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Immunology and Infection

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन नेटवर्क की प्लांटा पहचान में टर्बोआईडी-आधारित निकटता लेबलिंग

Published: May 17, 2020 doi: 10.3791/60728
Automatic Translation
*1, *2,3, 1, 1, 2, 2,3
1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis
* These authors contributed equally

Summary

यहां वर्णित निकोतियाना बेंथमियाना पत्ती ऊतक में एनएलआर प्रतिरक्षा रिसेप्टर के टीआईआर डोमेन के इंटरैक्शन पार्टनर्स की पहचान के लिए एक निकटता लेबलिंग विधि है। निकोतियाना और अन्य पौधों की प्रजातियों में इस तकनीक का उपयोग करके ब्याज के अन्य प्रोटीन के बीच बातचीत की पहचान के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल भी प्रदान किया गया है।

Abstract

स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) की पहचान के लिए इंजीनियर एस्कॉर्बेट पेरोक्सी (एपेक्स) या एस्चेरिचिया कोलाई बायोटिन लिगा (जिसे बायोआईडी के नाम से जाना जाता है) का उपयोग करके निकटता लेबलिंग (पीएल) तकनीकों का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। हालांकि, एपेक्स आधारित पीएल में विषाक्त हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)की आवश्यकताएं, बायोटिन (16-24 घंटे) के साथ लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय, और बायोआईडी-आधारित पीएल में उच्च इनक्यूबेशन तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) पौधों में उनके अनुप्रयोगों को गंभीर रूप से सीमित करता है। हाल ही में वर्णित टर्बोआईडी आधारित पीएल बायोआईडी और एपेक्स की कई सीमाओं को संबोधित करता है। टर्बोआईडी कमरे के तापमान (आरटी) स्थितियों के तहत सिर्फ 10 min में प्रोटीन की तेजी से निकटता लेबलिंग की अनुमति देता है । हालांकि टर्बोआईडी की उपयोगिता पशु मॉडलों में प्रदर्शित किया गया है, हमने हाल ही में दिखाया कि टर्बोआईडी आधारित पीएल प्रोटीन की लेबलिंग के लिए बायोआईडी की तुलना में पौधों में बेहतर प्रदर्शन करता है जो ब्याज के प्रोटीन के समीपस्थ हैं। बशर्ते यहां एक मॉडल के रूप में न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग ल्यूसिन-रिच रिपीट (एनएलआर) प्रोटीन परिवार के एन-टर्मिनल टोल/इंटरल्यूकिन-1 रिसेप्टर (टीआईआर) डोमेन का उपयोग करके प्रोटीन इंटरैक्शन पार्टनर्स की पहचान के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल है । विधि में वेक्टर निर्माण, प्रोटीन अभिव्यक्ति की कृषि घुसपैठ, बायोटिन उपचार, प्रोटीन निष्कर्षण और डिसाल्टिंग, क्वांटिफिकेशन और आत्मीयता शुद्धिकरण द्वारा बायोटिनेटेड प्रोटीन के संवर्धन का वर्णन किया गया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को निकोटियाना और अन्य पौधों की प्रजातियों में रुचि के अन्य प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

पीपीआई विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं का आधार है। पीपीआई की पहचान करने के लिए पारंपरिक तरीकों में खमीर-दो-हाइब्रिड (Y2H) स्क्रीनिंग और इम्यूनोप्रीप्रिसिप्रिशन शामिल हैं, जो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (आईपी-एमएस)1के साथ मिलकर हैं । हालांकि दोनों कुछ नुकसान से पीड़ित हैं। उदाहरण के लिए, Y2H स्क्रीनिंग के लिए लक्ष्य संयंत्र या जानवरों की प्रजातियों के Y2H पुस्तकालय की उपलब्धता की आवश्यकता होती है। इन पुस्तकालयों का निर्माण श्रम-प्रधान और महंगा है। इसके अलावा, Y2H दृष्टिकोण विषमलोगोस एकल-कोशिका यूकेरियोटिक ऑर्गेज्म खमीर में किया जाता है, जो उच्च यूकेरियोटिक कोशिकाओं की सेलुलर स्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है।

इसके विपरीत, आईपी-एमएस क्षणिक या कमजोर पीपीआई पर कब्जा करने में कम दक्षता दिखाता है, और यह कम बहुतायत या उच्च हाइड्रोफोबिसिटी वाले प्रोटीन के लिए भी अनुपयुक्त है। रिसेप्टर जैसे किनेस (आरएलके) या प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स के एनएलआर परिवार जैसे पौधे सिग्नलिंग रास्तों में शामिल कई महत्वपूर्ण प्रोटीन निम्न स्तर पर व्यक्त किए जाते हैं और अक्सर अन्य प्रोटीन के साथ क्षणिक रूप से बातचीत करते हैं। इसलिए, यह इन प्रोटीनों के नियमन में अंतर्निहित तंत्र ों की समझ को बहुत प्रतिबंधित करता है ।

हाल ही में, इंजीनियर एस्कॉर्बेट पेरोक्सी (एपेक्स) और एक उत्परिवर्ती एस्चेरिचिया कोलाई बायोटिन लिगासे बिराR118G (जिसे बायोआईडी के नाम से जाना जाता है) के आधार पर निकटता लेबलिंग (पीएल) विधियों को विकसित किया गया है और पीपीआई2,,3,,4के अध्ययन के लिए उपयोग किया गया है। पीएल का सिद्धांत यह है कि ब्याज का एक लक्ष्य प्रोटीन एंजाइम के साथ जुड़ा हुआ है, जो लेबिल बायोटिनिल-एएमपी (जैव-एएमपी) के गठन को उत्प्रेरक करता है। ये मुफ्त जैव-एएमपी पीएल एंजाइमों द्वारा जारी किए जाते हैं और लक्ष्य प्रोटीन के आसपास के क्षेत्र में फैलाते हैं, जिससे 10 एनएम5के अनुमानित त्रिज्या के भीतर प्राथमिक अमीनों में समीपस्थ प्रोटीन के बायोटिनीलेशन की अनुमति होती है।

इस दृष्टिकोण को पारंपरिक Y2H और आईपी-एमएस दृष्टिकोणों पर महत्वपूर्ण लाभ हैं, जैसे क्षणिक या कमजोर पीपीआई पर कब्जा करने की क्षमता। इसके अलावा, पीएल अपने मूल सेलुलर वातावरण में लक्ष्य प्रोटीन के समीपस्थ प्रोटीन की लेबलिंग की अनुमति देता है । विभिन्न पीएल एंजाइमों को विभिन्न प्रणालियों पर लागू करते समय अद्वितीय नुकसान होते हैं। उदाहरण के लिए, हालांकि एपेक्स बायोआईडी की तुलना में उच्च टैगिंग काइनेटिक्स प्रदान करता है और स्तनधारी प्रणालियों में सफलतापूर्वक लागू होता है, इस दृष्टिकोण में विषाक्त हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)की आवश्यकता इसे पौधों में पीएल अध्ययन के लिए अनुपयुक्त बनाती है।

इसके विपरीत, बायोआईडी-आधारित पीएल विषाक्त एच2ओ2के उपयोग से बचा जाता है, लेकिन लेबलिंग की दर धीमी है (बायोटिनीशन को पूरा करने के लिए 18-24 घंटे की आवश्यकता होती है), इस प्रकार क्षणिक पीपीआई का कब्जा कम कुशल बनाता है। इसके अलावा, बायोआईडी द्वारा कुशल पीएल के लिए आवश्यक उच्च इनक्यूबेशन तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) पौधों4जैसे कुछ जीवों के लिए बाहरी तनाव का परिचय देता है। इसलिए, पौधों (यानी, चावल प्रोटोप्लास्ट, अरबीडोप्सिस और एन बेंथमियाना) में बायोआईडी-आधारित पीएल की सीमित तैनाती6,7,7,8,,9की रिपोर्ट की गई है। हाल ही में वर्णित टर्बोआईडी एंजाइम एपेक्स और बायोआईडी आधारित पीएल की कमियों को दूर करता है । टर्बोआईडी ने उच्च गतिविधि दिखाई जो आरटी10में 10 मिनट के भीतर पीएल की उपलब्धि को सक्षम बनाती है । टर्बोआईडी आधारित पीएल सफलतापूर्वक स्तनधारी कोशिकाओं, मक्खियों, और कीड़े10में लागू किया गया है । हाल ही में, हमने और अन्य शोध समूहों ने एन बेंथमियाना और अरबीडोप्सिस पौधों और टमाटर बालों वाली जड़ें11,,12,,13, 14,14सहित विभिन्न संयंत्र प्रणालियों में पीपीआई का अध्ययन करने के लिए टर्बोआईडी-आधारित पीएल के उपयोग को स्वतंत्र रूप से अनुकूलित और बढ़ाया। तुलनात्मक विश्लेषणों से पता चला कि टर्बोआईडी बायोआईडी11,14की तुलना में पौधों में पीएल के लिए बेहतर प्रदर्शन करता है । इसने एक एनएलआर प्रतिरक्षा रिसेप्टर11के साथ कई उपन्यास बातचीत की पहचान करके प्लांटा में टर्बोआईडी-आधारित पीएल की मजबूती का भी प्रदर्शन किया है, एक प्रोटीन जिसका इंटरैक्शन पार्टनर आमतौर पर पारंपरिक तरीकों का उपयोग करके प्राप्त करना मुश्किल होता है।

यह प्रोटोकॉल एन बेंथमियाना संयंत्रों में एनएलआर प्रतिरक्षा रिसेप्टर के एन-टर्मिनल टीआईआर डोमेन के इंटरैक्शन प्रोटीन की पहचान का वर्णन करके प्लांटा में टर्बोआईडी-आधारित पीएल को दिखाता है। इस विधि को एन बेंथमियानामें रुचि के किसी भी प्रोटीन तक बढ़ाया जा सकता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि यह अरबीडोप्सिस,टमाटर और अन्य जैसे अन्य पादप प्रजातियों में पीपीआई की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण संदर्भ प्रदान करता है।

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Protocol

नोट: विधि का अवलोकन चित्र 1में दिखाया गया है ।

1. पौधे सामग्री तैयार करना

  1. एक उच्च घनत्व पर गीली मिट्टी में एन बेंथमियाना बीज उगाएं और उन्हें 16 घंटे की रोशनी (लगभग 75 μmol/m2s) और 23-25 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे डार्क फोटोपीरियड के साथ जलवायु कक्ष में बनाए रखें।
  2. लगभग 1 सप्ताह बाद, प्रत्येक युवा अंकुर को 4 'x 4' बर्तनों में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें और रोपण को एक ही कक्ष में रखें।
  3. कक्ष में पौधों को लगभग 4 सप्ताह तक बनाए रखें जब तक कि वे बाद में कृषि घुसपैठ15के लिए 4-8 के पत्ती चरण में न बढ़ जाएं।

2. टर्बोआईडी फ्यूजन का निर्माण

  1. टर्बोआईडी (आइडजीन प्लाज्मिड #107177 से पीसीआर टर्बोआईडी) के साथ टारगेट प्रोटीन का फ्यूजन जेनरेट करने के लिए स्टैंडर्ड मॉलिक्यूलर क्लोनिंग तकनीक का इस्तेमाल करें। यहां, हमने एनएलआर प्रतिरक्षा रिसेप्टर के एन-टर्मिनल टीआईआर डोमेन का उपयोग ब्याज के लक्ष्य प्रोटीन के रूप में किया और फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर (p35S::TIR-टर्बोआईडी) के नियंत्रण में टर्बोआईडी को विकसित किया।
    नोट: टर्बोआईडी एंजाइम का कार्बोसिल-टर्मिनस या लक्ष्य प्रोटीन का अमीनो-टर्मिनस का फ्यूजन ब्याज के प्रोटीन पर निर्भर करेगा। आमतौर पर, एक साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन के लिए, दोनों टर्मिनी स्वीकार्य होना चाहिए, जब तक टर्बोआईडी फ्यूजन लक्ष्य प्रोटीन के कार्य को प्रभावित नहीं करता है। हालांकि, झिल्ली स्थानीयकृत प्रोटीन के लिए, प्रोटीन टोपोलॉजी को यह निर्धारित करने से पहले पहले से ही विशेषता होनी चाहिए कि टर्बोआईडी संलयन के लिए कौन सा शब्दावली सबसे अच्छा है।
  2. बाद के मात्रात्मक प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए एक ही प्रमोटर के तहत टर्बोआईडी-फ्यूज्ड सिट्रिन का निर्माण करें।
    नोट: लक्ष्य प्रोटीन के लिए प्रोटेम समीपस्थ की पहचान करने के लिए टर्बोआईडी नियंत्रण का निर्माण करना महत्वपूर्ण है। टर्बोआईडी फ्यूजन कंट्रोल को टर्बोआईडी-फ्यूज्ड टारगेट प्रोटीन के समान एक्सप्रेशन लेवल दिखाना चाहिए । यह एग्रोबैक्टीरियम के दौरान एग्रोबैक्टीरियम एकाग्रता को समायोजित करके अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जा सकता है। इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि नियंत्रण प्रोटीन में ब्याज के लक्ष्य प्रोटीन के समान एक उपकोशिकीय स्थानीयकरण पैटर्न होता है।

3. एग्रोघुसपैठ

  1. एग्रोबैक्टीरियम में प्लाज्मिड्स का परिवर्तन
    1. एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफैक्सन्स स्ट्रेन GV3101 सक्षम कोशिकाओं के चरण 2.1 और 2.2 से 50 माइक्रोन से उत्पन्न प्लाज्मिड ्स के 0.5 माइक्रोन जोड़ें, जो पहलेवर्णित 16के रूप में तैयार किए गए हैं।
      नोट: GV2260 जैसे अन्य एग्रोबैक्टीरियम उपभेदों का भी उपयोग किया जा सकता है।
    2. 30 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
    3. 60 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में गर्मी सदमे।
    4. एग्रोबैक्टीरियम में एलबी मीडियम (10 जी/एल ट्राइपटोन, 5 जी/एल खमीर निकालने, और 10 जी/एल एनआइसीएल; पीएच = 7.0) के 400 माइक्रोन जोड़ें और 90 मीटर के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. प्लेट एलबी एगर पर ट्यूब में पूरी सामग्री प्लाज्मिड का चयन करने के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक है, साथ ही एग्रोबैक्टीरियम के लिए (GV3101 के लिए: 50 मिलीग्राम/एल gentamicin और 50 मिलीग्राम/L rifampicin)।
    6. 36-48 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें जब तक व्यक्तिगत उपनिवेश दिखाई नहीं देतीं।
  2. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एक ताजा पौंड आगर प्लेट पर कई व्यक्तिगत उपनिवेशों उठाओ और लकीर (चरण ३.१.५ देखें) और रात भर 28 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते हैं ।
    नोट: एग्रोबैक्टीरियममें विशिष्ट बाइनरी निर्माण की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए कॉलोनी पीसीआर का प्रदर्शन करना अधिक इष्टतम है। हमारे अनुभव में, 95% से अधिक उपनिवेशों में शुरू किए गए बाइनरी निर्माण होते हैं।
  3. एलबी मीडियम प्लस उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के 3 एमएल का टीका (देखें कदम 3.1.4) एग्रोबैक्टीरियम कॉलोनी के साथ ब्याज के निर्माण को शरण देते हुए, और एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति के ओडी600 तक पहुंचने तक 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हिलाकर इनक्यूबेट करें।
  4. 3,000 x ग्राम पर कोशिकाओं को केंद्रीकृत करें और उन्हें एग्रोघुसपैठ बफर में ओडी600 = 1.0 (10 एमएम एमजीसीएल2,10 एम एमईएस [पीएच = 5.6], 250 माइक्रोएम एसीटोसिरिंगोन में फिर से निलंबित करें।'
    नोट: हालांकि यह कृषि घुसपैठ से पहले आरटी में 2 घंटे के लिए inoculum इनक्यूबेट करने के लिए इष्टतम है, GV3101 तनाव के साथ हमारे अनुभव में, वहां इनक्यूबेशन के बिना बनाम के साथ लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति के बीच एक बड़ा अंतर नहीं किया गया है ।
  5. पूरी तरह से परिपक्व एन बेंथमियाना पत्तियों के (abaxial) एपिडर्मिस में इनोकुलम में घुसपैठ करने के लिए 1 मिलीएल सुईरहित सिरिंज का उपयोग करें।
    नोट: तीन जैविक प्रतिकृतियों के लिए पत्ती सामग्री की पर्याप्त मात्रा तैयार करने के लिए: एक पूरी पत्ती आमतौर पर घुसपैठ की जाती है, प्रति पौधे तीन पत्तियों में घुसपैठ की जाती है, और प्रत्येक निर्माण के लिए तीन से चार पौधों का उपयोग किया जाता है। प्रत्येक पत्ते के लिए, 1.5-2.0 मीटर पुनर्निलंबित एग्रोबैक्टीरिया पर्याप्त है।
  6. 36 घंटे के बाद घुसपैठ (एचपीआई) के बाद, टर्बोआईडी निर्माण के साथ पूर्व घुसपैठ पत्तियों में 200 माइक्रोएम बायोटिन (10 एम एम एमजीसीएल2 समाधान में) घुसपैठ करें।
  7. धारा 4 में वर्णित पत्ती के ऊतकों की कटाई से पहले अतिरिक्त 3-12 घंटे के लिए पौधे को बनाए रखें।
    नोट: बायोटिन घुसपैठ के लिए 36 एचपीआई चुनने का कारण यह है कि पिछले अध्ययनों के अनुसार इस टाइमपॉइंट पर लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति चोटियां11. यह ब्याज के लक्ष्य प्रोटीन की इष्टतम अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक समय निर्धारित करने की सलाह दी जाती है। बायोटिन के बाद इनक्यूबेशन बार घुसपैठ अध्ययन के तहत प्रयोगात्मक डिजाइन और लक्ष्य प्रोटीन पर निर्भर करती है। आमतौर पर, 3-12 घंटे का बायोटिन उपचार टर्बोआईडी फ्यूजन द्वारा लक्ष्य प्रोटीन के लिए अधिकांश प्रोटीन समीपस्थ की लेबलिंग की अनुमति देता है।

4. पत्ती नमूना संग्रह

नोट: पत्ती के नमूनों के बाद की प्रसंस्करण के लिए, नमूनों के केराटिन संदूषण से बचने के लिए बाँझ दस्ताने पहनें। सभी अभिकर्मक भी यथासंभव केराटिन मुक्त होने चाहिए।

  1. पेटियोल के आधार पर घुसपैठ की पत्तियों को काटें, पत्ती की नस को हटा दें, फिर तरल नाइट्रोजन में पत्ती के ऊतकों को फ्लैश-फ्रीज करें।
  2. एक मूसल और मोर्टार का उपयोग करपत्ती ऊतक पीसलें और बाद के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिलीएल या 50 मिलीएल फाल्कन ट्यूबों में पत्ती पाउडर स्टोर करें।
    नोट: विभिन्न पौधों से तीन जैविक प्रतिकृतियों में से प्रत्येक के लिए पत्तियों के तीन से चार टुकड़े लें। यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है। बाद के चरणों से पहले, इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति और लक्ष्य प्रोटीन के बायोटिनाइलेशन का आकलन करने की सिफारिश की जाती है। विशिष्ट पश्चिमी दाग चित्र 2में दिखाए गए हैं ।

5. पत्ती कुल प्रोटीन की निकासी

  1. लगभग 0.35 ग्राम लीफ पाउडर को 2 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें। प्रत्येक नमूने के लिए दो ट्यूब तैयार करें।
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन द्वारा ठंडा किसी भी वस्तु को छूते समय दस्ताने पहनें।
  2. रिपा लिसिस बफर के 700 माइक्रोन जोड़ें (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल [पीएच = 7.5], 500 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम ईटीए, 1% NP40 [v/v], 0.1% एसडीएस [w/v], 0.5% सोडियम डिऑक्सीकोलेट [w/v], 1 एमएम डीटीटी, प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल की 1 टेबलेट) से 0.35 ग्राम लीफ पाउडर।
  3. भंवर 10 min के लिए ट्यूबों।
  4. नमूनों को 30 नगदी के लिए बर्फ पर छोड़ दें।
  5. ट्यूबों को कई बार उल्टा करके हर 4-5 सीन की सामग्री मिलाएं।

6. डिसाल्टिंग द्वारा मुफ्त बायोटिन को हटाना

नोट: इस अनुभाग के बारे में 50 min लेता है.

  1. डिसाल्टिंग कॉलम को सम-रूप दें।
    1. डिसाल्टिंग कॉलम के नीचे सीलर निकालें और कॉलम को 50 मीटर ट्यूब में डाल दें।
    2. 2 मिन के लिए 1000 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा स्टोरेज सॉल्यूशन निकालें और सुनिश्चित करें कि टोपी ढीली हो।
    3. डिसाल्टिंग कॉलम को 50 मीटर ट्यूब में रखें। रिपा लाइसिस बफर के 5 mL के साथ कॉलम 3x को समतुल्य करें, हर बार 1000 x g पर अपकेंद्री और 2 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और प्रवाह को छोड़ दें।
    4. डिसाल्टिंग कॉलम को एक नए 50 मीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और बाद के उपयोग के लिए अस्थायी रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. चरण 5.4 से ट्यूबों को 16,500 x ग्राम और 10 किमी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें और दो ट्यूबों से सुपरनेट को एक नई 2 मिलील ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. समतुल्य डिसाल्टिंग कॉलम (चरण 6.1.4 से) के रेसिन के शीर्ष पर 1,500 माइक्रोन प्रोटीन निकालने जोड़ें। जब प्रोटीन निकालने के लिए रेसिन में प्रवेश करती है, RIPA lysis बफर के एक और १०० μL जोड़ें ।
    नोट: हालांकि रिपा लाइसिस बफर के १,४०० μL पत्तियों से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया गया था, प्रोटीन निष्कर्षण और desalting के बाद कुल मात्रा हमेशा मूल मात्रा के सापेक्ष कुछ हद तक बढ़ गया था । इसलिए, प्रत्येक समूह से नमूनों के संयोजन के रूप में चरण ५.१ और ५.४ में वर्णित प्रति नमूना प्रोटीन निकालने के कम से १,५०० μL में परिणाम कर सकते हैं ।
  4. 2 मिन के लिए 1000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र और बर्फ पर डिसाल्टेड नमूनों को अस्थायी रूप से छोड़ दें।

7. एक ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर desalted प्रोटीन अर्क की मात्रा

  1. प्रत्येक ढाल बीएसए समाधान के 50 माइक्रोन तैयार करें: 0 मिलीग्राम/mL, 0.2 मिलीग्राम/mL, 0.4 मिलीग्राम/mL, 0.6 मिलीग्राम/mL, 0.8 मिलीग्राम/mL, और 1 मिलीग्राम/mL।
  2. डीएच2ओ के 45 माइक्रोन के साथ 5 माइक्रोन नमूना मिलाकर डिसाल्टेड प्रोटीन एक्सट्रैक्ट को पतला करना।
  3. 5x ब्रैडफोर्ड रीजेंट (100 मिलीग्राम कूमासी शानदार ब्लू G250, मेथनॉल के 47 मिलीग्राम, 85% फॉस्फोरिक एसिड के 100 मिलील, डीडीएच2ओ के 53 मिलील) को कमजोर करके 1x ब्रैडफोर्ड रीजेंट तैयार करें।
  4. प्रत्येक ढाल बीएसए समाधान के 50 μL और 1x ब्रैडफोर्ड रीजेंट के 2.5 mL करने के लिए पतला प्रोटीन निकालने के 50 μL जोड़ें।
  5. 10 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  6. एलिसा प्लेट (प्रति नमूना तीन तकनीकी प्रतिकृति) के एक अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें।
  7. एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग कर ओडी595 उपाय।
  8. ढाल बीएसए समाधान के मूल्य के आधार पर मानक वक्र ड्रा और desalted प्रोटीन नमूनों की एकाग्रता की गणना। आमतौर पर, 0.7 ग्राम पत्तियों से प्राप्त कुल प्रोटीन एकाग्रता 3-6 मिलीग्राम/mL से होती है।
  9. बाद में आत्मीयता शुद्धि के लिए 6-8 मिलीग्राम डिसाल्टेड प्रोटीन निकालने को तैयार करें।

8. बायोटिनेटेड प्रोटीन का संवर्धन

  1. स्ट्रेप्टाविडन-सी 1-कंजुगेट चुंबकीय मोतियों के 200 माइक्रोन को 2 मिलीएल ट्यूब में लें।
  2. आरटी में 1 मिन के लिए रिपा लाइसिस बफर के 1 मिलील के साथ स्ट्रेप्टाविडन-सी1-कंजुगेड चुंबकीय मोतियों को समतुल्य करें।
  3. प्रत्येक धोने के बाद, चुंबकीय रैक का उपयोग 3 मिन के लिए मोतियों को सोखने के लिए करें और धीरे-धीरे पाइपिंग द्वारा समाधान को हटा दें।
  4. 8.2 और 8.3 चरणदोहराएं।
  5. डिसाल्टेड प्रोटीन एक्सट्रैक्ट को समतुल्य स्ट्रेप्टाविडन-सी 1-कंजुगेटेड चुंबकीय मोतियों में स्थानांतरित करें।
  6. बायोटिनी प्रोटीन को आत्मीयता-शुद्ध करने के लिए रोटेटर पर 12 घंटे (या रात भर) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
  7. आरटी में 4 मिन के लिए एक चुंबकीय रैक पर मोतियों पर कब्जा जब तक मोती ट्यूब के एक तरफ इकट्ठा, तो धीरे से पिपेट द्वारा supernatant हटा दें ।
  8. ट्यूब में वॉश बफर आई (पानी में 2% एसडीएस) के 1.7 mL जोड़ें और इसे 8 मिन के लिए आरटी पर रोटेटर पर रखें। 8.3 चरण दोहराएं।
  9. वॉश बफर II (50 mM HEPES: पीएच = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% deoxycholic एसिड [w/v], 1% ट्राइटन एक्स-100) के 1.7 mL ट्यूब के लिए जोड़ें और 8 मिन के लिए आरटी पर रोटेटर पर रखें। दोहराएं कदम 8.3।
  10. वॉश बफर III (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल: पीएच = 7.4, 250 मीटर लिसीएल, 1 एमएम ईटीए, 0.1% डिऑक्सीकोलिक एसिड [w/v], 1% NP40 [v/v]) के 1.7 mL जोड़ें और इसे 8 मिन के लिए आरटी पर रोटेटर पर रखें।
  11. डिटर्जेंट को हटाने के लिए 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच = 7.5) के 1.7 एमएएल जोड़ें, फिर चरण 8.3 दोहराएं।
  12. मोतियों को एक नई 1.5 mL ट्यूब पर स्थानांतरित करें, और 8.11 और 8.3 चरणदोहराएं।
  13. आरटी में 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर के साथ प्रत्येक 5 मिन के लिए मोतियों 6x धोएं।
  14. चुंबकीय मोतियों में 50 एम एम अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर का 1 एमएल जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
  15. बायोटिनी प्रोटीन के संवर्धन की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के लिए मोतियों के 100 माइक्रोन निकालें। एक ठेठ पश्चिमी दाग चित्र 3में दिखाया गया है ।
  16. बाकी प्रोटीन नमूनों को फ्लैश-फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें या सूखी बर्फ पर एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए तुरंत भेजें।
    नोट: ठेठ एमएस परिणाम पिछले प्रकाशन में प्रदर्शित होते हैं (झांग एट अल 2019; चित्रा 2, अनुपूरक डेटा 1, और अनुपूरक डेटा 2)11। पूरे डेटासेट मैसेटिव () पर उपलब्ध हैं, जो पहचानकर्ता का उपयोग करके: MSV000083018 और MSV000083019 ।

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Representative Results

प्रतिनिधि डेटा, जो वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर अपेक्षित परिणामों को दर्शाते हैं, झांग एट अल11से अनुकूलित हैं । चित्रा 1 एन बेंथमियानामें टर्बोआईडी आधारित पीएल प्रदर्शन के लिए प्रक्रियाओं का सारांश । चित्रा 2 घुसपैठ एन बेंटमिना पत्तियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति और बायोटिन्टिनेशन को दर्शाता है। चित्रा 3 से पता चलता है कि घुसपैठ की पत्तियों में बायोटिनेटेड प्रोटीन बाद के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए कुशलतापूर्वक समृद्ध थे। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि स्ट्रेप्टाविडन-सी 1-कंजुगेटेड चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके बायोटिनी प्रोटीन के संवर्धन के बाद, विभिन्न आकारों वाले विभिन्न प्रोटीनों पर कब्जा कर लिया गया, और समृद्ध प्रोटीन के पश्चिमी दाग विश्लेषण में गंदा बैंड(चित्रा 3)दिखाया गया। हाल ही में प्रकाशित कई अध्ययनों6,7,,13,,14में भी इसी तरह की टिप्पणियां की गई हैं .

Figure 1
चित्रा 1: एन बेंथमियानामें टर्बोआईडी आधारित पीएल विधि का अवलोकन । टर्बोआईडी-फ्यूजन निर्माण को शरण देने वाले एग्रोबैक्टीरियम एन बेंथमियाना पत्तियों में घुसपैठ की गई थी। 36 घंटे के बाद घुसपैठ, 200 μM बायोटिन एक ही पत्तियों के लिए घुसपैठ की है कि टर्बोआईडी-फ्यूज्ड लक्ष्य प्रोटीन के लिए समीपस्थ हैं कि एंडोजेनस प्रोटीन के बायोटिनेशन शुरू करने के लिए। इसके बाद घुसपैठ करने वाले पौधों को 3-12 घंटे के लिए आरटी में इनक्यूबेटेड किया जाता है, जिसके बाद पत्ती कटाई और तरल नाइट्रोजन में पीसने होते हैं । रिफा लाइसिस बफर में लीफ पाउडर को लाइका इज्ड किया जाता है और प्रोटीन निकालने में फ्री बायोटिन को हटाने के लिए एक डिसाल्टिंग कॉलम लगाया जाता है । इसके बाद बायोटिनेटेड प्रोटीन को स्ट्रेप्टाविडिन-कंजुगेमाट मोतियों के साथ आत्मीयता-शुद्ध किया गया और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाना गया । यह आंकड़ा झांग एट अल11से अनुपूरक चित्रा 3 से अनुकूलित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: चरण 4.2 में प्राप्त प्रोटीन अर्क का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण। (A)एएच टैग के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ एग्रोघुसपैठ पत्तियों से निकाले गए प्रोटीन का पश्चिमी दाग विश्लेषण । (ख)स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी के साथ एग्रोघुसपैठ पत्तियों में बायोटिनेटेड प्रोटीन का पश्चिमी दाग विश्लेषण । यह आंकड़ा झांग एट अल11के अनुपूरक चित्र 6B से अनुकूलित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: बायोटिनी प्रोटीन के संवर्धन की पुष्टि करने के लिए चरण 8.15 में प्राप्त मोतियों का पश्चिमी दाग विश्लेषण। प्रत्येक निर्माण के लिए, तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियां (1, 2, और 3) हैं। स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी का उपयोग विभिन्न नमूनों में बायोटिनेटेड प्रोटीन के विश्लेषण के लिए किया गया था। यह आंकड़ा झांग एट अल11से अनुपूरक चित्रा 7 से अनुकूलित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

टर्बोआईडी बायोटिन लिगाज बायोआईडी10के खमीर डिस्प्ले-आधारित निर्देशित विकास द्वारा उत्पन्न होता है। इसके अन्य पीएल एंजाइमों के ऊपर कई फायदे हैं। टर्बोआईडी मक्खियों और कीड़े सहित अन्य मॉडल प्रणालियों के लिए पीएल के आवेदन की अनुमति देता है, जिसका इष्टतम विकास तापमान 25 डिग्री सेल्सियस10के आसपास है। हालांकि पीएल दृष्टिकोण व्यापक रूप से पशु प्रणालियों में इस्तेमाल किया गया है, पौधों में अपने आवेदन सीमित है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल एन बेंथमियानामें टर्बोआईडी आधारित पीएल की स्थापना के लिए एक कदम-दर-कदम प्रक्रिया प्रदान करता है, जो एक मॉडल संयंत्र है जिसका व्यापक रूप से पौधे-रोगजनक बातचीत अध्ययन में उपयोग किया गया है। यह प्रोटोकॉल पत्ती नमूना तैयारकरने, मुफ्त बायोटिन को हटाने, निकाले गए प्रोटीन की मात्रा और बायोटिनेटेड प्रोटीन के संवर्धन को रेखांकित करता है।

हालांकि पशु सेल संस्कृति प्रणालियों में मुफ्त बायोटिन को काफी हद तक पीबीएस बफर4के साथ कोशिकाओं को धोकर हटाया जा सकता है, लेकिन पत्ती के ऊतकों में मुफ्त बायोटिन को सरल धोने से मंजूरी नहीं दी जा सकती है। हाल ही में हुए एक अध्ययन में बताया गया है कि मुक्त बायोटिन बायोटिन से बायोटिनेटेड प्रोटीन11के बाद के संवर्धन पर गंभीर प्रभाव पड़ सकता है । इस प्रोटोकॉल में, प्रोटीन अर्क में मुफ्त बायोटिन को सफलतापूर्वक हटाने के लिए एक डिसाल्टिंग कॉलम का उपयोग किया जाता है, जिससे स्ट्रेपेविडिन मोतियों को बायोटिनी प्रोटीन की कुशल बाध्यकारी की अनुमति मिलती है।

इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल अन्य संयंत्र प्रणालियों में पीएल के संचालन के लिए एक महत्वपूर्ण संदर्भ के रूप में कार्य करता है। हाल ही में, तीन रिपोर्टों ने यहां वर्णित एन बेंथमियाना के अलावा अरबीडोप्सिस12,13,,14 और टमाटर बालों वाली जड़12में टर्बोआईडी आधारित पीएल का इस्तेमाल किया है ।, पशु सेल संस्कृति प्रणालियों के समान, प्रोटीन निष्कर्षण6से पहले पौधे के प्रोटोप्लास्ट को धोकर मुफ्त बायोटिन को हटाना हासिल किया गया था। हालांकि, मुक्त बायोटिन अणुओं की कम मात्रा जो प्रोटीन के लिए एकीकृत नहीं थी, कोशिका के इंटीरियर में मौजूद थी, जिसने बायोटिनेटेड प्रोटीन के बाद के संवर्धन की दक्षता को प्रभावित किया। इसलिए, मुफ्त बायोटिन को पूरी तरह से हटाने के लिए एक डिसाल्टिंग प्रक्रिया की सिफारिश की जाती है, जिससे बायोटिनेटेड प्रोटीन की वसूली दक्षता में वृद्धि होती है।

दो प्रकार के कॉलम, पीडी-10 और जेबा का उपयोग मुफ्त बायोटिन हटाने11,,12,13,,14के लिए किया गया है।, भविष्य में लीफ प्रोटीन अर्क में फ्री बायोटिन को हटाने में इन दोनों कॉलम की दक्षता की तुलना करना भविष्य में रुचि हो सकती है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल एन बेंथमियाना पत्तियों में ब्याज के लक्ष्य प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए एक विहित सिरिंज-मध्यस्थता कृषि घुसपैठ विधि को नियोजित करता है। फिर, बायोटिन सब्सट्रेट को प्रोटीन लेबलिंग के लिए पत्तियों में फिर से घुसपैठ की जाती है जो लक्ष्य प्रोटीन के समीपस्थ होते हैं। हाल ही में सूचित किए गए अन्य दो अध्ययनों में भी इसी तरह के कार्यों का उपयोग किया गया है।,13 एक वैकल्पिक विधि के रूप में, एन बेंथमियाना और अरबीडोप्सिस14दोनों के लिए बायोटिन की वैक्यूम-मध्यस्थता घुसपैठ लागू होती है। इसके अलावा, उन पौधों में जो कृषि घुसपैठ के लिए उपयुक्त नहीं हैं, सेल संस्कृतियों को लक्षित प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए बदल दिया जा सकता है, इसके बाद बायोटिन उपचार और निकटता लेबलिंग परख12। इन हालिया अध्ययनों ने पीपीआई का अध्ययन करने में टर्बोआईडी आधारित पीएल की मजबूती पर टिकी है और विभिन्न पौधों की प्रजातियों में टर्बोआईडी आधारित पीएल के भविष्य के अनुप्रयोगों की नींव रखी है ।

इस प्रोटोकॉल में, एन बेंथमियाना में अच्छी तरह से स्थापित एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताक्षणिक अभिव्यक्ति ब्याज के लक्ष्य प्रोटीन के पीपीआई की पहचान करने के लिए नियोजित है। क्षणिक अभिव्यक्ति संलयन प्रोटीन की अतिअभिव्यक्ति का कारण बन सकती है। इसलिए, एक देशी प्रमोटर के नियंत्रण में टर्बोआईडी फ्यूजन को इंजीनियर करना और इसे कृषि घुसपैठ या स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी द्वारा व्यक्त करना है। जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी के विकास के साथ, टर्बोआईडी टुकड़े में सीधे ब्याज के जीन के देशी जीनोमिक लोकी में दस्तक देना भी संभव है।

विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक यह सुनिश्चित करना है कि टर्बोआईडी फ्यूजन ब्याज के लक्ष्य प्रोटीन के कार्य में परिवर्तन नहीं करता है। पिछले अध्ययन में, टर्बोआईडी के लिए जुड़े एनएलआर प्रतिरक्षा रिसेप्टर के कार्य की पुष्टि तंबाकू मोज़ेक वायरस p50 प्रभावक11की उपस्थिति में रक्षा-मध्यस्थता सेल मौत को प्रेरित करने की क्षमता का परीक्षण करके की गई थी। टर्बोआईडी जीएफपी की तुलना में अपेक्षाकृत बड़ा (यानी, 35 केडीए) है, और लक्ष्य प्रोटीन के लिए इसका संलयन लक्ष्य प्रोटीन के कार्य को प्रभावित कर सकता है। ऐसे मामलों में, छोटे मिनीटर्बोआईडी10 का उपयोग किया जा सकता है।

यह भी निर्धारित करने के लिए जो लक्ष्य प्रोटीन की टर्मिनस टर्बोआईडी के साथ फ्यूजिंग के लिए उपयुक्त है महत्वपूर्ण है। इस तरह के कार्यात्मक परीक्षणों के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण यह निर्धारित कर रहा है कि टर्बोआईडी संलयन लक्ष्य जीन की उत्परिवर्ती संयंत्र रेखा का पूरक होगा या नहीं। वैकल्पिक रूप से, लक्ष्य प्रोटीन के पहले से ज्ञात इंटरैक्शन पार्टनर के साथ टर्बोआईडी फ्यूजन की बातचीत के विश्लेषण का उपयोग किया जा सकता है। ज्यादातर मामलों में, साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन के लिए, टर्बोआईडी के एन-टर्मिनल या सी-टर्मिनल टैगिंग बाद के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में तुलनीय डेटासेट का उत्पादन कर सकते हैं। हालांकि, झिल्ली-स्थानीयकृत प्रोटीन के लिए, वेक्टर निर्माण से पहले टोपोलॉजी का निर्धारण करना महत्वपूर्ण है। अन्यथा, ब्याज के जीन के कोडिंग अनुक्रम के टर्बोआईडी अपस्ट्रीम या डाउनस्ट्रीम का संलयन पूरी तरह से अलग परिणाम उत्पन्न करेगा। इसलिए, झिल्ली-स्थानीयकृत प्रोटीन के एन-टर्मिनस या सी-टर्मिनस के सामना करने वाले पक्षों (जैसे, साइटोप्लाज्मिक- या ल्यूमेन-फेसिंग) का निर्धारण करना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करता है कि लक्ष्य प्रोटीन की अपेक्षित समीपस्थ प्रोटेम प्राप्त की जा सकती है।

हालांकि पीएल क्षणिक या कमजोर पीपीआई का पता लगाने के लिए पारंपरिक आईपी एमएस दृष्टिकोण पर कई फायदे हैं, यह अपनी आंतरिक सीमाएं हैं । सबसे पहले, उम्मीदवार इंटरैक्शन प्रोटीन की पहचान तुरंत चारा प्रोटीन के साथ प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष बातचीत का संकेत नहीं देती है, लेकिन यह केवल निकटता2को दर्शाती है। इसलिए, वीवो परखों (यानी, सह-इम्यूनोप्रिसिप्रिशन, बाइमॉलिक्यूलर फ्लोरेसेंस पूरण [बीएफसी], या इन विट्रो जीएसटी-पुल डाउन परख) में स्वतंत्र पीपीआई को और सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है।

दूसरा, झूठी नकारात्मक या झूठी सकारात्मक विभिन्न कारणों के कारण पीएल परख से उत्पन्न हो सकता है। उदाहरण के लिए, झूठे नकारात्मक तब हो सकते हैं जब प्रोटीन में सुलभ प्राथमिक अमीनों की कमी हो। इसके अलावा, पौधों में BIN2 interactors के हाल के अध्ययनों में दो प्रयोगों13से डेटा के बीच एक आंशिक ओवरलैप दिखाया, अपर्याप्त एमएस कवरेज के कारण झूठे नकारात्मक परिणामों के अस्तित्व का संकेत है । लक्ष्य प्रोटीन के कुछ इंटरएक्टर्स टर्बोआईडी-फ्यूज्ड नियंत्रण द्वारा कमजोर रूप से बायोटिनेटेड भी हो सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कटऑफ सीमा से नीचे एक गुना संवर्धन होता है और अंततः कुछ सच्चे इंटरएक्टर्स13,,14का नुकसान होता है। इसलिए, उचित नियंत्रण और कटऑफ मूल्यों के साथ पर्याप्त जैविक प्रतिकृतियों को झूठे नकारात्मक11,14की संख्या को कम करने के लिए सेट किया जाना चाहिए।

इसके अलावा, एक लंबी बायोटिन उपचार अवधि गैर-विशिष्ट प्रोटीन के बायोटिनेशन को बढ़ा सकती है, जिसके परिणामस्वरूप झूठी सकारात्मक10होती है। इसलिए, गैर-विशिष्ट बायोटिनीलेशन को कम करने के लिए वीवो लेबलिंग टाइम विंडो में अनुकूलन करना महत्वपूर्ण है, जबकिविश्लेषण 11,12,,,13,,14के लिए बायोटिनी प्रोटीन के उत्पादन को भी प्रभावित नहीं करता है। इसके अलावा, प्रोटीन के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी से प्राप्त झूठे सकारात्मक को मोतियों17तक कम करने के लिए कठोर निष्कर्षण और कठोर धोने की स्थिति की सिफारिश की जाती है। ऊपर वर्णित चेतावनी के अलावा, एक उचित नकारात्मक नियंत्रण का डिजाइन झूठे इंटरएक्टर्स से सच्चे इंटरएक्टर्स को अलग करने और सच्चे इंटरएक्टर्स11,12,,13,,14के लापता होने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।,

टर्बोआईडी ने बायोआईडी10,11की तुलना में लेबलिंग काइनेटिक्स में काफी सुधार दिखाया . हालांकि, यह पीएल विश्लेषण के दौरान एक उच्च पृष्ठभूमि का कारण भी बन सकता है। इसलिए, पृष्ठभूमि संकेतों को खत्म करने के लिए उचित नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए। हमने इस प्रोटोकॉल11में सिट्रिन-फ्यूज्ड टर्बोआईडी का उपयोग किया औरपिछले अध्ययनों 18में इसी तरह के नियंत्रण का उपयोग किया गया है। लक्ष्य प्रोटीन के लिए जो एक विशिष्ट ऑर्गेनेल झिल्ली को स्थानीयता देते हैं, टर्बोआईडी एक सिग्नल पेप्टाइड के साथ फ्यूजिंग करता है जो एक ही ऑर्गेनेल झिल्ली को लक्षित करता है जो साइटोप्लाज्म14में व्यक्त किए गए टर्बोआईडी फ्यूजिंग की तुलना में बेहतर नियंत्रण बनाता है।

इसके अलावा, यदि अन्य भागीदारों के साथ अपनी बातचीत निर्धारित करने वाले लक्ष्य प्रोटीन में प्रमुख डोमेन या अमीनो एसिड के बारे में जानकारी ज्ञात है, तो प्रमुख डोमेन या अमीनो एसिड में उत्परिवर्तन के साथ एक लक्ष्य प्रोटीन के साथ टर्बोआईडी को फ्यूज करना सबसे अच्छा नियंत्रण होना चाहिए और लक्ष्य प्रोटीन द्वारा उत्पन्न पृष्ठभूमि संकेतों को अधिकतम कम कर देगा। इसके अलावा, टर्बोआईडी एंजाइमों को विशिष्ट तापमान के साथ-साथ उचित पीएच स्थितियों की आवश्यकता होती है। ईआर, नाभिक और माइटोकॉन्ड्रिया जैसे सेल में अधिकांश ऑर्गेनेल्स के लिए, टर्बोआईडी ने समीपस्थ प्रोटीन10को सफलतापूर्वक लेबल किया। हालांकि, कुछ विशेष ऑर्गेनेल्स (यानी, पौधे की कोशिकाओं में रिक्तियां, जिनका पीएच बहुत कम19है) पीएल दृष्टिकोण का उपयोग करपीपीआई का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। इसके अलावा, तनाव प्रतिक्रिया के दौरान उपकोशिकीय वातावरण के पीएच स्तर या ऑक्सीकरण-कमी वाले राज्यों में परिवर्तन टर्बोआईडी की लेबलिंग दक्षता को प्रभावित कर सकता है।

संक्षेप में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल एन बेंथमियानामें टर्बोआईडी का उपयोग करपीपीआई की जांच करने का आधार प्रदान करता है, जो एक मॉडल संयंत्र प्रणाली है जिसका व्यापक रूप से पौधे जीव विज्ञान20के कई पहलुओं में उपयोग किया गया है। अरबीडोप्सिस पौधों और टमाटर बालों वाली जड़ों12,13,,14में हाल ही में वर्णित टर्बोआईडी आधारित पीएल अध्ययनों के साथ, यह उम्मीद की जाती है कि यह विधि अन्य पौधों की प्रजातियों पर लागू हो जाएगी।, यह अनुमान लगाया गया है कि टर्बोआईडी आधारित पीएल संयंत्र जीव विज्ञान अनुसंधान में पीपीआई का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाएगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय ट्रांसजेनिक विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (2019ZX08010-003 से वाईजेड) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31872637 से वाईजेड), और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष (2019TC028 से Y.Z.), और NSF-IOS-1354434, एनएसएफ-आईओएस-1339185, और एनआईएच-जीएम 132582-01 से एस.पी.डी.के.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
721 Spectrophotometer Metash, made in China Q/SXFZ6 For OD600 measurement
Ammonium bicarbonate Sigma A6141-500G
Biotin Sigma B4639-1G 50 mM Stock
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5702
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697489001
Deoxycholic acid Sigma D2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT) VWR Life Science 0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65001 For affinity purification
EDTA Sigma E6758-500G
ELISA plate Corning Costar 3590
HEPES Sigma H3375-1KG
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-212
Immobilon-P PVDF membrane Millipore IPVH00010 For Western blot analysis
Lithium chloride solution(LiCl), 8M Sigma L7026-500ML
Low speed refrigerated centrifuge Zonkia, made in China KDC-2046 For desalting
Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma M9272-500G
Magnetic rack Invitrogen 123.21D For bead adsorption
Multiskan FC Microplate Photometer Thermo Fisher Scientific N07710 For OD595 measurement
NP-40 (IGEPAL CA-630) Sigma I8896-100ML
Rat anti-HA Roche 11867423001
Rotational mixer Kylin-Bell Lab Instrument WH-986 For IP
Shock incubator Labotery, made in China ZQPZ-228
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3
Sodium deoxycholate Sigma D2510-100G
Sodium dodecyl sulfate(SDS) Sigma L4390-1KG
Streptavidin-HRP Abcam ab7403
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Trizma base Sigma T1503-1KG
Vortex Scientific Industries G-560E
Water-jacket Incubator Blue pard, made in China GHP-9080 For Agrobacterium incubation
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89893 For removal of biotin

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References

  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
  3. Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
  4. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
  6. Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
  7. Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
  8. Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
  9. Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
  10. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
  12. Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
  13. Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
  14. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
  15. Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
  16. McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
  17. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  18. Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
  19. Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
  20. Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).

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इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन इश्यू 159 प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग टर्बोआईडी प्रोटीन इंटरैक्शन डिसाल्टिंग क्वांटिफिकेशन शुद्धि टीआईआर
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Zhang, Y., Li, Y., Yang, X., Wen, Z., Nagalakshmi, U., Dinesh-Kumar, S. P. TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (159), e60728, doi:10.3791/60728 (2020).

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