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Immunology and Infection

Etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación en planta de redes de interacción proteína-proteína

Published: May 17, 2020 doi: 10.3791/60728
Automatic Translation
*1, *2,3, 1, 1, 2, 2,3
1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis
* These authors contributed equally

Summary

Aquí se describe un método de etiquetado de proximidad para la identificación de socios de interacción del dominio TIR del receptor inmune NLR en el tejido de hoja de Nicotiana benthamiana. También se proporciona un protocolo detallado para la identificación de interacciones entre otras proteínas de interés utilizando esta técnica en Nicotiana y otras especies vegetales.

Abstract

Las técnicas de etiquetado de proximidad (PL) que utilizan ascorbato peroxidasa (APEX) o Escherichia coli biotin ligase BirA (conocida como BioID) se han utilizado con éxito para la identificación de interacciones proteína-proteína (IPP) en células de mamíferos. Sin embargo, los requisitos de peróxido de hidrógeno tóxico (H2O2) en PL basado en APEX, tiempo de incubación más largo con biotina (16–24 h) y mayor temperatura de incubación (37 oC) en PL basado en BioID limitan gravemente sus aplicaciones en plantas. El PL basado en TurboID recientemente descrito aborda muchas limitaciones de BioID y APEX. TurboID permite el etiquetado rápido de proximidad de proteínas en tan solo 10 minutos en condiciones de temperatura ambiente (RT). Aunque la utilidad de TurboID se ha demostrado en modelos animales, recientemente demostramos que la PL basada en TurboID funciona mejor en plantas en comparación con BioID para el etiquetado de proteínas que son proximales a una proteína de interés. Aquí se proporciona un protocolo paso a paso para la identificación de socios de interacción proteica utilizando el dominio del receptor N-terminal Toll/interleukin-1 (TIR) de la familia de proteínas de repetición rica en leucina (NLR) de unión a nucleótidos como modelo. El método describe la construcción vectorial, la agroinfiltración de construcciones de expresión de proteínas, el tratamiento de la biotina, la extracción y desalación de proteínas, la cuantificación y el enriquecimiento de las proteínas biotinyladas mediante la purificación de afinidad. El protocolo descrito aquí se puede adaptar fácilmente para estudiar otras proteínas de interés en Nicotiana y otras especies de plantas.

Introduction

Los IBP son la base de varios procesos celulares. Los métodos tradicionales para identificar los IBP incluyen el cribado de levadura-dos híbridos (Y2H) y la inmunoprecipitación junto con espectrometría de masas (IP-MS)1. Sin embargo, ambos sufren de algunas desventajas. Por ejemplo, el cribado De2H requiere la disponibilidad de la biblioteca Y2H de las especies vegetales o animales objetivo. La construcción de estas bibliotecas es costosa y laboriosa. Además, el enfoque Y2H se realiza en la levadura de organismo eucariota de una sola célula heteróloga, que puede no representar el estado celular de las células eucariotas superiores.

Por el contrario, IP-MS muestra baja eficiencia en la captura de IBP transitorios o débiles, y también es inadecuado para aquellas proteínas con baja abundancia o alta hidrofobicidad. Muchas proteínas importantes implicadas en las vías de señalización de la planta como las quinasas similares a los receptores (RK) o la familia NLR de receptores inmunes se expresan en niveles bajos y a menudo interactúan con otras proteínas de forma transitoria. Por lo tanto, restringe en gran medida la comprensión de los mecanismos subyacentes a la regulación de estas proteínas.

Recientemente, se han desarrollado y utilizado métodos de etiquetado de proximidad (PL) basados en ascorbato peroxidasa (APEX) y un mutante Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (conocido como BioID) para el estudio de los IBP2,,3,4. El principio de PL es que una proteína objetivo de interés se fusiona con una enzima, que cataliza la formación de biotinyl-AMP de lábil (bio-AMP). Estos bio-AMP libres son liberados por las enzimas PL y difuminados a la proximidad de la proteína diana, permitiendo la biotinilación de proteínas proximales en las aminas primarias dentro de un radio estimado de 10 nm5.

Este enfoque tiene ventajas significativas sobre los enfoques tradicionales Y2H e IP-MS, como la capacidad de capturar PPI transitorios o débiles. Además, PL permite el etiquetado de proteínas proximales de la proteína diana en sus ambientes celulares nativos. Diferentes enzimas PL tienen desventajas únicas al aplicarlas a diferentes sistemas. Por ejemplo, aunque APEX ofrece una cinética de etiquetado más alta en comparación con BioID y se aplica con éxito en sistemas de mamíferos, el requisito de peróxido de hidrógeno tóxico (H2O2) en este enfoque hace que no sea adecuado para estudios de PL en plantas.

Por el contrario, la PL basada en BioID evita el uso del tóxico H2O2, pero la tasa de etiquetado es lenta (requiere 18-24 h para completar la biotinylación), lo que hace que la captura de IBP transitorios sea menos eficiente. Por otra parte, la temperatura de incubación más alta (37 oC) necesaria para el PL eficiente por BioID introduce estrés externo a algunos organismos, como las plantas4. Por lo tanto, se ha notificado un despliegue limitado de PL a base de BioID en plantas (es decir, protoplastias de arroz, Arabidopsis y N. benthamiana) 6,7,8,9. La enzima TurboID recientemente descrita supera las deficiencias de APEX y PL. basado en BioID demostró una alta actividad que permite la realización de PL dentro de 10 min en RT10. La PL basada en TurboID se ha aplicado con éxito en células de mamíferos, moscas y gusanos10. Recientemente, nosotros y otros grupos de investigación optimizamos y ampliamos de forma independiente el uso de PL basado en TurboID para el estudio de los IBP en diferentes sistemas vegetales, incluyendo las plantas de N. benthamiana y Arabidopsis y raíces peludas de tomate11,,12,,13,,14. Los análisis comparativos indicaron que TurboID funciona mejor para PL en plantas en comparación con BioID11,14. También ha demostrado la robustez de la PL basada en TurboID en planta mediante la identificación de una serie de interacciones novedosas con un receptor inmune NLR11, una proteína cuyos socios de interacción son generalmente difíciles de obtener utilizando métodos tradicionales.

Este protocolo ilustra el PL basado en TurboID en planta describiendo la identificación de proteínas de interacción del dominio N-terminal TIR del receptor inmune NLR en plantas de N. benthamiana. El método se puede extender a cualquier proteína de interés en N. benthamiana. Más importante aún, proporciona una referencia importante para la investigación de IBP en otras especies vegetales como Arabidopsis,tomate, y otros.

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Protocol

NOTA: En la Figura 1se muestra una descripción general del método.

1. Preparación de materiales vegetales

  1. Cultivar semillas de N. benthamiana en suelo húmedo a alta densidad y mantenerlas en una cámara climática con una luz de 16 h (alrededor de 75 omol/m2s) y fotoperiodo oscuro de 8 h a 23-25 oC.
  2. Aproximadamente 1 semana más tarde, transfiera cuidadosamente cada plántula joven a ollas de 4' x 4' y mantenga las plántulas en la misma cámara.
  3. Mantener las plantas en la cámara durante aproximadamente 4 semanas hasta que crezcan hasta una etapa de hoja de 4-8 para la posterior agroinfiltración15.

2. Construcción de fusiones TurboID

  1. Utilice la técnica de clonación molecular estándar para generar la fusión de la proteína diana con TurboID (PCR TurboID de Plásmido de Addgene #107177). Aquí, usamos el dominio N-terminal TIR del receptor inmune NLR como la proteína objetivo de interés y construido TIR fusionado a TurboID bajo el control del promotor del virus de mosaico de coliflor 35S (p35S::TIR-TurboID).
    NOTA: La fusión de la enzima TurboID al carboxilo-terminus o amino-terminus de la proteína diana dependerá de la proteína de interés. Por lo general, para una proteína citoplasmasmática, ambos termini deben ser aceptables, siempre y cuando la fusión TurboID no afecte la función de la proteína diana. Sin embargo, para una proteína localizada por membrana, la topología proteica debe caracterizarse de antemano antes de determinar qué terminus es mejor para la fusión TurboID.
  2. Construir un citrino fusionado con TurboID bajo el mismo promotor para servir como el control para el posterior análisis proteómico cuantitativo.
    NOTA: Es importante construir un control TurboID para identificar el proteome proximal a la proteína objetivo. El control de fusión TurboID debe mostrar un nivel de expresión similar al de la proteína diana fusionada con TurboID. Esto se puede determinar empíricamente ajustando la concentración de Agrobacterium durante la agroinfiltración. Además, es importante que la proteína de control tenga un patrón de localización subcelular similar al de la proteína diana de interés.

3. Agroinfiltración

  1. Transformación de los plásmidos a Agrobacterium
    1. Añadir 0,5 g de los plásmidos generados a partir de los pasos 2.1 y 2.2 a 50 l de las células competentes de la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101, preparadas como se describió anteriormente16.
      NOTA: También se pueden utilizar otras cepas de Agrobacterium, como GV2260.
    2. Incubar sobre hielo durante 30 min.
    3. Choque de calor en un baño de agua a 42 oC durante 60 s.
    4. Añadir 400 ml de medio de LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de NaCl; pH a 7,0) a la Agrobacterium e incubar a 28oC durante 90 min.
    5. Placar todo el contenido en el tubo en el agar LB complementado con antibióticos adecuados para seleccionar el plásmido, así como para el Agrobacterium (para GV3101: 50 mg/L gentamicina y 50 mg/L rifampicina).
    6. Incubar placas a 28oC durante 36–48 h hasta que las colonias individuales sean visibles.
  2. Recoger y rayar varias colonias individuales en una placa de agar LB fresco con antibióticos (ver paso 3.1.5) y crecer a 28 oC durante la noche.
    NOTA: Es más óptimo realizar la COLONIA PCR para confirmar la presencia de la construcción binaria específica en el Agrobacterium. En nuestra experiencia, más del 95% de las colonias contienen las construcciones binarias introducidas.
  3. Inocular 3 ml de medio LB más antibióticos apropiados (ver paso 3.1.4) con la colonia Agrobacterium albergando la construcción de interés, e incubar agitando durante la noche a 28 oC hasta que la DO600 del cultivo de Agrobacterium alcance 2.0.
  4. Centrifugar las células a 3.000 x g y resuspenderlas a OD600 a 1,0 en tampón de agroinfiltración (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH a 5,6], 250 m de acetosiringona).
    NOTA: Aunque es óptimo incubar el inóculo durante 2 h en RT antes de la agroinfiltración, en nuestra experiencia con la cepa GV3101, no ha habido una gran diferencia entre la expresión de proteína diana con frente a sin incubación.
  5. Utilice una jeringa sin aguja de 1 ml para infiltrarse en el inóculo en la epidermis (abaxial) de las hojas de N. benthamiana completamente maduras.
    NOTA: Para preparar una cantidad suficiente de materiales de hoja para tres réplicas biológicas: una hoja entera generalmente se infiltra, tres hojas se infiltran por planta, y se utilizan de tres a cuatro plantas para cada construcción. Para cada hoja, 1.5–2.0 mL de agrobacterias resuspendidas es suficiente.
  6. Después de 36 h de post-infiltración (hpi), infiltrarse 200 m de biotina (en 10 mM MgCl2 solución) en las hojas pre-infiltradas con construcciones TurboID.
  7. Mantener la planta durante 3-12 horas adicionales antes de cosechar el tejido de la hoja como se describe en la sección 4.
    NOTA: La razón para elegir los 36 hpi para la infiltración de biotina es que la expresión de proteína objetivo alcanza su punto máximo en este momento según estudios anteriores11. Se recomienda determinar el tiempo necesario para una expresión óptima de la proteína objetivo de interés. El tiempo de incubación después de la infiltración de biotina depende del diseño experimental y la proteína diana en estudio. Por lo general, 3-12 h de tratamiento de biotina permite el etiquetado de la mayoría de las proteínas proximales a la proteína diana por las fusiones TurboID.

4. Recogida de muestras de hojas

NOTA: Para el procesamiento posterior de las muestras de hojas, use guantes estériles para evitar la contaminación por queratina de las muestras. Todos los reactivos también deben estar lo más libres de queratina como sea posible.

  1. Cortar las hojas infiltradas en la base del pecíolo, eliminar la vena de la hoja, a continuación, flash-congelar el tejido de la hoja en nitrógeno líquido.
  2. Moler el tejido de la hoja con un mortero y un mortero y almacenar el polvo de la hoja en tubos de halcón de 15 ml o 50 ml a -80 oC para su uso posterior.
    NOTA: Tome de tres a cuatro piezas de hojas para cada una de las tres réplicas biológicas de diferentes plantas. El protocolo se puede pausar aquí. Antes de las etapas posteriores, se recomienda evaluar la expresión proteica y la biotinylación de la proteína diana mediante análisis inmunoblot. Las manchas occidentales típicas se muestran en la Figura 2.

5. Extracción de proteína total de la hoja

  1. Transfiera aproximadamente 0,35 g de polvo de hoja a un tubo de 2 ml. Prepare dos tubos para cada muestra.
    ADVERTENCIA: Use guantes cuando toque cualquier objeto enfriado por nitrógeno líquido.
  2. Añadir 700 l de tampón de lisis RIPA (50 mM Tris-HCl [pH a 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [p/v], 0,5% desoxicolato de sodio [p/v], 1 mM de TDT, 1 comprimido de cóctel inhibidor de la proteasa) a 0,35 g de polvo de hoja.
  3. Vortex los tubos durante 10 min.
  4. Deje las muestras en hielo durante 30 minutos.
  5. Mezcle el contenido cada 4-5 minutos girando los tubos al revés varias veces.

6. Eliminación de la biotina libre por desalación

NOTA: Esta sección tarda unos 50 minutos.

  1. Equilibrar la columna de desalación.
    1. Retire el sellador en la parte inferior de la columna de desalación y coloque la columna en un tubo de 50 ml.
    2. Retire la solución de almacenamiento por centrifugación a 1000 x g y 4 oC durante 2 min y asegúrese de que la tapa esté aflojada.
    3. Coloque la columna de desalación en un tubo de 50 ml. Equilibrar la columna 3x con 5 ml de tampón de lisis RIPA, cada vez centrifugando a 1000 x g y 4 oC durante 2 min y descartando el flujo.
    4. Transfiera la columna de desalación a un nuevo tubo de 50 ml y guárdela temporalmente a 4 oC para su uso posterior.
  2. Gire los tubos del paso 5.4 a 16.500 x g y 4 oC durante 10 minutos y transfiera el sobrenadante de los dos tubos a un nuevo tubo de 2 ml.
  3. Añadir 1.500 l de extracto proteico a la parte superior de la resina de la columna de desalación equilibrada (del paso 6.1.4). Cuando el extracto proteico entre en la resina, agregue otros 100 l de tampón de lisis RIPA.
    NOTA: Aunque se utilizaron 1.400 l de tampón de lisis RIPA para la extracción de proteínas de las hojas, el volumen total después de la extracción y desalación de proteínas se incrementó invariablemente en cierta medida en relación con el volumen original. Por lo tanto, una combinación de las muestras de cada grupo como se describe en los pasos 5.1 y 5.4 puede dar lugar a al menos 1.500 l de extracto de proteína por muestra.
  4. Centrifugar a 1000 x g y 4oC durante 2 min y dejar las muestras desaladas en hielo temporalmente.

7. Cuantificación de los extractos de proteína dessalada utilizando un ensayo de Bradford

  1. Preparar 50 ml de cada solución de BSA degradada: 0 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml y 1 mg/ml.
  2. Diluir el extracto de proteína desalada mezclando una muestra de 5 ml con 45 ml de ddH2O.
  3. Preparar 1 x regente Bradford diluyendo el regente 5x Bradford (100 mg de Coomassie azul brillante G250, 47 mL de metanol, 100 mL de 85% ácido fosfórico, 53 mL de ddH2O).
  4. Añadir 50 ml de la solución de BSA de cada gradiente y 50 l de extracto de proteína diluida a los 2,5 ml de 1 regente de Bradford.
  5. Incubar a RT durante 10 min.
  6. Añadir 200 ml de solución de cada muestra a un pozo de una placa ELISA (tres réplicas técnicas por muestra).
  7. Mida el OD595 con un lector de microplacas.
  8. Dibuje la curva estándar en función del valor de la solución BSA degradada y calcule la concentración de las muestras de proteínas desaladas. Por lo general, la concentración total de proteínas obtenida a partir de 0,7 g de hojas oscila entre 3 y 6 mg/ml.
  9. Preparar 6–8 mg de extracto de proteína desalada para la posterior purificación de afinidad.

8. Enriquecimiento de proteínas biotinyladas

  1. Tomar 200 l de perlas magnéticas conjugadas con streptavidn-C1 en un tubo de 2 ml.
  2. Equilibrar las perlas magnéticas conjugadas estreptavivida-C1 con 1 ml de tampón de lisis RIPA durante 1 min en RT.
  3. Después de cada lavado, utilice el estante magnético para adsorjar las perlas durante 3 minutos y retire suavemente la solución pipeteando.
  4. Repita los pasos 8.2 y 8.3.
  5. Transfiera el extracto de proteína desalada a las cuentas magnéticas conjugadas conjugadas con streptavidn-C1 equilibradas.
  6. Incubar el tubo a 4 oC durante 12 h (o durante la noche) en un rotador para purificar las proteínas biotiniladas.
  7. Capturar las perlas en un bastidor magnético durante 4 minutos en RT hasta que las perlas se acumulan en un lado del tubo, a continuación, retire suavemente el sobrenadante por pipeta.
  8. Añadir 1,7 ml de tampón de lavado I (2% SDS en agua) al tubo y mantenerlo en el rotador en RT durante 8 min. Repita el paso 8.3.
  9. Añadir 1,7 mL de tampón de lavado II (50 mM HEPES: pH a 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,1% de ácido desoxicólico [w/v], 1% De tritón X-100) al tubo y mantenerlo en el rotador a RT durante 8 min.
  10. Añadir 1,7 mL de tampón de lavado III (10 mM Tris-HCl: pH a 7,4, 250 mM de LiCl, 1 mM de EDTA, 0,1% de ácido desoxicólico [w/v], 1% NP40 [v/v]) al tubo y mantenerlo en el rotador a RT durante 8 min. Repita el paso 8.3.
  11. Añadir 1,7 ml de 50 mM Tris-HCl (pH a 7,5) para retirar el detergente y, a continuación, repita el paso 8.3.
  12. Transfiera las perlas a un nuevo tubo de 1,5 ml y repita los pasos 8.11 y 8.3.
  13. Lave las perlas 6x durante 5 min cada una con tampón de bicarbonato de amonio de 50 mM en RT.
  14. Añadir 1 mL de amortiguador de bicarbonato de amonio de 50 mM a las perlas magnéticas y mezclar bien.
  15. Retirar 100 l de perlas para el análisis de inmunoblot para confirmar el enriquecimiento de proteínas biotinyladas. En la Figura 3se muestra una mancha occidental típica.
  16. Congele con flash el resto de las muestras de proteínas y se almacene a -80 oC o envíelas inmediatamente para el análisis de LC-MS/MS en hielo seco.
    NOTA: Los resultados típicos de la EM se muestran en una publicación anterior (Zhang et al. 2019; Figura 2, Datos suplementarios 1 y Datos complementarios 2)11. Todos los conjuntos de datos están disponibles en MassIVE (que se encuentra en ) utilizando el identificador: MSV000083018 y MSV000083019.

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Representative Results

Los datos representativos, que ilustran los resultados esperados basados en el protocolo descrito, se adaptan de Zhang et al11. La Figura 1 resume los procedimientos para realizar PL basado en TurboID en N. benthamiana. La Figura 2 muestra la expresión proteica y biotinylación en las hojas infiltradas de N. benthamiana. La Figura 3 muestra que las proteínas biotiniladas en las hojas infiltradas se enriquecieron eficientemente para el posterior análisis de espectrometría de masas. Cabe señalar que después del enriquecimiento de las proteínas biotinyladas utilizando cuentas magnéticas conjugadas con streptavidn-C1, se capturaron diferentes proteínas con tamaños variados, y el análisis de manchas occidentales de las proteínas enriquecidas mostró bandas manchadas(Figura 3). Observaciones similares se han realizado en varios estudios publicados recientemente6,7,13,14.

Figure 1
Figura 1: Descripción general del método PL basado en TurboID en N. benthamiana.  Agrobacterium que alberga las construcciones de fusión TurboID fueron infiltrados en las hojas de N. benthamiana. 36 h después de la infiltración, 200 m de biotina se infiltra en las mismas hojas para iniciar la biotinylación de las proteínas endógenas que son proximales a la proteína diana fusionada con TurboID. Las plantas infiltradas se incuban a RT durante 3-12 h, seguidas de la recolección de hojas y la molienda en nitrógeno líquido. Polvo de hoja se lysed en el tampón de lisis RIPA, y se emplea una columna de desalación para eliminar la biotina libre en el extracto de proteína. Las proteínas biotiniladas fueron purificadas con perlas conjugadas con estreptavidina e identificadas por espectrometría de masas. Esta figura está adaptada de la Figura Suplementaria 3 de Zhang et al11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis inmunoblot de extractos proteicos obtenidos en el paso 4.2. (A) Análisis de manchas occidentales de proteínas extraídas de las hojas agroinlinfinadas con anticuerpos contra la etiqueta HA. (B) Análisis de manchas occidentales de proteínas biotiniladas en las hojas agroinlinnadas con estreptavidina-HRP. Esta cifra está adaptada de la Figura Suplementaria 6B de Zhang et al11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de manchas occidentales de perlas obtenidas en el paso 8.15 para confirmar el enriquecimiento de proteínas biotiniladas. Para cada construcción, hay tres réplicas independientes (1, 2 y 3). La estreptavidina-HRP se utilizó para el análisis de proteínas biotinyladas en diferentes muestras. Esta figura está adaptada de la Figura Suplementaria 7 de Zhang et al11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La ligaa de biotina TurboID es generada por la evolución dirigida basada en la visualización de levaduras del BioID10. Tiene muchas ventajas sobre otras enzimas PL. TurboID permite la aplicación de PL a otros sistemas de modelos, incluyendo moscas y gusanos, cuya temperatura óptima de crecimiento es de alrededor de 25 oC10. Aunque el enfoque PL ha sido ampliamente utilizado en sistemas animales, su aplicación en plantas es limitada. El protocolo descrito aquí proporciona un procedimiento paso a paso para establecer el PL basado en TurboID en N. benthamiana,una planta modelo que ha sido ampliamente utilizada en estudios de interacción planta-patógeno. Este protocolo describe la preparación de muestras de hojas, la eliminación de la biotina libre, la cuantificación de las proteínas extraídas y el enriquecimiento de las proteínas biotiniladas.

Aunque la biotina libre en los sistemas de cultivo celular animal se puede eliminar en gran medida lavando las células con el tampón PBS4, la biotina libre en el tejido de las hojas no se puede eliminar mediante un simple lavado. Un estudio reciente indicó que la biotina libre puede afectar gravemente el enriquecimiento posterior de las proteínas biotinyladas11. En este protocolo, se utiliza una columna de desalación para eliminar con éxito la biotina libre en los extractos de proteínas, permitiendo la unión eficiente de proteínas biodiladas a las perlas de estreptavidina.

Además, este protocolo sirve como una referencia importante para la realización de PL en otros sistemas de plantas. Recientemente, tres informes han utilizado PL basado en TurboID en Arabidopsis12,13,14 y raíz peluda de tomate12, además de la N. benthamiana descrita aquí. Al igual que los sistemas de cultivo celular animal, la eliminación de la biotina libre se logró lavando los protoplastias vegetales antes de la extracción de proteínas6. Sin embargo, en el interior de la célula existían cantidades más bajas de moléculas de biotina libres que no se integraron en la proteína, lo que impactó en la eficiencia del posterior enriquecimiento de las proteínas biotinadas. Por lo tanto, se recomienda un procedimiento de desalación para la eliminación completa de la biotina libre, aumentando así la eficiencia de recuperación de proteínas biotinyladas.

Dos tipos de columnas, PD-10 y Zeba, se han utilizado para la eliminación gratuita de biotina11,12,13,14. Puede ser de interés en el futuro comparar la eficiencia de estas dos columnas en la eliminación de biotina libre en extractos de proteína de hoja. Además, este protocolo emplea un método canónico de agroinfiltración mediado por jeringa para expresar transitoriamente la proteína objetivo de interés en las hojas de N. benthamiana. Luego, el sustrato de la biotina se vuelve a infiltrar en las hojas para etiquetar proteínas que son proximales a la proteína diana. Operaciones similares también se han utilizado en otros dos estudios recientemente reportados12,13. Como método alternativo, la infiltración mediada por vacío de la biotina es aplicable tanto para N. benthamiana como para Arabidopsis14. Además, en plantas que no son adecuadas para la agroinfiltración, los cultivos celulares pueden transformarse para la expresión de proteína objetivo, seguido según el tratamiento de la biotina y el ensayo de etiquetado de proximidad12. Estos estudios recientes han apuntalado la robustez de la PL basada en TurboID en el estudio de los IBP y han sentado las bases para futuras aplicaciones de PL basada en TurboID en diferentes especies de plantas.

En este protocolo, se emplea una expresión transitoria bien establecida mediada por Agrobacteriumen N. benthamiana para identificar los IBP de la proteína objetivo de interés. La expresión transitoria puede conducir a una sobreexpresión de las proteínas de fusión. Por lo tanto, una alternativa más óptima es diseñar la fusión TurboID bajo el control de un promotor nativo y expresarla por agroinfiltración o generación de líneas transgénicas estables. Con el desarrollo de la tecnología de edición del genoma, también es posible golpear el fragmento TurboID directamente en los loci genómicos nativos de genes de interés.

Otro factor importante a tener en cuenta es asegurarque que la fusión TurboID no altera la función de la proteína objetivo de interés. En un estudio anterior, la función del receptor inmune NLR fusionado con TurboID se confirmó probando su capacidad para inducir la muerte celular mediada por defensa en presencia del virus del mosaico de tabaco p50 efector11. TurboID es relativamente más grande (es decir, 35 kDa) que GFP, y su fusión con una proteína diana puede afectar la función de una proteína diana. En tales casos, se puede utilizar el miniTurboID10 más pequeño.

También es importante determinar qué término de la proteína diana es adecuado para fusionarse con TurboID. Un enfoque general para tales pruebas funcionales es determinar si la fusión TurboID complementará la línea vegetal mutante del gen objetivo. Alternativamente, se puede utilizar el análisis de la interacción de la fusión TurboID con un socio de interacción previamente conocido de la proteína diana. En la mayoría de los casos, para las proteínas citoplasmamáticas, el etiquetado N-terminal o C-terminal del TurboID puede producir conjuntos de datos comparables en el análisis de espectrometría de masas posterior. Sin embargo, para las proteínas localizadas por membrana, es importante determinar la topología antes de la construcción de vectores. De lo contrario, la fusión de TurboID aguas arriba o aguas abajo de la secuencia de codificación de genes de interés generará resultados completamente diferentes. Por lo tanto, es importante determinar los lados orientados (por ejemplo, citoplasma- o lumen-facing) de la N-terminus o C-terminus de las proteínas localizadas por membrana. Esto garantiza que se pueda obtener el proteome proximal esperado de la proteína diana.

Aunque PL tiene varias ventajas sobre los enfoques tradicionales de IP-MS para detectar IBP transitorios o débiles, tiene sus propias limitaciones intrínsecas. En primer lugar, la identificación de una proteína de interacción candidata no implica inmediatamente una interacción directa o indirecta con la proteína de cebo, sino que sólo refleja la proximidad2. Por lo tanto, se pueden llevar a cabo ensayos in vivo independientes (es decir, coinmunoprecipitación, complementación de fluorescencia bimolecular [BiFC] o ensayo in vitro de extracción de GST) para verificar aún más los IBP.

En segundo lugar, los falsos negativos o falsos positivos pueden surgir del ensayo PL debido a varias razones. Por ejemplo, los falsos negativos pueden ocurrir cuando la proteína que carece de aminas primarias accesibles. Además, estudios recientes de interactuadores BIN2 en plantas mostraron una superposición parcial entre los datos de dos experimentos13,lo que indica la existencia de resultados falsos negativos debido a una cobertura inadecuada de la EP. Algunos interactores de la proteína diana también pueden ser biotinigranados débilmente por el control fusionado con TurboID, lo que resulta en un enriquecimiento de pliegue por debajo del umbral de corte y, finalmente, la pérdida de algunos verdaderos interactores13,14. Por lo tanto, se deben establecer suficientes réplicas biológicas con controles y valores de corte adecuados para minimizar el número de falsos negativos11,14.

Además, un largo período de tratamiento con biotina puede aumentar la biotinilación de proteínas no específicas, lo que resulta en falsos positivos10. Por lo tanto, es importante optimizar las ventanas de tiempo de etiquetado in vivo para reducir la biotinilación inespecífica, sin afectar a la producción de proteínas biotimiladas para el análisis11,,12,,13,14. Además, se recomienda una extracción dura y condiciones de lavado estrictas para reducir los falsos positivos derivados de la unión inespecífica de proteínas a las cuentas17. Además de las advertencias descritas anteriormente, el diseño de un control negativo adecuado es crucial para distinguir a los verdaderos interactores de los falsos interactores y evitar la desaparición de los verdaderos interactores11,,12,,13,,14.

TurboID mostró una cinética de etiquetado muy mejorada en comparación con la de BioID10,11. Sin embargo, esto también puede conducir a un fondo más alto durante el análisis pl- Por lo tanto, se deben incluir los controles adecuados para eliminar las señales de fondo. Usamos el TurboID fusionado con citrino en este protocolo11, y un control similar se ha utilizado en estudios anteriores18. Para las proteínas diana que se localizan en una membrana de organimosculo específica, TurboID se fusiona con un péptido de señal que se dirige a la misma membrana de uberínmero hace un mejor control que la fusión TurboID con una que se expresa en el citoplasma14.

Además, si se conoce información sobre el dominio clave o los aminoácidos de la proteína diana que determinan sus interacciones con otros socios, fusionar el TurboID con una proteína diana con una mutación en el dominio clave o aminoácidos debe ser el mejor control y reducirá al máximo las señales de fondo generadas por la proteína objetivo. Además, las enzimas TurboID requieren temperaturas específicas, así como condiciones adecuadas de pH. Para la mayoría de los orgánulos en la célula como la ER, el núcleo y las mitocondrias, TurboID etiquetó con éxito las proteínas proximales10. Sin embargo, algunos orgánulos especiales (es decir, vacuolas en células vegetales, cuyo pH es muy bajo19)pueden no ser adecuados para estudiar los IBP utilizando el enfoque PL. Además, los cambios en los niveles de pH o los estados de reducción de oxidación del entorno subcelular durante la respuesta de tensión pueden afectar a la eficiencia de etiquetado del TurboID.

En resumen, el protocolo descrito aquí proporciona la base para investigar los IBP utilizando TurboID en N. benthamiana, un sistema vegetal modelo que ha sido ampliamente utilizado en muchos aspectos de la biología vegetal20. Con los estudios PL recientemente descritos basados en TurboID en plantas de Arabidopsis y raíces peludas de tomate12,,13,,14,se espera que este método sea aplicable a otras especies vegetales. Se prevé que la PL basada en TurboID desempeñará un papel importante en el estudio de los IBP en la investigación de biología vegetal.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de Ciencia y Tecnología Transgénica (2019ZX08010-003 a Y.Z.), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31872637 a Y.Z.), y los Fondos Fundamentales de Investigación para las Universidades Centrales (2019TC028 a Y.Z.), y NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, y NIH-GM132582-01 a S.P.D.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
721 Spectrophotometer Metash, made in China Q/SXFZ6 For OD600 measurement
Ammonium bicarbonate Sigma A6141-500G
Biotin Sigma B4639-1G 50 mM Stock
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5702
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697489001
Deoxycholic acid Sigma D2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT) VWR Life Science 0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65001 For affinity purification
EDTA Sigma E6758-500G
ELISA plate Corning Costar 3590
HEPES Sigma H3375-1KG
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-212
Immobilon-P PVDF membrane Millipore IPVH00010 For Western blot analysis
Lithium chloride solution(LiCl), 8M Sigma L7026-500ML
Low speed refrigerated centrifuge Zonkia, made in China KDC-2046 For desalting
Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma M9272-500G
Magnetic rack Invitrogen 123.21D For bead adsorption
Multiskan FC Microplate Photometer Thermo Fisher Scientific N07710 For OD595 measurement
NP-40 (IGEPAL CA-630) Sigma I8896-100ML
Rat anti-HA Roche 11867423001
Rotational mixer Kylin-Bell Lab Instrument WH-986 For IP
Shock incubator Labotery, made in China ZQPZ-228
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3
Sodium deoxycholate Sigma D2510-100G
Sodium dodecyl sulfate(SDS) Sigma L4390-1KG
Streptavidin-HRP Abcam ab7403
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Trizma base Sigma T1503-1KG
Vortex Scientific Industries G-560E
Water-jacket Incubator Blue pard, made in China GHP-9080 For Agrobacterium incubation
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89893 For removal of biotin

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References

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Inmunología e infección número 159 etiquetado de proximidad TurboID interacciones proteicas desalación cuantificación purificación TIR
Etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación en planta de redes de interacción proteína-proteína
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Zhang, Y., Li, Y., Yang, X., Wen, Z., Nagalakshmi, U., Dinesh-Kumar, S. P. TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (159), e60728, doi:10.3791/60728 (2020).

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