Summary
Beskrivs här är en närhet märkning metod för identifiering av interaktion partner i TIR domänen nlr immun receptorn i Nicotiana benthamiana blad vävnad. Dessutom tillhandahålls ett detaljerat protokoll för identifiering av interaktioner mellan andra proteiner av intresse med hjälp av denna teknik i Nicotiana och andra växtarter.
Abstract
Tekniker för närhetsmärkning (PL) med hjälp av konstruerade ascorbatperoxidas (APEX) eller Escherichia coli biotin ligase BirA (känd som BioID) har framgångsrikt använts för identifiering av protein-proteininteraktioner (PROPO) i däggdjursceller. Kraven på toxisk väteperoxid (H2O2)i APEX-baserad PL, längre inkubationstid med biotin (16–24 h) och högre inkubationstemperatur (37 °C) i BioID-baserade PL begränsar dock kraftigt deras tillämpningar i växter. Den nyligen beskrivna TurboID-baserade PL behandlar många begränsningar av BioID och APEX. TurboID möjliggör snabb närhetsmärkning av proteiner på bara 10 min under rumstemperatur (RT) förhållanden. Även om nyttan av TurboID har visats i djurmodeller, visade vi nyligen att TurboID-baserade PL presterar bättre i växter jämfört med BioID för märkning av proteiner som är proximala till ett protein av intresse. Tillhandahålls här är ett steg-för-steg-protokoll för identifiering av protein interaktion partner med hjälp av N-terminal Toll/interleukin-1 receptorn (TIR) domän av nukleotid-bindande leucin-rika upprepa (NLR) protein familj som modell. Metoden beskriver vektorkonstruktion, agroinfiltration av proteinuttryckskonstruktioner, biotinbehandling, proteinutvinning och avsaltning, kvantifiering och anrikning av de biotinylerade proteinerna genom affinitetsrening. Det protokoll som beskrivs här kan enkelt anpassas för att studera andra proteiner av intresse för Nicotiana och andra växtarter.
Introduction
Prothämmare är grunden för olika cellulära processer. Traditionella metoder för att identifiera prokrommor inkluderar svamp-två-hybrid (Y2H) screening och immunprecipitation i kombination med masspektrometri (IP-MS)1. Båda lider dock av vissa nackdelar. Y2H-screening kräver till exempel att måldjurs- eller djurarter finns tillgängliga för Y2H-bibliotek. Byggandet av dessa bibliotek är arbetsintensivt och dyrt. Dessutom utförs Y2H-metoden i den heterologa eukaryota organismjästen med en cell, som kanske inte representerar cellulära status för högre eukaryota celler.
Däremot visar IP-MS låg effektivitet i att fånga övergående eller svaga probetalare, och det är också olämpligt för de proteiner med lågt överflöd eller hög hydrofobabilitet. Många viktiga proteiner som är involverade i växtsignaleringsvägarna såsom receptorliknande kinaser (RLKs) eller NLR-familjen av immunreceptorer uttrycks på låga nivåer och interagerar ofta med andra proteiner övergående. Därför begränsar det i hög grad förståelsen av mekanismer som ligger till grund för regleringen av dessa proteiner.
Nyligen har närhetsmärkning (PL) metoder baserade på konstruerade ascorbateperoxidas (APEX) och en mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (känd som BioID) har utvecklats och utnyttjats för studier av probetalare2,3,4. Principen för PL är att ett målprotein av intresse är smält med ett enzym, som katalyserar bildandet av labile biotinyl-AMP (bio-AMP). Dessa fria bio-AMP frigörs av PL enzymer och diffusa till närheten av målet proteinet, vilket gör biotinylation av proximala proteiner vid de primära aminer inom en beräknad radie av 10 nm5.
Detta tillvägagångssätt har betydande fördelar jämfört med de traditionella Y2H- och IP-MS-metoderna, såsom förmågan att fånga övergående eller svaga protlyiditeter. Dessutom tillåter PL märkning av proximala proteiner av målproteinet i sina inhemska cellulära miljöer. Olika PL enzymer har unika nackdelar när de appliceras på olika system. Till exempel, även om APEX erbjuder högre märkning kinetik jämfört med BioID och framgångsrikt tillämpas i däggdjurssystem, kravet på giftiga väteperoxid (H2O2) i detta tillvägagångssätt gör det olämpligt för PL-studier i växter.
Däremot undviker BioID-baserade PL användning av giftiga H2O2, men graden av märkning är långsam (kräver 18-24 h för att slutföra biotinylation), vilket gör fångsten av övergående prolkys mindre effektiv. Dessutom medför den högre inkubationstemperatur (37 °C) som krävs för effektiv PL av BioID yttre stress för vissa organismer, såsom växter4. Därför har begränsad användning av BioID-baserade PL i växter (dvs. ris protoplaster, Arabidopsis, och N. benthamiana) rapporterats6,7,8,9. Den nyligen beskrivna TurboID enzym övervinner bristerna i APEX och BioID-baserade PL. TurboID visade hög aktivitet som gör det möjligt att uppnå PL inom 10 min på RT10. TurboID-baserade PL har framgångsrikt tillämpats i däggdjursceller, flugor och maskar10. Nyligen har vi och andra forskargrupper självständigt optimerat och utökat användningen av TurboID-baserade PL för att studera prober i olika växtsystem, inklusive N. benthamiana och Arabidopsis växter och tomat håriga rötter11,12,13,14. Jämförande analyser visade att TurboID presterar bättre för PL i anläggningar jämfört med BioID11,14. Det har också visat robustheten hos TurboID-baserade PL i planta genom att identifiera ett antal nya interaktioner med en NLR immunreceptor11, ett protein vars interaktionspartners vanligtvis är svåra att få med traditionella metoder.
Detta protokoll illustrerar TurboID-baserade PL i planta genom att beskriva identifiering av interaktion proteiner av N-terminal TIR domän nlr immunreceptorn i N. benthamiana växter. Metoden kan utvidgas till alla proteiner av intresse i N. benthamiana. Ännu viktigare, det ger en viktig referens för att undersöka protidies i andra växtarter som Arabidopsis,tomat, och andra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: En översikt över metoden visas i figur 1.
1. Beredning av växtmaterial
- Odla N. benthamiana frön i våt jord vid en hög densitet och underhålla dem i en klimatkammare med en 16 h ljus (ca 75 μmol/m2s) och 8 h mörk fotoperiod vid 23-25 °C .
- Ungefär 1 vecka senare, försiktigt överföra varje ung planta till 4 'x 4 ' krukor och hålla plantorna i samma kammare.
- Underhåll växterna i kammaren i ca 4 veckor tills de växer till ett blad stadium av 4-8 för efterföljande agroinfiltration15.
2. Konstruktion av TurboID fusioner
- Använd standardmolekylär kloningsteknik för att generera fusion av målproteinet med TurboID (PCR TurboID från Addgene plasmid #107177). Här använde vi N-terminalEN TIR domän NLR immunreceptorn som målprotein av intresse och konstruerade TIR smält till TurboID under kontroll av blomkål mosaikvirus 35S promotor (p35S::TIR-TurboID).
OBS: Fusion av TurboID-enzymet till karossyl-ändstationen eller amino-ändstationen för målproteinet beror på det protein som är av intresse. Vanligtvis, för ett cytoplasmiskt protein, bör båda termini vara acceptabelt, så länge TurboID-fusionen inte påverkar målproteinets funktion. Men för ett membran lokaliserat protein bör proteintopologin karakteriseras i förväg innan du bestämmer vilken ändstation som är bäst för TurboID-fusion. - Konstruera en TurboID-smält citrin under samma promotor för att fungera som kontroll för efterföljande kvantitativ proteomisk analys.
OBS: Det är viktigt att konstruera en TurboID-kontroll för att identifiera proteomproximala till målproteinet. TurboID-fusionskontrollen bör visa en uttrycksnivå som liknar den turboID-fusionsfusionsprotein. Detta kan empiriskt bestämmas genom att justera Agrobacterium koncentrationen under agroinfiltration. Dessutom är det viktigt att kontrollproteinet har ett subcellulärt lokaliseringsmönster som liknar målproteinet av intresse.
3. Agroinfiltration
- Omvandling av plasmiderna till Agrobacterium
- Tillsätt 0,5 μg av de plasmider som genereras från steg 2.1 och 2.2 till 50 μL Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 kompetenta celler, beredda enligt beskrivningen tidigare16.
ANDRA Agrobakterierstammar, såsom GV2260, kan också användas. - Inkubera på is i 30 min.
- Värmechock i ett vattenbad vid 42 °C för 60 s.
- Tillsätt 400 μl LB-medium (10 g/L trypton, 5 g/l jästextrakt och 10 g/L NaCl; pH = 7.0) till Agrobacterium och inkubera vid 28 °C i 90 min.
- Platta hela innehållet i röret på LB agar kompletterat med lämpliga antibiotika för att välja plasmid, liksom för Agrobacterium (för GV3101: 50 mg/L gentamicin och 50 mg/L rifampicin).
- Inkubera plattor vid 28 °C i 36–48 timmar tills enskilda kolonier är synliga.
- Tillsätt 0,5 μg av de plasmider som genereras från steg 2.1 och 2.2 till 50 μL Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 kompetenta celler, beredda enligt beskrivningen tidigare16.
- Plocka och strimlat flera enskilda kolonier på en färsk LB agar platta med antibiotika (se steg 3.1.5) och växa vid 28 °C över natten.
OBS: Det är mer optimalt att utföra kolonin PCR för att bekräfta närvaron av den specifika binära konstruktionen i Agrobacterium. Enligt vår erfarenhet innehåller över 95% av kolonierna de introducerade binära konstruktionerna. - Inokulera 3 ml LB-medium plus lämpliga antibiotika (se steg 3.1.4) med Agrobacterium koloni som hyser konstruktionen av intresse, och inkubera genom att skaka över natten vid 28 °C tills OD600 av Agrobacterium kulturen når 2,0.
- Centrifugera cellerna på 3000 x g och återanvända dem till OD600 = 1,0 i agroinfiltrationsbuffert (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH = 5,6], 250 μM acetosyringone).
OBS: Även om det är optimalt att inkubera inokulat i 2 h vid RT före agroinfiltration, enligt vår erfarenhet av GV3101-stammen, har det enligt vår erfarenhet av GV3101-stammen inte varit någon större skillnad mellan målproteinuttrycket med vs. utan inkubation. - Använd en 1 ml nållös spruta för att infiltrera inokulat i (abaxial) epidermis av de fullt mogna N. benthamiana bladen.
OBS: För att förbereda en tillräcklig mängd bladmaterial för tre biologiska replikat: ett helt blad är vanligtvis infiltreras, tre blad infiltreras per växt, och tre till fyra växter används för varje konstruktion. För varje blad räcker det med 1,5–2,0 ml återsuspenderad agrobakterieria. - Efter 36 h post-infiltration (hpi), infiltrera 200 μM biotin (i 10 mM MgCl2 lösning) i bladen förinfiltrerade med TurboID konstruktioner.
- Underhåll anläggningen i ytterligare 3–12 timmar innan bladvävnaden skördas enligt beskrivningen i avsnitt 4.
OBS: Anledningen till att välja 36 hpi för biotin infiltration är att målet protein uttryck toppar vid denna tidpunkt enligt tidigare studier11. Det rekommenderas att bestämma den tid som krävs för optimal uttryck för målproteinet av intresse. Inkubationstiden efter biotininfiltrationen beror på den experimentella designen och målproteinet som studeras. Vanligtvis, 3-12 h av biotin behandling tillåter märkning av de flesta proteiner proximala till målet protein av TurboID fusioner.
4. Insamling av bladprov
OBS: För efterföljande bearbetning av bladproverna, använd sterila handskar för att undvika keratinkontaminering av proverna. Alla reagenser bör också vara så keratinfria som möjligt.
- Skär de infiltrerade bladen vid basen av petiole, ta bort blad venen, sedan flash-frysa bladvävnaden i flytande kväve.
- Slipa bladvävnaden med hjälp av en mortel och mortel och förvara bladpulvret i 15 ml eller 50 ml falkrör vid -80 °C för efterföljande användning.
OBS: Ta tre till fyra bitar av blad för var och en av de tre biologiska replikat från olika växter. Protokollet kan pausas här. Före efterföljande steg rekommenderas att man bedömer proteinuttryck och biotinylering av målproteinet genom immunoblotanalyser. Typiska västerländska blots visas i figur 2.
5. Extraktion av blad totalt protein
- Överför ca 0,35 g bladpulver till ett 2 ml-rör. Förbered två rör för varje prov.
VARNING: Använd handskar när du vidrör något föremål som kyls av flytande kväve. - Tillsätt 700 μl RIPA lysis buffert (50 mM Tris-HCl [pH = 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0,5% natriumdeoxycholat [w/v], 1 mM DTT, 1 tablett proteashämmarecocktail) till 0,35 g bladpulver.
- Vortex rören i 10 min.
- Lämna proverna på is i 30 min.
- Blanda innehållet var 4–5:e minut genom att vrida rören upp och ner flera gånger.
6. Avlägsnande av fri biotin genom avsaltning
OBS: Detta avsnitt tar ca 50 min.
- Jämvikta avsaltningskolonnen.
- Ta bort tätningen längst ner i avsaltningskolonnen och lägg kolonnen i ett 50 ml-rör.
- Ta bort lagringslösningen genom centrifugering vid 1000 x g och 4 °C i 2 min och se till att locket lossnar.
- Sätt avsaltningskolonnen i ett 50 ml-rör. Balansera kolonnen 3x med 5 ml RIPA lysbuffert, varje gång centrifugering vid 1000 x g och 4 °C i 2 min och kasta flödet genomströmningen.
- Överför avsaltningskolonnen till ett nytt 50 ml-rör och förvara tillfälligt vid 4 °C för efterföljande användning.
- Snurra rören från steg 5.4 vid 16 500 x g och 4 °C i 10 min och överför supernatanten från de två rören till ett nytt 2 ml-rör.
- Tillsätt 1 500 μl proteinextrakt till toppen av hartset i den ekvilibrerade desaltningskolonnen (från steg 6.1.4). När proteinextraktet kommer in i hartset, tillsätt ytterligare 100 μl RIPA lysis buffert.
OBS: Även om 1 400 μl RIPA-lysbuffert användes för proteinutvinning från bladen, ökade den totala volymen efter proteinutvinning och avsaltning alltid i viss utsträckning i förhållande till den ursprungliga volymen. En kombination av proverna från varje grupp enligt beskrivningen i steg 5.1 och 5.4 kan därför resultera i minst 1 500 μl proteinextrakt per prov. - Centrifugera vid 1000 x g och 4 °C i 2 min och lämna de avsaltade proverna på is tillfälligt.
7. Kvantifiering av de avsaltade proteinextrakten med hjälp av en Bradford-analys
- Förbered 50 μl av varje gradient BSA-lösning: 0 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml och 1 mg/ml.
- Späd det avsaltade proteinextraktet genom att blanda ett 5 μL prov med 45 μL ddH2O.
- Förbered 1x Bradford regent genom att späda ut 5x Bradford regent (100 mg Coomassie lysande blå G250, 47 ml metanol, 100 ml 85% fosforsyra, 53 ml ddH2O).
- Tillsätt 50 μl av varje gradient BSA-lösning och 50 μl utspädd proteinextrakt till 2,5 ml 1x Bradford regent.
- Inkubera på RT i 10 min.
- Tillsätt 200 μl lösning av varje prov till en brunn av en ELISA-platta (tre tekniska replikat per prov).
- Mät OD595 med hjälp av en mikroplåtsläsare.
- Rita standardkurvan baserat på värdet av lutnings-BSA-lösningen och beräkna koncentrationen av de avsaltade proteinproverna. Vanligtvis varierar den totala proteinkoncentrationen från 0,7 g blad från 3–6 mg/ml.
- Förbered 6–8 mg avsaltat proteinextrakt för efterföljande affinitetsrening.
8. Anrikning av biotinylerade proteiner
- Ta 200 μL streptavidn-C1-konjugerade magnetiska pärlor i ett 2 ml-rör.
- Jämvikta de streptavidn-C1-konjugerade magnetiska pärlorna med 1 ml RIPA lysisbuffert i 1 min vid RT.
- Efter varje tvätt, använd magnetracket för att adsorbera pärlorna i 3 min och ta försiktigt bort lösningen genom pipettering.
- Upprepa steg 8.2 och 8.3.
- Överför det avsaltade proteinextraktet till de ekvilibrerade streptavidn-C1-konjugerade magnetiska pärlorna.
- Inkubera röret vid 4 °C i 12 timmar (eller över natten) på en rotator för att affinitetsrena de biotinylerade proteinerna.
- Fånga pärlorna på ett magnetiskt rack i 4 min vid RT tills pärlorna samlas på ena sidan av röret och ta sedan försiktigt bort supernatanten med pipett.
- Tillsätt 1,7 ml tvättbuffert I (2% SDS i vatten) till röret och håll den på rotatorn vid RT i 8 min. Upprepa steg 8.3.
- Tillsätt 1,7 ml tvättbuffert II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholic syra [w/v], 1% Triton X-100) till röret och håll den på rotator vid RT i 8 min. Upprepa steg 8.3.
- Tillsätt 1,7 ml tvättbuffert III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholic syra [w/v], 1% NP40 [v/v]) till röret och håll den på rotatorn vid RT i 8 min. Upprepa steg 8.3.
- Tillsätt 1,7 ml 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5) för att ta bort tvättmedlet och upprepa sedan steg 8.3.
- Överför pärlorna till ett nytt 1,5 ml-rör och upprepa steg 8.11 och 8.3.
- Tvätta pärlorna 6x i 5 min vardera med 50 mM ammoniumbikarbonatbuffert vid RT.
- Tillsätt 1 ml 50 mM ammoniumbikarbonatbuffert till de magnetiska pärlorna och blanda väl.
- Ta bort 100 μl pärlor för immunblotanalys för att bekräfta anrikningen av biotinylerade proteiner. En typisk västerländsk blot visas i figur 3.
- Flash-frysa resten av proteinproverna och lagras vid -80 °C eller skicka dem omedelbart för LC-MS/MS-analys på torris.
Vanliga MS-resultat visas i en tidigare publikation (Zhang m.fl. 2019; Figur 2, kompletterande uppgifter 1 och kompletterande uppgifter 2)11. Hela datamängder finns på MassIVE (finns på
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representativa uppgifterna, som illustrerar de förväntade resultaten baserat på det beskrivna protokollet, anpassas från Zhang et al11. Figur 1 sammanfattar förfarandena för att utföra TurboID-baserade PL i N. benthamiana. Figur 2 visar proteinuttryck och biotinylation i de infiltrerade N. benthamiana bladen. Figur 3 visar att de biotinylerade proteinerna i de infiltrerade bladen effektivt berikades för efterföljande masspektrometrianalys. Det bör noteras att efter anrikning av biotinylerade proteiner med streptavidn-C1-konjugerade magnetiska pärlor, olika proteiner med varierande storlekar fångades, och västra blot analys av berikade proteiner visade utsmetade band (figur 3). Liknande observationer har gjorts i flera nyligen publicerade studier6,,7,,13,14.
Figur 1: Översikt över den TurboID-baserade PL-metoden i N. benthamiana. Agrobacterium som hyser TurboID-fusionkonstruktionerna infiltrerades i N. benthamiana blad. 36 h postinfiltration, 200 μM biotin infiltreras till samma blad för att initiera biotinylation av endogena proteiner som är proximala till TurboID-smält målprotein. De infiltrerade växterna inkuberas sedan på RT i 3–12 timmar, följt av bladskörd och slipning i flytande kväve. Bladpulver är lyst i RIPA lysis buffert, och en avsaltning kolumn används för att ta bort den fria biotin i proteinextraktet. Biotinylated proteiner var sedan affinitet-renas med streptavidin-konjugerade pärlor och identifieras av massa spektrometri. Denna siffra är anpassad från kompletterande figur 3 från Zhang et al11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Immunblotanalys av proteinextrakt som erhållits i steg 4.2. (A)Västerländsk blot analys av proteiner som utvinns ur de agroinfiltrated bladen med antikroppar mot HA tag. B)Västerländsk blotanalys av biotinylerade proteiner i de agroinfiltiserade bladen med streptavidin-HRP. Denna siffra är anpassad från kompletterande figur 6B av Zhang et al11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Analys av pärlor i västerländska fläckar som erhållits i steg 8.15 för att bekräfta anrikningen av biotinylerade proteiner. För varje konstruktion finns det tre oberoende replikat (1, 2 och 3). Streptavidin-HRP användes för analys av biotinylerade proteiner i olika prover. Denna siffra är anpassad från kompletterande figur 7 från Zhang et al11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TurboID biotin ligase genereras av jäst display-baserad riktad utveckling av BioID10. Det har många fördelar jämfört med andra PL enzymer. TurboID tillåter tillämpning av PL till andra modellsystem, inklusive flugor och maskar, vars optimala tillväxttemperatur är runt 25 °C10. Även om PL-metoden har använts i stor utsträckning i djursystem är dess tillämpning i växter begränsad. Protokollet beskrivs här ger en steg-för-steg förfarande för att upprätta TurboID-baserade PL i N. benthamiana, en modell anläggning som har använts i stor utsträckning i växt-patogen interaktion studier. Detta protokoll beskriver bladprovsberedning, avlägsnande av fri biotin, kvantifiering av extraherade proteiner och anrikning av de biotinylerade proteinerna.
Även om fri biotin i djurcell kultur system kan till stor del bort genom att tvätta cellerna med PBS buffert4, den fria biotin i bladvävnad kan inte rensas genom enkel tvätt. En nyligen genomförd studie visade att den fria biotinen allvarligt kan påverka efterföljande anrikning av de biotinylerade proteinerna11. I detta protokoll används en avsaltningskolonn för att framgångsrikt ta bort fri biotin i proteinextrakten, vilket möjliggör effektiv bindning av biotinylerade proteiner till streptavidinpärlorna.
Dessutom fungerar detta protokoll som en viktig referens för genomförandet av PL i andra anläggningssystem. Nyligen har tre rapporter använt TurboID-baserade PL i Arabidopsis12,13,14 och tomat hårig rot12, förutom N. benthamiana beskrivs här. I likhet med djurcellsodlingssystem uppnåddes avlägsnandet av den fria biotinen genom att växtprotoplasterna tvättades före proteinutvinning6. Men lägre mängder av fria biotinmolekyler som inte integrerades i proteinet fanns i cellens inre, vilket påverkade effektiviteten i efterföljande anrikning av de biotinylerade proteinerna. Därför rekommenderas ett avsaltningsförfarande för fullständigt avlägsnande av fri biotin, vilket ökar återvinningseffektiviteten hos biotinylerade proteiner.
Två typer av kolumner, PD-10 och Zeba, har använts för fri biotin borttagning11,12,13,14. Det kan vara av intresse i framtiden att jämföra effektiviteten av dessa två kolumner för att ta bort gratis biotin i blad proteinextrakt. Dessutom använder detta protokoll en kanonisk spruta-medierad agroinfiltration metod för att övergående uttrycka målet protein av intresse för N. benthamiana blad. Sedan är biotinsubstratet återfiltrerat i bladen för märkning av proteiner som är proximala till målproteinet. Liknande operationer har också använts i andra två nyligen rapporterade studier12,13. Som en alternativ metod är vakuummedied infiltration av biotin tillämplig för både N. benthamiana och Arabidopsis14. Dessutom, i växter som inte är lämpliga för agroinfiltration, cellkulturer kan omvandlas för målprotein uttryck, följt av biotin behandling och närhet märkning analys12. Dessa nyligen genomförda studier har underbyggt robustheten hos TurboID-baserade PL i att studera protontonom och har lagt grunden för framtida tillämpningar av TurboID-baserade PL i olika växtarter.
I detta protokoll används väletablerade Agrobacterium-medieradtransienta uttryck i N. benthamiana för att identifiera protlyid av målproteinet av intresse. Övergående uttryck kan leda till överuttryck av fusionsproteinerna. Därför är ett mer optimalt alternativ att konstruera TurboID fusion under kontroll av en infödd promotor och uttrycka det genom agroinfiltration eller generering av stabila transgena linjer. Med utvecklingen av genomredigeringsteknik är det också möjligt att slå in TurboID-fragmentet direkt i den inhemska genomiska lokusen av gener av intresse.
En annan viktig faktor som bör beaktas är att se till att TurboID-fusionen inte ändrar funktionen hos målproteinet av intresse. I en tidigare studie, funktionen av NLR immunreceptorn smält till TurboID bekräftades genom att testa dess förmåga att inducera försvar-medierad celldöd i närvaro av Tobak mosaik virus p50 effektor11. TurboID är relativt större (dvs. 35 kDa) än GFP, och dess fusion till ett målprotein kan påverka funktionen hos ett målprotein. I sådana fall kan den mindre miniTurboID10 användas.
Det är också viktigt att bestämma vilken ändstation av målproteinet som är lämplig för sammansmätande med TurboID. En allmän metod för sådana funktionella tester är att avgöra om TurboID-fusionen kommer att komplettera målgenens muterade växtlinje. Alternativt kan analys av samspelet mellan TurboID-fusionen med en tidigare känd interaktionspartner till målproteinet användas. I de flesta fall, för cytoplasmatiska proteiner, N-terminal eller C-terminal märkning av TurboID kan producera jämförbara datamängder i efterföljande masspektrometri analys. Men för membran-lokaliserade proteiner, Det är viktigt att bestämma topologin innan vektor konstruktion. Annars kommer fusion av TurboID uppströms eller nedströms kodningssekvensen av gener av intresse att generera helt olika resultat. Därför är det viktigt att bestämma de motstående sidorna (t.ex. cytoplasmatiska- eller lumenvända) av N-ändstationen eller C-ändstationen hos de membranlokaliserade proteinerna. Detta säkerställer att det förväntade proximala proteomet av målproteinet kan erhållas.
Även om PL har flera fördelar jämfört med de traditionella metoderna för immateriella rättigheter för att upptäcka övergående eller svaga probetalare, har företaget sina egna inneboende begränsningar. För det första innebär identifiering av en kandidat interaktion proteiner inte omedelbart en direkt eller indirekt interaktion med bete protein, men det återspeglar bara nära2. Oberoende in vivo-analyser (dvs. co-immunoprecipitation, bimolekylär fluorescenskomplementering [BiFC] eller in vitro GST-pull down-analys) kan därför utföras för att ytterligare kontrollera protontoniteter.
För det andra kan falska negativ eller falska positiva uppstå från PL-analys på grund av olika skäl. Till exempel kan falska negativ uppstå när proteinet saknar tillgängliga primära aminer. Dessutom visade nyligen genomförda studier av BIN2-samspelare i växter en partiell överlappning mellan data från två experiment13, vilket tyder på förekomsten av falska negativa resultat på grund av otillräcklig MS-täckning. Vissa interactors av målproteinet kan också vara svagt biotinylerade av TurboID-smält kontroll, vilket resulterar i en vikberikning under cutoff tröskeln och så småningom förlusten av vissa sanna interactors13,14. Därför bör tillräckliga biologiska replikat med lämpliga kontroller och brytpunkter ställas in för att minimera antalet falska negativ11,14.
Dessutom kan en lång biotinbehandlingsperiod öka biotinylationen av ospecifika proteiner, vilket resulterar i falska positiva10. Därför är det viktigt att optimera in vivo märkning tidsfönster för att minska den ospecifika biotinylation, utan också påverkar produktionen av biotinylerade proteiner för analys11,,12,,13,14. Dessutom rekommenderas hård extraktion och stränga tvättförhållanden för att minska de falska positiva identifieringar som härrör från ospecificerad bindning av proteiner till pärlorna17. Förutom de förbehåll som beskrivs ovan, är utformningen av en ordentlig negativ kontroll avgörande för att skilja sanna interactorer från falska interactors och undvika att missa av sanna interactors11,12,13,14.
TurboID visade kraftigt förbättrad märkning kinetik jämfört med BioID10,11. Detta kan dock också leda till en högre bakgrund under PL-analys. Därför måste lämpliga kontroller inkluderas för att eliminera bakgrundssignalerna. Vi använde citrin-smält TurboID i detta protokoll11, och en liknande kontroll har använts i tidigare studier18. För målproteiner som lokaliserar till en specifik organellmembran, TurboID smälter med en signal peptid som riktar sig till samma organelle membran gör en bättre kontroll än TurboID fusing med en som uttrycks i cytoplasman14.
Dessutom, om information om de viktigaste domänen eller aminosyror i målet protein som bestämmer dess interaktioner med andra partners är kända, smälta TurboID med ett målprotein med en mutation i nyckeldomänen eller aminosyror bör vara den bästa kontrollen och kommer maximalt minska bakgrundssignaler som genereras av målet proteinet. Dessutom kräver TurboID-enzymer specifika temperaturer samt korrekta pH-förhållanden. För de flesta organeller i cellen som ER, kärnan och mitokondrierna, TurboID framgångsrikt märkt proximala proteiner10. Vissa speciella organeller (dvs. vakuoler i växtceller, vars pH är mycket lågt19) kan dock inte vara lämpliga för att studera protkunskaper med hjälp av PL-metoden. Dessutom kan förändringar i pH-nivåerna eller oxidationsreduktionstillstånden i subcellulära miljön under stressresponsen påverka TurboID:s märkningseffektivitet.
Sammanfattningsvis protokollet beskrivs här utgör grunden för att undersöka probetalare med TurboID i N. benthamiana, en modell växt system som har använts i stor utsträckning i många aspekter av växtbiologi20. Med den nyligen beskrivna TurboID-baserade PL studier i Arabidopsis växter och tomat håriga rötter12,13,14, förväntas denna metod bli tillämplig på andra växtarter. Det förväntas att TurboID-baserade PL kommer att spela en viktig roll i att studera prottros i växtbiologi forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 till Y.Z.), National Natural Science Foundation of China (31872637 till Y.Z.)) och grundforskningsfonderna för de centrala universiteten (2019TC028 till Y.Z.) och NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, och NIH-GM132582-01 till S.P.D.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
