Summary
यहां हम स्तनधारी कोशिकाओं में आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपीएस) के आरएनए लक्ष्यों को निर्धारित करने के लिए फ्लैग-बायोटिन टैंडेम शुद्धि के साथ Fbioक्लिप-एसईक्यू नामक एक संशोधित क्लिप-एसईक्यू प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
आरएनए और आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीएसपी) कई जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं। आरएनए और आरबीपीएस की स्थानिक और लौकिक व्यवस्था इन प्रक्रियाओं के नाजुक नियमन को रेखांकित करती है । क्लिप-सेक्यू (क्रॉस-लिंकिंग और इम्यूनोप्रिपिटेशन) नामक एक रणनीति विकसित की गई है ताकि प्रोवी क्रॉस-लिंकिंग के साथ अंतर्जात प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन को कैप्चर किया जा सके और इसके बाद इम्यूनोप्रिपिटेशन किया जा सके । आरबीपी अध्ययन में पारंपरिक क्लिप-सेक्यू विधि के व्यापक उपयोग के बावजूद, क्लिप विधि उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी, कोपुरीकृत आरबीएसपी से संभावित संदूषकों, आइसोटोप हेरफेर की आवश्यकता और एक थकाऊ प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान जानकारी के संभावित नुकसान की उपलब्धता से सीमित है। यहां हम फ्लैग-बायोटिन टैग टैंडेम शुद्धिकरण का उपयोग करके एफबीआईओक्लिप-सेक्यू नामक एक संशोधित क्लिप-एसईक्यू विधि का वर्णन करते हैं। मिलकर शुद्धिकरण और कड़े धोने की शर्तों के माध्यम से, लगभग सभी बातचीत आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन हटा रहे हैं । इस प्रकार, इन सहपुरीकृत आरबीएस द्वारा अप्रत्यक्ष रूप से मध्यस्थता करने वाले आरएनए भी कम हो जाते हैं । हमारी एफिकोक्लिप-सेक्यू विधि आइसोटोप-मुक्त और प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी-मुक्त तरीके से एसडीएस-पेज और झिल्ली हस्तांतरण प्रक्रियाओं के बिना प्रत्यक्ष प्रोटीन-बाध्य आरएनए का कुशल पता लगाने की अनुमति देती है।
Introduction
आरएनए और आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपीएस) स्प्लिसिंग, अनुवाद, राइबोसोम बायोजेनेसिस, एपिजेनेटिक विनियमन और सेल भाग्य संक्रमण1,2,3,4,5,6 सहित विविध सेलुलर प्रक्रियाओं कोनियंत्रित करतेहैं। इन प्रक्रियाओं के नाजुक तंत्र आरएनए और आरबीपीएस की अनूठी स्थानिक और लौकिक व्यवस्था पर निर्भर करते हैं। इसलिए, आणविक स्तर पर आरएनए नियमन को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम आरबीएसपी के बाध्यकारी स्थलों के बारे में स्थितीय जानकारी प्रकट करना है ।
यूवी क्रॉस-लिंकिंग के साथ प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन को कैप्चर करने के लिए क्रॉस-लिंकिंग और इम्यूनोप्रिपिटेशन (क्लिप-सेक्यू) के रूप में संदर्भित एक रणनीति विकसित की गई है जिसके बाद ब्याज7के प्रोटीन की इम्यूनोप्रिपिपिटेशन है । कार्यप्रणाली की प्रमुख विशेषता आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन और यूवी विकिरण8द्वारा सीधे बंधे आरएनए अणुओं (~ 1 Å के भीतर) के बीच सहसंयोजक क्रॉस-लिंक का शामिल होना है। आरबीपी पैरों के निशान क्लिप टैग क्लस्टरिंग और पीक कॉलिंग द्वारा निर्धारित किए जा सकते हैं, जिसमें आमतौर पर 30−60 एनटी का संकल्प होता है। वैकल्पिक रूप से, क्लिप के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण से क्रॉस-लिंकिंग साइटों कोडेल (सम्मिलित या विलोपन) या प्रतिस्थापन हो सकता है, जो एकल-न्यूक्लियोटाइड रिज़ॉल्यूशन पर आरएनए पर प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की पहचान की अनुमति देता है। क्लिप-सेक्यू8के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण परिणामों के विश्लेषण के लिए नोवोलाइन और सीआईएमएस जैसी पाइपलाइनों को विकसित किया गया है। कई संशोधित क्लिप-एसईक्यू तरीकों का भी प्रस्ताव किया गया है, जिनमें व्यक्तिगत-न्यूक्लियोटाइड रिजॉल्यूशन क्रॉस-लिंकिंग और इम्यूनोप्रिपिशन (आईआईक्लिप), एन्हांस्ड क्लिप (ईसीLIP), आईआरसीलिप, और फोटोएक्टिवेटेबल रिबोन्यूक्लियोसाइड-एन्हांस्ड क्रॉस-लिंकिंग और इम्यूनोप्रिपिटेशन (PAR-क्लिप)9,10, 11,12शामिल हैं ।
RBPs के अध्ययन में पारंपरिक क्लिप-seq विधियों के व्यापक उपयोग के बावजूद, क्लिप विधियों में कई कमियां हैं। सबसे पहले, थकाऊ विकृत जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और झिल्ली हस्तांतरण प्रक्रिया से जानकारी की हानि हो सकती है, और सीमित अनुक्रम जटिलता का कारण बन सकती है। दूसरा, प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी आधारित क्लिप विधि एक ही लक्ष्य प्रोटीन के बजाय एक प्रोटीन परिसर को नीचे खींच सकती है, जिससे कोपुरीकृत आरबीएस से झूठी सकारात्मक प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन हो सकती है । तीसरा, एंटीबॉडी आधारित रणनीति के लिए उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, जो उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी उपलब्ध के बिना आरबीएस के अध्ययन के लिए इन तरीकों के आवेदन को अपर्याप्त बनाता है । चौथा, पारंपरिक क्लिप विधि को प्रोटीन-बाउंड आरएनए लेबल करने के लिए रेडियोलेबल एटीपी की आवश्यकता होती है ।
बायोटिनेइलेटेड प्रोटीन के लिए स्ट्रेप्टाविडिन की उच्च आत्मीयता विशिष्ट प्रोटीन या प्रोटीन परिसरों को शुद्ध करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण बनाती है। स्तनधारी कोशिकाओं में एक्टोपिक रूप से व्यक्त बैक्टीरियल बीरा बायोटिन लिगाज़ द्वारा कृत्रिम पेप्टाइड अनुक्रम ले जाने वाले प्रोटीन का कुशल बायोटिनिलेशन वीवो13में बायोटिन शुद्धिकरण करने के लिए एक कुशल रणनीति बनाता है । हमने एक संशोधित क्लिप-एसईक्यू विधि विकसित की जिसे एफएफओक्लिप-सेक़(एफएलईजी-बायो टिन-मध्यस्थता सीरॉस-एलइंकिंग और आईएममुनोपीरिसिपिटेशन के बाद फ्लैग-बायोटिन टैग टैंडेम शुद्धिकरण 14(चित्रा1) का उपयोग करके विकसित किया। मिलकर शुद्धिकरण और कड़े धोने की शर्तों के माध्यम से, लगभग सभी बातचीत RBPs हटा रहे है(चित्रा 2)। कड़े धोने की स्थिति भी एसडीएस-पेज और झिल्ली हस्तांतरण को दरकिनार करने की अनुमति देती है, जो श्रम गहन और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। और eCLIP और irCLIP के समान, Fbioक्लिप-seq विधि आइसोटोप मुक्त है । जेल चल रहा है और हस्तांतरण कदम लंघन जानकारी के नुकसान से बचा जाता है, प्रामाणिक प्रोटीन आरएनए बातचीत बरकरार रहता है, और पुस्तकालय जटिलता बढ़ जाती है । इसके अलावा, टैगिंग सिस्टम की उच्च दक्षता उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी उपलब्ध कराए बिना आरबीएसपी के लिए एक अच्छा विकल्प बनाती है।
यहां हम स्तनधारी कोशिकाओं के लिए एफिकोक्लिप-सेक्यू प्रोटोकॉल का एक कदम-दर-कदम विवरण प्रदान करते हैं। संक्षेप में, कोशिकाओं को 254 एनएम यूवी द्वारा क्रॉस-लिंक किया जाता है, जिसके बाद सेल लाइसिस और फ्लैग इम्यूनोप्रिपिटेशन (फ्लैग-आईपी) होता है। इसके बाद, प्रोटीन-आरएनए परिसरों को बायोटिन आत्मीयता कैप्चर द्वारा और शुद्ध किया जाता है और आरएनए को एमएनएसे के साथ आंशिक पाचन द्वारा खंडित किया जाता है। फिर, प्रोटीन से बंधे आरएनए को 3 ' लिंकर के साथ डिफोस्फोरिलेटेड और लिगाटेड किया जाता है । आरएनए के बाद 5' आरएनए लिंकर जोड़ा जाता है, जो पीएनके के साथ फॉस्फोरिलेटेड होता है और प्रोटीनेज के पाचन द्वारा पतला होता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद, प्रोटीन-बाउंड आरएनए संकेतों को पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया जाता है और एगर उठे जेल शुद्धि द्वारा शुद्ध किया जाता है। दो RBPs को Fbioक्लिप-seq परिणाम की मिसाल के लिए चुना गया था । LIN28 एक अच्छी तरह से विशेषता आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन है जिसमें माइक्रोआरएनए परिपक्वता, प्रोटीन अनुवाद, और सेल रीप्रोग्रामिंग15,16,17शामिल हैं। WDR43 एक WD40 डोमेन युक्त प्रोटीन है जो राइबोसोम बायोजेनेसिस, यूकेरियोटिक ट्रांसक्रिप्शन, और भ्रूणस्टेम सेल प्लूरिपेंसी कंट्रोल14,18का समन्वय करने के लिए सोचा गया है। क्लिप-एसईक्यू के साथ LIN28 के लिए पहले रिपोर्ट किए गए परिणामों के अनुरूप, एफिकोक्लिप-सेक्यू माइक्रोआरएनए मीर-ले7जी और mRNAs16,19 (चित्रा 3)में "GGAG" रूपांकनों पर LIN28 की बाध्यकारी साइटों का पता चलता है। WDR43 Fbioक्लिप-seq भी पूर्व rRNAs20 (चित्रा 4)के 5 ' बाहरी लिखित spacers (5 '-ईटीएस) के साथ WDR43 की बाध्यकारी वरीयता की पहचान की । ये परिणाम एफबीआईओक्लिप-सेक्यू विधि की विश्वसनीयता को मान्य करते हैं।
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Protocol
1. सेल लाइन निर्माण
- एक PiggyBac वेक्टर pPiggyBac में ब्याज के जीन क्लोन-झंडा-जैव-[ब्याज की सीडीएनए]-(Hygromycin प्रतिरोधी) प्लाज्मिड कि एक झंडा-biotin epitope13,21 एक झंडा बायोटिन टैग जुड़े आरबीपी(FBRBP) व्यक्त करने के लिए किया जाता है ।
- एफबीआरबीपी को पीबेस वेक्टर के साथ बीरा एंजाइम22को व्यक्त करने वाली सेल लाइन में वेक्टर व्यक्त करते हुए सहसंस्रित करें ।
नोट: इस अध्ययन में, FBRBP जीन माउस भ्रूण स्टेम सेल (mESCs) में संक्रमित था एक एकीकृत बीरा अभिव्यक्ति वेक्टर21ले । वैकल्पिक रूप से, वेक्टर व्यक्त करने वाले एफबीआरबीपी को पीबेस और pPiggyBac-बीरा-V5 के साथ कोशिकाओं में एक साथ सहसंचरणित किया जा सकता है। - जिलेटिनीकृत व्यंजनों पर एमईएससी में कोशिकाओं को बढ़ाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में एमईएस कल्चर मीडियम(सामग्री की तालिका)में बनाए रखें। 1 सप्ताह के लिए हाइग्रोमाइसिन बी (100 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ संक्रमित कोशिकाओं का चयन करें।
- दवा चयन के बाद, एसडीएस लोडिंग बफर(टेबल 1)द्वारा फसल कोशिकाओं और क्रमशः एक झंडा एंटीबॉडी और स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी के साथ जीन की टैगिंग और अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए एक पश्चिमी दाग23 का उपयोग करें ।
2. क्रॉस-लिंकिंग
- प्रयोग से 1 दिन पहले 10 सेमी प्लेट में प्लेट ~ 3 x 106 एमईएस कोशिकाएं ताकि काटा जाने पर कोशिकाएं 70−90% संगम तक बढ़ जाएं (प्रति नमूना ~ 5−10 मिलियन कोशिकाएं)।
- एक वैक्यूम के साथ माध्यम निकालें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 मिनट के लिए 0.25% ट्राइपसिन-ईडीटीए के 2 मिलील के साथ कोशिकाओं का इलाज करें और ताजा एमएससी माध्यम के 4 एमएल द्वारा ट्राइप्सिन को बुझाएं। कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें और सुपरनैंट को हटा दें।
- ठंडे पीबीएस के 4 एमएल के साथ कोशिकाओं को निलंबित करें और कोशिकाओं को क्रॉस-लिंकिंग के लिए 10 सेमी प्लेट में वापस प्लेट करें। 254 एनएम यूवी लाइट के साथ विकिरण द्वारा कोशिकाओं को क्रॉस-लिंक करें (यूवी क्रॉस-लिंकर को 400 mJ/सेमी2के पैरामीटर के साथ सेट करें)।
नोट: सेल मोनोलेयर्स के लिए, ट्रिप्सिन उपचार से पहले कोशिकाओं को सीधे प्लेट पर यूवी प्रकाश के साथ क्रॉस-लिंक किया जा सकता है। - क्रॉस-लिंक्ड कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा नीचे स्पिन और सुपरनैंट हटा दें।
नोट: क्रॉस-लिंक्ड सेल पेलेट को उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
3. सेल lysate तैयारी
- Lyse वॉश बफर के 500 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं(तालिका 1)हौसले से 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल, और 400 यू/एमएल RNase अवरोधक के साथ पूरक। कोशिकाओं को आरएनएसई-मुक्त 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल रोटेशन के साथ एक रोटर पर 30−60 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
- 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर DNase I के 30 माइक्रोन के साथ lysate का इलाज करें। 0.5 एम ईडीटीए के 4 माइक्रोल जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम द्वारा अघुलनशील गोली को नीचे स्पिन करें और सुपरनैंट को एक नई प्रीचिल्ड 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
नोट: तत्काल उपयोग के लिए, बर्फ पर रखें। यदि सुपरनैंट का तुरंत उपयोग नहीं किया जाएगा, तो इसे उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
4. ध्वज मोती की तैयारी
- एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब के लिए प्रति नमूना घोल झंडा मोती के 40 μL जोड़ें।
- मोतियों को बर्फ-कोल्ड वॉश बफर ए के 0.5 एमएल से जल्दी धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 3,000 एक्स ग्राम से नीचे स्पिन करें।
- एक बार चरण 4.2 दोहराएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम के साथ मोतियों को नीचे स्पिन करें। एक संकीर्ण अंत पिपेट टिप के साथ बफर को ध्यान से हटा दें। मोतियों को हटाने से बचें।
5. इम्यूनोप्रिपिटेशन
- सेल को स्टेप 3.2 से पहले के फ्लैग मोतियों में ट्रांसफर करें। सभी नमूनों को एक रोलर शेकर पर धीरे-धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं। 2−4 घंटे या रात भर के लिए lysate के साथ ध्वज मोतियों को इनक्यूबेट करें।
- 3,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए मोतियों को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेशन द्वारा प्रीचिल्ड वॉश बफर ए के 0.5 एमएल के साथ मोतियों को धोएं, 2 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम के साथ मोतियों को नीचे स्पिन करें और सुपरनैंट को हटा दें। वॉश 1x दोहराएं।
- 0.5 एमएल प्रीचिल्ड वॉश बफर बी(टेबल 1)के साथ स्टेप 5.3 में वर्णित वॉश 2x दोहराएं।
6. 3x फ्लैग पेप्टाइड के साथ एल्यूशन
- 200 एनजी/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए वॉश बफर ए के 5 एमएल के साथ 1 मिलीग्राम 3x फ्लैग पेप्टाइड को भंग करके 3x फ्लैग एल्यूशन समाधान तैयार करें।
- 2 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम के साथ चरण 5.4 से फ्लैग मोतियों को नीचे स्पिन करें। सुपरनेट को सावधानी से निकालें। सुनिश्चित करें कि अधिकांश सुपरनेट को एक संकीर्ण अंत पिपेट टिप का उपयोग करके हटा दिया जाता है।
- प्रत्येक नमूने में 3x फ्लैग एल्यूशन समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोमल रोटेशन के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें। 3,000 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए फ्लैग मोतियों को नीचे स्पिन करें। सुपरनेटेंट को ताजा ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
- चरण 6.2 और 6.3 में वर्णित एल्यूशन 2x दोहराएं और एल्यूट्स को एक साथ पूल करें। फ्लैग-आईपी की दक्षता की जांच करने के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण या चांदी धुंधला के लिए eluents के 5% बचाओ।
7. स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों की तैयारी
- प्रत्येक नमूने के लिए एक स्ट्रेप्टाविडिन मनका घोल के 50 माइक्रोन तैयार करें। 30 एस के लिए एक चुंबकीय स्टैंड के साथ मोतियों को इकट्ठा करें और एक पिपेट टिप के साथ सुपरनेट निकालें।
- मोतियों को बर्फ-कोल्ड वॉश बफर ए के 0.5 एमएल से जल्दी धोएं और 30 एस के लिए मैग्नेटिक स्टैंड के साथ मोतियों को इकट्ठा करें।
- वॉश 1x दोहराएं। धोने के बाद सुपरनेट निकालें।
8. बायोटिन आत्मीयता शुद्धि
- पूल्ड एल्यूट्स को स्टेप 6.4 से स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों में स्टेप 7.3 से स्थानांतरित करें और नमूनों को धीरे-धीरे 1−3 घंटे या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
- 30 एस के लिए एक चुंबकीय स्टैंड के साथ मोतियों को इकट्ठा करें और सुपरनैंट को हटा दें। मोतियों को 5 मिनट के लिए आरटी में कोमल रोटेशन द्वारा वॉश बफर सी(टेबल 1)के 500 माइक्रोल के साथ 2x धोएं।
- मोतियों को चुंबकीय स्टैंड से इकट्ठा करें और सुपरनिट को हटा दें। मोतियों को 5 मिनट के लिए आरटी में घुमाकर वॉश बफर डी(टेबल 1)के 500 माइक्रोन के साथ 2x धोएं।
- मोतियों को चुंबकीय स्टैंड से इकट्ठा करें और सुपरनिट को हटा दें। मोतियों को 2x को बर्फ-ठंडे पीएनके बफर(टेबल 1)के 500 माइक्रोल के साथ जल्दी से धोएं।
9. आंशिक आरएनए पाचन
- MNase प्रतिक्रिया बफर (तालिका 1) के साथ MNase के एक105गुना कमजोर पड़ने बनाओ । प्रत्येक नमूने में एमएनएसई समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें। भंवर 10 मिनट के लिए 1,200 आरपीएम (5 एस रन, 30 एस स्टॉप) पर सेट थर्मल मिक्सर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर मोती, 30 एस के लिए एक चुंबकीय स्टैंड के साथ मोती इकट्ठा और सुपरनैंट को हटा दें।
नोट: एमएनएसई की एकाग्रता को विभिन्न आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। एमएनएज़ एकाग्रता जो आरएनए को 30−50 एनटी टुकड़ों (अंतिम पुस्तकालय के डालने के आकार से निर्धारित) में पचा सकती है, इष्टतम है। - मोतियों को 2x को बर्फ-ठंडे PNK+ EGTA बफर(टेबल 1)के 500 माइक्रोन के साथ जल्दी से धोएं। एक चुंबकीय स्टैंड के साथ मोती ले लीजिए और प्रत्येक धोने के कदम के बीच सुपरनैंट हटा दें।
- मोतियों को 2x के साथ 500 माइक्रोन वॉश बफर सी के साथ आरटी में 5 मिनट के लिए कोमल रोटेशन द्वारा धोएं। फिर जल्दी से मोतियों को 2x को 500 माइक्रोन बर्फ-ठंडे पीएनके बफर के साथ धोएं।
10. आरएनए के Dephosphorylation
- 10x सीआईपी बफर(सामग्रीकी तालिका), सीआईपी एंजाइम के 3 माइक्रोन, और पानी के 69 माइक्रोन के 8 माइक्रोन के साथ एक बछड़े आंत फॉस्फेट (सीआईपी) प्रतिक्रिया मिश्रण करें। कुल मात्रा प्रति प्रतिक्रिया 80 माइक्रोल है।
- मोतियों को चुंबकीय स्टैंड से इकट्ठा करें और बफर को हटा दें। मोतियों में सीआईपी रिएक्शन मिक्स जोड़ें। भंवर 37 डिग्री सेल्सियस पर मोतियों को 10 मिनट के लिए 1,200 आरपीएम (5 एस रन, 30 एस स्टॉप) पर सेट थर्मल मिक्सर के साथ।
- मोतियों को 2x को बर्फ-ठंडे PNK + EGTA बफर के 500 माइक्रोन के साथ जल्दी से धोएं। मोतियों को 2x को बर्फ से ठंडा पीएनके बफर के 500 माइक्रोन के साथ जल्दी से धोएं।
11. 3' लिंकर लिगेशन
- 20 माइक्रोन 3 के 4 माइक्रोन के साथ 3'लिंकर मिक्स करें, 10x T4 आरएनए लिगाज़ बफर के 4 माइक्रोन, 50% PEG8000 के 4 माइक्रोन, T4 आरएनए लिगाज़ 2 (कटा हुआ) का 2 माइक्रोन, और 26 μl पानी। कुल मात्रा प्रति प्रतिक्रिया 40 माइक्रोल है।
- एक चुंबकीय स्टैंड के साथ कदम 10.3 से मोतियों को इकट्ठा करें और बफर को हटा दें। मोतियों में 3 'लिंकर लिगेशन मिश्रण के 40 μL जोड़ें। भंवर 16 डिग्री सेल्सियस पर मोतियों को 1,200 आरपीएम (5 एस रन, 30 एस स्टॉप) पर 3 घंटे या रात भर सेट थर्मल मिक्सर के साथ।
- मोतियों को 2x को बर्फ-ठंडे PNK + EGTA बफर के 500 माइक्रोन के साथ जल्दी से धोएं। मोतियों को 2x को बर्फ से ठंडा पीएनके बफर के 500 माइक्रोन के साथ जल्दी से धोएं।
12. पीएनके उपचार
- 10x PNK बफर के 4 माइक्रोन के साथ एक पीएनके मिश्रण करें, T4 PNK एंजाइम के 2 माइक्रोन, 10 mm एटीपी के μL, और पानी की ३३ माइक्रोन । कुल मात्रा प्रति प्रतिक्रिया 40 माइक्रोल है।
- मोतियों को चुंबकीय स्टैंड से इकट्ठा करें और बफर को हटा दें। मोतियों में पीएनके मिक्स के 40 माइक्रोन जोड़ें। भंवर मोती धीरे 37 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल मिक्सर के साथ 1,200 आरपीएम (5 एस रन, 30 s स्टॉप) पर 10 मिनट के लिए सेट।
- जल्दी से बर्फ के 500 माइक्रोन के साथ मोतियों को धोएं- ठंडा पीएनके + EGTA बफर।
- मोतियों को बर्फ से ठंडे पीएनके बफर के 500 माइक्रोन से जल्दी धो लें। इम्यूनोप्रिपिपिटेशन की दक्षता की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी या चांदी के धुंधला विश्लेषण के लिए मोतियों का 5% बचाएं।
13. आरएनए अलगाव
- एक चुंबकीय स्टैंड के साथ कदम 12.4 से मोती ले लीजिए और बफर को हटा दें। प्रोटीन के पाचन बफर(टेबल 1)के 200 माइक्रोन जोड़ें। भंवर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मोतियों 1,200 आरपीएम (5 एस रन, 30 एस स्टॉप) पर सेट थर्मल मिक्सर के साथ। चुंबकीय रूप से मोतियों को अलग करें और प्रयोग के लिए सुपरनेट लें।
- चरण 13.1 से सुपरनेटेंट में आरएनए आइसोलेशन रिएजेंट(सामग्री की तालिका) के400 माइक्रोन जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। क्लोरोफॉर्म के 80 माइक्रोन डालकर अच्छी तरह मिलाएं और फिर 5 मिनट तक बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 12,000 x ग्राम के साथ नीचे स्पिन करें।
नोट: यह कदम एक रासायनिक हुड में किया जाना चाहिए। - सुपरनेट (~ 500 माइक्रोल) लें और आइसोप्रोपेनॉल के दो वॉल्यूम जोड़ें: इथेनॉल मिक्स (1:1), 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच = 5.5) की 1/10 मात्रा, और ग्लाइकोजन का 1 माइक्रोल। 2 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। 20 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज।
- गोली 2x बर्फ से ठंड 70% इथेनॉल के साथ धोएं। 5 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली नीचे स्पिन। सुपरनेट निकालें और गोली को सुखा लें। आरएनए को आरएनएसे-मुक्त एच 2 ओ के 5माइक्रोनमें भंग करें।
14. 5 ' आरएनए लिंकर लिगेशन
- 10x T4 आरएनए लिगास बफर के 1 माइक्रोन के साथ 5' आरएनए लिगेशन मिश्रण बनाएं, बीएसए के 0.5 माइक्रोन (1 माइक्रोन/माइक्रोन), 10 एमएम एटीपी के 1 माइक्रोन, आरएनएएस अवरोधक के 1 माइक्रोन, और T4 rna ligase के 0.5 माइक्रोनल। कुल मात्रा प्रतिक्रिया प्रति 4 μL है।
- चरण 13.4 से आरएनए में 5'20 माइक्रोन आरएनए लिंकर का 1 माइक्रोन जोड़ें, 2 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके आरएनए को विकृत करें, और तुरंत बर्फ पर ठंडा करें।
- चरण 14.2 से आरएनए में 5 'आरएनए लिगेशन मिश्रण जोड़ें। रात 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
15. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन
- धारा 13 में वर्णित आरएनए को शुद्ध करें और आरएनए को आरएनए-मुक्त पानी के 11.5 माइक्रोन के साथ भंग करें।
- शुद्ध आरएनए में 10 माइक्रोन रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर का 1 माइक्रोन जोड़ें, 2 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी करें, और तुरंत बर्फ पर ठंडा करें।
- 5x रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन बफर के 4 माइक्रोन के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मिक्स करें, 10 m m dNTPs के 1 माइक्रोन, 0.1 एम डीटीटी के 1 माइक्रोन, RNase अवरोधक के 1 माइक्रोन, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज(सामग्री की तालिका) के0.5 माइक्रोन के साथ। कुल मात्रा प्रति प्रतिक्रिया 7.5 माइक्रोन है।
- आरएनए में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मिक्स का 7.5 माइक्रोन जोड़ें, 30 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन द्वारा प्रतिक्रिया को रोकें। 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
16. पीसीआर प्रवर्धन
- 2x पीसीआर मास्टर मिक्स(सामग्रीकी तालिका), सीडीएनए के 5 माइक्रोन के साथ एक पीसीआर प्रवर्धन मिश्रण बनाएं, चरण 15.4 से, 0.6 माइक्रोनल ऑफ 10 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर 1(टेबल 2),10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर 1(टेबल 2)का 0.6 माइक्रोन, और एच 2 ओ का8.8माइक्रोन। इसकी कुल मात्रा 30 माइक्रोल है।
- निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ सीडीएनए को बढ़ाना: 98 डिग्री सेल्सियस 30 एस, 98 डिग्री सेल्सियस 10 एस, 60 डिग्री सेल्सियस 30 एस, 72 डिग्री सेल्सियस 30 एस (15−20 चक्रों के लिए दोहराने के चरण 2−4), 72 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो। पीसीआर उत्पाद को 2−3% एगरेग्याड जेल पर चलाएं। ~ 100−150 बीपी के डीएनए को काट लें, जेल निकासी किट(सामग्री की तालिका) केसाथ डीएनए निकालें, और डीएनए को 20 माइक्रोन पानी के साथ एल्यूट करें।
- शुद्ध पीसीआर उत्पाद के 3 माइक्रोन लें, फॉरवर्ड प्राइमर 2(टेबल 2)और रिवर्स प्राइमर 2 (इंडेक्स प्राइमर) के साथ बढ़ाना; तालिका 2) जैसा कि सूचकांक दृश्यों को पेश करने के लिए पांच चक्रों के लिए चरण 16.2 में वर्णित है। पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें जैसा कि चरण 16.2 में वर्णित है।
- एक उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण मंच के साथ पुस्तकालय अनुक्रम।
17. बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण
- पहलेवर्णितवाणिज्यिक कार्यक्रमों का उपयोग करके डेटा विश्लेषण करें ।
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Representative Results
एफिकोक्लिप-सेक्यू प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1में दिखाया गया है। फ्लैग-मध्यस्थता या स्ट्रेप्टाविडिन-मध्यस्थता एक-कदम आत्मीयता शुद्धि के साथ तुलना में, फ्लैग-बायोटिन टैंडेम शुद्धि ने अप्रत्यक्ष प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन(चित्रा 2)के प्रदूषण से बचते हुए लगभग सभी सहसंबद्ध प्रोटीन को हटा दिया। LIN28 और WDR43 के लिए Fbioक्लिप-seq के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3 और चित्रा 4 में चित्रित कर रहे हैं । हमने mESCs के साथ LIN28 या WDR43 Fbioक्लिप-seq प्रदर्शन किया। चित्रा 3A पूर्व-चलो-7g में LIN28 और WDR43 Fbioक्लिप-seq के ट्रैक दृश्य से पता चलता है । पूर्व-लेट-7जी में रिपोर्ट किए गए GGAG आकृति और Fbioक्लिप-seq द्वारा पहचाने गए क्रॉस-लिंक्ड साइटों को चित्रा 3Bमें दिखाया गया है । सीआईएमएस एल्गोरिदम द्वारा बुलाए गए उत्परिवर्तन साइटों के वर्गीकरण से पता चला है कि LIN28 जी न्यूक्लियोटाइड(चित्रा 3 सी)के लिए बांधना और क्रॉस-लिंक करना पसंद करता है। LIN28 Fbioक्लिप-seq बाध्यकारी साइटों में समृद्ध आरएनए रूपांकनों चित्रा 3 डीमें दिखाया गया है । LIN28 और HNRNPU पर Fbioक्लिप-seq के अधिक प्रतिनिधि पटरियों चित्रा 3Eमें दिखाया गया है । WDR43 और LIN28 Fbioक्लिप-seq की तुलना Rn45 पूर्व rRNA लोकस(चित्रा 4)में अपने अलग बाध्यकारी पैटर्न दिखाया । चित्रा 5 सेल लाइन निर्माण के बाद फ्लैग और बायोटिन टैग सत्यापन के प्रतिनिधि परिणामों को दिखाता है। चित्रा 6 कुशल(चित्रा 6A)या असफल(चित्रा 6B)फ्लैग-आईपी और फ्लैग-बायोटिन टैंडेम शुद्धिकरण के प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है।
चित्रा 1: Fbioक्लिप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। यूवी-क्रॉस-लिंक्ड कोशिकाओं (चरण 1) को लाइसिस बफर (चरण 2) में लाइस किया जाता है। एफबीआरबीपी-आरएनए कॉम्प्लेक्स एंटी-फ्लैग राल (चरण 3−4) का उपयोग करके इम्यूनोप्रिपिटेटेड है। एलुयूटीड प्रोटीन-आरएनए परिसर को स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के साथ और शुद्ध किया जाता है और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (चरण 5−6) को हटाने के लिए कड़े धोने की स्थिति का उपयोग किया जाता है। आरएनए को एमएनएस द्वारा आंशिक रूप से पचाया जाता है और गैर-प्रोटीन-बाध्य आरएनए टुकड़े को आगे धोने (चरण 7−8) द्वारा हटा दिया जाता है। इसके बाद आरएनए को 3 ' लिंकर (स्टेप 9) के साथ डिफोस्फोरिलेटेड और लिगाटेड किया जाता है । फिर आरएनए को प्रोटीन के उपचार (चरण 10) द्वारा फॉस्फोरिलेटेड और एल्यूट किया जाता है। शुद्ध आरएनए को 5'आरएनए लिंकर के साथ लिगा किया जाता है जिसमें 6 एनटी रैंडम बारकोड (चरण 11) होता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (चरण 12) के बाद, सीडीएनए लाइब्रेरी पीसीआर के साथ परिलक्षित होती है और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (चरण 13−15) किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: फ्लैग-बायोटिन टैंडेम शुद्धिकरण सहस्राइड प्रोटीन को हटा देता है। FBWDR43 के चांदी धुंधला से पता चला है कि लगभग सभी बातचीत प्रोटीन झंडा में प्रस्तुत-या बायोटिन मध्यस्थता एक कदम शुद्धि मिलकर शुद्धि में कड़े धोने के बाद समाप्त हो गए थे । फ्लैग: फ्लैग-मध्यस्थता आत्मीयता शुद्धिकरण, एसए: स्ट्रेप्टाविडिन-मध्यस्थता बायोटिन शुद्धिकरण, मिलकर: फ्लैग-बायोटिन मिलकर शुद्धि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: LIN28 Fbioक्लिप-seq के प्रतिनिधि परिणाम । (A)LIN28 Fbioक्लिप-seq टैग और उत्परिवर्तन का ट्रैक दृश्य पूर्व-चलो-7g आरएनए में सीआईएमएस द्वारा बुलाया पढ़ता है । दिखाए गए टैग Fbioक्लिप-seq के अद्वितीय पढ़ता है । कुल मिलाकर, ~ 7.7 मिलियन अद्वितीय LIN28 Fbioक्लिप-seq के लिए पढ़ता है और ~ 2.2 मिलियन अद्वितीय WDR43 Fbioक्लिप-seq के लिए पढ़ता है अनावश्यक पढ़ता है हटाने के बाद प्राप्त किया गया. (ख)LIN28 Fbioक्लिप-seq द्वारा पूर्व-let7-g आरएनए के GGAG आकृति पर क्रॉस-लिंक्ड साइटें । तीर क्रॉस-लिंक्ड साइटों को इंगित करते हैं। (ग)विभिन्न प्रकार के उत्परिवर्तनों में उत्परिवर्तित न्यूक्लियोटाइड का प्रतिशत। जी सबसे लगातार क्रॉस-लिंक्ड और म्यूटेड न्यूक्लियोटाइड है। रैंडम: चार न्यूक्लियोटाइड का यादृच्छिक वितरण। (घ)होमर एल्गोरिदम के साथ Fbioक्लिप-seq द्वारा LIN28 बाध्यकारी रूपांकनों की भविष्यवाणी की । (ई)LIN28 और HNRNPU mRNAs पर LIN28 Fbioक्लिप-seq के ट्रैक विचार । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: WDR43 और LIN28 Fbioक्लिप के प्रतिनिधि परिणाम-Rn45S लोकस पर seq । Rn45S लोकस पर WDR43 और LIN28 Fbioक्लिप-seq का ट्रैक व्यू। WDR43 और LIN28 ने प्री-आरएनए पर अलग-अलग बाध्यकारी पैटर्न दिखाए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: फ्लैग और बायोटिन टैग सत्यापन के प्रतिनिधि परिणाम। फ्लैग या बायोटिन वेस्टर्न ब्लॉट सेल लाइनों की टैगिंग को मान्य करता है। क्लोन #1, #2, और #4 कुशल अभिव्यक्ति और टैग के बायोटिनाइलेशन दिखाया, जबकि #3 टैग प्रोटीन की खराब अभिव्यक्ति दिखाया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 6: फ्लैग इम्यूनोप्रिपिफिकेशन और टैंडेम शुद्धिकरण दक्षता सत्यापन के प्रतिनिधि परिणाम। (ए)फ्लैग और बायोटिन ए आत्मीयता शुद्धि द्वारा टैग किए गए प्रोटीन की कुशल शुद्धि का उदाहरण। (ख)ध्वज और बायोटिन आत्मीयता शुद्धि द्वारा टैग किए गए प्रोटीन की अक्षम शुद्धि का उदाहरण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| बफ़र | संरचना |
| एसडीएस लोडिंग बफर | 50 m TriS पीएच 6.8, 2% एसडीएस, 0.1% ब्रोमोफेनॉलब्लू, 10% ग्लाइसरोल, 100 mM DTT |
| बफर ए धोएं | 1x पीबीएस, 0.5% एनपी-40, 0.5% सोडियम डिऑक्सीकोटलेट, 0.1% एसडीएस |
| बफर बी धोएं | 5x पीबीएस, 0.5% एनपी-40, 0.5% सोडियम डिऑक्सीकोटलेट, 0.1% एसडीएस |
| बफर सी धोएं | 50 m TriS पीएच 7.4, 2% एसडीएस |
| बफर डी धोएं | 5x पीबीएस, 0.5% एनपी-40, 0.5% एसडीएस, 1 मीटर यूरिया |
| पीएनके बफर | 50 एमएम ट्रिस पीएच 7.4, 0.5% एनपी-40, 10 एमएमएम एमजीसीएल 2 |
| MNase प्रतिक्रिया बफर | 10 एमएमएल ट्रिस पीएच 8.0, 1 एमएमएम CaCl2 |
| PNK+EGTA बफर | 50 m TriS पीएच 7.4, 0.5% एनपी-40, 10 m EGTA |
| प्रोटीनेज के पाचन बफर | 50 m Tris पीएच 7.4, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.5% एसडीएस, 20 माइक्रोग्राम प्रोटीनेज कश्मीर |
तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स की संरचना।
| ओलिगो नाम | अनुक्रम | नोट्स | ||||
| 3' लिंकर | ̈पगात्टगागेकाकैक्सीजीटीसीटी-एनएच 2 | |||||
| 5 ' आरएनए लिंकर | गुवागागुकागुसागुसागुसेक्यूक्न्ननन | |||||
| आरटी प्राइमर | AGACGTGTGCTCटीसीटीटी | |||||
| फॉरवर्ड प्राइमर 1 | जीटीटीसीगागटक्टैकागेटसीसीजीजीटीसी | |||||
| रिवर्स प्राइमर 1 | AGACGTGTGCTCटीसीटीटी | |||||
| फॉरवर्ड प्राइमर 2 | AATGATACGGCGACCACCGATGATCTACGTTCAGTTCTACAGTCCGAC | |||||
| रिवर्स प्राइमर 2 | CAAGCAAGACGGCATACGAGATCGTGATGATGGATGGATGGATGGATGGATGATGATGATGATGATGATGATC | लाल और रेखांकित दृश्य इलुमिना इंडेक्स सीक्वेंस का प्रतिनिधित्व करते हैं। | ||||
तालिका 2: इस अध्ययन में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग किया जाता है।
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Discussion
यहां हम प्रोटीन-आरएनए परिसरों के मिलकर शुद्धिकरण करने के लिए फ्लैग-बायोटिन डबल टैगिंग सिस्टम का लाभ उठाते हुए एफिकोक्लिप-सेक्यू नामक एक संशोधित क्लिप-एसईक्यू विधि पेश करते हैं। फ्लैग-बायोटिन डबल टैगिंग प्रणाली को प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन13, 21की पहचान करने में शक्तिशाली दिखाया गया है । यहां हम प्रोटीन के साथ बातचीत करने वाले आरएनए की पहचान करने में इस प्रणाली की उच्च विशिष्टता और सुविधा प्रदर्शित करते हैं। मिलकर शुद्धिकरण और कड़े धोने की स्थिति के माध्यम से, हमने चुनौतीपूर्ण एसडीएस-पेज और झिल्ली हस्तांतरण कदम को छोड़ दिया, ताकि अधिक प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन को संरक्षित किया जा सके और एक ही परिसर में आरबीएपी द्वारा मध्यस्थता किए गए दूषित आरएनए संकेतों से बचा जा सके। इसके अलावा, इन चरणों का बाईपास रेडियोलाेबल एटीपी के साथ आरएनए की लेबलिंग से बचता है। इससे प्रक्रिया काफी आसान हो जाती है। ध्यान दें कि हमारे प्रकाशन की तैयारी के दौरान, यूवीसीएलएपी नामक एक समान विधि भी24प्रस्तावित की गई है ।
प्रोटोकॉल की सफलता के लिए कई कदम महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, टैग किए गए प्रोटीन के बायोटिनिलेशन की दक्षता की पुष्टि प्रयोग(चित्र 5)से पहले पश्चिमी दाग द्वारा की जानी चाहिए। दूसरा, आरएनए संकेतों के सफल प्रवर्धन के लिए 3 एक्स फ्लैग पेप्टाइड द्वारा शुद्ध प्रोटीन का कुशल एल्यूशन आवश्यक है। चरण 12.4 से मोतियों का विश्लेषण पश्चिमी दाग या चांदी के धुंधला के साथ किया जाना चाहिए ताकि यह गारंटी दी जा सके कि लक्ष्य प्रोटीन की एक सभ्य मात्रा(चित्र 6)प्राप्त की जाती है। दक्षता बढ़ाने के लिए, या तो 500 एनजी/एमएल तक चरण 6 में 3 एक्स फ्लैग पेप्टाइड एकाग्रता बढ़ाएं या बेहतर उत्पादन प्राप्त करने के लिए कई बार एल्यूशन चरण दोहराएं। तीसरा, पहले परीक्षण में प्रत्येक प्रोटीन के लिए एमएनएई एकाग्रता को कम करना इष्टतम है। अतिव्यगिव्य या अपर्याप्त उपचार अनुचित आकार के आरएनए टुकड़े करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । पिछले, प्रोटोकॉल आत्मीयता शुद्धि और अत्यधिक कठोर धोने के दो दौर शामिल हैं । केवल शुद्ध आरएनए की एक छोटी राशि प्राप्त की जाती है। रिएजेंट RNase मुक्त होना चाहिए और MNase उपचार कदम के बाद आरएनए क्षरण से बचना चाहिए।
इस विधि की आसानी के बावजूद, अभी भी कुछ पहलू हैं जिन्हें सुधारा जा सकता है। उदाहरण के लिए, आरएनए के लिए 5 ' एडाप्टर का लिगेशन सीधे संकेतों की वसूली को सीमित कर सकता है क्योंकि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा अवशिष्ट क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स द्वारा समाप्त किया जाएगा । हमारा वर्तमान अध्ययन मुख्य रूप से टैग किए गए प्रोटीन की एक्टोपिक अभिव्यक्ति पर आधारित है, जिससे प्रोटीन अतिव्यक्ति के कारण कुछ कलाकृतियों का कारण बन सकता है। यह अंतर्जात लोकस में टैग शुरू करके विधि में सुधार के लायक है। CRISPR/Cas9 प्रणाली सेल लाइन निर्माण बहुत आसान और साध्य बनाता है । कुछ अध्ययनों ने माउस ऊतकों25के लिए eCLIP-seq प्रयोग लागू किया है । डबल टैग के साथ दस्तक चूहों का व्युत्पन्न भी एफिकोक्लिप-सेक्यू विधि के सुधार और अनुप्रयोग में एक संभावित और आशाजनक दिशा है। इसके अलावा, एक्टोपिकल रूप से व्यक्त बैक्टीरियल बीरा लिगाज़ वीवो में अप्रत्याशित बायोटिनाइलेशन घटनाओं का कारण बन सकता है। प्रोटीन की टैगिंग इसके जैविक कार्यों को भी प्रभावित कर सकती है।
बड़ी संख्या में अध्ययनों से पता चला है कि कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति और एपिजेनोम पूरी तरह से सजातीय के बजाय विषम हैं, यह सुझाव देते हुए कि एकल कोशिका स्तर पर इंटरैक्शन नेटवर्क का अध्ययन करना मूल्यवान है । एकल कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टोम और एपिगेनोम का अध्ययन करने के लिए कई रणनीतियां विकसित की गई हैं। हालांकि, एकल कोशिका स्तर पर प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्टोम का विश्लेषण करने के लिए कोई रणनीतियों की सूचना नहीं दी गई है । विकृत जेल चल रहा है और झिल्ली हस्तांतरण कदम के बिना, Fbioक्लिप-seq अधिक संकेतों को संरक्षित कर सकते हैं, जो यह एक एकल सेल स्तर पर प्रोटीन आरएनए बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक संभावित रणनीति बनाता है ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
अनुदान सहायता चीन के राष्ट्रीय बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31630095) से है, और Tsinghua विश्वविद्यालय में जीवन विज्ञान के लिए केंद्र।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
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