Summary
Здесь мы представляем модифицированный протокол CLIP-seq под названием FbioCLIP-seq с очисткой тандема FLAG-biotin для определения целей РНК-связывающих белков (RBPs) в клетках млекопитающих.
Abstract
РНК и РНК-связывающие белки (РБП) контролируют несколько биологических процессов. Пространственное и временное расположение РНК и РРБ лежит в основе деликатного регулирования этих процессов. Разработана стратегия под названием CLIP-seq (перекрестное связывание и иммунопреципиентация) для захвата эндогенных белково-РНК-взаимодействий с УФ-перекрестными соединениями с последующим иммунопреципитацией. Несмотря на широкое использование традиционного метода CLIP-seq в исследовании RBP, метод CLIP ограничен наличием высококачественных антител, потенциальными загрязняющими веществами из copurified RBPs, требованием манипуляции изотопами и потенциальной потерей информации во время утомительной экспериментальной процедуры. Здесь мы описываем модифицированный метод CLIP-seq под названием FbioCLIP-seq с использованием тандема FLAG-biotin. Благодаря тандемной очистке и строгим условиям мытья удаляются почти все взаимодействующие РНК-связывающие белки. Таким образом, рнк, взаимодействующие косвенно при посредничестве этих copurified RBPs, также сокращаются. Наш метод FbioCLIP-seq позволяет эффективно обнаруживать прямые РНК, связанные с белком, без процедур SDS-PAGE и мембранной передачи без изотопов и без белка.
Introduction
РНК и РНК-связывающие белки (РБП) контролируют различные клеточные процессы, включая сращивание, перевод, рибосомный биогенез, эпигенетическуюрегуляции и переход судьбы клеток 1,2,3,4,5,6. Тонкие механизмы этих процессов зависят от уникального пространственного и временного расположения РНК и РРБ. Поэтому важным шагом на пути к пониманию регулирования РНК на молекулярном уровне является выявление позиционной информации о связывающих участках РРБ.
Разработана стратегия, именуемая перекрестными соединениями и иммунопреципитацией (CLIP-seq) для захвата белково-РНК-взаимодействий с УФ-перекрестными соединениями с последующим иммунопреципитациейбелка интереса 7. Ключевой особенностью методологии является индукция ковалентных перекрестных связей между РНК-связывающим белком и его непосредственно связанными молекулами РНК (в пределах 1 евро) путемУФ-облучения 8. Следы RBP могут быть определены кластеризацией тегов CLIP и пиковым вызовом, разрешение которого обычно составляет 30–60 nt. Кроме того, обратный этап транскрипции CLIP может привести к indels (вставки или удаления) или замены кросс-связывающих сайтов, что позволяет идентифицировать белковые связывающие сайты на РНК при одном нуклеотидном разрешении. Трубопроводы, такие как Novoalign и CIMS, были разработаны для анализа результатов секвенирования высокой пропускной способности CLIP-seq8. Несколько модифицированных методов CLIP-seq также были предложены, в том числе индивидуальное нуклеотидное разрешение кросс-ссылок и иммунопреципиентации (iCLIP), расширенный CLIP (eCLIP), irCLIP, и фотоактивируемый рибонуклеозид-улучшенной перекрестной связи и иммунопреципиентации (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Несмотря на широкое использование традиционных методов CLIP-seq при изучении RBPs, методы CLIP имеют несколько недостатков. Во-первых, утомительный денатурированный гель электрофорез и процедура переноса мембраны могут привести к потере информации и вызвать ограниченную сложность последовательности. Во-вторых, белок конкретных антител на основе метода CLIP может тянуть вниз белковый комплекс вместо одного целевого белка, что может привести к ложноположим белково-РНК взаимодействий с copurified RBPs. В-третьих, антитела на основе стратегии требует большого количества высококачественных антител, что делает применение этих методов недостаточным для изучения RBPs без высококачественных антител доступны. В-четвертых, традиционный метод CLIP требует радиозаклейм АТФ для обозначения связанных с белком РНК.
Высокое сродство стрептавидина к биотинилированным белкам делает его очень мощным подходом к очистке конкретных белков или белковых комплексов. Эффективное биотинилирование белков, несущих искусственную пептидную последовательность эктопически выраженной бактериальной биотиновой лигазой BirA в клетках млекопитающих, делает его эффективной стратегией для выполнения биотиновой очистки in vivo13. Мы разработали модифицированный метод CLIP-seq под названием FbioCLIP-seq(FLAG- Bioолово-опосредованное Cross-lчернила и Immuno p recipitation с последующим секвенированием высокой пропускной способности) с использованием FLAG-биотина тегатандема очистки 14 (Рисунок 1). Благодаря тандемной очистке и строгим условиям мытья, почти все взаимодействующие RBPs удаляются(рисунок 2). Строгие условия мытья также позволяют обойти SDS-PAGE и мембраны передачи, которая является трудоемкой и технически сложной задачей. И подобно eCLIP и IRCLIP, метод FbioCLIP-seq не имеет изотопов. Пропуск геля на ход и перенос шагов позволяет избежать потери информации, сохраняет аутентичные взаимодействия белка и РНК нетронутыми, а также увеличивает сложность библиотеки. Кроме того, высокая эффективность системы маркировки делает ее хорошим выбором для RBPs без высококачественных антител доступны.
Здесь мы предоставляем пошаговое описание протокола FbioCLIP-seq для клеток млекопитающих. Короче говоря, клетки связаны между собой 254 нм УФ, а затем клеточный лиз и FLAG иммунопреципитации (FLAG-IP). Далее белково-РНК-комплексы дополнительно очищаются путем захвата биотинов, а РНК фрагментированы частичным пищеварением с помощью MNase. Затем РНК, связанная с белком, дефосфорилируется и привязается к связующим звену 3' 5' РНК linker добавляется после РНК фосфорилируется с PNK и eluted по proteinase K пищеварения. После обратной транскрипции сигналы РНК, связанные с белком, усиливаются ПЦР и очищаются путем очистки геля агарозы. Два RBPs были выбраны в качестве примера fbioCLIP-seq результат. LIN28 является хорошо охарактеризованным РНК-связывающим белком, участвующим в созревании микроРНК, переводе белка иперепрограммировании клеток 15,16,17. WDR43 является WD40 домен-содержащий белок считается координировать рибосомы биогенез, эукариотической транскрипции, и эмбриональных стволовых клеток плюрипотентностиуправления 14,18. В соответствии с ранее сообщенные результаты для LIN28 с CLIP-seq, FbioCLIP-seq показывает связывающие сайты LIN28 на "GGAG" мотивы в микроРНК мир-let7g и mRNAs16,19 (Рисунок 3). WDR43 FbioCLIP-seq также определил связывающее предпочтение WDR43 с 5' внешними транскрибированными spacers (5'-ETS) предварительно rRNAs20 (Рисунок 4). Эти результаты подтверждают надежность метода FbioCLIP-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Строительство клеточной линии
- Клонировать ген интереса в PiggyBac вектор pPiggyBac-FLAG-био-"cDNA интереса" --(Hygromycin-устойчивый) плазмида, которая несет FLAG-биотин эпитоп13,21, чтобы выразить FLAG-биотин тег сплавленных RBP (FBRBP).
- Сотрансфект FBRBP, выражаюющий вектор с вектором pBase, в клеточную линию, выражают фермент BirA22.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании ген FBRBP был трансфицирован в эмбриональные стволовые клетки мыши (mESCs) с интегрированным вектором экспрессии BirA21. Кроме того, вектор экспрессии FBRBP может быть котрансфицирован в ячейки с pBase и pPiggyBac-BirA-V5 вместе. - Выращиваем клетки в mESC на желатинизированных блюдах и поддерживайте в МЕС культурную среду(Таблицаматериалов) в 5% CO2 при 37 градусах Цельсия. Выберите трансфектированные клетки с гигромицином b (100 мкг/мл) в течение 1 недели.
- После выбора препарата, урожай клеток SDS загрузки буфера (Таблица 1) и использоватьзападную помарку 23 для подтверждения пометки и экспрессии гена с антителом FLAG и стрептавидин-HRP, соответственно.
2. Перекрестные связи
- Плита No3 х 106 мЕS клеток в 10 см пластины за 1 день до эксперимента, так что клетки вырастут до 70-90% слияния при сборе урожая (5-10 миллионов клеток на образец).
- Удалите носитель с помощью вакуума. Лечить клетки с 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 2 мин при комнатной температуре (RT) и утолить трипсин на 4 мл свежей среды mESC. Перенесите клетки в центрифугу 15 мл. Спин вниз клетки центрифугации на 300 х г в течение 3 мин при 4 градусов по Цельсию и удалить супернатант.
- Приостановить клетки с 4 мл холодного PBS и пластины клетки обратно в 10 см пластины для перекрестного соединения. Перекрестная связь клеток по излучению с 254 нм УФ-излучения (установить УФ-перекрестный связующим с параметром 400 мДж/см2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для однослойных клеток клетки могут быть связаны с ультрафиолетовым светом непосредственно на пластине перед лечением трипсином. - Перенесите перекрестные клетки в трубку 15 мл. Спин вниз по центрифуге при 300 х г в течение 3 мин при 4 градусов по Цельсию и удалить супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перекрестные клеточные гранулы могут храниться при -80 градусов по Цельсию до их использования.
3. Препарат лисации клеток
- Подливка клеток с 500 йл буфера мытья(таблица 1) недавно дополнены 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF, 1/500 ингибитор протеазы коктейль, и 400 U/mL RNase ингибитор. Перенесите клетки в трубку без RNase 1,5 мл. Инкубировать клетки в течение 30-60 мин на роторе с нежным вращением при 4 градусов по Цельсию.
- Лечить лизат с 30 йл DNase I при 37 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Остановите реакцию, добавив 4 МКЛ 0,5 М EDTA. Спин вниз нерастворимые гранулы на 12000 х г в течение 20 мин при 4 градусов по Цельсию и передачи супернатанта в новую prechilled 1,5 мл трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для немедленного использования, держать на льду. Если супернатант не будет использоваться немедленно, храните его при -80 градусов по Цельсию до его использования.
4. Подготовка бисера FLAG
- Добавьте 40 йл суспензии FLAG шариков на образец в свежую трубку 1,5 мл.
- Быстро промыть бисер с 0,5 мл ледяного буфера мытья и спина вниз на 3000 х г в течение 2 мин при 4 градусов по Цельсию.
- Повторите шаг 4.2 один раз. Спин вниз бисера с 3000 х г в течение 2 мин при 4 градусов по Цельсию. Аккуратно удалите буфер с помощью узкого наконечника пипетки. Избегайте удаления бисера.
5. Иммунопреципиентация
- Перенесите лизайв ячейки с шага 3.2 на предварительно равнорассмыслено бусы FLAG. Поверните все образцы на роликовом шейкере при 4 градусах Цельсия. Инкубировать бусинки FLAG с лисяю в течение 2'4 ч или на ночь.
- Центрифуга бисера в течение 2 мин при 3000 х г и удалить супернатант.
- Вымойте бисер с 0,5 мл предварительной мыть буфера путем инкубации в течение 5 минут в ротатор при 4 градусов по Цельсию, спина вниз бисера с 3000 х г в течение 2 мин и удалить супернатант. Повторите стирку 1x.
- Повторите мыть 2x, как описано в шаге 5.3 с 0,5 мл prechilled мыть буфер B (Таблица 1).
6. Элюция с 3x пептидом FLAG
- Подготовка 3x FLAG elution раствор путем растворения 1 мг пептида 3x FLAG с 5 мл буфера мытья А до окончательной концентрации 200 нг/мл.
- Спин вниз FLAG бусы от шага 5,4 с 3000 х г в течение 2 мин. Удалите супернатант тщательно. Убедитесь, что большинство супернатантов удаляется с помощью узкого кончика пипетки конца.
- Добавьте к каждому образцу 200 МКЛ 3x решения FLAG elution. Инкубировать образцы с нежным вращением в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию. Спин вниз FLAG шарики в течение 2 мин на 3000 х г. Перенесите супернатанты на свежие трубки.
- Повторите elution 2x, как описано в шагах 6.2 и 6.3 и объединить eluents вместе. Сэкономьте 5% элюентов для анализа западных пятен или окрашивания серебра, чтобы проверить эффективность FLAG-IP.
7. Стрептавидин бисер подготовки
- Подготовьте 50 МКЛ из суспензии из бисера стрептавидина для каждого образца. Соберите бисер с магнитным стендом на 30 с и удалите супернатант кончиком пипетки.
- Быстро вымойте бисер с 0,5 мл ледяного буфера мытья и собирать бисер с магнитной подстоять на 30 с.
- Повторите стирку 1x. Удалите супернатант после мытья.
8. Биотин сродство очистки
- Перенесите соединенные элюенты с шага 6,4 на стрептавидин бусы из шага 7.3 и аккуратно поверните образцы при 4 градусов по Цельсию в течение 1-3 ч или на ночь.
- Соберите бисер с магнитным стендом на 30 с и удалите супернатант. Вымойте бисер 2x с 500 йл буфера мытья C (Таблица 1) нежным вращением на RT в течение 5 минут.
- Соберите бисер с магнитной подсвеки и удалить супернатант. Вымойте бисер 2x с 500 йл буфера мытья D (Таблица 1) путем вращения на RT в течение 5 минут.
- Соберите бисер с магнитной подсвеки и удалить супернатант. Быстро промыть бисер 2x с 500 йл ледяного буфера PNK (Таблица 1).
9. Частичное переваривание РНК
- Сделайте 105-фолдразбавления MNase с буфером реакции MNase (Таблица 1). Добавьте к каждому образцу 100 МКЛ раствора MNase. Вихрь бисера при 37 градусов по Цельсию с термальным микшером при 1200 об/мин (5 с пробегом, 30 с остановкой) в течение 10 мин, собрать бисер с магнитной подстоять на 30 с и удалить супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация MNase должна быть оптимизирована для различных РНК-связывающих белков. Концентрация MNase, способная переваривать РНК в фрагменты 30–50 нт (определяемые размером вставки окончательной библиотеки), является оптимальной. - Быстро промыть бисер 2x с 500 йл ледяного буфера PNK-EGTA(таблица 1). Соберите бисер с магнитной подсовки и удалить supernatant между каждым шагом мытья.
- Вымойте бисер 2x с 500 йл буфера мытья C нежным вращением в течение 5 минут на RT. Затем быстро мыть бисер 2x с 500 йл ледяного буфера PNK.
10. Дефосфорилирование РНК
- Сделайте реакцию фосфатазы кишечника (CIP) смесью с 8 МКЛ 10x буфера CIP(Таблицаматериалов), 3 МКЛ фермента CIP и 69 йл воды. Общий объем составляет 80 мкл за реакцию.
- Соберите бисер с магнитной подгоной и удалите буфер. Добавьте смесь реакции CIP к бисеру. Vortex бусы при 37 градусов по Цельсию с тепловой смеситель установлен на 1200 об / мин (5 с перспективе, 30 с остановкой) в течение 10 мин.
- Быстро промыть бисер 2x с 500 йл ледяного буфера PNK-EGTA. Быстро промыть бисер 2x с 500 йл ледяного буфера PNK.
11. 3' перевязка связующим звеном
- Сделайте 3' связующим смесью с 4 МКЛ из 20 звеняжей МКМ 3, 4 МКЛ 10x T4 РНК лигаз буфера, 4 йл 50% PEG8000, 2 МЛ T4 РНК лигазы 2 (усеченный), и 26 йл воды. Общий объем составляет 40 мкл за реакцию.
- Соберите шарики из шага 10.3 с магнитной подгоной и удалите буфер. Добавьте 40 йл смеси перевязки 3' linker к бисеру. Vortex бисера при 16 градусов по Цельсию с термальным смесителем набор на 1200 об / мин (5 с перспективе, 30 с остановкой) в течение 3 ч или на ночь.
- Быстро промыть бисер 2x с 500 йл ледяного буфера PNK-EGTA. Быстро промыть бисер 2x с 500 йл ледяного буфера PNK.
12. Лечение PNK
- Сделайте смесь PNK с 4 МКЛ 10x PNK буфера, 2 йл фермента T4 PNK, 1 йл 10 мМ АТФ, и 33 йл воды. Общий объем составляет 40 мкл за реакцию.
- Соберите бисер с магнитной подгоной и удалите буфер. Добавьте 40 МКЛ смеси PNK в бисер. Vortex бисер мягко при 37 градусов по Цельсию с тепловой смеситель установлен на 1200 об / мин (5 с перспективе, 30 с остановкой) в течение 10 мин.
- Быстро вымойте бисер с 500 йл ледяного буфера PNK-EGTA.
- Быстро промыть бисер с 500 йл ледяного буфера PNK. Сохранить 5% шариков для западного или серебряного анализа окрашивания, чтобы подтвердить эффективность иммунопреципиентации.
13. Изоляция РНК
- Соберите шарики из шага 12.4 с магнитной подгоной и удалите буфер. Добавьте 200 МКЛ буфера пищеварения протеиназы K(таблица 1). Vortex шарики в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию с термальным смесителем установлен на 1200 об / мин (5 с перспективе, 30 с остановкой). Магнитно изолировать бисер и принять супернатант для эксперимента.
- Добавьте 400 МКЛ реагента изоляции РНК(Таблица материалов)к супернатанту из шага 13.1, тщательно перемешайте и инкубировать на льду в течение 5 минут. Добавьте 80 МКЛ хлороформа и тщательно перемешайте, а затем инкубировать на льду в течение 5 минут. Спин вниз с 12000 х г в течение 10 мин 4 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен в химическом капюшоне. - Возьмите супернатант (500 л) и добавьте два тома изопропанола: смесь этанола (1:1), 1/10 тома 3 М ацетата натрия (рН 5,5) и 1 мл гликогена. Заморозить при -20 градусов по Цельсию на 2 ч. Центрифуга при 4 градусов по Цельсию с 12000 х г в течение 20 мин.
- Вымойте гранулы 2x с ледяной 70% этанола. Спин вниз гранулы при 4 градусов по Цельсию с 12000 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и высушите гранулы. Растворите РНК в 5 МКЛ без RNase H2O.
14. 5' РНК связующим лигой
- Сделать 5' РНК перевязки смесь с 1 МКЛ 10x T4 РНК лигазы буфера, 0,5 йл BSA (1 мкг / йл), 1 йл 10 мМ АТФ, 1 йл ингибитора RNase, и 0,5 йл T4 РНК лигазы. Общий объем составляет 4 МКЛ за реакцию.
- Добавьте 1 МКЛ 5' 20 МКМ РНК-связующим звеном в РНК из шага 13,4, денатуратуру RNA при нагревании при 70 градусов по Цельсию в течение 2 минут, и охладите на льду немедленно.
- Добавьте смесь перевязки РНК 5' в РНК с 14,2 шага. Инкубировать при 16 градусов по Цельсию на ночь.
15. Обратная транскрипция
- Очистите РНК, описанные в разделе 13, и растворите РНК с помощью 11,5 МКЛ воды, свободной от RNase.
- Добавьте 1 МКЛ из 10 МКМ обратной транскрипции грунтовки в очищенной РНК, тепла при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 2 минут, и охладить на льду немедленно.
- Сделайте обратную транскрипцию смесью с 4 йл 5x буфера обратной транскрипции, 1 МКЛ из 10 мММ dNTPs, 1 МЛ 0,1 М ДТТ, 1 йл ингибитора RNase, и 0,5 МЛ обратной транскриптазы (Таблица материалов). Общий объем составляет 7,5 МКЛ за реакцию.
- Добавьте 7,5 МЛ смеси обратной транскрипции в РНК, инкубировать при 50 градусов по Цельсию в течение 30 минут, и остановить реакцию инкубации при 70 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Оставьте при 4 градусов по Цельсию.
16. Усиление ПЦР
- Сделайте смесь усиления ПЦР с 15 МКЛ 2x PCR мастер смеси (Таблица материалов), 5 йл кДНА от шага 15,4, 0,6 МКЛ из 10 МКМ вперед грунтовка 1 (Таблица 2), 0,6 МКЛ из 10 МКМ обратного грунтовка 1 (Таблица 2), и 8,8 МЛ H2O. Общий объем составляет 30 мкл.
- Усильте cDNA со следующими настройками: 98 градусов по Цельсию 30 с, 98 градусов по Цельсию 10 с, 60 градусов по Цельсию 30 с, 72 градусов по Цельсию 30 с (повторите шаги 2'4 для 15'20 циклов), 72 C 2 мин, и удерживайте при 4 градусах Цельсия. Запустите продукт ПЦР на 2-3% агарозного геля. Вырежьте ДНК в 100-150 б.п., извлекайте ДНК с помощью набора для извлечения геля(Таблицаматериалов) и утешьте ДНК 20 МКЛ воды.
- Возьмите 3 МКЛ очищенного продукта ПЦР, усилите с помощью вперед грунтовка 2 (Таблица 2) и обратный грунт 2 (индекс грунтовка; Таблица 2) как описано в шаге 16.2 в течение пяти циклов для введения последовательностей индексов. Очистить продукт PCR, описанный в шаге 16.2.
- Последовательность библиотеки с высокой пропускной способностью платформы секвенирования.
17. Анализ биоинформатики
- Выполните анализ данных с помощью коммерческих программ, как описаноранее 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схематичное представление процедуры FbioCLIP-seq показано на рисунке 1. По сравнению с FLAG-опосредовано или стрептавидин-опосредованное одноступенчатое очищение сродства, FLAG-биотин тандем очистки удалены почти все copurified белков, избегая загрязнения косвенных белков-РНК взаимодействий (Рисунок 2). Результаты представительов FbioCLIP-seq для LIN28 и WDR43 изображены на рисунке 3 и рисунке 4. Мы выполнили LIN28 или WDR43 FbioCLIP-seq с mESCs. Рисунок 3A показывает вид трека LIN28 и WDR43 FbioCLIP-seq в предварительном let-7g. Сообщается, GGAG мотив в предварительном пусть-7g и кросс-связанных сайтов, выявленных FbioCLIP-seq показаны на рисунке 3B. Классификация сайтов мутаций, называемых алгоритмом CIMS, показала, что LIN28 предпочитает связывать и связываться с нуклеотидом G(рисунок 3C). Обогащенные мотивы РНК в LIN28 FbioCLIP-seq связывающих сайтов показаны на рисунке 3D. Более репрезентативные треки FbioCLIP-seq на LIN28 и HNRNPU показаны на рисунке 3E. Сравнение WDR43 и LIN28 FbioCLIP-seq показало их различные связывающие модели в локусе Rn45 pre-rRNA(рисунок 4). На рисунке 5 показаны репрезентативные результаты проверки тегов FLAG и биотина после строительства клеточной линии. На рисунке 6 показаны репрезентативные результаты эффективной(рисунок 6A)или неудачной(рисунок 6B)FLAG-IP и очистки тандема FLAG-biotin.
Рисунок 1: Схематическое представление FbioCLIP. УФ-перекрестные ячейки (шаг 1) лизированы в буфере лиза (шаг 2). Комплекс FBRBP-RNA иммунопрециптирован с использованием смолы анти-FLAG (шаги 3–4). Элетон белково-РНК-комплекс дополнительно очищается стрептавидиным бисером, а для удаления белково-белковых взаимодействий (шаги 5–6) используются строгие условия мытья. РНК частично усваиваются MNase, а фрагменты РНК, не связанные с белком, удаляются путем дальнейшей стирки (шаги 7–8). РНК затем дефосфорилированы и привязались с 3' linker (шаг 9). Затем РНК фосфорилированы и в восторге от лечения протеиназы K (шаг 10). Очищенные РНК перевязаются с 5' РНК linker, содержащий 6 nt случайный штрих-код (шаг 11). После обратной транскрипции (шаг 12) библиотека cDNA усиливается с помощью ПЦР и выполняется секвенирование высокой пропускной способности (шаги 13–15). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: FLAG-биотин тандем очистки удаляет copurified белков. Серебряное окрашивание FBWDR43 показало, что почти все взаимодействующие белки, представленные в ОДНОступенчатой очистке FLAG- или биотин-опосредованного, были устранены после строгой стирки в тандемной очистке. FLAG: FLAG-опосредованное очищение сродства, SA: стрептавидин-опосредованная биотиновая очистка, тандем: FLAG-биотиновая очистка тандема. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты LIN28 FbioCLIP-seq. (A) Трек зрения LIN28 FbioCLIP-seq теги и мутации читает называется CIMS в предварительном пусть-7g РНК. Теги показаны уникальные читает FbioCLIP-seq. В общей сложности, 7,7 миллиона уникальных считых для LIN28 FbioCLIP-seq и 2,2 миллиона уникальных считых для WDR43 FbioCLIP-seq были получены после удаления избыточных считых считых. (B) Кросс-связанных сайтов на мотив GGAG до-let7-g РНК LIN28 FbioCLIP-seq. Стрелки указывают на перекрестные сайты. (C)Процент мутировавших нуклеотидов в различных типах мутаций. G является наиболее частым перекрестным и мутировавшим нуклеотидом. Случайное: случайное распределение четырех нуклеотидов. (D)Предсказал МОТИВы связывания LIN28 от FbioCLIP-seq с алгоритмом HOMER. (E) Просмотров LIN28 FbioCLIP-seq на LIN28 и HNRNPU mRNAs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты WDR43 и LIN28 FbioCLIP-seq на локусе Rn45S. Просмотр трека WDR43 и LIN28 FbioCLIP-seq на локусе Rn45S. WDR43 и LIN28 показали различные связывающие шаблоны на предварительной рРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Репрезентативные результаты проверки FLAG и биотин-тегов. FLAG или биотин Западная помарка подтверждает пометку клеточных линий. Клоны #1, #2 и #4 показали эффективное выражение и биотинилирование тега, в то #3 время как он показал плохое выражение помеченного белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Репрезентативные результаты проверки иммунопреципиентации FLAG и проверки эффективности тандемной очистки. (A)Пример эффективной очистки помеченного белка FLAG и очищения биотинов. (B)Пример неэффективной очистки помеченного белка FLAG и очищения биотинов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Буфера | Состав |
| Буфер загрузки SDS | 50 мМ Трис рН 6,8, 2% SDS, 0,1% бромофенолблю, 10% глицерол, 100 мМ ДТТ |
| Вымойте буфер A | 1x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS |
| Вымойте буфер B | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS |
| Вымойте буфер C | 50 мм Трис рН 7,4, 2% SDS |
| Вымойте буфер D | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% SDS, 1 M мочевина |
| Буфер PNK | 50 мМ Трис рН 7,4, 0,5% НП-40, 10 мМ МгКл2 |
| Буфер реакции MNase | 10 мМ Трис рН 8,0, 1 мМ CaCl2 |
| Буфер PNK-EGTA | 50 мМ Трис рН 7,4, 0,5% НП-40, 10 мМ ЕГТА |
| Буфер пищеварения Proteinase K | 50 мм Трис рН 7,4, 10 мм ЭДТА, 50 мм НаКл, 0,5% SDS, 20 мкг протеиназы K |
Таблица 1: Состав буферов, используемых в данном исследовании.
| Имя Олиго | Последовательности | Заметки | ||||
| 3' связующим звеном | rAppAGATCGGAAGAGCACGTCT-NH2 | |||||
| 5' РНК-связующим звеном | ГУУКАГУУЧУКУАКУАКХАКГАКГУКННННН | |||||
| Праймер RT | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Форвард праймер 1 | GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC | |||||
| Обратная грунтовка 1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Форвард праймер 2 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTGAC | |||||
| Обратная грунтовка 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCACGTGTGTCCCGATC-s-T | Красные и подчеркнутые последовательности представляют последовательность индекса Illumina. | ||||
Таблица 2: Олигонуклеотиды, используемые в данном исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем модифицированный метод CLIP-seq под названием FbioCLIP-seq, воспользовавшись системой двойной маркировки FLAG-biotin для выполнения тандемной очистки белково-РНК-комплексов. Система двойной маркировки FLAG-biotin была показана, что была мощна в определять взаимодействия протеин-протеина ипротеина-ДНК 13,21. Здесь мы демонстрируем высокую специфичность и удобство этой системы в определении РНК, взаимодействующих с белками. Благодаря тандемной очистке и строгим условиям мытья, мы пропустили сложный шаг SDS-PAGE и мембранной передачи, так что больше белково-РНК взаимодействий были сохранены и, чтобы избежать загрязненных РНК-сигналов при посредничестве RBPs в том же комплексе. Кроме того, обход этих шагов позволяет избежать маркировки РНК радиозаклейтой АТФ. Это значительно упрощает процедуру. Отметим, что в ходе подготовки нашей публикации, аналогичный метод под названием uvCLAP также былпредложен 24.
Для успеха протокола важно несколько шагов. Во-первых, эффективность биотинилирования помеченного белка должна быть подтверждена западной пятном перед экспериментом(рисунок 5). Во-вторых, для успешного усиления РНК-сигналов требуется эффективная элюция очищенного белка пептидом 3 x FLAG. Бусы из шага 12.4 должны быть проанализированы с западной пятном или серебряным окрашивание, чтобы гарантировать, что приличное количество целевого белка извлекается(рисунок 6). Чтобы повысить эффективность, либо увеличить концентрацию пептида 3 х FLAG в шаге 6 до 500 нг/мл или повторить шаг элюции несколько раз, чтобы получить лучшее производство. В-третьих, при первом испытании оптимально синицать концентрацию MNase для каждого белка. Переварение желудка или недостаточное лечение может привести к фрагментам РНК ненадлежащего размера. Наконец, протокол содержит два раунда сродства очистки и очень строгий мыть. Извлекается лишь небольшое количество очищенных РНК. Реагент должен быть без RNase и избежать деградации РНК после шага лечения MNase.
Несмотря на простоту этого метода, Есть еще некоторые аспекты, которые могут быть улучшены. Например, перевязка 5' адаптера к РНК непосредственно может ограничить восстановление сигналов, потому что значительная часть обратной транскрипции будет прекращена остаточными перекрестными пептидами. Наше текущее исследование в основном основано на эктопической экспрессии помеченных белков, что может привести к некоторым артефактам из-за переэкспрессии белка. Метод стоит улучшить, введя тег в эндогенный локус. Система CRISPR/Cas9 значительно упрощает и делает строительство клеточной линии. Некоторые исследования применили эксперимент eCLIP-seq к тканям мыши25. Вывод стук-в мышей с двойным тегом также является потенциальным и перспективным направлением в улучшении и применении метода FbioCLIP-seq. Кроме того, эктопически выраженная бактериальная лигаза BirA может привести к неожиданным биотиниляционным событиям in vivo. Маркировка белка может также повлиять на его биологические функции.
Большое количество исследований показало, что экспрессия генов и эпигеном клеток являются неоднородными, а не полностью однородными, что свидетельствует о том, что важно изучать сеть взаимодействия на одноклеточном уровне. Было разработано несколько стратегий для изучения транскриптома и эпигенома одиночных клеток. Тем не менее, не было зарегистрировано никаких стратегий для анализа белка РНК interactome на одноклеточном уровне. Без денатурированного геля работает и мембраны передачи шаги, FbioCLIP-seq может сохранить больше сигналов, что делает его потенциальной стратегией для изучения белково-РНК взаимодействий на одноклеточном уровне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Грантовая поддержка предоставляется Национальной программой фундаментальных исследований Китая (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), Национальным фондом естественных наук Китая (31630095) и Центром наук о жизни при Университете Цинхуа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
