Summary
وصفها هنا هو طريقة وضع العلامات القرب لتحديد شركاء التفاعل من مجال النقل البري الدولي من مستقبلات المناعة NLR في أنسجة أوراق نيكوتيانا بنتاميانا. كما يتم توفير بروتوكول مفصل لتحديد التفاعلات بين البروتينات الأخرى ذات الأهمية باستخدام هذه التقنية في نيكوتيانا والأنواع النباتية الأخرى.
Abstract
تقنيات وضع العلامات القرب (PL) باستخدام هندسة أسكوربات بيروكسيديز (APEX) أو Escherichia coli biotin biotin ligase Bira (المعروفة باسم BioID) وقد استخدمت بنجاح لتحديد التفاعلات البروتين والبروتين (PPIs) في خلايا الثدييات. ومع ذلك ، فإن متطلبات بيروكسيد الهيدروجين السام (H2O2)في PL المستندة إلى APEX ، ووقت الحضانة الأطول مع البيوتين (16-24 ساعة) ، ودرجة حرارة الحضانة الأعلى (37 درجة مئوية) في PL المستندة إلى BioID تحد بشدة من تطبيقاتها في النباتات. وPL التي وصفت مؤخرا TurboID المستندة إلى العديد من القيود من BioID وAPEX. يسمح TurboID بوضع علامات سريعة على قرب البروتينات في 10 دقيقة فقط تحت ظروف درجة حرارة الغرفة (RT). على الرغم من أن فائدة TurboID قد ثبت في النماذج الحيوانية، أظهرنا مؤخرا أن PL المستندة إلى TurboID يؤدي بشكل أفضل في النباتات مقارنة بـ BioID لوضع العلامات من البروتينات التي هي قريبة من البروتين من الفائدة. يقدم هنا بروتوكول خطوة بخطوة لتحديد شركاء التفاعل البروتين باستخدام N-محطة تول / interleukin-1 مستقبلات المجال (TIR) من النيوكليوتيدات ملزمة leucine الغنية مكرر الأسرة (NLR) البروتين كنموذج. تصف الطريقة بناء النواقل ، والتسلل الزراعي لبنيات التعبير البروتينية ، وعلاج البيوتين ، واستخراج البروتين وإزالة الملح ، والكم ، وإثراء البروتينات المتناهية الحيوية عن طريق تنقية التقارب. ويمكن تكييف البروتوكول الموصوف هنا بسهولة لدراسة البروتينات الأخرى ذات الأهمية في نيكوتيانا والأنواع النباتية الأخرى.
Introduction
PPIs هي أساس العمليات الخلوية المختلفة. تشمل الطرق التقليدية لتحديد PPIs فحص الخميرة-اثنين الهجين (Y2H) وهطول الامطار المناعية إلى جانب قياس الطيف الكتلي (IP-MS)1. ومع ذلك، يعاني كلاهما من بعض العيوب. فعلى سبيل المثال، يتطلب فحص عام 2حاء توافر مكتبة Y2H للأنواع النباتية أو الحيوانية المستهدفة. إن بناء هذه المكتبات كثيف العمالة ومكلف. وعلاوة على ذلك، يتم تنفيذ نهج Y2H في خميرة الكائن الحي الأوكاريوتيكي أحادي الخلية غير المتجانسة، والتي قد لا تمثل الحالة الخلوية للخلايا الأوكاريوتيكية العليا.
وعلى النقيض من ذلك، فإن IP-MS يظهر كفاءة منخفضة في التقاط مؤشرات أسعار الصفحات العابرة أو الضعيفة، كما أنه غير مناسب لتلك البروتينات ذات الوفرة المنخفضة أو الهيدروفوبية العالية. يتم التعبير عن العديد من البروتينات الهامة المشاركة في مسارات إشارات النبات مثل الكيناز الشبيهة بالمستقبل (RLKs) أو عائلة NLR من مستقبلات المناعة بمستويات منخفضة وغالباً ما تتفاعل مع البروتينات الأخرى بشكل عابر. ولذلك، فإنه يحد إلى حد كبير من فهم الآليات التي تقوم عليها تنظيم هذه البروتينات.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق وضع العلامات القرب (PL) على أساس الايكوربات المهندسة peroxidase (APEX) ومتحولة Escherichia coli biotin الكولاي biraR118G (المعروفة باسم BioID) واستخدامها لدراسة PPIs2،3،4. مبدأ PL هو أن البروتين المستهدف من الفائدة تنصهر مع إنزيم، مما يحفز تشكيل labile biotinyl-AMP (الحيوي AMP). يتم تحرير هذه الحرة الحيوية AMP بواسطة إنزيمات PL وتنتشر إلى محيط البروتين المستهدف، مما يسمح للتفريط الحيوي من البروتينات القريبة في الأمينات الأولية ضمن دائرة نصف قطرها تقدر بـ 10 نانومتر5.
ولهذا النهج مزايا كبيرة على النهجالتقليدي لعام 2H وIP-MS، مثل القدرة على التقاط مؤشرات أسعار الصرف الأولي العابرة أو الضعيفة. وعلاوة على ذلك، يسمح PL وضع العلامات من البروتينات القريبة من البروتين المستهدف في بيئاتها الخلوية الأصلية. الإنزيمات PL مختلفة لها عيوب فريدة عند تطبيقها على أنظمة مختلفة. على سبيل المثال ، على الرغم من أن APEX يقدم حركية علامات أعلى مقارنة بـ BioID ويتم تطبيقه بنجاح في أنظمة الثدييات ، فإن متطلبات بيروكسيد الهيدروجين السام (H2O2)في هذا النهج يجعلها غير مناسبة لدراسات PL في النباتات.
في المقابل ، يتجنب PL المستند إلى BioID استخدام H2O2السام ، ولكن معدل وضع العلامات بطيء (يتطلب 18-24 ساعة لإكمال علم الخلايا الحيوية) ، مما يجعل التقاط مؤشرات أسعار الصفحات العابرة أقل كفاءة. وعلاوة على ذلك، فإن ارتفاع درجة حرارة الحضانة (37 درجة مئوية) اللازمة لكفاءة PL بواسطة BioID يدخل الإجهاد الخارجي لبعض الكائنات الحية، مثل النباتات4. لذلك ، تم الإبلاغ عن نشر محدود من PL المستندة إلى BioID في النباتات (أي نتوءات الأرز وArabidopsis و N. benthamiana) 6و7و8و9. الانزيم TurboID وصفها مؤخرا يتغلب على أوجه القصور من APEX وBioID القائم على PL. TurboID أظهرت نشاط عال يمكن من إنجاز PL في غضون 10 دقيقة في RT10. وقد تم تطبيق PL توربوID المستندة بنجاح في خلايا الثدييات والذباب والديدان10. في الآونة الأخيرة، ونحن وغيرها من مجموعات البحوث بشكل مستقل الأمثل وتوسيع نطاق استخدام PL توربودي المستندة لدراسة PPIs في أنظمة نباتية مختلفة، بما في ذلك N. بنتامانيا والنباتات Arabidopsis والطماطم جذور شعر11،12،13،14. أشارت التحليلات المقارنة إلى أن TurboID يؤدي أداء أفضل لPL في النباتات مقارنة بـ BioID11,14. كما أظهرت متانة PL المستندة إلى TurboID في بلانتا من خلال تحديد عدد من التفاعلات الجديدة مع مستقبلات المناعة NLR11, بروتين يصعب عادة الحصول على شركاء التفاعل باستخدام الطرق التقليدية.
يوضح هذا البروتوكول PL المستندة إلى TurboID في بلانتا من خلال وصف تحديد بروتينات التفاعل في مجال النقل البري الدولي N-terminal لمستقبلات المناعة NLR في نباتات N. benthamiana. ويمكن توسيع هذه الطريقة إلى أي بروتينات ذات أهمية في N. بنثاميانا. والأهم من ذلك، أنه يوفر مرجعا هاما للتحقيق PPIs في الأنواع النباتية الأخرى مثل العربيدوبسيسوالطماطم وغيرها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم عرض نظرة عامة على الأسلوب في الشكل 1.
1. إعداد المواد النباتية
- تنمو N. بنثاميانا البذور في التربة الرطبة بكثافة عالية والحفاظ عليها في غرفة المناخ مع ضوء 16 ساعة (حوالي 75 ميكرومول / م2ث) و 8 ساعة فترة ضوئية مظلمة في 23-25 درجة مئوية.
- حوالي 1 أسبوع في وقت لاحق، ونقل بعناية كل شتلات الشباب إلى 4 '× 4' الأواني والحفاظ على الشتلات في نفس الغرفة.
- الحفاظ على النباتات في الغرفة لمدة 4 أسابيع تقريبا حتى تنمو إلى مرحلة ورقة من 4-8 للتسرب الزراعي اللاحقة15.
2. بناء الانصهار TurboID
- استخدام تقنية الاستنساخ الجزيئي القياسية لتوليد الانصهار من البروتين المستهدف مع TurboID (PCR TurboID من #107177 Addgene plasmid). هنا، استخدمنا مجال النقل البري الدولي N-terminal من مستقبلات المناعة NLR كبروتين الهدف من الفائدة وشيدت TIR تنصهر إلى TurboID تحت سيطرة القرنبيط فيروس الفسيفساء 35S المروج (p35S::TIR-TurboID).
ملاحظة: سوف الانصهار من إنزيم توربوID إلى الريكونولين أو الأمينية terminus من البروتين المستهدف تعتمد على البروتين الفائدة. عادة، للبروتين السيتوبلازمي، ينبغي أن يكون كلا تيرميني مقبولة، طالما أن الانصهار TurboID لا يؤثر على وظيفة البروتين المستهدف. ومع ذلك ، بالنسبة للبروتين المترجمة الغشاء ، يجب وصف طوبولوجيا البروتين مسبقًا قبل تحديد الترصال الأفضل للانصهار TurboID. - بناء السيترين المنصهر ة TurboID تحت نفس المروج لتكون بمثابة السيطرة على التحليل البروتيني الكمي اللاحقة.
ملاحظة: من المهم بناء عنصر تحكم TurboID لتحديد البروتيوم القريب من البروتين المستهدف. يجب أن يظهر عنصر التحكم في الانصهار TurboID مستوى تعبير مشابه لمستوى البروتين المستهدف المنصهر TurboID. ويمكن تحديد ذلك تجريبيا عن طريق تعديل تركيز البكتيريا الزراعية أثناء التسلل الزراعي. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم أن يكون بروتين التحكم نمط توطين تحت الخلية مشابهًا لنمط البروتين المستهدف المهم.
3 - التسلل الزراعي
- تحويل البلازميدات إلى بكتيريا زراعية
- أضف 0.5 ميكروغرام من البلازميدات المتولدة من الخطوتين 2.1 و 2.2 إلى 50 ميكرولتر من الخلايا الزراعية المتوحية من Agrobacterium سلالة GV3101 الخلايا المختصة، أعدت على النحو المبين سابقا16.
ملاحظة: يمكن أيضًا استخدام سلالات أخرى من البكتيريا الزراعية، مثل GV2260. - التأنيعلى الثلج لمدة 30 دقيقة.
- صدمة الحرارة في حمام مائي في 42 درجة مئوية لمدة 60 s.
- أضف 400 ميكرولتر من LB المتوسطة (10 ز/لتر تريبتون، 5 ز/لتر مستخلص الخميرة، و 10 ز/لتر NaCl؛ درجة الحموضة = 7.0) إلى Agrobacterium واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
- لوحة المحتوى بأكمله في أنبوب على LB أجار تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة لتحديد البلازميد, وكذلك لAgrobacterium (لGV3101: 50 ملغ / لتر gentamicin و 50 ملغ / لتر ريفامبيسين).
- لوحات الحضن في 28 درجة مئوية لمدة 36-48 ساعة حتى المستعمرات الفردية مرئية.
- أضف 0.5 ميكروغرام من البلازميدات المتولدة من الخطوتين 2.1 و 2.2 إلى 50 ميكرولتر من الخلايا الزراعية المتوحية من Agrobacterium سلالة GV3101 الخلايا المختصة، أعدت على النحو المبين سابقا16.
- اختيار وسلسلة العديد من المستعمرات الفردية على لوحة أجار LB الطازجة مع المضادات الحيوية (انظر الخطوة 3.1.5) وتنمو في 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: فمن الأمثل أكثر لأداء PCR مستعمرة لتأكيد وجود بناء ثنائي محددة في Agrobacterium. في تجربتنا, أكثر من 95% من المستعمرات تحتوي على البنى الثنائية المقدمة. - Inoculate 3 مل من LB المتوسطة بالإضافة إلى المضادات الحيوية المناسبة (انظر الخطوة 3.1.4) مع مستعمرة Agrobacterium إيواء بناء الفائدة، واحتضان عن طريق الهز بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية حتى OD600 من ثقافة Agrobacterium تصل إلى 2.0.
- طرد الخلايا في 3000 × ز وإعادة تعليقها إلى OD600 = 1.0 في المخزن المؤقت للتسلل الزراعي (10 mM MgCl2، 10 mM MES [pH = 5.6] ، 250 ميكرومتر acetosyringone).
ملاحظة: على الرغم من أنه من الأمثل لاحتضان التطعيم لمدة 2 ساعة في RT قبل الاختراق الزراعي، في تجربتنا مع سلالة GV3101، لم يكن هناك فرق كبير بين التعبير البروتين المستهدف مع مقابل دون حضانة. - استخدام حقنة 1 مل إبرة لاختراق inoculum في البشرة (abaxial) من أوراق N. بنتامانيانا ناضجة تماما.
ملاحظة: لإعداد كمية كافية من المواد الورقية لثلاث نسخ بيولوجية: عادة ما يتم اختراق ورقة كاملة، ويتم اختراق ثلاث أوراق لكل مصنع، وتستخدم ثلاثة إلى أربعة مصانع لكل بناء. لكل ورقة، 1.5-2.0 مل من البكتيريا الزراعية التي أعيد تعليقها كافية. - After 36 h post-infiltration (hpi), infiltrate 200 μM biotin (in 10 mM MgCl2 solution) into the leaves pre-infiltrated with TurboID constructs.
- الحفاظ على النبات ل3-12 ساعة إضافية قبل حصاد الأنسجة ورقة كما هو موضح في القسم 4.
ملاحظة: السبب في اختيار 36 hpi لتسلل البيوتين هو أن التعبير البروتين المستهدف قمم في هذه النقطة الزمنية وفقا للدراسات السابقة11. ينصح بتحديد الوقت اللازم للتعبير الأمثل عن البروتين المستهدف من الفائدة. يعتمد وقت الحضانة بعد تسرب البيوتين على التصميم التجريبي والبروتين المستهدف قيد الدراسة. عادة، 3-12 ساعة من العلاج البيوتين يسمح وضع العلامات من معظم البروتينات قريبة من البروتين المستهدف من قبل الانصهار توربوID.
4. ورقة عينة جمع
ملاحظة: للمعالجة اللاحقة لعينات الأوراق، ارتدي قفازات معقمة لتجنب تلوث الكيراتين بالعينات. يجب أن تكون جميع الكواشف أيضًا خالية من الكيراتين قدر الإمكان.
- قطع الأوراق المتسللة في قاعدة البتيول، وإزالة الوريد ورقة، ثم فلاش تجميد الأنسجة ورقة في النيتروجين السائل.
- طحن الأنسجة ورقة باستخدام الحشرات وقذائف الهاون وتخزين مسحوق ورقة في 15 مل أو 50 مل أنابيب الصقر في -80 درجة مئوية للاستخدام اللاحق.
ملاحظة: خذ ثلاث إلى أربع قطع من الأوراق لكل من النسخ البيولوجية الثلاثة من النباتات المختلفة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا. قبل الخطوات اللاحقة ، يوصى بتقييم التعبير البروتيني وفرط البروتين الحيوي من البروتين المستهدف عن طريق تحليلات المناعي. وتظهر البوات الغربية النموذجية في الشكل 2.
5. استخراج من البروتين الكلي ورقة
- نقل حوالي 0.35 غرام من مسحوق ورقة إلى أنبوب 2 مل. إعداد أنبوبين لكل عينة.
تنبيه: ارتداء القفازات عند لمس أي كائن تبريد بواسطة النيتروجين السائل. - إضافة 700 ميكرولتر من العازلة الليسيس RIPA (50 mM Tris-HCl [درجة الحموضة = 7.5] ، 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0.1% SDS [w/v], 0.5% ثنائي الصوديوم [w/v], 1 mM DTT, 1 قرص من كوكتيل مثبطات البروتياز) إلى 0.35 غرام من مسحوق الأوراق.
- دوامة الأنابيب لمدة 10 دقيقة.
- اترك العينات على الثلج لمدة 30 دقيقة.
- خلط محتويات كل 4-5 دقيقة عن طريق تحويل الأنابيب رأسا على عقب عدة مرات.
6. إزالة البيوتين الحر عن طريق إزالة الملح
ملاحظة: يستغرق هذا القسم حوالي 50 دقيقة.
- معادلة العمود إزالة الملح.
- إزالة الصاحب في الجزء السفلي من العمود desalting ووضع العمود في أنبوب 50 مل.
- إزالة محلول التخزين عن طريق الطرد المركزي في 1000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وتأكد من أن يتم تخفيف الغطاء.
- ضع العمود المملح في أنبوب 50 مل. Equilibrate العمود 3x مع 5 مل من العازلة RIPA lysis، في كل مرة الطرد المركزي في 1000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة والتخلص من flowthrough.
- نقل العمود إزالة الملح إلى أنبوب جديد 50 مل وتخزينها مؤقتا في 4 درجة مئوية للاستخدام اللاحق.
- تدور الأنابيب من الخطوة 5.4 في 16500 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ونقل supernatant من اثنين من أنابيب إلى أنبوب جديد 2 مل.
- أضف 1500 ميكرولتر من مستخلص البروتين إلى الجزء العلوي من راتنج العمود الملوحة المتساوية (من الخطوة 6.1.4). عندما يدخل مستخلص البروتين الراتنج، أضف 100 ميكرولتر أخرى من عازل RIPA lysis.
ملاحظة: على الرغم من أن 1400 ميكرولتر من المحلول المؤقت RIPA كان يستخدم لاستخراج البروتين من الأوراق، تم دائما زيادة الحجم الإجمالي بعد استخراج البروتين وإزالة الملح إلى حد ما بالنسبة للحجم الأصلي. ولذلك، فإن الجمع بين العينات من كل مجموعة على النحو المبين في الخطوتين 5-1 و 5.4 يمكن أن يؤدي إلى ما لا يقل عن 500 1 ميكرولتر من مستخلص البروتين لكل عينة. - الطرد المركزي في 1000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وترك العينات المنحلة على الجليد مؤقتا.
7. القياس الكمي لمستخلصات البروتين المملح باستخدام قياس برادفورد
- إعداد 50 ميكرولتر من كل محلول BSA التدرج: 0 ملغ / مل, 0.2 ملغ/مل, 0.4 ملغ/مل, 0.6 ملغ/مل, 0.8 ملغ/مل, و 1 ملغ/مل.
- تمييع مستخلص البروتين المملح عن طريق خلط عينة 5 ميكرولتر مع 45 ميكرولتر من ddH2O.
- إعداد 1x برادفورد ريجنت عن طريق تخفيف 5x برادفورد الوصي (100 ملغ من Coomassie الأزرق الرائع G250, 47 مل من الميثانول, 100 مل من 85% حمض الفوسفوريك, 53 مل من ddH2O).
- إضافة 50 ميكرولتر من كل التدرج BSA الحل و 50 ميكرولتر من مستخلص البروتين المخفف إلى 2.5 مل من 1x برادفورد ريجنت.
- احتضان في RT لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 200 ميكرولتر من محلول كل عينة إلى بئر واحد من لوحة ELISA (ثلاثة يكرر التقنية لكل عينة).
- قياس OD595 باستخدام قارئ microplate.
- رسم المنحنى القياسي على أساس قيمة التدرج محلول BSA وحساب تركيز عينات البروتين المملح. عادة، يتراوح إجمالي تركيز البروتين الذي تم الحصول عليه من 0.7 غرام من الأوراق من 3-6 ملغم/مل.
- إعداد 6-8 ملغ من مستخلص البروتين المملح لتنقية تقارب لاحقة.
8- إثراء البروتينات الحيوية
- خذ 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المترافق بين العقديات وC1 في أنبوب 2 مل.
- Equilibrate streptavidn-C1-زوجية الخرز المغناطيسي مع 1 مل من RIPA lysis المخزن المؤقت لمدة 1 دقيقة في RT.
- بعد كل غسل، استخدم الرف المغناطيسي لامتصاص الخرز لمدة 3 دقيقة وإزالة بلطف الحل عن طريق الأنابيب.
- كرر الخطوتين 8.2 و 8.3.
- نقل مستخلص البروتين المملح إلى الخرز المغناطيسي المأبس streptavidn-C1- المترافق.
- احتضان الأنبوب في 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة (أو بين عشية وضحاها) على دوار لتنقية تقارب البروتينات الحيوية.
- التقاط الخرز على رف المغناطيسي لمدة 4 دقيقة في RT حتى الخرز جمع في جانب واحد من الأنبوب، ثم إزالة بلطف supernatant بواسطة ماصة.
- إضافة 1.7 مل من غسل المخزن المؤقت الأول (2٪ SDS في الماء) إلى الأنبوب والاحتفاظ بها على الدوار في RT لمدة 8 دقيقة. كرر الخطوة 8.3.
- إضافة 1.7 مل من غسل المخزن المؤقت الثاني (50 mM HEPES: pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% حمض ديوكسيتشوليك [ث/v], 1% تريتون X-100) إلى الأنبوب والاحتفاظ بها على الدوار في RT لمدة 8 دقيقة. كرر الخطوة 8.3.
- إضافة 1.7 مل من غسل المخزن المؤقت الثالث (10 mM Tris-HCl: pH = 7.4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% حمض ديوكسيكولينيك [ث/v], 1% NP40 [v/v]) إلى الأنبوب والاحتفاظ بها على الدوار في RT لمدة 8 دقيقة. كرر الخطوة 8.3.
- أضف 1.7 مل من 50 مل تريس-HCl (درجة الحموضة = 7.5) لإزالة المنظفات، ثم كرر الخطوة 8.3.
- نقل الخرز إلى أنبوب جديد 1.5 مل، وكرر الخطوات 8.11 و 8.3.
- اغسل الخرز 6x لمدة 5 دقيقة لكل منها مع حاجز بيكربونات الأمونيوم 50 mm في RT.
- إضافة 1 مل من 50 mm البيكربونات الأمونيوم العازلة إلى الخرز المغناطيسي وتخلط جيدا.
- إزالة 100 ميكرولتر من الخرز لتحليل البلوت المناعي لتأكيد إثراء البروتينات الحيوية. وتظهر لطخة غربية نموذجية في الشكل 3.
- فلاش تجميد بقية عينات البروتين وتخزينها في -80 درجة مئوية أو إرسالها على الفور لتحليل LC-MS / MS على الجليد الجاف.
ملاحظة: يتم عرض نتائج MS النموذجية في منشور سابق (Zhang et al. 2019; الشكل 2، البيانات التكميلية 1، والبيانات التكميلية 2)11. تتوفر مجموعات البيانات بأكملها على MassIVE (وجدت في < http://massive.ucsd.edu > ) باستخدام المعرف: MSV000083018 و MSV000083019.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البيانات التمثيلية، التي توضح النتائج المتوقعة استناداً إلى البروتوكول الموصوف، مقتبسة من تشانغ وآخرون11. يلخص الشكل 1 إجراءات تنفيذ PL المستندة إلى TurboID في N. benthamiana. ويبين الشكل 2 التعبير البروتين والحيوية tinylation في أوراق N. بنتامانيانا تسلل. ويبين الشكل 3 أن البروتينات الضئيلة بيولوجيا في الأوراق المخترقة قد تم إثراؤها بكفاءة لتحليل الطيف الكتلي اللاحق. تجدر الإشارة إلى أنه بعد إثراء البروتينات الحيوية الصغيرة باستخدام الخرز المغناطيسي العقدي-C1-jugated، تم التقاط بروتينات مختلفة ذات أحجام متنوعة، وأظهر تحليل لطخة الغربية من البروتينات المخصب العصابات لطخت(الشكل 3). وقد أبديت ملاحظات مماثلة في العديد من الدراسات التي نشرت مؤخرا6,7,13,14.
الشكل 1: نظرة عامة على طريقة PL المستندة إلى TurboID في N. benthamiana. تم اختراق Agrobacterium التي تؤوي بنيات توربوبيد الانصهار إلى أوراق N. benthamiana. 36 ساعة بعد التسلل، يتم اختراق 200 ميكرومتر البيوتين إلى نفس الأوراق لبدء tinylation biotinylation من البروتينات الذاتية التي هي قريبة من البروتين الهدف توربود تنصهر. ثم يتم احتضان النباتات المتسللة في RT لمدة 3-12 ساعة ، تليها حصاد الأوراق وطحن النيتروجين السائل. يتم تحلل مسحوق الأوراق في عازل RIPA lysis ، ويتم استخدام عمود إزالة الملح لإزالة البيوتين الحر في مستخلص البروتين. ثم تم تنقية البروتينات الحيوية المنقاة مع الخرز المترافق العقدي وتم تحديدها بواسطة قياس الطيف الكتلي. تم تكييف هذا الرقم من الشكل التكميلي 3 من تشانغ وآخرون11. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل المناعي لمستخلصات البروتين التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.2. (أ)تحليل لطخة الغربية من البروتينات المستخرجة من الأوراق الزراعية المتسللة مع الأجسام المضادة ضد علامة HA. (ب)تحليل لطخة الغربية من البروتينات الحيوية في الأوراق الزراعية المتسللة مع العقدية HRP. تم تكييف هذا الرقم من الشكل التكميلي 6B من تشانغ وآخرون11. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل لطخة غربية للخرز تم الحصول عليها في الخطوة 8.15 لتأكيد إثراء البروتينات الحيوية. لكل بناء، هناك ثلاثة نسخ متماثلمستقلة (1 و 2 و 3). استُخدم العقديات-HRP لتحليل البروتينات المتعددة الناحية الحيوية في عينات مختلفة. تم تكييف هذا الرقم من الشكل التكميلي 7 من تشانغ وآخرون11. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم إنشاء الرباط البيوتيد TurboID بواسطة الخميرة القائمة على عرض تطور توجيه BioID10. لديها العديد من المزايا على إنزيمات PL الأخرى. TurboID يسمح بتطبيق PL على أنظمة نموذج أخرى، بما في ذلك الذباب والديدان، ودرجة حرارة النمو الأمثل حوالي 25 درجة مئوية10. على الرغم من أن نهج PL قد استخدم على نطاق واسع في النظم الحيوانية ، فإن تطبيقه في النباتات محدود. يوفر البروتوكول الموصوف هنا إجراءً خطوة بخطوة لإنشاء PL المستند إلى TurboID في N. benthamiana، وهو نبات نموذجي تم استخدامه على نطاق واسع في دراسات التفاعل بين مسببات الأمراض النباتية. يحدد هذا البروتوكول إعداد عينة الأوراق ، وإزالة البيوتين الحر ، والتقدير الكمي للبروتينات المستخرجة ، وإثراء البروتينات الحيوية المتناهية الصغر.
على الرغم من أن البيوتين الحر في أنظمة زراعة الخلايا الحيوانية يمكن إزالته إلى حد كبير عن طريق غسل الخلايا مع الحاجز PBS4، لا يمكن مسح البيوتين المجاني في الأنسجة الورقية عن طريق الغسيل البسيط. أشارت دراسة حديثة إلى أن البيوتين الحر يمكن أن يؤثر بشدة على الإثراء اللاحق للبروتينات الحيوية11. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام عمود إزالة الملح لإزالة البيوتين الحر بنجاح في مستخلصات البروتين ، مما يسمح بالربط الفعال للبروتينات الحيوية إلى حبات العقدتافيدين.
وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول بمثابة مرجع هام لإجراء PL في أنظمة المصانع الأخرى. في الآونة الأخيرة، استخدمت ثلاثة تقارير توربود القائم على PL في Arabidopsis12،13،14 والطماطم شعر الجذر12، إلى جانب N. benthamiana وصفها هنا. على غرار أنظمة زراعة الخلايا الحيوانية ، تم تحقيق إزالة البيوتين الحر عن طريق غسل البتوبوات النباتية قبل استخراج البروتين6. ومع ذلك ، كانت كميات أقل من جزيئات البيوتين الحرة التي لم يتم دمجها مع البروتين موجودة في المناطق الداخلية من الخلية ، مما أثر على كفاءة الإثراء اللاحق للبروتينات الحيوية. لذلك ، يوصى بإجراء إزالة الملح لإزالة الكائنات الحية الحرة بالكامل ، مما يزيد من كفاءة استعادة البروتينات الحيوية.
وقد استخدمت نوعين من الأعمدة، PD-10 وزيبا، لإزالة البيوتين مجانا11،12،13،14. قد يكون من الفائدة في المستقبل لمقارنة كفاءة هذين العمودين في إزالة البيوتين الحر في مستخلصات بروتين الأوراق. وعلاوة على ذلك، يستخدم هذا البروتوكول طريقة تسلل زراعي بوساطة الحقنة الكنسية للتعبير بشكل عابر عن البروتين المستهدف الذي يهم أوراق N. بنثاميانا. ثم، يتم إعادة اختراق الركيزة البيوتين في الأوراق لوضع العلامات البروتينات التي هي قريبة من البروتين المستهدف. كما استخدمت عمليات مماثلة في دراستين آخرتين أُبلغ عنهما مؤخراً12،,13. كطريقة بديلة، وفراغ بوساطة التسلل من البيوتين ينطبق على كل من ن. بنتامانيا وArabidopsis14. بالإضافة إلى ذلك ، في النباتات التي لا تصلح للتسرب الزراعي ، يمكن تحويل ثقافات الخلايا للتعبير عن البروتين المستهدف ، تليها معالجة البيوتين وتصنيف القرب من القول12. وقد دعمت هذه الدراسات الحديثة متانة PL المستندة إلى TurboID في دراسة PPIs ووضعت الأساس للتطبيقات المستقبلية لـ TurboID BASED PL في أنواع نباتية مختلفة.
في هذا البروتوكول، يستخدم التعبير العابر الراسخ من قبل Agrobacteriumبوساطة في N. بينثاميانا لتحديد PPIs من البروتين المستهدف من الفائدة. التعبير العابر قد يؤدي إلى الإفراط في التعبير عن البروتينات الانصهار. لذلك ، فإن البديل الأمثل هو هندسة الانصهار TurboID تحت سيطرة مروج أصلي والتعبير عنه عن طريق التسلل الزراعي أو توليد خطوط معدلة مستقرة. مع تطوير تكنولوجيا تحرير الجينوم ، من الممكن أيضًا طرق جزء TurboID مباشرة إلى موضع الجينوم الأصلي للجينات ذات الاهتمام.
عامل مهم آخر يجب النظر فيه هو ضمان أن الانصهار TurboID لا يغير وظيفة البروتين المستهدف من الفائدة. في دراسة سابقة, تم تأكيد وظيفة مستقبلات المناعة NLR تنصهر إلى TurboID من خلال اختبار قدرتها على حث موت الخلية بوساطة الدفاع في وجود التبغ فيروس الفسيفساء P50 effector11. TurboID هو أكبر نسبيا (أي 35 كيلو يد) من GFP، والانصهار إلى البروتين المستهدف يمكن أن تؤثر على وظيفة البروتين المستهدف. في مثل هذه الحالات، يمكن استخدام أصغر توربوID10.
من المهم أيضًا تحديد أي من السُرَب من البروتين المستهدف مناسب للإنفطيمع مع TurboID. وهناك نهج عام لمثل هذه الاختبارات الوظيفية هو تحديد ما إذا كان الانصهار TurboID سيكمل خط النبات المتحول للجين المستهدف. بدلا من ذلك، يمكن استخدام تحليل التفاعل بين توربوID مع شريك التفاعل المعروفسابقا للبروتين المستهدف. في معظم الحالات، بالنسبة للبروتينات السيتوبلازمية، يمكن أن تنتج علامات N-terminal أو C-terminal للـ TurboID مجموعات بيانات قابلة للمقارنة في تحليل قياس الطيف الكتلي اللاحق. ومع ذلك ، بالنسبة للبروتينات المترجمة عن الأغشية ، من المهم تحديد الطوبولوجيا قبل بناء المتجه. خلاف ذلك ، فإن دمج TurboID المنبع أو المصب من تسلسل الترميز من الجينات ذات الاهتمام سيولد نتائج مختلفة تمامًا. لذلك ، من المهم تحديد الجوانب المواجهة (على سبيل المثال ، السيتوبلازمية - أو التجويف التي تواجه) من N-terminus أو C-terminus من البروتينات المترجمة الغشاء. وهذا يضمن أنه يمكن الحصول على البروتين القريب المتوقع من البروتين المستهدف.
على الرغم من أن PL له العديد من المزايا على نهج IP-MS التقليدية للكشف عن مؤشرات أسعار الصفحات العابرة أو الضعيفة ، إلا أن لها قيودًا جوهرية خاصة بها. أولاً، تحديد بروتينات التفاعل المرشح لا يعني على الفور تفاعل مباشر أو غير مباشر مع بروتين الطعم، ولكنه يعكس فقط القرب الشديد2. لذلك ، يمكن إجراء مستقلة في المقالات الفية (أي الترسيب المناعي المشترك ، مكملات الفلورالجزيئية [BiFC] ، أو في المختبر GST - سحب أسفل القول) لمزيد من التحقق من مؤشرات أسعار المؤشرات.
ثانياً، قد تنشأ سلبيات كاذبة أو إيجابيات كاذبة من القول PL لأسباب مختلفة. على سبيل المثال، يمكن أن تحدث سلبيات كاذبة عندما البروتين تفتقر إلى الأمينات الأولية التي يمكن الوصول إليها. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة للممثلين البينيين BIN2 في النباتات تداخلجزئي بين البيانات من تجربتين13، مما يشير إلى وجود نتائج سلبية كاذبة بسبب عدم كفاية تغطية التصلب المتعدد. قد يكون بعض الجهات الفاعلة من البروتين المستهدف أيضا ضعيفة المناطق الحيوية بواسطة التحكم TurboID تنصهر, مما أدى إلى إثراء أضعاف تحت عتبة قطع وفي نهاية المطاف فقدان بعض interactors صحيح13,,14. لذلك، يجب تعيين النسخ المتماثل البيولوجي الكافي مع الضوابط المناسبة وقيم القطع لتقليل عدد السلبيات الزائفة11،14.
وعلاوة على ذلك، يمكن لفترة طويلة لعلاج البيوتين زيادة التهوية الحيوية من البروتينات غير محددة، مما يؤدي إلى ايجابيات كاذبة10. لذلك ، من المهم تحسين النوافذ الزمنية في تحديد الأحياء للحد من الـ biotinylation غير المحدد ، في حين لا يؤثر أيضًا على إنتاج البروتينات الحيوية الصغيرة للتحليل11،12،13،14. بالإضافة إلى ذلك ، ينصح الاستخراج القاسي وظروف الغسيل الصارمة للحد من الإيجابيات الزائفة المستمدة من الربط غير المحدد للبروتينات إلى الخرز17. إلى جانب المحاذير المذكورة أعلاه ، فإن تصميم عنصر تحكم سلبي مناسب أمر بالغ الأهمية للتمييز بين الممثلين الحقيقيين من بين الفاعلين الكاذبين وتجنب فقدان الممثلين الحقيقيين11،12،13،14.
أظهر TurboID تحسنًا كبيرًا في وضع العلامات الحركية مقارنة بحركة BioID10،11. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي هذا أيضاً إلى خلفية أعلى أثناء تحليل PL. ولذلك، يجب إدراج الضوابط المناسبة للقضاء على إشارات الخلفية. استخدمنا TurboID المنصهر بالسيترين في هذا البروتوكول11، وقد تم استخدام عنصر تحكم مماثل في الدراسات السابقة18. للبروتينات المستهدفة التي توطينها إلى غشاء عضوي معين، تيربود الصمامات مع الببتيد إشارة التي تستهدف نفس الغشاء العضي يجعل سيطرة أفضل من الصمامات TurboID مع واحد الذي يعبر عنه في السيتوبلازم14.
وعلاوة على ذلك، إذا كانت المعلومات حول المجال الرئيسي أو الأحماض الأمينية في البروتين المستهدف التي تحدد تفاعلاتها مع الشركاء الآخرين معروفة، فإن دمج التوربوID مع بروتين مستهدف مع طفرة في المجال الرئيسي أو الأحماض الأمينية يجب أن يكون أفضل تحكم ويقلل إلى أقصى حد من إشارات الخلفية التي يولدها البروتين المستهدف. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب إنزيمات TurboID درجات حرارة محددة بالإضافة إلى ظروف درجة الحموضة المناسبة. بالنسبة لمعظم العضيات في الخلية مثل ER, نواة, والميتوكوندريا, TurboID بنجاح المسمى البروتينات القريبة10. ومع ذلك، قد لا تكون بعض الخلايا العضوية الخاصة (أي الخلايا المُخَلّة في الخلايا النباتية، التي تكون درجة الحموضة فيها منخفضة جداً19)مناسبة لدراسة مؤشرات أسعار الصفحات باستخدام نهج PL. وعلاوة على ذلك، قد تؤثر التغيرات في مستويات درجة الحموضة أو حالات الحد من الأكسدة في البيئة دون الخلوية أثناء استجابة الإجهاد على كفاءة وضع العلامات على التوربوID.
باختصار، يوفر البروتوكول الموصوف هنا الأساس للتحقيق في PPIs باستخدام TurboID في N. benthamiana، وهو نظام نباتي نموذجي تم استخدامه على نطاق واسع في العديد من جوانب بيولوجيا النبات20. مع وصفها مؤخرا TurboID المستندة إلى دراسات PL في النباتات العربيدوبسية والطماطم جذور شعر12،13،14، فمن المتوقع أن تصبح هذه الطريقة قابلة للتطبيق على الأنواع النباتية الأخرى. ومن المتوقع أن PL توربوID المستندة إلى تلعب دورا هاما في دراسة PPIs في بحوث بيولوجيا النبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح من البرنامج الوطني للعلوم والتكنولوجيا المعدلة وراثيا (2019ZX08010-003 إلى Y.Z.) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31872637 إلى Y.Z.) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (2019TC028 إلى Y.Z.) ، وNSF-IOS-1354434 ، NSF-IOS-1339185، وNIH-GM132582-01 إلى S.P.D.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
