Summary
Beskrevet her er en nærhed mærkning metode til identifikation af interaktion partnere tir domæne NLR immunreceptoren i Nicotiana benthamiana bladvæv. Der findes også en detaljeret protokol til identifikation af interaktioner mellem andre proteiner af interesse ved hjælp af denne teknik i Nicotiana og andre plantearter.
Abstract
Nærhedsmærkningsteknikker (PL) ved hjælp af manipuleret ascorbatperoxidase (APEX) eller Escherichia coli biotin ligase BirA (kendt som BioID) er med succes blevet anvendt til identifikation af proteinproteininteraktioner (PPI) i pattedyrceller. Kravene til giftig hydrogenperoxid (H2O2) i APEX-baseret PL, længere inkubationstid med biotin (16-24 timer) og højere inkubationstemperatur (37 °C) i BioID-baseret PL begrænser imidlertid i alvorlig grad deres anvendelse i planter. Den nyligt beskrevne TurboID-baserede PL adresser mange begrænsninger af BioID og APEX. TurboID giver mulighed for hurtig nærhed mærkning af proteiner på bare 10 min under stuetemperatur (RT) betingelser. Selv om nytten af TurboID er blevet påvist i dyremodeller, vi for nylig viste, at TurboID-baserede PL klarer sig bedre i planter i forhold til BioID for mærkning af proteiner, der er proksimale til et protein af interesse. Forudsat her er en trin-for-trin protokol til identifikation af protein interaktion partnere ved hjælp af N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domæne af nukleotid-bindende leucin-rige gentage (NLR) protein familie som model. Metoden beskriver vektorkonstruktion, agroinfiltration af proteinekspressionskonstruktioner, biotinbehandling, proteinekstraktion og afsaltning, kvantificering og berigelse af de biotinyterede proteiner ved affinitetsrensning. Den protokol, der er beskrevet her, kan let tilpasses til at studere andre proteiner af interesse i Nicotiana og andre plantearter.
Introduction
PPI er grundlaget for forskellige cellulære processer. Traditionelle metoder til identifikation af PPI omfatter gær-to-hybrid (Y2H) screening og immunudfældning kombineret med massespektrometri (IP-MS)1. Men begge lider under nogle ulemper. For eksempel kræver Y2H screening tilgængeligheden af Y2H bibliotek af målet plante eller dyrearter. Opførelsen af disse biblioteker er arbejdskrævende og dyrt. Desuden udføres Y2H-metoden i den heterologe eukaryote organismegær med en enkelt celle, som muligvis ikke repræsenterer den cellulære status for højere eukaryote celler.
I modsætning hertil viser IP-MS lav effektivitet i indfangning af forbigående eller svage PPI, og det er også uegnet til de proteiner med lav overflod eller høj hydrofobitet. Mange vigtige proteiner involveret i planten signalering veje såsom receptor-lignende kinaser (RLKs) eller NLR familie af immunreceptorer udtrykkes på lave niveauer og ofte interagere med andre proteiner forbigående. Derfor begrænser det i høj grad forståelsen af mekanismer, der ligger til grund for reguleringen af disse proteiner.
For nylig, nærhed mærkning (PL) metoder baseret på manipuleret ascorbat peroxidase (APEX) og en mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (kendt som BioID) er blevet udviklet og udnyttet til studiet af PPI2,3,4. Princippet i PL er, at et målprotein af interesse er sammensmeltet med et enzym, som katalyserer dannelsen af labilbiotinyl-AMP (bio-AMP). Disse frie bio-AMP frigives af PL enzymer og diffuse til nærheden af målet protein, så biotinylation af proksimale proteiner på de primære aminer inden for en anslået radius på 10 nm5.
Denne tilgang har betydelige fordele i forhold til de traditionelle Y2H- og IP-MS-tilgange, såsom evnen til at fange forbigående eller svage PPI. Desuden tillader PL mærkning af proksimale proteiner af målproteinet i deres oprindelige cellulære miljøer. Forskellige PL enzymer har unikke ulemper, når de anvender dem til forskellige systemer. Selv om APEX tilbyder højere tagging kinetik sammenlignet med BioID og anvendes med succes i pattedyrsystemer, gør kravet om giftig hydrogenperoxid (H2O2)i denne metode det uegnet til PL-undersøgelser i planter.
I modsætning hertil undgår BioID-baseret PL brugen af den giftige H2O2, men mærkningshastigheden er langsom (kræver 18-24 h for at fuldføre biotinylation), hvilket gør indfangningen af forbigående PPI mindre effektiv. Desuden medfører den højere inkubationstemperatur (37 °C), der kræves for effektiv PL ved BioID, ekstern stress for nogle organismer, såsom planter4. Der er derfor rapporteret om begrænset udbredelse af BioID-baseret PL i planter (dvs. risprotoplasts, Arabidopsis og N. benthamiana) 6,7,8,9. Den nyligt beskrevne TurboID enzym overvinder manglerne ved APEX og BioID-baserede PL. TurboID viste høj aktivitet, der gør det muligt at realiseringen af PL inden for 10 min på RT10. TurboID-baserede PL er blevet anvendt med succes i pattedyr celler, fluer, og orme10. For nylig har vi og andre forskningsgrupper uafhængigt optimeret og udvidet brugen af TurboID-baserede PL til at studere PPI i forskellige plantesystemer, herunder N. benthamiana og Arabidopsis planter og tomat behårede rødder11,,12,13,14. Sammenlignende analyser viste , at TurboID klarer sig bedre for PL i planter sammenlignet med BioID11,14. Det har også vist robustheden af TurboID-baseret PL i planta ved at identificere en række nye interaktioner med en NLR immunreceptor11, et protein, hvis interaktionspartnere normalt er vanskelige at opnå ved hjælp af traditionelle metoder.
Denne protokol illustrerer det TurboID-baserede PL i planta ved at beskrive identifikationen af interaktionsproteiner i NLR-immunreceptorens N-terminal-tir-domæne i N. benthamianaplanter. Metoden kan udvides til at omfatte proteiner af interesse i N. benthamiana. Endnu vigtigere, det giver en vigtig reference til at undersøge PPI i andre plantearter såsom Arabidopsis, tomat, og andre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: En oversigt over metoden er vist i figur 1.
1. Fremstilling af plantemateriale
- Grow N. benthamiana frø i våd jord ved en høj tæthed og vedligeholde dem i et klimakammer med en 16 h lys (ca. 75 μmol/m2s) og 8 h mørkt fotoperiode ved 23-25 °C.
- Omkring 1 uge senere, omhyggeligt overføre hver ung sætteplante til 4 'x 4' potter og holde planter i samme kammer.
- Vedligehold planterne i kammeret i ca 4 uger, indtil de vokser til et blad fase af 4-8 for efterfølgende agroinfiltration15.
2. Opførelse af TurboID-fusioner
- Brug standardmolekylær kloningsteknik til at generere fusion af målproteinet med TurboID (PCR TurboID fra Addgene plasmid #107177). Her brugte vi N-terminal TIR domæne NLR immun receptor som målet protein af interesse og konstrueret TIR smeltet til TurboID under kontrol af Blomkål mosaik virus 35S promotor (p35S::TIR-TurboID).
BEMÆRK: Fusion af TurboID-enzymet til carboxyl-endetidens eller amino-endetidens af målproteinet vil afhænge af det protein af interesse. Normalt, for et cytoplasmamisk protein, begge termini bør være acceptabelt, så længe TurboID fusion ikke påvirker funktionen af målet protein. For et membranlokaliseret protein bør proteintopologien dog karakteriseres på forhånd, før det afgøres, hvilken endetid der er bedst til TurboID-fusion. - Konstruere en TurboID-fusioneret citrin under samme promotor for at fungere som kontrol for efterfølgende kvantitativ proteomisk analyse.
BEMÆRK: Det er vigtigt at konstruere en TurboID-kontrol til identifikation af proteomproksimalt til målproteinet. TurboID-fusionskontrollen skal vise et udtryksniveau svarende til det TurboID-sammensmeltede målprotein. Dette kan empirisk bestemmes ved at justere Agrobacterium koncentrationen under agroinfiltration. Desuden er det vigtigt, at kontrolproteinet har et subcellulært lokaliseringsmønster svarende til målproteinet af interesse.
3. Agroinfiltration
- Omdannelse af plasmider til Agrobacterium
- Der tilsættes 0,5 μg plasmider fra trin 2.1 og 2,2 til 50 μL Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101 kompetente celler, fremstillet som beskrevet tidligere16.
BEMÆRK: Andre Agrobacterium stammer, såsom GV2260, kan også anvendes. - Inkuber på is i 30 min.
- Varmechok i et vandbad ved 42 °C i 60 s.
- Der tilsættes 400 μL LB-medium (10 g/L tryptone, 5 g/L gærekstrakt og 10 g/L NaCl; pH = 7,0) til Agrobacterium og inkuberes ved 28 °C i 90 min.
- Pladen hele indholdet i røret på LB agar suppleret med passende antibiotika for at vælge plasmid, samt for Agrobacterium (for GV3101: 50 mg/l gentamicin og 50 mg/l rifampicin).
- Inkuberpladerne ved 28 °C i 36-48 timer, indtil de enkelte kolonier er synlige.
- Der tilsættes 0,5 μg plasmider fra trin 2.1 og 2,2 til 50 μL Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101 kompetente celler, fremstillet som beskrevet tidligere16.
- Pick og streak flere individuelle kolonier på en frisk LB agar plade med antibiotika (se trin 3.1.5) og vokse ved 28 °C natten over.
BEMÆRK: Det er mere optimalt at udføre kolonien PCR for at bekræfte tilstedeværelsen af den specifikke binære konstruktion i Agrobacterium. Det er vores erfaring, at over 95% af kolonierne indeholder de indførte binære konstruktioner. - Inokulere 3 ml LB-medium plus passende antibiotika (se trin 3.1.4) med Agrobacteriumkoloni, der huser den pågældende konstruktion, og inkuberer ved at ryste natten over ved 28 °C, indtil OD600 i Agrobacterium-kulturen når 2,0.
- Cellerne centrifugeres ved 3.000 x g, og de suspenderes igen til OD600 = 1,0 i agroinfiltrationsbuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH = 5,6], 250 μM acetosyringone).
BEMÆRK: Selv om det er optimalt at inkubere inoculum i 2 timer på RT før agroinfiltration, har der i vores erfaring med GV3101-stammen ikke været stor forskel på målproteinudtrykket med vs. uden inkubation. - Brug en 1 ml nåleløs sprøjte til at infiltrere inoculum i (aksial) epidermis af de fuldt modne N. benthamiana blade.
BEMÆRK: For at forberede en tilstrækkelig mængde bladmaterialer til tre biologiske replikater: et helt blad er normalt infiltreret, tre blade infiltreres pr. plante, og tre til fire planter anvendes til hver konstruktion. For hvert blad er 1,5-2,0 ml resuspenderede agrobakterier tilstrækkeligt. - Efter 36 h post-infiltration (hpi), infiltrere 200 μM biotin (i 10 mM MgCl2 opløsning) i bladene forinfiltreret med TurboID konstruktioner.
- Planten opretholdes i yderligere 3-12 timer, inden bladvævet høstes som beskrevet i afsnit 4.
BEMÆRK: Grunden til at vælge 36 hki til biotininfiltration er, at målproteinudtrykket topper på dette tidspunkt i henhold til tidligere undersøgelser11. Det tilrådes at bestemme den tid, der kræves for optimal ekspression af målet protein af interesse. Inkubationstiden efter biotininfiltrering afhænger af det eksperimentelle design og målproteinet, der undersøges. Normalt, 3-12 h biotin behandling tillader mærkning af de fleste proteiner proksimalt til målet protein ved TurboID fusioner.
4. Indsamling af prøver af blade
BEMÆRK: Ved efterfølgende behandling af bladprøverne skal der bæres sterile handsker for at undgå keratinkontaminering af prøverne. Alle reagenser skal også være så keratinfri som muligt.
- Skær de infiltrerede blade i bunden af stilk, fjern bladet vene, derefter flash-fryse bladet væv i flydende nitrogen.
- Bladvævet males ved hjælp af en støder og mørtel, og bladpulveret opbevares i 15 ml eller 50 ml falkerør ved -80 °C til senere brug.
BEMÆRK: Tag tre til fire stykker blade til hver af de tre biologiske replikater fra forskellige planter. Protokollen kan sættes på pause her. Forud for de efterfølgende trin anbefales det at vurdere proteinekspression og biotinylation af målproteinet ved immunoblot-analyser. Typiske vestlige bloter er vist i figur 2.
5. Ekstraktion af protein i bladtotal
- Ca. 0,35 g bladpulver overføres til et 2 ml rør. Der fremstilles to rør til hver prøve.
FORSIGTIG: Brug handsker, når du rører ved genstande, der er afkølet af flydende nitrogen. - Der tilsættes 700 μL RIPA lysis buffer (50 mM Tris-HCl [pH = 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0,5% natriumdeoxycholate [w/v], 1 mM DTT, 1 tablet proteaseinhibitor cocktail) til 0,35 g pulver.
- Vortex rørene i 10 min.
- Prøverne efterlades på is i 30 min.
- Bland indholdet hver 4-5 min ved at dreje rørene på hovedet flere gange.
6. Fjernelse af fri biotin ved afsaltning
BEMÆRK: Dette afsnit tager ca. 50 min.
- Afsaltningssøjlen skal bringes i ligevægt.
- Fjern forsegleren i bunden af afsaltningssøjlen og læg kolonnen i et 50 ml rør.
- Opbevaringsopløsningen fjernes ved centrifugering ved 1000 x g og 4 °C i 2 min. og sørg for, at hætten løsnes.
- Sæt afsaltningssøjlen i et 50 ml rør. Kolonnen 3x med 5 ml RIPA-lysisbuffer skal kalibreres med 5 ml RIPA-lysis, hver gang der centrifugeres ved 1000 x g og 4 °C i 2 minutter, og gennemstrømningen kasseres.
- Afsaltningskolonnen overføres til et nyt 50 ml rør, og den opbevares midlertidigt ved 4 °C til senere brug.
- Rørene drejes fra trin 5.4 ved 16.500 x g og 4 °C i 10 min, og supernatanten overføres fra de to rør til et nyt 2 ml rør.
- Der tilsættes 1.500 μL proteinekstrakt til toppen af harpiksen i den ekvilibrerede afsaltningssøjle (fra trin 6.1.4). Når proteinekstraktet kommer ind i harpiksen, tilsættes yderligere 100 μL RIPA lysisbuffer.
BEMÆRK: Selv om 1.400 μL RIPA lysisbuffer blev anvendt til proteinekstraktion fra bladene, blev den samlede mængde efter proteinekstraktion og afsaltning uvægerligt steget til en vis grad i forhold til det oprindelige volumen. Derfor kan en kombination af prøverne fra hver gruppe som beskrevet i trin 5.1 og 5.4 resultere i mindst 1.500 μL proteinekstrakt pr. prøve. - Der centrifugeres ved 1000 x g og 4 °C i 2 min. og de saltede prøver efterlades midlertidigt på is.
7. Kvantificering af de afsaltede proteinekstrakter ved hjælp af en Bradford-analyse
- 50 μL af hver gradient BSA-opløsning: 0 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml og 1 mg/ml.
- Det afsaltede proteinekstrakt fortyndes ved at blande en 5 μL prøve med 45 μL ddH2O.
- Forbered 1x Bradford regent ved at fortynde 5x Bradford regent (100 mg Coomassie strålende blå G250, 47 ml methanol, 100 ml 85% fosforsyre, 53 ml ddH2O).
- 50 μL af hver gradient BSA-opløsning og 50 μL fortyndet proteinekstrakt tilsættes 2,5 ml 1x Bradford regent.
- Inkuber på RT i 10 min.
- 200 μL opløsning af hver prøve tilsættes en brønd af en ELISA-plade (tre tekniske replikater pr. prøve).
- Mål OD595 ved hjælp af en mikropladelæser.
- Der tegnes en standardkurve baseret på værdien af gradient BSA-opløsningen, og koncentrationen af de saltede proteinprøver beregnes. Normalt varierer den samlede proteinkoncentration fra 0,7 g blade fra 3-6 mg/ml.
- Forbered 6-8 mg af saltet protein ekstrakt til efterfølgende affinitet rensning.
8. Berigelse af biotinylatere proteiner
- Der indtages 200 μL streptavidn-C1-konjugerede magnetiske perler i et 2 ml rør.
- Ligevægt mellem de streptavidn-C1-konjugerede magnetiske perler med 1 ml RIPA lysisbuffer i 1 min ved RT.
- Efter hver vask skal du bruge den magnetiske rist til at adsorbere perlerne i 3 min og forsigtigt fjerne opløsningen ved pipettering.
- Gentag trin 8.2 og 8.3.
- Det afsaltede proteinekstrakt overføres til de ekvilibrerede streptavidn-C1-konjugerede magnetiske perler.
- Røret inkuberes ved 4 °C i 12 timer (eller natten over) på en rotator for at rense de biotinylatere proteiner.
- Fang perlerne på en magnetisk rack i 4 minutter på RT, indtil perlerne samler sig på den ene side af røret, og fjern derefter forsigtigt supernatanten med pipette.
- Der tilsættes 1,7 ml vaskebuffer I (2% SDS i vand) til røret, og den holdes på rotatoren ved RT i 8 min. Gentag trin 8.3.
- Der tilsættes 1,7 ml vaskebuffer II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholsyre [w/v], 1% Triton X-100) til røret og hold det på rotatoren ved RT i 8 min. Gentag trin 8.3.
- Der tilsættes 1,7 ml vaskebuffer III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholsyre [w/v], 1% NP40 [v/v]) til røret, og hold det på rotatoren ved RT i 8 min. Gentag trin 8.3.
- Der tilsættes 1,7 ml 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) for at fjerne vaskemidlet, og derefter gentages trin 8.3.
- Perlerne overføres til et nyt 1,5 ml rør, og gentag trin 8.11 og 8.3.
- Perlerne vaskes 6x i 5 min hver med 50 mM ammoniumbikarbonatbuffer ved RT.
- Der tilsættes 1 ml 50 mM ammoniumbikarbonatbuffer til de magnetiske perler, og bland godt.
- 100 μL perler fjernes til immunoblotanalyse for at bekræfte berigelsen af biotinylatere proteiner. En typisk western blot er vist i figur 3.
- Flash-fryse resten af proteinprøver og opbevares på -80 °C eller sende dem straks til LC-MS / MS analyse på tøris.
BEMÆRK: Typiske MS-resultater vises i en tidligere publikation (Zhang et al. 2019; Figur 2, Supplerende data 1 og supplerende data 2)11. Alle datasæt er tilgængelige på MassIVE (findes på
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De repræsentative data, som illustrerer de forventede resultater baseret på den beskrevne protokol, er tilpasset fra Zhang et al11. Figur 1 opsummerer procedurerne for udførelse af TurboID-baseret PL i N. benthamiana. Figur 2 viser proteinekspressionen og biotinylationen i de infiltrerede N. benthamianablade. Figur 3 viser, at de biotinylatere proteiner i de infiltrerede blade effektivt blev beriget til efterfølgende massespektrometrianalyse. Det skal bemærkes, at efter berigelse af de biotinylated proteiner ved hjælp af streptavidn-C1-konjugerede magnetiske perler, forskellige proteiner med forskellige størrelser blev fanget, og vestlige blot analyse af de berigede proteiner viste smurt bands (Figur 3). Lignende observationer er foretaget i flere nyligt offentliggjorte undersøgelser6,7,13,14.
Figur 1: Oversigt over turboid-baserede PL metode i N. benthamiana. Agrobacterium huser TurboID-fusion konstruktioner blev infiltreret i N. benthamiana blade. 36 h post-infiltration, 200 μM biotin infiltreres til de samme blade for at indlede biotinylation af de endogene proteiner, der er proksimale for turboid-fusionerede målprotein. De infiltrerede planter inkuberes derefter på RT i 3-12 timer, efterfulgt af bladhøst og slibning i flydende nitrogen. Bladpulver er lysed i RIPA lysis buffer, og en afsaltning kolonne er ansat til at fjerne den frie biotin i proteinekstrakt. De biotinylated proteiner blev derefter affinitet-renset med streptavidin-konjugerede perler og identificeret ved massespektrometri. Dette tal er tilpasset fra supplerende figur 3 fra Zhang et al11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Immunoblotanalyse af proteinekstrakter opnået i trin 4.2. (A) Vestlig blotanalyse af proteiner udvundet af de agroinerede blade med antistof mod HA-tag. (B) Vestlig blotanalyse af biotinylatere proteiner i de agroinuerede blade med streptavidin-HRP. Dette tal er tilpasset fra supplerende figur 6B i Zhang et al11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Vestlig blotanalyse af perler opnået i trin 8.15 for at bekræfte berigelsen af biotinylatere proteiner. For hver konstruktion er der tre uafhængige replikater (1, 2 og 3). Streptavidin-HRP blev anvendt til analyse af biotinylated proteiner i forskellige prøver. Dette tal er tilpasset fra supplerende figur 7 fra Zhang et al11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TurboID biotin ligase genereres af gær display-baseret rettet udvikling af BioID10. Det har mange fordele i forhold til andre PL enzymer. TurboID tillader anvendelse af PL til andre modelsystemer, herunder fluer og orme, hvis optimale væksttemperatur er omkring 25 °C10. Selv om PL-metoden har været udbredt i dyresystemer, er dens anvendelse i planter begrænset. Den protokol, der er beskrevet her, giver en trinvis procedure for oprettelse af TurboID-baserede PL i N. benthamiana, en model plante, der har været meget udbredt i plante-patogen interaktion undersøgelser. Denne protokol skitserer præparattil et bladprøve, fjernelse af fri biotin, kvantificering af de ekstraherede proteiner og berigelse af de biotinyerede proteiner.
Selv om gratis biotin i dyrecelledyrkningssystemer i vid udstrækning kan fjernes ved at vaske cellerne med PBS buffer4, kan den frie biotin i bladvæv ikke cleares ved simpel vask. En nylig undersøgelse viste, at den frie biotin kan have alvorlige konsekvenser efterfølgende berigelse af de biotinylated proteiner11. I denne protokol udnyttes en afsaltningssøjle til at fjerne gratis biotin i proteinekstrakterne, hvilket gør det muligt at binde biotinylaterproteiner effektivt til streptavidinperlerne.
Desuden tjener denne protokol som en vigtig reference for udførelsen af PL i andre anlægssystemer. For nylig har tre rapporter brugt TurboID-baserede PL i Arabidopsis12,13,14 og tomat behårede rod12, foruden N. benthamiana beskrevet her. I lighed med dyrecelledyrkningssystemer blev fjernelsen af den frie biotin opnået ved at vaske planteprotoplasterne før proteinekstraktion6. Der fandtes imidlertid lavere mængder af frie biotinmolekyler, som ikke var integreret i proteinet, i cellens indre, hvilket påvirkede effektiviteten af den efterfølgende berigelse af de biotinylatede proteiner. Derfor anbefales en afsaltningsprocedure til fuldstændig fjernelse af gratis biotin, hvilket øger genvindingseffektiviteten af biotinylatere proteiner.
To typer af kolonner, PD-10 og Zeba, er blevet brugt til gratis biotin fjernelse11,12,13,14. Det kan være af interesse i fremtiden at sammenligne effektiviteten af disse to kolonner i at fjerne gratis biotin i blade protein ekstrakter. Desuden anvender denne protokol en kanonisk sprøjtemedieret agroinfiltrationsmetode til forbigående at udtrykke målproteinet af interesse for N. benthamianablade. Derefter refiltreres biotinsubstratet i bladene til mærkning af proteiner, der er proksimale for målproteinet. Lignende operationer er også blevet anvendt i andre to nyligt rapporterede undersøgelser12,13. Som en alternativ metode gælder vakuummedieret infiltration af biotin for både N. benthamiana og Arabidopsis14. Desuden kan cellekulturer i planter, der ikke er egnede til agroinfiltration, omdannes til målproteinekspression efterfulgt af biotinbehandling og nærhedsmærkningsanalyse12. Disse nylige undersøgelser har understøttet robustheden af TurboID-baseret PL i at studere PPI og har lagt grunden til fremtidige anvendelser af TurboID-baseret PL i forskellige plantearter.
I denne protokol anvendes veletablerede Agrobacterium-medieretforbigående udtryk i N. benthamiana til at identificere PPI af målproteinet af interesse. Forbigående udtryk kan føre til overekspression af fusionsproteinerne. Derfor er et mere optimalt alternativ at konstruere TurboID-fusion under kontrol af en indfødt promotor og udtrykke det ved agroinfiltration eller generation af stabile transgene linjer. Med udviklingen af genom redigering teknologi, er det også muligt at knock-in TurboID fragment direkte ind i den indfødte genomiske loci af gener af interesse.
En anden vigtig faktor, der skal overvejes, er at sikre, at TurboID-fusionen ikke ændrer funktionen af det målprotein, der er af interesse. I en tidligere undersøgelse, funktionen af NLR immunreceptoren smeltet til TurboID blev bekræftet ved at teste dens evne til at fremkalde forsvars-medieret celledød i overværelse af Tobak mosaik virus p50 effector11. TurboID er relativt større (dvs. 35 kDa) end GFP, og dets fusion til et målprotein kan påvirke funktionen af et målprotein. I sådanne tilfælde kan de mindre miniTurboID10 bruges.
Det er også vigtigt at afgøre, hvilken endeaf målproteinet er egnet til sammensmeltning med TurboID. En generel tilgang til sådanne funktionelle test er at afgøre, om TurboID-fusion vil supplere målgenets mutante plantelinje. Alternativt kan der anvendes analyse af turboid-fusionens interaktion med en tidligere kendt interaktionspartner for målproteinet. I de fleste tilfælde kan n-terminal- eller C-terminalmærkning af TurboID for cytoplasmatiske proteiner producere sammenlignelige datasæt i efterfølgende massespektrometrianalyse. Men for membranlokaliserede proteiner er det vigtigt at bestemme topologien før vektorkonstruktion. Ellers vil fusion af TurboID opstrøms eller nedstrøms for kodningssekvensen af gener af interesse generere helt forskellige resultater. Derfor er det vigtigt at bestemme de modstående sider (f.eks cytoplasmatisk- eller lumen-vender) af N-endepunkt inus eller C-endeinus af membran-lokaliserede proteiner. Dette sikrer, at det forventede proksimale proteom af målproteinet kan opnås.
Selv om PL har flere fordele i forhold til de traditionelle IP-MS-metoder til påvisning af forbigående eller svage PPI'er, har det sine egne iboende begrænsninger. For det første indebærer identifikation af et kandidatinteraktionsprotein ikke umiddelbart en direkte eller indirekte interaktion med agnproteinet, men det afspejler kun nærhed2. Derfor kan der udføres uafhængige in vivo-analyser (dvs. co-immunudfældning, bimolekylær fluorescenskomplation [BiFC] eller in vitro GST-pull down-analyse) for yderligere at verificere PPI.
For det andet kan falske negativer eller falske positiver opstå fra PL analyse på grund af forskellige årsager. For eksempel kan falske negativer forekomme, når proteinet mangler tilgængelige primære aminer. Desuden viste nylige undersøgelser af BIN2 interactors i planter en delvis overlapning mellem data fra to forsøg13, hvilket tyder på, at der forelå falske negative resultater på grund af utilstrækkelig MS-dækning. Nogle interactors af målproteinet kan også være svagt biotinylated af TurboID-fusionerede kontrol, hvilket resulterer i en fold berigelse under cutoff tærskel og i sidste ende tab af nogle sande interactors13,14. Der bør derfor indstilles tilstrækkelige biologiske replikater med passende kontroller og cutoff-værdier til at minimere antallet af falske negativer11,14.
Desuden kan en lang biotin behandlingsperiode øge biotinylation af uspecifikke proteiner, resulterer i falske positiver10. Det er derfor vigtigt at optimere in vivo-mærkningstidsvinduerne for at reducere den uspecifikke biotinylation, samtidig med at det heller ikke påvirker produktionen af biotinylatere proteiner til analyse11,12,13,14. Desuden anbefales hård ekstraktion og strenge vaskebetingelser for at reducere de falske positiver, der stammer fra uspecifik binding af proteiner til perlerne17. Ud over de forbehold, der er beskrevet ovenfor , er udformningen af en ordentlig negativ kontrol afgørende for at skelne ægte interactors fra falske interactors og undgå mangler af ægte interactors11,12,13,14.
TurboID viste stærkt forbedret mærkning kinetik i forhold til BioID10,11. Dette kan dog også føre til en højere baggrund under PL-analyse. Derfor skal der medtages passende kontroller for at fjerne baggrundssignalerne. Vi brugte citrin-fusionerede TurboID i denne protokol11,og en lignende kontrol er blevet udnyttet i tidligere undersøgelser18. For målproteiner, der lokaliseres til en bestemt organelle membran, TurboID fusionere med et signal peptid, der er rettet mod den samme organelle membran gør en bedre kontrol end TurboID fusionere med en, der er udtrykt i cytoplasmaet14.
Hvis der kendes oplysninger om nøgledomænet eller aminosyrer i målproteinet, der bestemmer dets interaktioner med andre partnere, bør det at sammensmelte TurboID med et målprotein med en mutation på nøgledomænet eller aminosyrer være den bedste kontrol og maksimere baggrundssignalerne genereret af målproteinet. Desuden kræver TurboID-enzymer specifikke temperaturer samt korrekte pH-betingelser. For de fleste organeller i cellen, såsom ER, kerne, og mitokondrier, TurboID held mærket proksimale proteiner10. Nogle specielle organeller (dvs. vakuoler i planteceller, hvis pH-grad er meget lav19) er dog muligvis ikke egnede til at studere PPI ved hjælp af PL-metoden. Desuden kan ændringer i pH-niveauerne eller oxidationsreduktionstilstandene i det subcellulære miljø under stressresponsen påvirke TurboID'ets mærkningseffektivitet.
Sammenfattende giver den protokol, der er beskrevet her, grundlaget for at undersøge PPI ved hjælp af TurboID i N. benthamiana, et modelanlægssystem, der har været meget udbredt i mange aspekter af plantebiologi20. Med de nyligt beskrevne TurboID-baserede PL-undersøgelser i Arabidopsis-planter og tomatbehårede rødder12,13,14, forventes det, at denne metode vil finde anvendelse på andre plantearter. Det forventes, at TurboID-baserede PL vil spille en vigtig rolle i at studere PPI i plantebiologi forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 til Y.Z.), National Natural Science Foundation of China (31872637 til Y.Z.), og Fundamental Research Funds for the Central Universities (2019TC028 til Y.Z.), og NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 og NIH-GM132582-01 til S.P.D.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
