Summary
Описано здесь метод маркировки близости для идентификации партнеров взаимодействия области TIR иммунного рецептора NLR в ткани листьев Nicotiana benthamiana. Также предусмотрен подробный протокол для выявления взаимодействий между другими белками, представляющими интерес с использованием этой техники в Никотина и других видов растений.
Abstract
Методы маркировки близости (PL) с использованием сконструированного аскорбата пероксидаза (APEX) или Escherichia coli biotin ligase BirA (известный как BioID) были успешно использованы для идентификации белково-белковых взаимодействий (PPIs) в клетках млекопитающих. Тем не менее, требования токсичной перекиси водорода (H2O2) в APEX основе PL, больше времени инкубации с биотином (16-24 ч), и более высокая температура инкубации (37 градусов по Цельсию) в BioID основе PL серьезно ограничить их применение в растениях. Недавно описанный TurboID основе PL рассматриваются многие ограничения BioID и APEX. TurboID позволяет быстро маркировать близость белков всего за 10 минут при комнатной температуре (RT). Хотя полезность TurboID была продемонстрирована в животных моделях, мы недавно показали, что TurboID основе PL работает лучше в растениях по сравнению с BioID для маркировки белков, которые проксимальны для белка интерес. Приведенный здесь пошаговый протокол для идентификации партнеров взаимодействия протеина используя N-терминальный Toll/interleukin-1 пренициальное устройство (TIR) домена нуклеотид-связывающего лейцина-богатого повтора (NLR) протеинового семейства (NLR) в качестве модели. Метод описывает векторную конструкцию, агроининсредуификацию конструкций экспрессии белка, лечение биотином, экстракцию белка и опреснение, количественную оценку и обогащение биотинилатированных белков сродством очищения. Описанный здесь протокол может быть легко адаптирован для изучения других белков, представляющих интерес у Никотинианы и других видов растений.
Introduction
ИЦП являются основой различных клеточных процессов. Традиционные методы выявления ИЦП включают скрининг дрожжей-двух гибридов (Y2H) и иммунопрецитивввву в сочетании с масс-спектрометрией (IP-MS)1. Тем не менее, оба страдают от некоторых недостатков. Например, скрининг на 200 00 лет требует наличия библиотеки 2000-х растений-мишеней или видов животных. Строительство этих библиотек является трудоемким и дорогостоящим. Кроме того, подход Y2H осуществляется в гетерологических одноклеточных дрожжах эукариотического организма, которые не могут представлять клеточный статус высших эукариотических клеток.
В отличие от этого, IP-MS показывает низкую эффективность в захвате переходных или слабых ИЦП, и это также не подходит для тех белков с низким изобилием или высокой гидрофобичностью. Многие важные белки, участвующие в растительной сигнальных путей, таких как рецептороподобные киназы (RLKs) или NLR семьи иммунных рецепторов выражаются на низких уровнях и часто взаимодействуют с другими белками переходно. Таким образом, это значительно ограничивает понимание механизмов, лежащих в основе регулирования этих белков.
В последнее время методы маркировки близости (PL) на основе инженерных аскорбат перекиснида (APEX) и мутант Escherichia coli биотина ligase BirAR118G (известный как BioID) были разработаны и использованы для изучения ИЦП2,3,4. Принцип PL заключается в том, что интересуемый целевой белок сливается с ферментом, который катализает образование лабийского биотинила-AMP (био-AMP). Эти бесплатные био-AMP высвобождаются ферментами PL и диффундируют в непосредственной близости от целевого белка, что позволяет биотиниляцию проксимальных белков в первичных аминах в пределах предполагаемого радиуса 10 нм5.
Этот подход имеет значительные преимущества по сравнению с традиционными подходами Y2H и IP-MS, такими как способность фиксировать переходные или слабые ИЦП. Кроме того, PL позволяет маркировки проксимальных белков целевого белка в их родной клеточной среде. Различные ферменты PL имеют уникальные недостатки при применении их к различным системам. Например, хотя APEX предлагает более высокую пометку кинетики по сравнению с BioID и успешно применяется в системах млекопитающих, требование токсичного перекиси водорода (H2O2) в этом подходе делает его непригодным для исследований PL в растениях.
В отличие от этого, BioID основе PL избегает использования токсичных H2O2, но скорость маркировки медленно (требуя 18-24 ч для завершения биотинилаации), что делает захват переходных ИЦП менее эффективным. Кроме того, более высокая температура инкубации (37 градусов по Цельсию), необходимая для эффективного Pl by BioID, вводит внешний стресс для некоторых организмов, таких как растения4. Таким образом, ограниченное развертывание BioID основе PL в растениях (т.е. рис протопластов, arabidopsis, и Н. benthamiana) было сообщено6,,7,8,9. Недавно описанный фермент TurboID преодолевает недостатки APEX и BioID на основе PL. TurboID показал высокую активность, которая позволяет достижение PL в течение 10 минут на RT10. TurboID основе PL была успешно применена в клетках млекопитающих, мух, и червей10. Недавно мы и другие исследовательские группы независимо оптимизировали и расширили использование TurboID на основе PL для изучения ИЦП в различных системах растений, в том числе Н. бентамиана и Арабидопсис растений и томатные волосатые корни11,12,13,14. Сравнительный анализ показал, что TurboID работает лучше для PL в растениях по сравнению с BioID11,14. Он также продемонстрировал надежность TurboID основе PL в плантиве, определив ряд новых взаимодействий с иммунным рецептором NLR11, белок, взаимодействие партнеров которого, как правило, трудно получить с помощью традиционных методов.
Этот протокол иллюстрирует TurboID основе PL в плану, описывая определение взаимодействия белков N-терминала TIR домена NLR иммунного рецептора в N. benthamiana растений. Метод может быть распространен на любые белки, представляющие интерес у N. benthamiana. Что еще более важно, он обеспечивает важную ссылку для исследования ИЦП в других видов растений, таких как Arabidopsis, помидоры, и другие.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор метода показан на рисунке 1.
1. Подготовка материала завода
- Выращивайте семена N. benthamiana во влажной почве при высокой плотности и поддерживайте их в климатической камере с 16 ч светом (около 75 моль/м2с) и 8 ч темным фотопериодом при 23–25 градусах Цельсия.
- Примерно через 1 неделю тщательно перенесите каждую молодую рассаду в кастрюли 4' x 4 и держите саженцы в одной камере.
- Поддерживайте растения в камере около 4 недель, пока они не вырастут до листа стадии 4-8 для последующего агроининфильтрации15.
2. Строительство турбодиджейсинтеза
- Используйте стандартный метод молекулярного клонирования для генерации синтеза целевого белка с TurboID (PCR TurboID от Addgene plasmid #107177). Здесь мы использовали N-терминальный tIR домен иммунного рецептора NLR в качестве целевого белка интереса и построили TIR слитый с TurboID под контролем вируса мозаики цветной капусты 35S промоутер (p35S::TIR-TurboID).
ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние фермента TurboID в карбоксил-терминус или амино-терминус целевого белка будет зависеть от интересуемого белка. Как правило, для цитоплазмического белка, оба термини должны быть приемлемыми, до тех пор, как Fusion TurboID не влияет на функцию белка цели. Однако для мембранного локализованного белка топология белка должна быть охарактеризована заранее до определения того, какой термин лучше всего подходит для синтеза TurboID. - Постройте цитрин с турбоидированным под тем же промоутером, чтобы служить в качестве контроля для последующего количественного протеомного анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно построить контроль TurboID для идентификации проксимального протеома к целевому белку. Контроль синтеза TurboID должен показывать уровень экспрессии, аналогичный уровню срастированного в TurboID целевого белка. Это может быть эмпирически определено путем корректировки концентрации агробактерий во время агроининфильтрации. Кроме того, важно, чтобы контрольный белок имеет субклеточное логово локализации, аналогичное модели целевой белка, представляющих интерес.
3. Агроинфильтрация
- Преобразование плазмидов в агробактерию
- Добавьте 0,5 мкг плазмидов, генерируемых из шагов 2.1 и 2.2 до 50 ЗЛ штамма agrobacterium tumefaciens GV3101 компетентных клеток, подготовленных как описано ранее16.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие штаммы агробактерий, такие как GV2260, также могут быть использованы. - Инкубировать на льду 30 мин.
- Тепловой шок в водяной бане при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 60 с.
- Добавьте в агробактерию 400 кЛ среды LB (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, и 10 г/л NaCl; рН 7,0) в агробактерию и инкубировать при 28 градусах По цельсии в течение 90 мин.
- Плита все содержимое в трубке на LB агар дополнен соответствующими антибиотиками для выбора плазмиды, а также для агробактерий (для GV3101: 50 мг/ л гентамицин и 50 мг / л рифампицин).
- Инкубировать пластины при 28 градусах по Цельсию для 36-48 h, пока отдельные колонии не видны.
- Добавьте 0,5 мкг плазмидов, генерируемых из шагов 2.1 и 2.2 до 50 ЗЛ штамма agrobacterium tumefaciens GV3101 компетентных клеток, подготовленных как описано ранее16.
- Выберите и полоса несколько отдельных колоний на свежий LB агар пластины с антибиотиками (см. шаг 3.1.5) и расти на 28 градусов по Цельсию в одночасье.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это более оптимально для выполнения колонии ПЦР, чтобы подтвердить наличие конкретной двоичной конструкции в Агробактерии. По нашему опыту, более 95% колоний содержат введенные двоичные конструкции. - Прививать 3 мл среднего LB плюс соответствующие антибиотики (см. шаг 3.1.4) с колонией агробактерий укрывательство конструкции интерес, и инкубировать, встряхивая ночь на 28 градусов по Цельсию до ОД600 культуры агробактерий достигает 2.0.
- Центрифуги ячеек на 3000 х г и повторно их od600 и 1,0 в буфере агроинфильтрации (10 мм MgCl2, 10 мм MES »pH 5,6 »,, 250 мкм acetosyringone).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя оптимально инкубировать инокулум для 2 ч на RT до агроинфильтрации, по нашему опыту с штаммом GV3101, не было большой разницы между выражением белка цели с против без инкубации. - Используйте 1 мл шприца без иглы, чтобы проникнуть в инокулум в (афаксиальное) эпидермис полностью зрелых листьев N. benthamiana.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки достаточного количества листовых материалов для трех биологических репликатов: весь лист, как правило, проникают, три листа проникают на растение, и три-четыре растения используются для каждой конструкции. Для каждого листа достаточно 1,5-2,0 мл взвешенных агробактерий. - После 36 ч после инфильтрации (hpi), проникнуть 200 мкм биотин (в 10 мМ MgCl2 раствор) в листья х предварительно проникли с TurboID конструкций.
- Поддерживайте растение в течение дополнительных 3-12 ч до сбора урожая листовой ткани, как описано в разделе 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Причина для выбора 36 hpi для инфильтрации биотина является то, что цель выражение белка пики в этой точке времени в соответствии с предыдущими исследованиями11. Рекомендуется определить время, необходимое для оптимального выражения целевого белка интереса. Инкубационное время после биотина инфильтрации зависит от экспериментальной конструкции и целевого белка в исследовании. Как правило, 3-12 ч лечения биотина позволяет маркировки большинства белков проксимальна к целевому белку Fusions TurboID.
4. Сбор образцов листьев
ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующей обработки образцов листьев, носить стерильные перчатки, чтобы избежать кератина загрязнения образцов. Все реагенты также должны быть максимально бескерогенными.
- Вырезать проникнутые листья в основании петиола, удалить вену листьев, а затем флэш-заморозить ткань листьев в жидком азоте.
- Измельчить ткань листьев с помощью пестика и раствора и хранить лист порошок в 15 мл или 50 мл сокол атрубы при -80 градусов по Цельсию для последующего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите от трех до четырех кусочков листьев для каждого из трех биологических репликации из разных растений. Протокол можно приложить здесь. Перед последующими шагами рекомендуется оценивать экспрессию белка и биотиниляцию целевого белка с помощью иммуноблотных анализов. Типичные западные помарки показаны на рисунке 2.
5. Извлечение листа общего белка
- Перенесите около 0,35 г листового порошка в трубку 2 мл. Подготовьте две трубки для каждого образца.
ВНИМАНИЕ: Носите перчатки при прикосновении к любому объекту, охлажденный жидким азотом. - Добавить 700 л из буфера лиза RIPA (50 мм Tris-HCl (pH) 7,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% NP40 "v/v", 0,1% SDS (w/v), 0,5% дезоксихолат натрия ,w/v, 1 мМ DTT, 1 таблетка ингибитора протеазы коктейль) до 0,35 г листового порошка.
- Вихрь труб в течение 10 мин.
- Оставьте образцы на льду на 30 мин.
- Смешайте содержимое каждые 4-5 минут, перевернув трубки вверх дном несколько раз.
6. Удаление свободного биотина путем опреснения
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел занимает около 50 минут.
- Равновесие опреснительной колонки.
- Снимите герметик в нижней части опреснительной колонны и поместите колонну в трубку 50 мл.
- Удалите раствор для хранения путем центрифугирования при 1000 х г и 4 кв кв 2 мин и убедитесь, что крышка ослаблена.
- Поместите опреснительную колонку в трубку 50 мл. Уравновесите столбец 3x с 5 мл буфера лиза RIPA, каждый раз центрифугирование на 1000 х г и 4 КК в течение 2 мин и отбрасывая проточного.
- Перенесите опреснительную колонку в новую трубку 50 мл и временно храните при 4 градусах Цельсия для последующего использования.
- Спин трубки от шага 5.4 на 16500 х г и 4 КК в течение 10 минут и передать супернатант из двух труб в новую трубку 2 мл.
- Добавьте 1500 л экстракта белка в верхнюю часть миски равновесной опреснительной колонки (от шага 6.1.4). Когда экстракт белка попадает в селину, добавьте еще 100 л буфера лиза RIPA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя 1400 л буфера лиза RIPA использовалось для извлечения белка из листьев, общий объем после извлечения белка и опреснения неизменно увеличивался в некоторой степени по сравнению с первоначальным объемом. Таким образом, сочетание образцов из каждой группы, как описано в шагах 5.1 и 5.4 может привести к по крайней мере 1500 л экстракта белка на образец. - Центрифуге при 1000 х г и 4 кв 2 мин и оставьте опресненные образцы на льду временно.
7. Количественная оценка экстрактов опресненого белка с использованием брэдфордского анализа
- Приготовьте 50 л каждого градиентного раствора BSA: 0 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,8 мг/мл и 1 мг/мл.
- Разбавить экстракт опреснения белка, смешивая образец 5 л с 45 л дДГ2O.
- Подготовка 1x Брэдфорд регента путем разбавления 5x Брэдфорд регент (100 мг Coomassie блестящий синий G250, 47 мл метанола, 100 мл 85% фосфорной кислоты, 53 мл ddH2O).
- Добавьте 50 кл.л каждого градиентного раствора BSA и 50 л разбавленного белкового экстракта в 2,5 мл 1x-регента Брэдфорда.
- Инкубировать на RT в течение 10 мин.
- Добавьте 200 л раствора каждого образца к одной скважине пластины ELISA (три технических репликана на образец).
- Измерьте OD595 с помощью микроплитного считывателя.
- Нарисуйте стандартную кривую на основе значения градиентного раствора BSA и вычислите концентрацию образцов опресненных белков. Как правило, общая концентрация белка, полученная из 0,7 г листьев, колеблется от 3-6 мг/мл.
- Приготовьте 6-8 мг экстракта опреснительного белка для последующего очищения сродства.
8. Обогащение биоинтинилатированных белков
- Возьмите 200 л стрептавидна-C1-конъюгированных магнитных бусин в трубку 2 мл.
- Уравновешить стрептавидн-C1-конъюгированные магнитные бусы с 1 мл буфера лиза RIPA в течение 1 мин на RT.
- После каждой стирки используйте магнитную стойку, чтобы адсорбировать бусы в течение 3 минут и аккуратно удалите раствор путем пайпетирования.
- Повторите шаги 8.2 и 8.3.
- Перенесите экстракт опреснения белка в уравновешенные стрептавид-C1-конъюгированные магнитные бусы.
- Инкубировать трубку при 4 градусах по Цельсию на 12 ч (или на ночь) на ротаторе, чтобы сродни-очистить биоинтинилатированные белки.
- Захват бусины на магнитной стойке в течение 4 минут на RT, пока бусы собирают на одной стороне трубки, а затем осторожно удалить супернатант пипеткой.
- Добавьте 1,7 мл буфера для мытья I (2% SDS в воде) в трубку и держите его на ротаторе на RT в течение 8 мин. Повторите шаг 8.3.
- Добавьте 1,7 мл буфера для мытья II (50 мМ HEPES: рН 7,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0,1% дезоксихолевой кислоты ,w/v, 1% Triton X-100) в трубку и держите его на ротаторе на РТ в течение 8 мин. Повторите шаг 8.3.
- Добавьте 1,7 мл буфера для мытья III (10 мм Tris-HCl: рН 7,4, 250 мМ LiCl, 1 мМ EDTA, 0,1% дезоксихолевой кислоты ,w/v, 1% NP40 "v/v") в трубку и держите его на ротаторе на RT в течение 8 мин. Повторите шаг 8.3.
- Добавьте 1,7 мл 50 мм Tris-HCl (pH 7.5), чтобы удалить моющее средство, а затем повторите шаг 8.3.
- Перенесите бисер на новую трубку 1,5 мл и повторите шаги 8.11 и 8.3.
- Вымойте бисер 6x в течение 5 минут каждый с 50 мм бикарбонат буфера аммония бикарбонат на RT.
- Добавьте 1 мл 50 мМ буфера бикарбоната аммония в магнитные бусы и хорошо перемешайте.
- Удалите 100 л бусиндляов для анализа иммуноблота, чтобы подтвердить обогащение биотинилатированных белков. Типичная западная поместье показана на рисунке 3.
- Флэш-заморозить остальные образцы белка и храниться при -80 градусах по Цельсию или немедленно отправить их для LC-MS/MS анализа на сухом льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные результаты MS отображаются в предыдущей публикации (Чжан и др. 2019; Рисунок 2, Дополнительные данные 1 и дополнительные данные 2)11. Все наборы данных доступны на MassIVE (найдено на lt;http://massive.ucsd.edu'gt;) с помощью идентификатора: MSV000083018 и MSV000083019.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативные данные, иллюстрирующие ожидаемые результаты, основанные на описанном протоколе, адаптированы из «Чжан идр.11». Рисунок 1 обобщает процедуры выполнения TurboID на основе PL в Н. benthamiana. На рисунке 2 показано выражение белка и биотиниляция в проникнутых листьях Н. Бентамиана. На рисунке 3 показано, что биотинилаповые белки в проникнутых листьях были эффективно обогащены для последующего анализа масс-спектрометрии. Следует отметить, что после обогащения биотинилатированных белков с использованием стрептавидно-C1-конъюгированных магнитных бусинов, различные белки с различными размерами были захвачены, и западный анализ побелки обогащенных белков показал смазанные полосы (Рисунок 3). Аналогичные наблюдения были сделаны в нескольких недавно опубликованных исследованиях6,,7,,13,,14.
Рисунок 1: Обзор метода PL на основе TurboID в Н. Бентамиане. Агробактерии, укрывающие конструкции TurboID-фьюжн, проникли в листья Н. Бентамиана. 36 ч после инфильтрации, 200 мкм биотин проникает в те же листья, чтобы инициировать биотиниляцию эндогенных белков, которые проксимальны к белоку-мишень, слитому TurboID. Проникнунные растения затем инкубируются на RT в течение 3-12 ч, а затем сбор листьев и шлифовка в жидком азоте. Лист порошок лизируется в буфере лиза RIPA, и опреснительная колонка используется для удаления свободного биотина в экстракте белка. Затем биотинилатированные белки были очищены с помощью стрептавидиновых бусинов и идентифицированы масс-спектрометрией. Эта цифра адаптирована из дополнительной рисунок 3 от Чжан идр. 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Иммуноблотный анализ белковых экстрактов, полученных в шаге 4.2. (A) Западный анализ побелки, извлеченные из агроинфильтрированных листьев с антителами против HA тега. (B) Западный анализ побелки биотинилатированных белков в агроинтриджей листья с стрептавидин-HrP. Эта цифра адаптирована из дополнительной диаграммы 6B Чжан идр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Западный анализ поблужев бисера, полученный в шаге 8.15 для подтверждения обогащения биотинилатированных белков. Для каждой конструкции существует три независимых репликации (1, 2 и 3). Стрептавидин-ГПП использовался для анализа биотинилаповых белков в различных образцах. Эта цифра адаптирована из дополнительной рисунок 7 от Чжан идр. 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TurboID биотин лигаза генерируется дрожжей дисплей основе направленной эволюции BioID10. Он имеет много преимуществ по сравнению с другими ферментами PL. TurboID позволяет применять PL к другим модельным системам, включая мух и червей, оптимальная температура роста которых составляет около 25 градусов по Цельсию10. Хотя подход PL широко используется в системах животных, его применение в растениях ограничено. Описанный здесь протокол предусматривает пошаговую процедуру создания TurboID на основе PL в N. benthamiana, модель завода, который был широко использован в исследованиях взаимодействия растительного патогена. В этом протоколе излагаются подготовка образца листьев, удаление свободного биотина, количественная оценка извлеченных белков и обогащение биотинилапотированных белков.
Хотя свободный биотин в системах культуры животных клеток может быть в значительной степени удалены путем мытья клеток с PBS буфер4, свободный биотин в ткани листьев не может быть очищен путем простого мытья. Недавнее исследование показало, что свободный биотин может серьезно повлиять на последующее обогащение биотинилапотированных белков11. В этом протоколе используется опреснительная колонка для успешного удаления свободного биотина в белковых экстрактах, что позволяет эффективно связывать биотинилатированные белки с стрептавидиновыми бусинами.
Кроме того, этот протокол служит важным ориентиром для проведения PL в других системах завода. В последнее время три доклада использовали TurboID основе PL в Arabidopsis12,13,14 и томатный волосатый корень12, кроме Н. benthamiana описано здесь. Подобно системам культуры клеток животных, удаление свободного биотина было достигнуто путем мытья растительных протопластов до извлечения белка6. Однако, более низкое количество свободных молекул биотина которые не были интегрированы к протеину существовали в интерьере клетки, которые повлияли на эффективность затем обогащения биотинилапоированных протеинов. Поэтому процедура опреснения рекомендуется для полного удаления свободного биотина, тем самым повышая эффективность восстановления биотинилаповых белков.
Два типа столбцов, PD-10 и Зеба, были использованы для свободного удаления биотина11,12,13,14. В будущем может возникнуть интерес для сравнения эффективности этих двух столбцов при удалении свободного биотина в экстрактах листового белка. Кроме того, в этом протоколе используется канонический метод агроининининфильтрации при посредничестве шприцев, чтобы преходяще выражать целевой белок, представляющий интерес к листьям Н. Бентамиана. Затем субстрат биотина повторно проникает в листья для маркировки белков, которые проксимальны к целевому белку. Аналогичные операции были также использованы в двух других недавно сообщенных исследований12,13. В качестве альтернативного метода, вакуумно-опосредованного инфильтрации биотина применимо как для N. benthamiana и Arabidopsis14. Кроме того, в растениях, которые не подходят для агроинфильтрации, клеточные культуры могут быть преобразованы для целевого экспрессии белка, а затем лечение биотина и анализ близости маркировки12. Эти недавние исследования подкрепили надежность TurboID на основе PL в изучении ИЦП и заложили основу для будущих применений TurboID основе PL в различных видах растений.
В этом протоколе для определения ИЦП целевого белка, интересующего интерес, используется хорошо зарекомендовавшем себя агробактерия-опосредовано переходное выражение в Н. бентамиане. Agrobacterium Переходное выражение может привести к переэкспрессии белков синтеза. Таким образом, более оптимальной альтернативой является проектирование Fusion TurboID под контролем родного промоутера и выразить его агроинфильтрацией или генерацией стабильных трансгенных линий. С развитием технологии редактирования генома, это также возможно стук в Фрагмент TurboID непосредственно в родной геномных локусов генов, представляющих интерес.
Другим важным фактором, который следует учитывать, является обеспечение того, чтобы fusion TurboID не изменял функцию целевого белка, интересуемого. В предыдущем исследовании, функция иммунного рецептора NLR сливается с TurboID было подтверждено путем тестирования его способности вызывать оборонно-опосредощенной клеточной смерти в присутствии табака мозаичный вирус p50 эффектор11. TurboID относительно больше (т.е. 35 kDa), чем GFP, и его слияние с целевым белком может повлиять на функцию белка-мишени. В таких случаях можно использовать меньший miniTurboID10.
Важно также определить, какая конечность целевого белка подходит для слива с TurboID. Общий подход к таким функциональным тестам определяет, будет ли синтез TurboID дополнять линию мутантов в гене-мишени. Кроме того, можно использовать анализ взаимодействия fusion TurboID с ранее известным партнером взаимодействия целевого белка. В большинстве случаев для цитоплазмических белков N-терминал или C-терминал пометки TurboID могут производить сопоставимые наборы данных при последующем анализе масс-спектрометрии. Однако, для мембранно-локализованных белков, важно определить топологию перед векторной конструкцией. В противном случае слияние TurboID вверх по течению или вниз по течению последовательности кодирования генов, представляющих интерес, будет генерировать совершенно другие результаты. Поэтому важно определить облицовочные стороны (например, цитоплазматическое или просвет) N-термина или C-терминуса мембранно-локализованных белков. Это гарантирует, что ожидаемый проксимальный протеом е-эн-эн белка может быть получен.
Хотя PL имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными подходами IP-MS для обнаружения переходных или слабых ИЦП, она имеет свои собственные внутренние ограничения. Во-первых, выявление белков взаимодействия кандидата не подразумевает непосредственное или косвенное взаимодействие с белком приманки, но отражает только близость2. Таким образом, независимые анализы in vivo (т.е. совместное иммунопрецициция, бимолекулярная флуоресценция дополняют (BiFC) или в пробирке GST-pull down asay) могут быть проведены для дальнейшей проверки ИЦП.
Во-вторых, ложные негативы или ложные срабатывания могут возникнуть в результате проверки PL по разным причинам. Например, ложные негативы могут возникать, когда белок не хватает доступных первичных аминов. Кроме того, недавние исследования interactors BIN2 в растениях показали частичное совпадение данных двух экспериментов13,что свидетельствует о наличии ложных отрицательных результатов из-за недостаточного охвата MS. Некоторые интеркторы целевого белка также могут быть слабо биоцинители TurboID-слитого управления, в результате чего раз обогащения ниже порога отсечения и в конечном итоге потеря некоторых истинных interactors13,14. Таким образом, достаточно биологических репликатов с соответствующими контрольными и значениями отсечения должны быть установлены, чтобы свести к минимуму количество ложных негативов11,14.
Кроме того, длительный период лечения биотина может увеличить биотиниляцию неспецифических белков, в результате чего ложные срабатывания10. Поэтому важно оптимизировать окна времени маркировки in vivo, чтобы уменьшить неспецифическую биотиниляцию, не влияя при этом на производство биотинилатированных белков для анализа11,,12,,13,14. Кроме того, суровая добыча и строгие условия мытья рекомендуется уменьшить ложные срабатывания, полученные из неспецифического связывания белков к бисеру17. Помимо описанных выше оговорок, дизайн надлежащего отрицательного контроля имеет решающее значение для того, чтобы отличить истинных взаимодействующих от ложных взаимодействующих и избежать пропавших без вести истинных взаимодействующих11,12,13,14.
TurboID показал значительно улучшенную маркировку кинетики по сравнению с BioID10,11. Тем не менее, это также может привести к более высокому фону во время анализа PL. Поэтому для устранения фоновых сигналов необходимо включить соответствующие элементы управления. Мы использовали цитрин слитый TurboID в этом протоколе11, и аналогичный контроль был использован в предыдущих исследованиях18. Для целевых белков, которые локализуются на конкретную мембрану органеллы, TurboID сливается с пептидом сигнала, который нацелен на ту же мембрану органеллы, делает лучший контроль, чем TurboID, сливаясь с тем, который выражается в цитоплазме14.
Кроме того, если информация о ключевом домене или аминокислотах в целевом белке, определяющих его взаимодействие с другими партнерами, известна, то совмещение TurboID с целевым белком с мутацией в ключевом домене или аминокислотах должно быть лучшим контролем и максимально снизит фоновые сигналы, генерируемые целевым белком. Кроме того, ферменты TurboID требуют специфических температур, а также надлежащих условий рН. Для большинства органелл в клетке, таких как ER, ядро, и митохондрии, TurboID успешно помечены проксимальных белков10. Однако некоторые специальные органеллы (т.е. вакуолы в клетках растений, рН которых оченьнизкий 19)могут быть непригодны для изучения ИЦП с использованием подхода PL. Кроме того, изменения уровня рН или состояния снижения окисления в подклеточной среде во время реакции на стресс могут повлиять на эффективность маркировки TurboID.
Таким образом, протокол, описанный здесь, служит основой для исследования ИЦП с использованием TurboID в N. benthamiana, модель системы растений, которая широко используется во многих аспектах биологии растений20. С недавно описанных TurboID основе PL исследований в Arabidopsis растений и томатных волосатых корней12,13,14, ожидается, что этот метод станет применимым к другим видам растений. Предполагается, что TurboID основе PL будет играть важную роль в изучении ИЦП в исследованиях биологии растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами От Национальной трансгенной научно-технической программы (2019-X08010-003 до Y.З.), Национального фонда естественных наук Китая (31872637 до Y.З.), а также фундаментальных научно-исследовательских фондов для центральных университетов (2019TC028 к Y.) и NSF-IOS-13544444, NSF-IOS-1339185, и NIH-GM132582-01 до S.P.D.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
