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Immunology and Infection

Étiquetage de proximité basé sur TurboID pour l’identification dans planta des réseaux d’interaction protéines-protéines

Published: May 17, 2020 doi: 10.3791/60728
Automatic Translation
*1, *2,3, 1, 1, 2, 2,3
1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis
* These authors contributed equally

Summary

Décrit ici est une méthode d’étiquetage de proximité pour l’identification des partenaires d’interaction du domaine TIR du récepteur immunitaire NLR dans le tissu foliaire de Nicotiana benthamiana. Un protocole détaillé pour l’identification des interactions entre d’autres protéines d’intérêt utilisant cette technique à Nicotiana et d’autres espèces végétales est également fourni.

Abstract

Les techniques d’étiquetage de proximité (PL) utilisant l’acérétique peroxidase (APEX) ou escherichia coli biotin ligase BirA (connue sous le nom de BioID) ont été utilisées avec succès pour identifier les interactions protéines-protéines (IPP) dans les cellules des mammifères. Cependant, les exigences de peroxyde d’hydrogène toxique (H2O2) dans le PL basé sur APEX, le temps d’incubation plus long avec la biotine (16-24 h), et la température d’incubation plus élevée (37 oC) dans le PL basé sur BioID limitent sévèrement leurs applications dans les plantes. Le PL, récemment décrit par TurboID, traite de nombreuses limites de BioID et d’APEX. TurboID permet l’étiquetage de proximité rapide des protéines en seulement 10 minutes dans des conditions à température ambiante (RT). Bien que l’utilité de TurboID a été démontrée dans les modèles animaux, nous avons récemment montré que TurboID-basé PL effectue mieux dans les plantes par rapport à BioID pour l’étiquetage des protéines qui sont proximales à une protéine d’intérêt. Il est prévu ici un protocole étape par étape pour l’identification des partenaires d’interaction protéique à l’aide du domaine du récepteur N-terminal Toll/interleukin-1 (TIR) de la famille de protéines riches en leucine nucléotide-contraignante (NLR) comme modèle. La méthode décrit la construction vectorielle, l’agroinfiltration des constructions d’expression protéique, le traitement de la biotine, l’extraction et le desalting des protéines, la quantification et l’enrichissement des protéines biotinées par purification d’affinité. Le protocole décrit ici peut être facilement adapté pour étudier d’autres protéines d’intérêt pour Nicotiana et d’autres espèces végétales.

Introduction

Les IPP sont à la base de divers processus cellulaires. Les méthodes traditionnelles d’identification des IPP comprennent le dépistage et l’immunoprécipitation de levure-deux hybrides (Y2H) couplés à la spectrométrie de masse (IP-MS)1. Cependant, les deux souffrent de certains inconvénients. Par exemple, le dépistage de L2H nécessite la disponibilité de la bibliothèque Y2H des espèces végétales ou animales cibles. La construction de ces bibliothèques est exigeante en main-d’œuvre et coûteuse. En outre, l’approche Y2H est effectuée dans la levure hétérologique d’organisme eucaryote à cellule unique, qui peut ne pas représenter le statut cellulaire des cellules eucaryotes supérieures.

En revanche, l’IP-MS montre une faible efficacité dans la capture des IPP transitoires ou faibles, et elle n’est pas adaptée aux protéines à faible abondance ou à haute hydrophobicité. De nombreuses protéines importantes impliquées dans les voies de signalisation végétale telles que les kinases récepteurs (RLKs) ou la famille NLR des récepteurs immunitaires sont exprimées à de faibles niveaux et interagissent souvent avec d’autres protéines de façon transitoire. Par conséquent, il restreint considérablement la compréhension des mécanismes sous-jacents à la régulation de ces protéines.

Récemment, des méthodes d’étiquetage de proximité (PL) basées sur l’ascorbate peroxidase (APEX) et un mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (connu sous le nom de BioID) ont été développées et utilisées pour l’étude des IPP2,3,4. Le principe de PL est qu’une protéine cible d’intérêt est fusionnée avec une enzyme, qui catalyse la formation de biotinyl-AMP labile (bio-AMP). Ces bio-AMP gratuits sont libérés par les enzymes PL et diffusent à proximité de la protéine cible, permettant la biotinylation des protéines proximales aux amines primaires dans un rayon estimé de 10 nm5.

Cette approche présente des avantages significatifs par rapport aux approches traditionnelles du Y2H et de la SPP, comme la capacité de saisir les IPP transitoires ou faibles. En outre, PL permet l’étiquetage des protéines proximales de la protéine cible dans leurs environnements cellulaires indigènes. Différentes enzymes PL ont des inconvénients uniques lors de leur application à différents systèmes. Par exemple, bien que l’APEX offre une cinétique de marquage plus élevée par rapport à BioID et est appliquée avec succès dans les systèmes de mammifères, l’exigence de peroxyde d’hydrogène toxique (H2O2) dans cette approche le rend impropre aux études de PL dans les plantes.

En revanche, le PL basé sur BioID évite l’utilisation du H2O2toxique, mais le taux d’étiquetage est lent (nécessitant 18-24 h pour compléter la biotinylation), ce qui rend la capture des IPP transitoires moins efficace. En outre, la température d’incubation plus élevée (37 oC) requise pour l’efficacité du PL par BioID introduit un stress externe à certains organismes, tels que les plantes4. Par conséquent, le déploiement limité de PL à base de BioID dans les plantes (c.-à-d. les protoplastes de riz, Arabidopsis et N. benthamiana) a été signalé6,7,8,9. L’enzyme TurboID récemment décrite surmonte les carences de l’APEX et bioID-basé PL. TurboID a montré une forte activité qui permet l’accomplissement de PL dans les 10 minutes à RT10. Le PL à base de TurboID a été appliqué avec succès dans les cellules de mammifères, les mouches et les vers10. Récemment, nous et d’autres groupes de recherche indépendamment optimisé et étendu l’utilisation de TurboID-basé PL pour étudier les IPP dans différents systèmes végétaux, y compris N. benthamiana et Arabidopsis plantes et les racines poilues tomate11,12,13,14. Des analyses comparatives ont indiqué que TurboID obtient de meilleurs résultats pour le PL dans les usines par rapport à BioID11,14. Il a également démontré la robustesse de TURBOID-basé PL dans planta en identifiant un certain nombre de nouvelles interactions avec un récepteur immunitaire NLR11, une protéine dont les partenaires d’interaction sont généralement difficiles à obtenir en utilisant des méthodes traditionnelles.

Ce protocole illustre le PL à base de TurboID en planta en décrivant l’identification des protéines d’interaction du domaine TIR N-terminal du récepteur immunitaire NLR dans les plantes de N. benthamiana. La méthode peut être étendue à toutes les protéines d’intérêt dans N. benthamiana. Plus important encore, il fournit une référence importante pour l’étude des IPP chez d’autres espèces végétales telles que Arabidopsis,tomate, et d’autres.

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Protocol

REMARQUE : Une vue d’ensemble de la méthode est indiquée à la figure 1.

1. Préparation des matériaux végétaux

  1. Cultivez les graines de N. benthamiana dans un sol humide à haute densité et maintenez-les dans une chambre climatique avec une lumière de 16 h (environ 75 'mol/m2s) et 8 h photoperiod foncé à 23-25 'C.
  2. Environ 1 semaine plus tard, transférer soigneusement chaque jeune semis à 4' x 4' pots et garder les semis dans la même chambre.
  3. Maintenir les plantes dans la chambre pendant environ 4 semaines jusqu’à ce qu’elles poussent à un stade de feuille de 4-8 pour l’agroinfiltration ultérieure15.

2. Construction de fusions TurboID

  1. Utilisez la technique de clonage moléculaire standard pour générer la fusion de la protéine cible avec TurboID (PCR TurboID de Addgene plasmid #107177). Ici, nous avons utilisé le domaine TIR N-terminal du récepteur immunitaire NLR comme protéine cible d’intérêt et construit TIR fusionné à TurboID sous le contrôle de la mosaïque de chou-fleur virus 35S promoteur (p35S::TIR-TurboID).
    REMARQUE : La fusion de l’enzyme TurboID au carboxyl-terminus ou à l’amino-terminus de la protéine cible dépendra de la protéine d’intérêt. Habituellement, pour une protéine cytoplasmique, les deux termini devraient être acceptables, tant que la fusion TurboID n’affecte pas la fonction de la protéine cible. Cependant, pour une protéine localisée à membrane, la topologie des protéines doit être caractérisée à l’avance avant de déterminer quel terminus est le meilleur pour la fusion TurboID.
  2. Construire une citrine turboréfutée sous le même promoteur pour servir de contrôle pour une analyse protéomique quantitative ultérieure.
    REMARQUE : Il est important de construire un contrôle TurboID pour identifier le protéomome proximale à la protéine cible. Le contrôle de fusion TurboID devrait afficher un niveau d’expression similaire à celui de la protéine cible TurboID.fused. Ceci peut être déterminé empiriquement en ajustant la concentration d’Agrobacterium pendant l’agroinfiltration. En outre, il est important que la protéine de contrôle ait un modèle de localisation subcellulaire semblable à celui de la protéine cible d’intérêt.

3. Agroinfiltration

  1. Transformation des plasmides en Agrobacterium
    1. Ajoutez 0,5 g des plasmides générés par les étapes 2.1 et 2.2 à 50 'L de cellules capables de souche GV3101 d’Agrobacterium tumefaciens, préparées comme indiqué précédemment16.
      REMARQUE : D’autres souches d’Agrobacterium, telles que GV2260, peuvent également être utilisées.
    2. Incuber sur la glace pendant 30 min.
    3. Choc thermique dans un bain d’eau à 42 oC pour 60 s.
    4. Ajouter 400 l de L de milieu LB (10 g/L tryptone, extrait de levure de 5 g/L et 10 g/L NaCl; pH et 7,0) à l’Agrobacterium et incuber à 28 oC pendant 90 min.
    5. Plaquez l’ensemble du contenu dans le tube sur LB agar complété par des antibiotiques appropriés pour sélectionner le plasmide, ainsi que pour l’Agrobacterium (pour GV3101: 50 mg/L gentamicine et 50 mg/L rifampicin).
    6. Plaques incubate à 28 oC pour 36-48 h jusqu’à ce que les colonies individuelles soient visibles.
  2. Choisissez et striez plusieurs colonies individuelles sur une plaque d’agar LB fraîche avec des antibiotiques (voir étape 3.1.5) et poussez à 28 oC pendant la nuit.
    REMARQUE: Il est plus optimal d’effectuer la colonie PCR pour confirmer la présence de la construction binaire spécifique dans l’Agrobacterium. D’après notre expérience, plus de 95 % des colonies contiennent les constructions binaires introduites.
  3. Inoculer 3 ml de LB moyenne plus antibiotiques appropriés (voir étape 3.1.4) avec la colonie d’Agrobacterium abritant la construction d’intérêt, et incuber en secouant pendant la nuit à 28 oC jusqu’à ce que l’OD600 de la culture Agrobacterium atteigne 2,0.
  4. Centrifuge les cellules à 3.000 x g et les réutiliser àOD 600 ' 1.0 dans le tampon d’agroinfiltration (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH - 5.6], 250 'M acétosyringone).
    REMARQUE : Bien qu’il soit optimal d’incuber l’inoculum pendant 2 h à RT avant l’agroinfiltration, dans notre expérience avec la souche GV3101, il n’y a pas eu une grande différence entre l’expression de protéine cible avec vs. sans incubation.
  5. Utilisez une seringue sans aiguille de 1 mL pour infiltrer l’inoculum dans l’épiderme (abaxial) des feuilles de N. benthamiana entièrement matures.
    REMARQUE : Pour préparer une quantité suffisante de matériaux foliés pour trois répliques biologiques : une feuille entière est habituellement infiltrée, trois feuilles sont infiltrées par plante, et trois à quatre plantes sont utilisées pour chaque construction. Pour chaque feuille, 1,5 à 2,0 ml d’agrobactéries résuspendées suffisent.
  6. Après 36 h post-infiltration (hpi), infiltrer 200 m de biotine (dans la solution MgCl2 de 10 mM) dans les feuilles pré-infiltrées avec des constructions TurboID.
  7. Maintenir la plante pour 3 à 12 h supplémentaires avant de récolter le tissu foliaire tel que décrit à la section 4.
    REMARQUE: La raison de choisir le 36 hpi pour l’infiltration de biotine est que l’expression protéique cible culmine à ce moment-là selon les études précédentes11. Il est conseillé de déterminer le temps nécessaire pour l’expression optimale de la protéine cible d’intérêt. L’infiltration post-biotine en temps d’incubation dépend de la conception expérimentale et de la protéine cible à l’étude. Habituellement, 3 à 12 h de traitement de biotine permet l’étiquetage de la plupart des protéines proximales à la protéine cible par les fusions TurboID.

4. Collecte d’échantillons de feuilles

REMARQUE : Pour le traitement ultérieur des échantillons de feuilles, portez des gants stériles pour éviter la contamination par la kératine des échantillons. Tous les réactifs doivent également être aussi exempts de kératine que possible.

  1. Couper les feuilles infiltrées à la base du pétiole, enlever la veine des feuilles, puis congeler le tissu foliaire dans de l’azote liquide.
  2. Broyer le tissu foliaire à l’aide d’un pilon et un mortier et conserver la poudre de feuilles dans des tubes de faucon de 15 ml ou de 50 ml à -80 oC pour une utilisation ultérieure.
    REMARQUE : Prenez trois à quatre morceaux de feuilles pour chacune des trois répliques biologiques de différentes plantes. Le protocole peut être mis en pause ici. Avant les étapes ultérieures, il est recommandé d’évaluer l’expression des protéines et la biotinylation de la protéine cible par des analyses d’immunoblot. Les taches typiques de l’Ouest sont indiquées dans la figure 2.

5. Extraction de protéines totales de feuilles

  1. Transférer environ 0,35 g de poudre de feuilles dans un tube de 2 ml. Préparer deux tubes pour chaque échantillon.
    CAUTION : Portez des gants lorsque vous touchez un objet refroidi par de l’azote liquide.
  2. Ajouter 700 l de tampon ripA lysis (50 mM Tris-HCl [pH - 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0,5% de désoxycholate de sodium [w/v], 1 mM DTT, 1 comprimé de cocktail inhibiteur de la protéase) à 0,35 g de poudre de feuilles.
  3. Vortex les tubes pendant 10 min.
  4. Laisser les échantillons sur la glace pendant 30 min.
  5. Mélanger le contenu toutes les 4 à 5 minutes en retournant les tubes à l’envers plusieurs fois.

6. Enlèvement de biotine gratuite par desalting

REMARQUE: Cette section prend environ 50 min.

  1. Équilibrez la colonne dessalement.
    1. Retirez le scellant au bas de la colonne de désalting et mettez la colonne dans un tube de 50 ml.
    2. Retirez la solution de stockage par centrifugation à 1000 x g et 4 oC pendant 2 minutes et assurez-vous que le bouchon est desserré.
    3. Placez la colonne de dessalement dans un tube de 50 ml. Équilibrez la colonne 3x avec 5 ml de tampon de lyse RIPA, chaque fois centrifuger à 1000 x g et 4 oC pendant 2 minutes et jeter le flowthrough.
    4. Transférer la colonne de dessalement dans un nouveau tube de 50 ml et entreposer temporairement à 4 oC pour une utilisation ultérieure.
  2. Tourner les tubes de l’étape 5.4 à 16.500 x g et 4 'C pendant 10 min et transférer le supernatant des deux tubes dans un nouveau tube de 2 mL.
  3. Ajouter 1 500 l d’extrait de protéine au dessus de la résine de la colonne de dessalement équilibrée (de l’étape 6.1.4). Lorsque l’extrait de protéine pénètre dans la résine, ajouter un autre tampon de lyse de 100 L de RIPA.
    REMARQUE : Bien que 1 400 L de tampon de lyse RIPA aient été utilisés pour l’extraction de protéines des feuilles, le volume total après extraction et désalting de protéine a été invariablement augmenté dans une certaine mesure par rapport au volume original. Par conséquent, une combinaison des échantillons de chaque groupe tel que décrit dans les étapes 5.1 et 5.4 peut entraîner au moins 1500 l 'l d’extrait de protéine par échantillon.
  4. Centrifugeuse à 1000 x g et 4 oC pendant 2 min et laisser temporairement les échantillons désaltés sur la glace.

7. Quantification des extraits de protéines desalted à l’aide d’un essai Bradford

  1. Préparer 50 ll de chaque solution BSA gradient : 0 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL et 1 mg/mL.
  2. Diluer l’extrait de protéine desalted en mélangeant un échantillon de 5 L avec 45 L de ddH2O.
  3. Préparer 1x Bradford régent en diluant le régent 5x Bradford (100 mg de Coomassie bleu brillant G250, 47 ml de méthanol, 100 ml d’acide phosphorique de 85%, 53 ml de ddH2O).
  4. Ajouter 50 ll de chaque solution BSA gradient et 50 l d’extrait dilué de protéine à la 2,5 ml de régent de 1x Bradford.
  5. Incubate à RT pour 10 min.
  6. Ajoutez 200 L de solution de chaque échantillon à un puits d’une plaque ELISA (trois répliques techniques par échantillon).
  7. Mesurer l’OD595 à l’aide d’un lecteur de microplates.
  8. Dessinez la courbe standard en fonction de la valeur de la solution BSA gradient et calculez la concentration des échantillons de protéines désaltées. Habituellement, la concentration totale de protéines obtenue à partir de 0,7 g de feuilles varie de 3 à 6 mg/mL.
  9. Préparer 6 à 8 mg d’extrait de protéine desalted pour la purification ultérieure de l’affinité.

8. Enrichissement des protéines biotinées

  1. Prendre 200 L de perles magnétiques conjuguées streptocovidn-C1 dans un tube de 2 mL.
  2. Équilibrez les perles magnétiques sreptavidn-C1-conjuguées avec 1 mL de tampon de lyse RIPA pendant 1 min à RT.
  3. Après chaque lavage, utilisez la grille magnétique pour adsorb les perles pendant 3 minutes et retirez doucement la solution par tuyauterie.
  4. Répétez les étapes 8.2 et 8.3.
  5. Transférer l’extrait de protéine desalted aux perles magnétiques sptotrées-C1 étlibérées.
  6. Incuber le tube à 4 oC pendant 12 h (ou toute la nuit) sur un rotateur pour purifier les protéines biotinyées.
  7. Capturez les perles sur une grille magnétique pendant 4 minutes à RT jusqu’à ce que les perles s’accumulent d’un côté du tube, puis retirez doucement le supernatant par pipette.
  8. Ajouter 1,7 ml de tampon de lavage I (2% SDS dans l’eau) au tube et le garder sur le rotateur à RT pendant 8 min. Répéter l’étape 8.3.
  9. Ajouter 1,7 mL de tampon de lavage II (50 mM HEPES: pH - 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% d’acide désoxycholic [w/v], 1% Triton X-100) au tube et le garder sur le rotateur à la RT pendant 8 min.
  10. Ajouter 1,7 mL de tampon de lavage III (10 mM Tris-HCl: pH - 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% d’acide désoxycholic [w/v], 1% NP40 [v/v]) au tube et le garder sur le rotateur à RT pour 8 min.
  11. Ajouter 1,7 mL de 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) pour enlever le détergent, puis répéter l’étape 8.3.
  12. Transférer les perles dans un nouveau tube de 1,5 mL et répéter les étapes 8.11 et 8.3.
  13. Laver les perles 6x pendant 5 min chacune avec 50 mm ammonium bicarbonate tampon à RT.
  14. Ajouter 1 ml de tampon de bicarbonate d’ammonium de 50 mM aux perles magnétiques et bien mélanger.
  15. Retirez 100 L de perles pour l’analyse de l’immunoblote afin de confirmer l’enrichissement des protéines biotinyées. Une tache occidentale typique est indiquée dans la figure 3.
  16. Congelez flash le reste des échantillons de protéines et entreposez à -80 oC ou envoyez-les immédiatement pour l’analyse LC-MS/MS sur la glace sèche.
    REMARQUE : Les résultats typiques de la SP sont affichés dans une publication précédente (Zhang et coll. 2019; Figure 2, Données complémentaires 1 et Données complémentaires 2)11. L’ensemble des jeux de données sont disponibles sur MassIVE (trouvé à lt;http://massive.ucsd.edu-gt;) en utilisant l’identifiant: MSV000083018 et MSV000083019.

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Representative Results

Les données représentatives, qui illustrent les résultats attendus basés sur le protocole décrit, sont adaptées de Zhang etcoll. La figure 1 résume les procédures d’exécution turboID-basé PL dans N. benthamiana. La figure 2 montre l’expression et la biotinylation des protéines dans les feuilles infiltrées de N. benthamiana. La figure 3 montre que les protéines biotinyées dans les feuilles infiltrées ont été efficacement enrichies pour l’analyse subséquente de spectrométrie de masse. Il convient de noter qu’après l’enrichissement des protéines biotinyées à l’aide de perles magnétiques sreptavidn-C1, différentes protéines de tailles variées ont été capturées, et l’analyse occidentale des taches des protéines enrichies a montré des bandes enduites(figure 3). Des observations similaires ont été faites dans plusieurs études récemment publiées6,7,13,14.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu de la méthode PL basée sur TurboID à N. benthamiana.  L’agrobacterium abritant les constructions TurboID-fusion ont été infiltrés dans les feuilles de N. benthamiana. 36 h post-infiltration, 200 M biotine est infiltrée aux mêmes feuilles pour initier la biotinylation des protéines endogènes qui sont proximales à la protéine cible TurboID-fusionnée. Les plantes infiltrées sont ensuite incubées à RT pendant 3 à 12 h, suivies de la récolte et du broyage des feuilles dans de l’azote liquide. La poudre de feuille est lysed dans le tampon de lyse RIPA, et une colonne de dessalement est employée pour enlever la biotine libre dans l’extrait de protéine. Les protéines biotinylated ont ensuite été affinity-purifiées avec des perles streptavidin-conjuguées et identifiées par spectrométrie de masse. Ce chiffre est adapté de la figure supplémentaire 3 de Zhang et al11. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Analyse immunoblot des extraits de protéines obtenus à l’étape 4.2. (A) Analyse occidentale des protéines extraites des feuilles agroinfiltrées avec anticorps contre l’étiquette HA. (B) Analyse occidentale de tache des protéines biotinylated dans les feuilles agroinfiltrées avec streptavidin-HRP. Ce chiffre est adapté de la figure supplémentaire 6B de Zhang et al11. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Analyse occidentale des perles obtenue à l’étape 8.15 pour confirmer l’enrichissement des protéines biotinyées. Pour chaque construction, il y a trois répliques indépendantes (1, 2 et 3). Streptavidin-HRP a été utilisé pour l’analyse des protéines biotinyées dans différents échantillons. Ce chiffre est adapté de la figure supplémentaire 7 de Zhang et al11. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le ligase biotin TurboID est généré par l’évolution dirigée basée sur l’affichage de levure du BioID10. Il a de nombreux avantages par rapport à d’autres enzymes PL. TurboID permet l’application de PL à d’autres systèmes modèles, y compris les mouches et les vers, dont la température de croissance optimale est d’environ 25 oC10. Bien que l’approche PL ait été largement utilisée dans les systèmes animaux, son application dans les plantes est limitée. Le protocole décrit ici fournit une procédure étape par étape pour établir le PL basé sur TurboID à N. benthamiana, une plante modèle qui a été largement utilisé dans les études d’interaction plant-pathogène. Ce protocole décrit la préparation de l’échantillon de feuilles, l’élimination de la biotine libre, la quantification des protéines extraites et l’enrichissement des protéines biotinées.

Bien que la biotine gratuite dans les systèmes de culture des cellules animales peut être en grande partie enlevée en lavant les cellules avec tampon PBS4, la biotine libre dans le tissu foliaire ne peut pas être effacée par un simple lavage. Une étude récente a indiqué que la biotine libre peut avoir un impact grave sur l’enrichissement subséquent des protéines biotinyées11. Dans ce protocole, une colonne de desalting est utilisée pour éliminer avec succès la biotine libre dans les extraits de protéines, permettant la liaison efficace des protéines biotinylated aux perles de streptavidine.

En outre, ce protocole sert de référence importante pour la conduite de PL dans d’autres systèmes végétaux. Récemment, trois rapports ont utilisé TurboID-basé PL dans Arabidopsis12,13,14 et tomate racine poilue12, en plus de la N. benthamiana décrit ici. Semblable aux systèmes de culture des cellules animales, l’élimination de la biotine libre a été réalisée en lavant les protoplastes végétaux avant l’extraction des protéines6. Cependant, des quantités plus faibles de molécules de biotine libres qui n’étaient pas intégrées à la protéine existaient à l’intérieur de la cellule, ce qui a eu un impact sur l’efficacité de l’enrichissement ultérieur des protéines biotinées. Par conséquent, une procédure de désalting est recommandée pour l’élimination complète de la biotine libre, augmentant ainsi l’efficacité de récupération des protéines biotinylated.

Deux types de colonnes, PD-10 et Zeba, ont été utilisés pour l’enlèvement gratuit de biotine11,12,13,14. Il peut être intéressant à l’avenir de comparer l’efficacité de ces deux colonnes dans l’élimination de la biotine libre dans les extraits de protéines de feuilles. En outre, ce protocole utilise une méthode d’agroinfiltration canonique à médiation de seringue pour exprimer de façon transitoire la protéine cible d’intérêt dans les feuilles de N. benthamiana. Ensuite, le substrat de biotine est réimfiltré dans les feuilles pour étiqueter les protéines qui sont proximales à la protéine cible. Des opérations similaires ont également été utilisées dans deux autres études récemment rapportées12,13. Comme méthode alternative, l’infiltration sous vide de biotine s’applique à la fois pour N. benthamiana et Arabidopsis14. En outre, dans les plantes qui ne conviennent pas à l’agroinfiltration, les cultures cellulaires peuvent être transformées pour l’expression des protéines cibles, suivies par le traitement de la biotine et l’étiquetage de proximité essai12. Ces études récentes ont étayé la robustesse du PL basé sur TurboID dans l’étude des IPP et ont jeté les bases d’applications futures de PL basée sur TurboID chez différentes espèces végétales.

Dans ce protocole, l’expression transitoire bien établie d’Agrobacteriumà N. benthamiana est employée pour identifier les IPP de la protéine cible d’intérêt. L’expression transitoire peut conduire à une surexpression des protéines de fusion. Par conséquent, une alternative plus optimale est d’ingénierie de la fusion TurboID sous le contrôle d’un promoteur indigène et de l’exprimer par agroinfiltration ou génération de lignes transgéniques stables. Avec le développement de la technologie d’édition du génome, il est également possible d’entrer dans le fragment TurboID directement dans le loci génomique indigène de gènes d’intérêt.

Un autre facteur important à prendre en considération est de s’assurer que la fusion TurboID ne modifie pas la fonction de la protéine cible d’intérêt. Dans une étude précédente, la fonction du récepteur immunitaire NLR fusionné à TurboID a été confirmée en testant sa capacité à induire la mort cellulaire négociée par la défense en présence du virus de la mosaïque de tabac p50 effecteur11. TurboID est relativement plus grand (c.-à-d., 35 kDa) que GFP, et sa fusion à une protéine cible peut affecter la fonction d’une protéine cible. Dans de tels cas, le miniTurboID10 plus petit peut être utilisé.

Il est également important de déterminer quel terminus de la protéine cible convient à la fusion avec TurboID. Une approche générale pour de tels tests fonctionnels est de déterminer si la fusion TurboID viendra compléter la lignée végétale mutante du gène cible. Alternativement, l’analyse de l’interaction de la fusion TurboID avec un partenaire d’interaction précédemment connu de la protéine cible peut être utilisée. Dans la plupart des cas, pour les protéines cytoplasmiques, le marquage N-terminal ou C-terminal du TurboID peut produire des ensembles de données comparables dans l’analyse subséquente de spectrométrie de masse. Cependant, pour les protéines localisées par la membrane, il est important de déterminer la topologie avant la construction vectorielle. Sinon, la fusion de TurboID en amont ou en aval de la séquence de codage des gènes d’intérêt générera des résultats complètement différents. Par conséquent, il est important de déterminer les côtés orientés (p. ex., cytoplasmique ou lumen-face) du N-terminus ou C-terminus des protéines localisées par la membrane. Cela garantit que le protéome proximale prévu de la protéine cible peut être obtenu.

Bien que le PL présente plusieurs avantages par rapport aux approches traditionnelles de la SP pour détecter les IPP transitoires ou faibles, il a ses propres limites intrinsèques. Tout d’abord, l’identification d’une protéine d’interaction candidate n’implique pas immédiatement une interaction directe ou indirecte avec la protéine d’appât, mais elle ne reflète que la proximitéétroite 2. Par conséquent, des essais in vivo indépendants (c.-à-d. co-immunoprecipitation, compléments bimoléculaires de fluorescence [BiFC], ou essai in vitro de TPS) peuvent être effectués pour vérifier davantage les IPP.

Deuxièmement, de faux négatifs ou de faux positifs peuvent provenir de l’analyse PL pour diverses raisons. Par exemple, de faux négatifs peuvent se produire lorsque la protéine manque d’amines primaires accessibles. En outre, des études récentes d’interagissant BIN2 dans les plantes ont montré un chevauchement partiel entre les données de deux expériences13, indiquant l’existence de faux résultats négatifs en raison de la couverture inadéquate de LA SP. Certains interagissants de la protéine cible peuvent également être faiblement biotinylés par le contrôle TurboID-fusionné, résultant en un enrichissement pliant en dessous du seuil de coupure et finalement la perte de certains vrais interagissants13,14. Par conséquent, des répliques biologiques suffisantes avec des contrôles et des valeurs de coupure appropriées devraient être définies pour minimiser le nombre de faux négatifs11,14.

En outre, une longue période de traitement de la biotine peut augmenter la biotinylation des protéines non spécifiques, résultant en de faux positifs10. Par conséquent, il est important d’optimiser les fenêtres de temps d’étiquetage in vivo pour réduire la biotinylation non spécifique, tout en n’affectant pas la production de protéines biotinylated pour l’analyse11,12,13,14. En outre, l’extraction sévère et les conditions de lavage strictes sont recommandées pour réduire les faux positifs dérivés de la liaison non spécifique des protéines aux perles17. Outre les mises en garde décrites ci-dessus, la conception d’un contrôle négatif approprié est cruciale pour distinguer les vrais acteurs des faux acteurs et éviter de manquer de vrais interagissants11,12,13,14.

TurboID a montré une cinétique d’étiquetage grandement améliorée par rapport à celle de BioID10,11. Cependant, cela peut également conduire à un arrière-plan plus élevé au cours de l’analyse PL. Par conséquent, des contrôles appropriés doivent être inclus pour éliminer les signaux de fond. Nous avons utilisé le TurboID fondu citrine dans ce protocole11, et un contrôle similaire a été utilisé dans les études précédentes18. Pour les protéines cibles qui se localisent à une membrane d’organelle spécifique, TurboID fusionnant avec un peptide de signal qui cible la même membrane d’organelle fait un meilleur contrôle que TurboID fusionnant avec celui qui est exprimé dans le cytoplasme14.

En outre, si des informations sur le domaine clé ou les acides aminés dans la protéine cible qui déterminent ses interactions avec d’autres partenaires sont connus, la fusion du TurboID avec une protéine cible avec une mutation dans le domaine clé ou les acides aminés devrait être le meilleur contrôle et réduira au maximum les signaux de fond générés par la protéine cible. En outre, les enzymes TurboID nécessitent des températures spécifiques ainsi que des conditions de pH appropriées. Pour la plupart des organites de la cellule comme l’ER, le noyau et les mitochondries, TurboID a réussi à étiqueter les protéines proximales10. Cependant, certains organites spéciaux (c’est-à-dire les vacuoles dans les cellules végétales, dont le pH est très faible19) peuvent ne pas convenir à l’étude des IPP en utilisant l’approche PL. En outre, les changements dans les niveaux de pH ou les états de réduction d’oxydation de l’environnement subcellulaire pendant la réponse au stress peuvent affecter l’efficacité d’étiquetage du TurboID.

En résumé, le protocole décrit ici fournir la base pour enquêter sur les IPP en utilisant TurboID à N. benthamiana, un système végétal modèle qui a été largement utilisé dans de nombreux aspects de la biologie végétale20. Avec les études PL récemment décrites à base de TurboID dans les plantes Arabidopsis et les racines poilues de tomate12,13,14, on s’attend à ce que cette méthode devienne applicable à d’autres espèces végétales. On s’attend à ce que le PL basé sur TurboID joue un rôle important dans l’étude des IPP dans la recherche en biologie végétale.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme national de science et de technologie transgéniques (2019ZX08010-003 à Y.Z.), de la National Natural Science Foundation of China (31872637 à Y.Z.), et des Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (2019TC028 à Y.Z.), et du NSF-IOS-1354444444444444444444444444 NSF-IOS-1339185, et NIH-GM132582-01 à S.P.D.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
721 Spectrophotometer Metash, made in China Q/SXFZ6 For OD600 measurement
Ammonium bicarbonate Sigma A6141-500G
Biotin Sigma B4639-1G 50 mM Stock
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5702
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697489001
Deoxycholic acid Sigma D2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT) VWR Life Science 0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65001 For affinity purification
EDTA Sigma E6758-500G
ELISA plate Corning Costar 3590
HEPES Sigma H3375-1KG
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-212
Immobilon-P PVDF membrane Millipore IPVH00010 For Western blot analysis
Lithium chloride solution(LiCl), 8M Sigma L7026-500ML
Low speed refrigerated centrifuge Zonkia, made in China KDC-2046 For desalting
Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma M9272-500G
Magnetic rack Invitrogen 123.21D For bead adsorption
Multiskan FC Microplate Photometer Thermo Fisher Scientific N07710 For OD595 measurement
NP-40 (IGEPAL CA-630) Sigma I8896-100ML
Rat anti-HA Roche 11867423001
Rotational mixer Kylin-Bell Lab Instrument WH-986 For IP
Shock incubator Labotery, made in China ZQPZ-228
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3
Sodium deoxycholate Sigma D2510-100G
Sodium dodecyl sulfate(SDS) Sigma L4390-1KG
Streptavidin-HRP Abcam ab7403
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Trizma base Sigma T1503-1KG
Vortex Scientific Industries G-560E
Water-jacket Incubator Blue pard, made in China GHP-9080 For Agrobacterium incubation
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89893 For removal of biotin

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References

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  20. Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).

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Immunologie et infection numéro 159 étiquetage de proximité TurboID interactions protéiques dessalement quantification purification TIR
Étiquetage de proximité basé sur TurboID pour l’identification dans planta des réseaux d’interaction protéines-protéines
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Zhang, Y., Li, Y., Yang, X., Wen, Z., Nagalakshmi, U., Dinesh-Kumar, S. P. TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (159), e60728, doi:10.3791/60728 (2020).

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