genomici nativi dei geni di interesse.
Un altro fattore importante da considerare è quello di garantire che la fusione TurboID non alteri la funzione della proteina bersaglio di interesse. In uno studio precedente, la funzione del recettore immunitario NLR fuso a TurboID è stata confermata testando la sua capacità di indurre la morte cellulare mediata dalla difesa in presenza di effettore p50 del virus del mosaico di tabacco11. Il turboID è relativamente più grande (cioè 35 kDa) di GFP e la sua fusione in una proteina bersaglio può influenzare la funzione di una proteina bersaglio. In questi casi, è possibile utilizzare il miniTurboID10 più piccolo.
È anche importante determinare quale capolinea della proteina bersaglio è adatto per la fusazione con TurboID. Un approccio generale per tali test funzionali è determinare se la fusione TurboID andrà ad integrare la linea vegetale mutante del gene bersaglio. In alternativa, è possibile utilizzare l'analisi dell'interazione della fusione TurboID con un partner di interazione precedentemente noto della proteina bersaglio. Nella maggior parte dei casi, per le proteine citoplasmiche, l'etichettatura n-terminale o terminale C del TurboID può produrre set di dati comparabili nella successiva analisi della spettrometria di massa. Tuttavia, per le proteine localizzate in membrana, è importante determinare la topologia prima della costruzione vettoriale. In caso contrario, la fusione di TurboID a monte o a valle della sequenza di codifica dei geni di interesse genererà risultati completamente diversi. Pertanto, è importante determinare i lati rivolti (ad esempio, citoplasmatica o lumen-facing) del N-terminus o C-terminus delle proteine localizzate in membrana. Ciò garantisce che sia possibile ottenere il proteoma prossimale previsto della proteina bersaglio.
Sebbene PL presenti diversi vantaggi rispetto agli approcci IP-MS tradizionali per il rilevamento di IPP transitori o deboli, presenta limitazioni intrinseche. In primo luogo, l'identificazione di proteine di interazione candidata non implica immediatamente un'interazione diretta o indiretta con la proteina esca, ma riflette solo la vicinanza2. Pertanto, i saggi indipendenti in vivo (cioè la co-immunoprecipitazioni, il complemento alla fluorescenza bimolecolare [BiFC] o il test GST-pull down in vitro) possono essere effettuati per verificare ulteriormente gli IPP.
In secondo luogo, falsi negativi o falsi positivi possono derivare dal saggio PL a causa di vari motivi. Ad esempio, falsi negativi possono verificarsi quando la proteina priva di ammine primarie accessibili. Inoltre, studi recenti sugli interreattori BIN2 negli impianti hanno evidenziato una parziale sovrapposizione tra i dati di due esperimenti13, indicando l'esistenza di falsi risultati negativi a causa di una copertura inadeguata delle SM. Alcuni interactriani della proteina bersaglio possono anche essere debolmente biotinylati dal controllo fuso turboiide, con conseguente arricchimento di piega al di sotto della soglia di taglio e alla fine la perdita di alcuni veri interreattori13,14. Pertanto, è necessario impostare un numero sufficiente di repliche biologiche con controlli appropriati e valori limite per ridurre al minimo il numero di falsi negativi11,14.
Inoltre, un lungo periodo di trattamento della biotina può aumentare la biotinylazione di proteine non specifiche, con conseguente falsi positivi10. Pertanto, è importante ottimizzare le finestre temporali di etichettatura in vivo per ridurre la biotinylazione non specifica, pur non influenzando la produzione di proteine biotinylate per l'analisi11,12,13,14. Inoltre, si raccomanda di estrazione dura e condizioni di lavaggio rigorose per ridurre i falsi positivi derivati dal legame non specifico di proteine alle perline17. Oltre alle avvertenze sopra descritte, la progettazione di un adeguato controllo negativo è fondamentale per distinguere i veri interactiani dai falsi interactiani ed evitare di perdere i veri interactiani11,12,13,14.
TurboID ha mostrato un'etichettatura molto migliorata rispetto a quella del BioID10,,11. Tuttavia, questo può anche portare a uno sfondo più elevato durante l'analisi PL. Pertanto, devono essere inclusi controlli appropriati per eliminare i segnali di sfondo. Abbiamo usato il TurboID citrino-fuso in questo protocollo11, e un controllo simile è stato utilizzato negli studi precedenti18. Per le proteine bersaglio che si localizzano in una membrana di organello specifica, TurboID fondendo con un peptide di segnale che si rivolge la stessa membrana di organello rende un controllo migliore di TurboID fingendo con uno che si esprime nel citoplasma14.
Inoltre, se sono note informazioni sul dominio chiave o sugli amminoacidi nella proteina bersaglio che determinano le sue interazioni con altri partner, fondere il TurboID con una proteina bersaglio con una mutazione nel dominio chiave o negli aminoacidi dovrebbe essere il miglior controllo e ridurrà al massimo i segnali di fondo generati dalla proteina bersaglio. Inoltre, gli enzimi TurboID richiedono temperature specifiche e condizioni di pH adeguate. Per la maggior parte degli organelli nella cellula come il ER, il nucleo e i mitocondri, TurboID ha etichettato con successo le proteine prossimali10. Tuttavia, alcuni organelli speciali (cioè vacuoli nelle cellule vegetali, il cui pH è molto basso19)potrebbero non essere adatti per studiare IPP utilizzando l'approccio PL. Inoltre, i cambiamenti nei livelli di pH o negli stati di riduzione dell'ossidazione dell'ambiente subcellulare durante la risposta allo stress possono influire sull'efficienza dell'etichettatura del TurboID.
In sintesi, il protocollo qui descritto fornisce la base per studiare gli IPP utilizzando TurboID in N. benthamiana, un sistema vegetale modello che è stato ampiamente utilizzato in molti aspetti della biologia vegetale20. Con gli studi PL basati su TurboID recentemente descritti nelle piante arabidopsis e le radici pelose di pomodoro12,13,14, si prevede che questo metodo diventerà applicabile ad altre specie vegetali. Si prevede che pl basato su TurboID svolgerà un ruolo importante nello studio degli IPP nella ricerca sulla biologia vegetale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Transgenic Science and Technology Program (2019-X08010-003 a Y.z.), della National Natural Science Foundation of China (31872637 a Y.z.) e dei Fondi di Ricerca Fondamentali per le Università Centrali (da 2019TC028 a Y.E.) e della NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 e NIH-GM132582-01 a S.P.D.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
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