Summary
Descrito aqui é um método de rotulagem de proximidade para identificação de parceiros de interação do domínio TIR do receptor imunológico NLR no tecido da folha Nicotiana benthamiana. Também é fornecido um protocolo detalhado para a identificação de interações entre outras proteínas de interesse utilizando essa técnica em Nicotiana e outras espécies vegetais.
Abstract
Técnicas de rotulagem de proximidade (PL) utilizando ascorbate peroxidase (APEX) ou Escherichia coli biotin ligase BirA (conhecida como BioID) têm sido usadas com sucesso para identificação de interações proteína-proteína (PPIs) em células de mamíferos. No entanto, os requisitos de peróxido de hidrogênio tóxico (H2O2) em PL baseado em APEX, maior tempo de incubação com biotina (16-24 h) e maior temperatura de incubação (37 °C) em PL baseado em BioID limitam severamente suas aplicações em plantas. O PL baseado em TurboID recentemente descrito aborda muitas limitações do BioID e do APEX. TurboID permite rotulagem rápida de proximidade de proteínas em apenas 10 min sob condições de temperatura ambiente (RT). Embora a utilidade do TurboID tenha sido demonstrada em modelos animais, recentemente mostramos que o PL baseado em TurboID tem melhor desempenho em plantas em comparação com o BioID para rotulagem de proteínas que são proximais a uma proteína de interesse. Desde que aqui esteja um protocolo passo-a-passo para a identificação de parceiros de interação proteica usando o domínio n-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) da família de proteínas de nucleotídeo-binding leucina-rich repeat (NLR) como modelo. O método descreve construção vetorial, agroinfiltração de construtos de expressão proteica, tratamento de biotina, extração e dessalização de proteínas, quantificação e enriquecimento das proteínas biotinylated por purificação de afinidade. O protocolo descrito aqui pode ser facilmente adaptado para estudar outras proteínas de interesse em Nicotiana e outras espécies vegetais.
Introduction
Os PPIs são a base de vários processos celulares. Os métodos tradicionais de identificação de PPIs incluem triagem de leveduras-dois híbridos (Y2H) e imunoprecipitação juntamente com espectrometria de massa (IP-MS)1. No entanto, ambos sofrem de algumas desvantagens. Por exemplo, a triagem Y2H requer a disponibilidade da biblioteca Y2H da espécie de planta-alvo ou animal. A construção dessas bibliotecas é trabalhosa e cara. Além disso, a abordagem Y2H é realizada na levedura heteróloga do organismo eucaótico unicelular, que pode não representar o status celular de células eucaóticas mais altas.
Em contraste, o IP-MS mostra baixa eficiência na captura de PPIs transitórios ou fracos, e também é inadequado para aquelas proteínas com baixa abundância ou alta hidrofobicidade. Muitas proteínas importantes envolvidas nas vias de sinalização vegetal, como quinases semelhantes a receptores (RLKs) ou a família NLR de receptores imunológicos são expressas em níveis baixos e frequentemente interagem com outras proteínas transitoriamente. Por isso, restringe muito a compreensão dos mecanismos subjacentes à regulação dessas proteínas.
Recentemente, métodos de rotulagem de proximidade (PL) baseados em ascorbate peroxidase (APEX) e um mutante Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (conhecido como BioID) foram desenvolvidos e utilizados para o estudo de PPIs2,3,4. O princípio da PL é que uma proteína de interesse alvo é fundida com uma enzima, que catalisa a formação de biotinyl-AMP labile (bio-AMP). Estes bio-AMP livres são liberados por enzimas PL e difusos para a proximidade da proteína alvo, permitindo a biotinylação de proteínas proximais nas aminas primárias dentro de um raio estimado de 10 nm5.
Essa abordagem tem vantagens significativas em relação às abordagens tradicionais Y2H e IP-MS, como a capacidade de capturar PPIs transitórios ou fracos. Além disso, o PL permite a rotulagem de proteínas proximais da proteína alvo em seus ambientes celulares nativos. Diferentes enzimas PL têm desvantagens únicas ao aplicá-las em diferentes sistemas. Por exemplo, embora a APEX ofereça cinética de marcação mais alta em comparação com o BioID e seja aplicada com sucesso em sistemas de mamíferos, a exigência de peróxido de hidrogênio tóxico (H2O2) nesta abordagem torna-o inadequado para estudos de PL em plantas.
Em contraste, o PL baseado em BioID evita o uso do Tóxico H2O2, mas a taxa de rotulagem é lenta (exigindo 18-24 h para completar a biotinylação), tornando assim a captura de PPIs transitórios menos eficiente. Além disso, a maior temperatura de incubação (37 °C) necessária para um PL eficiente pelo BioID introduz estresse externo a alguns organismos, como plantas4. Portanto, a implantação limitada de PL baseado em BioID em plantas (ou seja, protoplastos de arroz, Arabidopsis e N. benthamiana) foi relatada6,7,8,9. A enzima TurboID recentemente descrita supera as deficiências do PL. Turbo. TurboID, baseado em APEX e BioID, mostrou alta atividade que permite a realização de PL dentro de 10 min na RT10. O PL baseado em TurboID foi aplicado com sucesso em células, moscas e vermes10. Recentemente, nós e outros grupos de pesquisa otimizamos e ampliamos independentemente o uso de PL baseado em TurboID para estudar PPIs em diferentes sistemas vegetais, incluindo plantas n. benthamiana e arabidopsis e raízes peludas de tomate11,12,13,14. Análises comparativas indicaram que o TurboID tem melhor desempenho para pl em plantas em comparação com o BioID11,14. Também demonstrou a robustez do PL baseado em TurboID na planta, identificando uma série de novas interações com um receptor imunológico NLR11, uma proteína cujos parceiros de interação são geralmente difíceis de obter usando métodos tradicionais.
Este protocolo ilustra o PL baseado em TurboID na planta, descrevendo a identificação de proteínas de interação do domínio N-terminal TIR do receptor imunológico NLR em plantas n. benthamiana. O método pode ser estendido a quaisquer proteínas de interesse em N. benthamiana. Mais importante, fornece uma referência importante para investigar PPIs em outras espécies vegetais, como Arabidopsis,tomate e outras.
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Protocol
NOTA: Uma visão geral do método é mostrada na Figura 1.
1. Preparação do material vegetal
- Cultivar sementes N. benthamiana em solo úmido em alta densidade e mantê-las em uma câmara climática com uma luz de 16 horas (cerca de 75 μmol/m2s) e 8 h de fotoperíodo escuro a 23-25 °C.
- Cerca de 1 semana depois, transfira cuidadosamente cada muda jovem para potes de 4' x 4' e mantenha as mudas na mesma câmara.
- Manter as plantas na câmara por cerca de 4 semanas até que elas cresçam para um estágio de folha de 4-8 para a posterior agroinfiltração15.
2. Construção de fusões TurboID
- Use a técnica padrão de clonagem molecular para gerar fusão da proteína alvo com TurboID (PCR TurboID da Addgene plasmid #107177). Aqui, usamos o domínio TIR n-terminal do receptor imunológico NLR como a proteína de interesse alvo e construído TIR fundido ao TurboID sob o controle do vírus do mosaico de couve-flor 35S promotor (p35S::TIR-TurboID).
NOTA: A fusão da enzima TurboID ao carboxil-terminus ou amino-terminus da proteína-alvo dependerá da proteína de interesse. Normalmente, para uma proteína citoplasmática, ambos os termini devem ser aceitáveis, desde que a fusão TurboID não afete a função da proteína alvo. No entanto, para uma proteína localizada em membrana, a topologia proteica deve ser caracterizada com antecedência antes de determinar qual terminus é melhor para a fusão TurboID. - Construa uma citermina fundida com TurboID sob o mesmo promotor para servir como controle para análise proteômica quantitativa subseqüente.
NOTA: É importante construir um controle TurboID para identificar o proteome proximal à proteína alvo. O controle de fusão TurboID deve mostrar um nível de expressão semelhante ao da proteína alvo fundida com TurboID. Isso pode ser determinado empiricamente ajustando a concentração de Agrobacterium durante a agroinfiltração. Além disso, é importante que a proteína de controle tenha um padrão de localização subcelular semelhante ao da proteína de interesse alvo.
3. Agroinfiltração
- Transformação dos plasmídeos para Agrobacterium
- Adicionar 0,5 μg dos plasmídeos gerados das etapas 2.1 e 2.2 a 50 μL da cepa Agrobacterium tumefaciens GV3101, preparadas como descrito anteriormente16.
NOTA: Outras cepas de Agrobacterium, como o GV2260, também podem ser utilizadas. - Incubar no gelo por 30 min.
- Choque térmico em banho-maria a 42 °C por 60 s.
- Adicione 400 μL de meio LB (tripptone de 10 g/L, 5 g/l de levedura e 10 g/L NaCl; pH = 7,0) ao Agrobacterium e incubar a 28 °C por 90 min.
- Emplacasse todo o teor no tubo no ágar LB suplementado com antibióticos apropriados para selecionar o plasmídeo, bem como para o Agrobacterium (para GV3101: 50 mg/L gentamicina e 50 mg/L rifampicina).
- Incubar placas a 28 °C por 36-48 h até que as colônias individuais sejam visíveis.
- Adicionar 0,5 μg dos plasmídeos gerados das etapas 2.1 e 2.2 a 50 μL da cepa Agrobacterium tumefaciens GV3101, preparadas como descrito anteriormente16.
- Escolha e estique várias colônias individuais em uma placa de ágar LB fresco com antibióticos (ver passo 3.1.5) e cresça a 28 °C durante a noite.
NOTA: É mais ideal realizar a pcr colônia para confirmar a presença da construção binária específica no Agrobacterium. Em nossa experiência, mais de 95% das colônias contêm as construções binárias introduzidas. - Inocula3 mL de meio LB mais antibióticos apropriados (ver passo 3.1.4) com colônia Agrobacterium abrigando a construção de interesse, e incuba ndo agitando durante a noite a 28 °C até que o OD600 da cultura Agrobacterium atinja 2.0.
- Centrifugar as células a 3.000 x g e resuspendê-las para OD600 = 1,0 em tampão de agroinfiltração (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH = 5,6], 250 μM acetosyringone).
NOTA: Embora seja ideal incubar o inóculo por 2 h no RT antes da agroinfiltração, em nossa experiência com a cepa GV3101, não houve grande diferença entre a expressão proteica alvo com vs. sem incubação. - Use uma seringa sem agulha de 1 mL para infiltrar o inóculo na epiderme (abaxial) das folhas n. benthamiana totalmente maduras.
NOTA: Para preparar uma quantidade suficiente de materiais de folha para três réplicas biológicas: uma folha inteira é geralmente infiltrada, três folhas são infiltradas por planta, e três a quatro plantas são usadas para cada construção. Para cada folha, 1,5-2,0 mL de agrobactérias resuspensas é suficiente. - Após 36 h de pós-infiltração (hpi), infiltrar-se em biotina de 200 μM (na solução MgCl2 de 10 mM) nas folhas pré-infiltradas com construções TurboID.
- Mantenha a planta por 3-12 h adicionais antes de colher o tecido da folha conforme descrito na seção 4.
NOTA: A razão para escolher os 36 hpi para infiltração de biotina é que a expressão proteica alvo atinge picos neste ponto de tempo de acordo com estudos anteriores11. É aconselhável determinar o tempo necessário para a expressão ideal da proteína de interesse alvo. O tempo de incubação da infiltração pós-biotina depende do projeto experimental e da proteína alvo em estudo. Normalmente, 3-12 h de tratamento com biotina permite a rotulagem da maioria das proteínas proximais à proteína alvo pelas fusões TurboID.
4. Coleta de amostras de folhas
NOTA: Para posterior processamento das amostras de folhas, use luvas estéreis para evitar a contaminação da queratina das amostras. Todos os reagentes também devem ser o mais livre de queratina possível.
- Corte as folhas infiltradas na base do petiole, remova a veia da folha e congele o tecido da folha em nitrogênio líquido.
- Triture o tecido da folha usando um pilão e argamassa e armazene o pó de folha em tubos de falcão de 15 mL ou 50 mL a -80 °C para uso subsequente.
NOTA: Leve de três a quatro pedaços de folhas para cada uma das três réplicas biológicas de diferentes plantas. O protocolo pode ser pausado aqui. Antes das etapas subseqüentes, recomenda-se avaliar a expressão proteica e a biotinylação da proteína alvo por meio de análises de imunoblot. As manchas ocidentais típicas são mostradas na Figura 2.
5. Extração de proteína total da folha
- Transfira cerca de 0,35 g de pó de folha para um tubo de 2 mL. Prepare dois tubos para cada amostra.
ATENÇÃO: Use luvas ao tocar em qualquer objeto resfriado por nitrogênio líquido. - Adicionar 700 μL de tampão de lyse RIPA (50 mM Tris-HCl [pH = 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0,5% de desoxicoto de sódio [w/v], 1 mM DTT, 1 comprimido de coquetel inibidor de protease) a 0,35 g de pó de folha.
- Vórtice os tubos por 10 min.
- Deixe as amostras no gelo por 30 min.
- Misture o conteúdo a cada 4-5 minutos, virando os tubos de cabeça para baixo várias vezes.
6. Remoção da biotina livre por dessalela
NOTA: Esta seção leva cerca de 50 min.
- Equilibre a coluna de salgadinho.
- Remova o selador na parte inferior da coluna de dessalela e coloque a coluna em um tubo de 50 mL.
- Remova a solução de armazenamento por centrifugação a 1000 x g e 4 °C por 2 min e certifique-se de que a tampa está solta.
- Coloque a coluna de dessalela em um tubo de 50 mL. Equilibre a coluna 3x com 5 mL de tampão de lysis RIPA, cada vez centrifugando a 1000 x g e 4 °C por 2 min e descartando o fluxo.
- Transfira a coluna de desalsão para um novo tubo de 50 mL e armazene temporariamente a 4 °C para uso subsequente.
- Gire os tubos do passo 5.4 a 16.500 x g e 4 °C por 10 min e transfira o sobrenadante dos dois tubos para um novo tubo de 2 mL.
- Adicionar 1.500 μL de extrato proteico ao topo da resina da coluna de seladura equilibrada (a partir do passo 6.1.4). Quando o extrato de proteína entrar na resina, adicione mais 100 μL de tampão de lyse RIPA.
NOTA: Embora 1.400 μL de tampão de lyse RIPA tenha sido utilizado para extração de proteínas das folhas, o volume total após a extração e dessaling da proteína foi invariavelmente aumentado em certa medida em relação ao volume original. Portanto, uma combinação das amostras de cada grupo conforme descrito nas etapas 5.1 e 5.4 pode resultar em pelo menos 1.500 μL de extrato de proteína por amostra. - Centrifugação a 1000 x g e 4 °C por 2 min e deixe as amostras salgadas no gelo temporariamente.
7. Quantificação dos extratos de proteína selada usando um ensaio de Bradford
- Preparar 50 μL de cada solução BSA gradiente: 0 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL e 1 mg/mL.
- Diluir o extrato de proteína dessacou misturando uma amostra de 5 μL com 45 μL de ddH2O.
- Prepare 1x regente bradford diluindo o regente 5x Bradford (100 mg de Coomassie brilhante azul G250, 47 mL de metanol, 100 mL de 85% de ácido fosfórico, 53 mL de ddH2O).
- Adicione 50 μL de cada solução BSA gradiente e 50 μL de extrato de proteína diluído ao 2,5 mL de 1x regente bradford.
- Incubar no RT por 10 min.
- Adicione 200 μL de solução de cada amostra a um poço de uma placa ELISA (três réplicas técnicas por amostra).
- Meça o OD595 usando um leitor de microplacas.
- Desenhe a curva padrão com base no valor da solução BSA gradiente e calcule a concentração das amostras de proteína selada. Normalmente, a concentração total de proteínas obtida de 0,7 g de folhas varia de 3-6 mg/mL.
- Prepare 6-8 mg de extrato de proteína dessalgado para posterior purificação de afinidade.
8. Enriquecimento de proteínas biotinyladas
- Pegue 200 μL de contas magnéticas conjugadas com Streptavidn-C1 em um tubo de 2 mL.
- Equilibre as contas magnéticas conjugadas streptavidn-C1 com 1 mL de tampão de lyse RIPA por 1 min em RT.
- Após cada lavagem, use o rack magnético para adsorvar as contas por 3 min e remova suavemente a solução por pipetting.
- Repita as etapas 8.2 e 8.3.
- Transfira o extrato de proteína dessalgado para as contas magnéticas conjugadas com streptavidn-C1 equilibradas.
- Incubar o tubo a 4 °C durante 12 horas (ou durante a noite) em um rotor para purificar a afinidade das proteínas biotinylated.
- Capture as contas em um rack magnético por 4 min em RT até que as contas se recolquem em um lado do tubo, em seguida, remova suavemente o sobrenadante por pipeta.
- Adicione 1,7 mL de tampão de lavagem I (2% SDS em água) ao tubo e mantenha-o no rotor em RT por 8 min. Repita o passo 8.3.
- Adicionar 1,7 mL de tampão de lavagem II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% ácido desoxicoxicolico [w/v], 1% Triton X-100) no tubo e mantê-lo no rotor em RT por 8 min. Repita o passo 8.3.
- Adicionar 1,7 mL de tampão de lavagem III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% ácido desoxico [w/v], 1% NP40 [v/v]) no tubo e mantê-lo no rotor em RT por 8 min. Repita o passo 8.3.
- Adicione 1,7 mL de 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) para remover o detergente e repita o passo 8.3.
- Transfira as contas para um novo tubo de 1,5 mL e repita as etapas 8.11 e 8.3.
- Lave as contas 6x por 5 min cada com tampão de bicarbonato de amônio de 50 mM no RT.
- Adicione 1 mL de 50 mM tampão de bicarbonato de amônio às contas magnéticas e misture bem.
- Remova 100 μL de contas para análise de imunoblot para confirmar o enriquecimento de proteínas biotinyladas. Uma mancha típica ocidental é mostrada na Figura 3.
- Congele o resto das amostras de proteínas e armazenada a -80 °C ou envie-as imediatamente para análise de LC-MS/MS em gelo seco.
NOTA: Os resultados típicos de MS são exibidos em uma publicação anterior (Zhang et al. 2019; Figura 2, Dados Suplementares 1 e Dados Suplementares 2)11. Todos os conjuntos de dados estão disponíveis no MassIVE (encontrado em
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Representative Results
Os dados representativos, que ilustram os resultados esperados com base no protocolo descrito, são adaptados de Zhang et al11. A Figura 1 resume os procedimentos para a realização de PL baseado em TurboID em N. benthamiana. A Figura 2 mostra a expressão proteica e biotinylation nas folhas de N. benthamiana infiltradas. A Figura 3 mostra que as proteínas biotinyladas nas folhas infiltradas foram eficientemente enriquecidas para posterior análise de espectrometria de massa. Deve-se notar que após o enriquecimento das proteínas biotinylated utilizando contas magnéticas conjugadas streptavidn-C1, diferentes proteínas com tamanhos variados foram capturadas, e a análise das manchas ocidentais das proteínas enriquecidas mostrou bandas manchadas(Figura 3). Observações semelhantes foram feitas em vários estudos publicados recentemente6,,7,,13,,14.
Figura 1: Visão geral do método PL baseado em TurboID em N. benthamiana. Agrobacterium que abrigava as construções de fusão TurboID foram infiltrados em folhas de N. benthamiana. 36 h pós-infiltração, 200 μM biotina é infiltrada nas mesmas folhas para iniciar a biotinylation das proteínas endógenas que são proximais à proteína alvo fundida por TurboID. As plantas infiltradas são então incubadas em RT por 3-12 horas, seguidas pela colheita de folhas e moagem em nitrogênio líquido. O pó de folha é lysed no tampão de lyse RIPA, e uma coluna de dessalsão é empregada para remover a biotina livre no extrato de proteína. As proteínas biotinylated foram então purificadas por afinidade com contas conjugadas com streptavidin e identificadas por espectrometria de massa. Esta figura é adaptada da Figura Suplementar 3 de Zhang et al11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise imunoblota de extratos proteicos obtidos na etapa 4.2. (A) Análise da mancha ocidental de proteínas extraídas das folhas agroinfiltradas com anticorpos contra a etiqueta HA. (B) Análise das manchas ocidentais de proteínas biotinylated nas folhas agroinfiltradas com streptavidin-HRP. Esta figura é adaptada da Figura Suplementar 6B de Zhang et al11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de manchas ocidentais de contas obtidas na etapa 8.15 para confirmar o enriquecimento de proteínas biotinyladas. Para cada construção, há três réplicas independentes (1, 2 e 3). Streptavidin-HRP foi utilizado para análise de proteínas biotinyladas em diferentes amostras. Esta figura é adaptada da Figura Suplementar 7 de Zhang et al11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A ligase de biotina TurboID é gerada pela evolução direcionada baseada em levedura do BioID10. Tem muitas vantagens sobre outras enzimas PL. TurboID permite a aplicação de PL em outros sistemas modelo, incluindo moscas e vermes, cuja temperatura de crescimento ideal é de cerca de 25 °C10. Embora a abordagem pl tenha sido amplamente utilizada em sistemas animais, sua aplicação em plantas é limitada. O protocolo descrito aqui fornece um procedimento passo-a-passo para estabelecer o PL baseado em TurboID em N. benthamiana, uma planta modelo que tem sido amplamente utilizada em estudos de interação plantas-patógenos. Este protocolo descreve a preparação da amostra de folhas, a remoção da biotina livre, a quantificação das proteínas extraídas e o enriquecimento das proteínas biotinylated.
Embora a biotina livre em sistemas de cultura de células animais possa ser em grande parte removida lavando as células com tampão PBS4, a biotina livre no tecido da folha não pode ser limpa por simples lavagem. Um estudo recente indicou que a biotina livre pode afetar severamente o enriquecimento subseqüente das proteínas biotinylated11. Neste protocolo, uma coluna de dessaling é utilizada para remover com sucesso a biotina livre nos extratos proteicos, permitindo a eficiente ligação de proteínas biotinyladas às contas de streptavidin.
Além disso, este protocolo serve como uma importante referência para a condução do PL em outros sistemas de plantas. Recentemente, três relatórios usaram PL baseado em TurboID em Arabidopsis12,13,14 e raiz peluda de tomate12, além da N. benthamiana descrita aqui. Semelhante aos sistemas de cultura de células animais, a remoção da biotina livre foi obtida pela lavagem dos protoplastos vegetais antes da extração de proteínas6. No entanto, quantidades menores de moléculas de biotina livre que não estavam integradas à proteína existiam no interior da célula, o que impactou a eficiência do enriquecimento subsequente das proteínas biotinyladas. Portanto, recomenda-se um procedimento de dessalsão para a remoção completa da biotina livre, aumentando assim a eficiência de recuperação de proteínas biotinyladas.
Dois tipos de colunas, PD-10 e Zeba, foram utilizadas para remoção gratuita debiotinas 11,12,,13,,14. Pode ser interessante no futuro comparar a eficiência dessas duas colunas na remoção da biotina livre em extratos de proteína folha. Além disso, este protocolo emprega um método de agroinfiltração mediado por seringas canônicas para expressar transitóriamente a proteína de interesse alvo nas folhas de N. benthamiana. Em seguida, o substrato de biotina é reinfiltrado nas folhas para rotular proteínas que são proximais à proteína alvo. Operações semelhantes também foram utilizadas em outros dois estudos recentementerelatados 12,13. Como método alternativo, a infiltração mediada a vácuo da biotina é aplicável tanto para N. benthamiana quanto para Arabidopsis14. Além disso, em plantas que não são adequadas para a agroinfiltração, as culturas celulares podem ser transformadas para a expressão proteica alvo, seguidas do tratamento de biotina e do ensaio de rotulagem de proximidade12. Esses estudos recentes têm sustentado a robustez do PL baseado em TurboID no estudo de PPIs e estabeleceram as bases para futuras aplicações de PL baseado em TurboID em diferentes espécies de plantas.
Neste protocolo, a expressão transitória bem estabelecida agrobacteriumem N. benthamiana é empregada para identificar PPIs da proteína de interesse alvo. A expressão transitória pode levar à superexpressão das proteínas de fusão. Portanto, uma alternativa mais ideal é projetar a fusão TurboID sob o controle de um promotor nativo e expressá-la por agroinfiltração ou geração de linhas transgênicas estáveis. Com o desenvolvimento da tecnologia de edição de genomas, também é possível derrubar o fragmento TurboID diretamente no loci genômico nativo de genes de interesse.
Outro fator importante a ser considerado é garantir que a fusão TurboID não altere a função da proteína alvo de interesse. Em um estudo anterior, a função do receptor imunológico NLR fundido ao TurboID foi confirmada testando sua capacidade de induzir a morte celular mediada pela defesa na presença do vírus do mosaico de tabaco p50 effector11. TurboID é relativamente maior (ou seja, 35 kDa) do que GFP, e sua fusão a uma proteína alvo pode afetar a função de uma proteína alvo. Nesses casos, o miniTurboID10 menor pode ser usado.
Também é importante determinar qual terminal da proteína alvo é adequado para fundir com TurboID. Uma abordagem geral para tais testes funcionais é determinar se a fusão TurboID irá complementar a linha de plantas mutantes do gene alvo. Alternativamente, a análise da interação da fusão TurboID com um parceiro de interação previamente conhecido da proteína alvo pode ser utilizada. Na maioria dos casos, para proteínas citoplasmáticas, a marcação n-terminal ou terminal C do TurboID pode produzir conjuntos de dados comparáveis na análise subsequente da espectrometria de massa. No entanto, para proteínas localizadas em membrana, é importante determinar a topologia antes da construção de vetores. Caso contrário, a fusão de TurboID a montante ou a jusante da seqüência de codificação de genes de interesse gerará resultados completamente diferentes. Portanto, é importante determinar os lados voltados (por exemplo, citoplasmáticos ou voltados para lúmen) do N-terminus ou C-terminus das proteínas localizadas em membrana. Isso garante que o proteome proximal esperado da proteína alvo possa ser obtido.
Embora o PL tenha várias vantagens sobre as abordagens tradicionais do IP-MS para detectar PPIs transitórios ou fracos, ele tem suas próprias limitações intrínsecas. Em primeiro lugar, a identificação de proteínas de interação do candidato não implica imediatamente uma interação direta ou indireta com a proteína da isca, mas reflete apenas a proximidade2. Portanto, ensaios in vivo independentes (ou seja, co-imunoprecipitação, complementação de fluorescência bimolecular [BiFC], ou ensaio in vitro GST-pull down) podem ser realizados para verificar ainda mais os PPIs.
Em segundo lugar, falsos negativos ou falsos positivos podem surgir do ensaio pl devido a várias razões. Por exemplo, falsos negativos podem ocorrer quando a proteína não tem aminas primárias acessíveis. Além disso, estudos recentes de interatores bin2 em plantas mostraram uma sobreposição parcial entre dados de dois experimentos13, indicando a existência de resultados falsos negativos devido à cobertura inadequada de ESM. Alguns interatores da proteína alvo também podem ser fracamente biotinyados pelo controle fundido por TurboID, resultando em um enriquecimento dobrável abaixo do limiar de corte e,eventualmente,a perda de alguns verdadeiros interatores13,14. Portanto, devem ser definidas réplicas biológicas suficientes com controles adequados e valores de corte para minimizar o número de falsos negativos11,14.
Além disso, um longo período de tratamento da biotina pode aumentar a biotinylação de proteínas não específicas, resultando em falsos positivos10. Por isso, é importante otimizar as janelas de tempo de rotulagem in vivo para reduzir a biotinylação não específica, ao mesmo tempo em que não afeta a produção de proteínas biotinyladas para análise11,,12,,13,14. Além disso, recomenda-se a extração severa e as condições rigorosas de lavagem para reduzir os falsos positivos derivados da vinculação inespecífica das proteínas às contas17. Além das ressalvas descritas acima, o desenho de um controle negativo adequado é crucial para distinguir verdadeiros interatores de falsos interatores e evitar a falta de verdadeiros interatores11,12,13,14.
TurboID mostrou uma rotulagem cinética muito melhor em comparação com a do BioID10,11. No entanto, isso também pode levar a um maior histórico durante a análise do PL. Portanto, devem ser incluídos controles apropriados para eliminar os sinais de fundo. Utilizamos o TurboID fundido com citermina neste protocolo11, e um controle semelhante foi utilizado em estudos anteriores18. Para as proteínas-alvo que se localizam a uma membrana organela específica, a fusão turboid com um peptídeo de sinal que visa a mesma membrana organela faz um melhor controle do que a fusão TurboID com uma que é expressa no citoplasma14.
Além disso, se as informações sobre o domínio-chave ou aminoácidos na proteína-alvo que determinam suas interações com outros parceiros são conhecidas, fundir o TurboID com uma proteína alvo com uma mutação no domínio-chave ou aminoácidos deve ser o melhor controle e reduzirá ao máximo os sinais de fundo gerados pela proteína alvo. Além disso, as enzimas TurboID requerem temperaturas específicas, bem como condições adequadas de pH. Para a maioria das organelas na célula, como o ER, núcleo e mitocôndrias, turboid rotulado com sucesso as proteínas proximais10. No entanto, algumas organelas especiais (ou seja, vacúolos em células vegetais, cujo pH é muito baixo19) podem não ser adequados para estudar PPIs usando a abordagem pl. Além disso, alterações nos níveis de pH ou estados de redução de oxidação do ambiente subcelular durante a resposta ao estresse podem afetar a eficiência de rotulagem do TurboID.
Em resumo, o protocolo descrito aqui fornece a base para investigar os PPIs usando TurboID em N. benthamiana, um sistema de planta modelo que tem sido amplamente utilizado em muitos aspectos da biologia vegetal20. Com os estudos pl baseados em TurboID recentemente descritos em plantas arabidopsis e raízes peludas de tomate12,13,14, espera-se que este método se torne aplicável a outras espécies vegetais. Prevê-se que o PL baseado em TurboID terá um papel importante no estudo de PPIs na pesquisa de biologia vegetal.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de Ciência e Tecnologia Transgênica (2019ZX08010-003 para Y.Z.), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31872637 para Y.Z.), e dos Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (2019TC028 a Y.Z.), e NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 e NIH-GM132582-01 para S.P.D.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
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